Marcadores de ADN. ¿Por qué usar marcadores de ADN en estudios de diversidad biológica?
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Marcadores de ADN
¿Por qué usar marcadores de ADN en estudios de diversidad biológica?
Genotipo 1ambiente
Fenotipo 1
Fenotipo 2
Fenotipo 3
Dependiendo de las condiciones ambientales, un mismo genotipo puede expresarse como distintos fenotipos
FENOTIPO GENOTIPO
¿Cómo surgen las variantes genéticas (genotipos) en la naturaleza?
Mutaciones
Reordenamientos cromosómicos
Polimorfismo genético: presencia de múltiples formas alélicas para un mismo locus
Las mutaciones que no son reparadas son incorporadasa la población
?
¿Por qué se mantiene el polimorfismo genético en la naturaleza si la
selección natural actúa seleccionando a los
alelos mejor adaptados?
Eritrocitos normales Eritrocitos en anemia falciforme
El caso de la anemia falciforme
Plasmodium
Anopheles
Análisis cuali y cuantitativo dela diversidad biológica
EcologíaEvolución
SistemáticaAgronomíaSilvicultura
Biotecnología
Algunas aplicaciones de los marcadores de ADN
Mapeo y ligamiento a atributos de interés agrícola y forestal (MAS: Markers Assisted Selection)Detección de genotipos “exóticos” como fuente de genes de atributos de interés biotecnológico
En ciencia aplicada
En ciencia básica
Indicadores de diversidad genética para la aplicación de programas de manejo y conservación de recursos genéticos
Estudios de sistemática (taxonomía y filogenia)
Las técnicas de biología molecular ofrecen una gran variedad de herramientas para realizar
estudios de diversidad genética de alta resolución
Marcadores genéticos
Marcador genético multi-locus(ejemplo RFLP con sonda microsatélite)
Ejemplo de análisis:F y H: Siempre heredados juntos - ligados?A y B: En la progenie siempre A o B - alélicos?A y D: 4 combinaciones: A y D, A, D o ninguno - no ligados?Alelo P posiblemente ligado a I y C
Conclusiones que se pueden obtener del análisis con marcadores de ADN
ADN eucariótico
Genes funcionalesde copia única ADN repetido ADN espaciador
Secuenciasfuncionales
Secuencias sin función conocida
Familias de genes funcionales
(y pseudogenesrelacionados)
Secuencias funcionales
no-codificantes
Repeticiones de heterocromatina
centromérica
Repeticiones en tandem de número
variable
Transposones
Familias de genes dispersos
Familias de genes
en tandem
Características deseables en un marcador de ADN:
•Comportamiento altamente polimórfico.•Herencia codominante.•Presencia frecuente en el genoma.•Distribución regular en el genoma.•Comportamiento selectivamente neutro.•Altamente reproducibles.•Fácil acceso.
Genotipo
Marcador codominante(Ej. RFLP, VNTR)
Marcador dominante(Ej. RAPD, AFLP)
1,1 1,2 2,2
Clases de marcadores de ADN
Técnicas de análisis multi-locus basadas en la hibridación RFLP con sondas minisatélites y microsatélites (VNTRs clásico)
Técnicas de análisis multi-locus basadas en la PCR RAPD AFLP
Técnicas de análisis single-locus basadas en la PCR SSR (Análisis de VNTRs) PCR-RFLP PCR-Secuenciación
Técnicas de análisis multi-locus basadas en la hibridación RFLP con sondas minisatélites y microsatélites (VNTRs)
¿En qué se basa el análisis de Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP)?
Una Er cuya secuencia de reconocimiento es de 6pb es probable que encuentre su secuencia una vez cada 4096 pb (46 ) en un genoma
Se puede detectar la presencia de polimorfismo genético en una de cada 500 pb
Empleando 8 Er de 6 pb: 4096/8 = 500 pb
Se puede detectar la presencia de polimorfismo genético en una de cada 32 pb
Empleando 8 Er de 4 pb: 256/8 = 32 pb
Una Er cuya secuencia de reconocimiento es de 4pb es probable que encuentre su secuencia una vez cada 256 pb (44 ) en un genoma
¿Cómo se detecta el polimorfismo?
