Marcadores e Genômica - Aula Teórica Thiago final
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Marcadores e Genômica
Engenheiro AgrônomoMestrando em Agronomia - Genética e Melhoramento de
Plantas
Thiago Martins Pinheiro
Marcadores moleculares
Homozigotos e heterozigotos não são diferenciados
Indivíduos homozigotos e heterozigotos são diferenciados
Marcadores moleculares
Importância• Melhoramento
– Marcadores moleculares ligados a diferentes características de importância econômica tem sido desenvolvidos, permitindo a seleção indireta de características desejáveis em gerações precoces, reduzindo tempo, fontes e energia necessários.
• Estudos genéticos– São ferramentas úteis para detectar variações
no genoma, o que aumenta o poder de análise genética das plantas.
Importância• Estudos de caracterização de populações• Avaliação de germoplasma e populações de
melhoramento: – Variabilidade– Diversidade genética– Classificação– Distância genética– Filogenia;
• Construção de coleções nucleares;
Importância• Estrutura de populações
– Fluxo de genes– Sistema de cruzamento– O tamanho efetivo
• Evolução• Construção de mapas genéticos;• Mapeamento de QTLs•Seleção assistida
Tipos de marcadores
• Marcadores isoenzimáticos• Marcadores RFLP• Marcadores baseados em PCR
– Marcadores RAPD– Marcadores microssatélites– Marcadores AFLP– Marcadores SNPs
Marcadores isoenzimáticos
• Termo introduzido por Market & Moller (1959)• Designa formas moleculares múltiplas de
enzimas que ocorrem em um mesmo organismo e membros da mesma espécie
• Detecção, isolamento, e distinção: métodos bioquímicos = cromatografia, filtração gélica, eletroforese, etc.
• Controle genético: monogenético, co-dominante = híbridos
Marcadores isoenzimáticos• Aplicações:
– Caracterização da variabilidade genética de populações naturais e espécies cultivadas;
– Estudos de evolução e dispersão de espécies e análises filogenéticas;
– Identificação de ligação gênica entre isoenzimas e caracteres de herança simples e complexa
– Identificação de acessos e cultivares;– Seleção indireta de caracteres de interesse
agronômico;– Aumento na resolução de mapas de ligação
Marcadores isoenzimáticos
• Vantagens– Herança mendeliana simples– Co-dominância– Técnica barata– Operacionalmente acessível– Determinação genotípica dos locos em qualquer
parte da planta– Análise simultânea de vários locos isoenzimáticos– Não-detecção de efeitos deletérios, epistáticos
ou pleinotrópicos
Marcadores isoenzimáticos
• Desvantagens– Cobertura reduzida do genoma (nº de locos
detectáveis)– Baixo nível de polimorfismo por loco– Especificidade de algumas isoenzimas em certas
partes da planta– Expressão de certas enzimas é influenciada pelo
ambiente e estádio de desenvolvimento da planta– Complexidade de alguns zimogramas
Marcadores RFLP
• Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism)
• Enzimas de restrição “tesouras” moleculares• Criação/eliminação de sítios de restrição
substituição ou modificação de par de bases, deleções, inserções, inversões ou translocações
Marcadores RFLP• Detecção
– Extração e purificação do DNA– Tratamento com enzimas de restrição– Separação por eletroforese em gel de agarose– Transferência para suporte sólido (membrana de
náilon ou nitrocelulose)– Fixação por alta temperatura ou luz UV– Hibridização com sonda radioativa ou
quimioluminescência– Autoradiografia (Raio X)
Marcadores RFLP• Vantagens
– Co-dominância– Não afetados por pleiotropia, epistasia ou
variações ambientais– DNA extraído de qualquer parte do organismo– Não depende do estádio de desenvolvimento do
organismo– Resultados altamente estáveis e reproduzíveis– Ampla cobertura do genoma– Disponibilidade de diversas enzimas de restrição
Marcadores RFLP
• Desvantagens– Desenvolvimento de marcadores RFLP é
caro e trabalhoso– Não permite automatização– Inexistência de biblioteca de sondas para
espécies “menos importantes”
O marcador RFLP usa a técnica do SOUTHERN BLOTTING
Marcadores SNPs
Vantagens• Alta densidade no genoma• Estáveis do ponto de vista
evolucionário• Genotipagem dos SNPs não
se baseia na medida de comprimento dos alelos
• Distinção dos alelos pode ser automatizada
• Taxa de mutação relativamente baixa
Desvantagens• Alto custo de
desenvolvimento e genotipagem
Marcadores RAPD
• DNA polimorfico amplificado ao acaso (Random amplified polymorphic DNA)
• Primer curto (10 nucleotídeos), de sequência arbitrária
• Amplificações de fragmentos de DNA ao acaso• Detecção normalmente feita em gel de
agarose corado com brometo de etídio, visualizado sob luz ultravioleta
Marcadores RAPD• Vantagens
– Técnica simples, fácil e rápida de se obter resultados– Custo relativamente reduzido– Aplicável em qualquer organismo– Não emprega radioatividade– Não necessita mão-de-obra altamente especializada– Não exige sequenciamento de nucleotídeos nem
desenho de primers específicos– Necessidade mínima de DNA necessária
Marcadores RAPD• Desvantagens
– Baixo conteúdo de informação genética em cada loco (dominância)
– Baixa reprodutibilidade dos resultados (bastante sensível a pequenas modificações
– Requer certa experiência com procedimentos moleculares: preparo de soluções-estoque e componentes da reação; manipulação cuidadosa de micropipetas, reagentes e enzimas; programação de termocicladores; etc
Marcadores microssatélites - SSR• Sequência Simples Repetida (Simple Sequence Repeat)• 1 a 6 nucleotídeos repetidos em tandem (AACT
AACTAACTAACTAACTAACT) • Repetições
– Perfeitas não são interrompidas– Imperfeitas interrompidas por bases não
repetidas– Compostas duas ou mais repetições estão
dispostas adjacentes– Simples Apenas uma repetição
Marcadores microssatélites - SSR• Os produtos amplificados são observados em gel de
poliacrilamida desnaturante ou não-desnaturante, ou em gel de agarose de alta resolução, corados com brometo de etídio ou nitrato de prata
• Cada microssatélite constitui um loco genético altamente variável, multialélico e de grande conteúdo informativo
• Natureza altamente informativa + especificidade + rapidez = eficiente ferramenta para estudos de genes eucarióticos
• Microssatélites desenvolvidos para uma espécie podem ser utilizados com sucesso em outras espécies
Marcadores microssatélites - SSR• Uso
– Mapeamento genômico– Mapeamento comparativo– Estudos de ligação– Identificação de genótipos– Proteção de variedades– Avaliação de pureza de sementes– Utilização e conservação de germoplasma– Estudos de diversidade– Análise gênica e de QTLs– Análise de pedigree– Seleção assistida por marcadores– Análise de bibliotecas para clonagem de genes
Marcadores microssatélites - SSRVantagens
• Uso fácil e eficiente
Desvantagens• Necessidade de serem
isolados e desenvolvidos especificamente para cada espécie, não sendo possível desenho de “primers universais”
• Desenvolvimento processo demorado, trabalhoso e com alto custo
Exemplo de Microssatélites
Marcadores AFLP
• Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados (Amplified Fragment Lenght Polymorphism)
• Amplificação do DNA via PCR para detectar diferenças em um conjunto de fragmentos selecionados e digeridos com enzima de restrição
• Crucial utilização de DNA genômico altamente puro garantir completa digestão
Marcadores AFLP
• Utiliza duas enzimas de restrição, uma de corte raro e outra de corte frequente
• Os produtos da amplificação são separados em gel de poliacrilamida desnaturante (alto nível de resolução). Polimorfismo detectado por presença ou ausência de bandas
• Revelação feita com radioatividade, visualização por auto-radiografia; nitrato de prata ou fluorescência
Marcadores AFLP• Uso:– Mapas de ligação– Clonagem de genes– Acessar diferenças genéticas entre indivíduos,
populações e espécies– Estudos filogenéticos– Discriminação de variedades– Registro de variedades (testes de distinção,
homogeneidade e estabilidade)– Monitoramento da herança de características
agronômicas
• Uso– Diagnóstico de doenças– Análise de pedigree– Análise de diversidade genética– Análise de marcadores ligados a características
de interesse– Análise de erosão genética causada por
melhoramento– Estimativa de taxas de fecundação cruzada em
populações melhoradas
Marcadores AFLP
Marcadores AFLP• Vantagens
– Capacidade de analisar várias regiões diferentes do genoma
– Capacidade de analisar grande número de locos polimórficos simultaneamente
– Alta reprodutibilidade e robustez– Número de marcas geradas virtualmente
ilimitado– Alto valor informativo– Herança mendeliana