Sondas: Minisatélites: repeticiones de 10 a 35 pb Microsatélites: repeticiones de 2 a 10 pb
Análisis de paternidad basado en el análisis de VNTRs (clásico)
Análisis forense mediante VNTRs (clásico)
Técnicas de análisis multi-locus basadas en la PCR
RAPD AFLP
ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD)
Denaturación
Unión del partidor
Extensión
Separación electroforética de los productos amplificados
ADN molde, partidor, dNTPs, Taq pol
Patrones de amplificación RAPD de 7 cepas de D. salina analizadas, con los partidores de RAPD P-100 (ranuras 2 a 8) y OPA-11 (ranuras 9-15)
CONC-001: ranuras 2 y 9 CONC-006: ranuras 3 y 10 CONC-007: ranuras 4 y 11 México: ranuras 5 y 12 China: ranuras 6 y 13 Australia: ranuras 7 y 14D. bardawil: ranuras 8 y 15
P-100 OPA-11
Análisis de agrupamiento UPGMAderivado de la data de RAPD
Cepa 1
Cepa 2
Cepa 3
Cepa 4
Cepa 5
Cepa 6
Cepa 7
I
II
III
IV
0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
SimilitudAnálisis de
datos
nabS =
na+nb
nab: nº bandas compartidasna: nº bandas en anb: nº bandas en b
AFLP (Amplified fragment lenght polymorphism)
Técnicas de análisis single-locus basadas en la PCR
SSR (Análisis de VNTRs) PCR-RFLP PCR-Secuenciación
Los marcadores SSR (Simple sequence repeat) o microsatélites, presentan la
ventaja de que las regiones que flanquean las repeticiones son, generalmente,
conservadas entre genotipos de la misma especie
Diseño de partidores
Heterocigoto Homocigoto
Las diferencias detectadas están dadas por cambios en el número de repeticiones de las secuencias microsatélites (flanqueadas por los partidores) en los distintos alelos
Actualmente la determinación de paternidad se hace analizando SSRs utilizando partidores específicos
Madre Hijo Padre?
Análisis single locus por RFLP o secuenciación
18S 5.8S 28SITS-1 ITS-2
Región ITS
IGS IGS
Distribución de las secuencias ribosomales en el ADN nuclear eucarionte
Forward
Reverse
Análisis de PCR-RFLP en cepas de Haematococcus pluvialis
AluI
Fragmento ITS sin digerir
Taq I
Las diferencias en la secuencia son más
específicamente reveladas por secuenciación
Secuenciación de la región ITS en cepas de Dunaliella salina
Tamaño del fragmento ITS en cepas de Dunaliella salina
1.- CONC-0012.- CONC-0063.- CONC-0074.- México
1500
700500
M 1 2 3 4 5 6 7
pb
5.- China6.- Australia7.- D. bardawil
Cepa ITS-1 (pb) ITS-2 (pb)
CONC-001 213 232CONC-006 214 225CONC-007 214 231México 214 225China 213 226Australia 213 226D. bardawil 213 227
Longitud de los espaciadores ITS-1 e ITS-2
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1. CONC-001
2. CONC-006
3. CONC-007
4. México
5. China
6. Australia
7. D. bardawil
8. D. viridis
9. D. tertiolecta
- 0.1019 0.0275 0.0989 0.1014 0.0906 0.1014 0.1416 0.1085
- 0.1145 0.0778 0.0829 0.0751 0.0880 0.1519 0.1244
- 0.1007 0.1034 0.0980 0.1032 0.1613 0.1298
- 0.0023 0.0209 0.0092 0.1380 0.1275
- 0.0232 0.0115 0.1409 0.1304
- 0.0304 0.1291 0.1105
- 0.1407 0.1239
- 0.1164
-
Matriz de divergencia de las secuencias ITS-1 e ITS-2
Arbol de MP y MLbasado en las secuencia ITS
91 (MP)
94 (ML)
98 (MP)
96 (ML)
100 (MP)
100 (ML)
99 (MP)
98 (ML)
99 (MP)
100 (ML)
D. salina México
D. salina China
D. bardawil
D. salina Australia
D. salina CONC-006
D. salina CONC-001
D. salina CONC-007
D. viridis
D. tertiolecta
A
B
C
D
Análisis de diversidad genética en comunidades
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) ADN
Ambiental 1
PCR conpartidores específicos
ADNAmbiental 2
Gel de agararosade los productos de PCR
Concentración de denaturante
DGGE profiles of archaeal 16S rRNA gene fragments from a full-scale activated sludge plant showing changes in the archaeal communities over time.
ADNambiental
PCR conpartidores específicos
Secuenciación
...etc...
Secuenciación
Genoteca