Marcadores AFLP
• Desvantagens– Nível de polimorfismo detectado é menor
quando comparado com outros marcadores
– Dificuldade de identificar variantes alélicos em um loco específico
Marcadores SNPs• Polimorfismo em único nucleotídeo (Single
Nucleotide Polymorphism)• Detectam polimorfismos de uma única base no
genoma• Deve ocorrer em pelo menos 1% da população para
ser considerada SNP• 90% do polimorfismo no genoma humano são SNPs• Sequenciamento em larga escala de espécies
vegetais tem permitido evidenciar presença de SNPs (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Glycine max, Cucumis melo, Zea mays, etc)
Marcadores SNPs• Natureza bi-alélica e abundantes no genoma• Estimativas
– Genoma humano: 1 SNP : 1000 bases ou menos– Milho: 1 SNP : 70 bases
• Visualização (técnicas): – Cromatografia líquida de alta pressão
desnaturante (DHPLC)– Polimorfismo conformacional fita única (SSCP)– Outros métodos de clivagem química ou
enzimática
Marcadores SNPs
• Indispensável validação experimental dos dados obtidos para se conhecer o potencial informativo de cada polimorfismo
• Métodos de validação e genotipagem disponíveis atualmente– Microarranjos– Cromatografia líquida de alta pressão
desnaturante (DHPLC)– Espectrometria de massa
Marcadores SNPs
– Ensaios com extensão de primers– PCR em tempo real– Minissequenciamento– Sequenciamento de única base– Digestão por enzimas de restrição (RFLP)
Marcadores SNPs• Uso:
– Mapas de resolução 100x maior que os existentes– Melhoramento assistido por marcadores
moleculares– Construção e integração de mapas genéticos e
físicos– Estudos de genética de populações– Estudos de filogenias
Marcadores SNPs
– Análise de genes– Descobertas da base genética molecular de
importantes características vegetais– Associação entre doses de alelos e expressão
fenotípica (poliploides)– Identificação de variedades
Características RFLP RAPD SSR AFLP
Ação gênica Co-dominante Dominante Co-dominante Dominante
Número de alelos/loco Multi-alélico 2 Multi-alélico 2
Disponibilidade de marcadores no
genomaIlimitada Ilimitada Ilimitada Ilimitada
Nível de polimorfismo Alto Alto Muito alto Muito alto
Necessidade de procedimentos
prévios
Construção bibliotecas
genômicas ou cDNAs
Não há Desenho de primers Não há
Concentração de DNA 10 mg 25 ng 50 ng 500 ng
Marcação radioativa Sim / não Não Não Sim / não
Reprodutibilidade Alta Média Alta Média
Investimento Alto Médio Alto Médio
Genômica• Genoma: Conjunto completo de cromossomos de uma espécie • Genômica: É o estudo da estrutura e função dos genomas inteiros• Genômica estrutural e funcional• Genômica estrutural: Estuda a estrutura dos genomas inteiros através do sequenciamento do DNA dos mesmos• Genômica funcional: Estuda a função das sequências obtidas na genômica estrutural
Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 10 de Junho de 2009 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome)
Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 24 de Novembro de 2009 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome)
Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 21 de Abril de 2010 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome)
Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 3 de Maio de 2010 Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome
Genômica: Exemplos de plantas sequenciadas
• O genoma da primeira planta a ser totalmente seqüenciado foi a da Arabidopsis thaliana em 2001. • Em seguida foi sequenciado o do Arroz (Oryza sativa) em 2002.• O Brasil vem se destacando nessa área e participou do sequenciamento de: A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), o eucalipto (Eucalyptus ssp), o Café (Coffea ssp), o milho e a banana (único ainda em andamento).
Exemplos de alguns microrganismos fitopatogênicos sequenciados
•Xylella fastidiosa (Amarelinho dos citros),
•Xanthomonas campestris (cancro cítrico),
•Magnaphorte oryzae (brusone)
Xylella fastidiosa
Xanthomonas campestris
Magnaphorte oryzae
Exemplos de algumas espécies vegetais sequenciadas
• Eucalipto (Eucalyptus globulus subsp. globulus)
• Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum)
• Café (Coffea arabica)
• Milho (Zea mays)
Genômica no Brasil
• 1998: criação de uma rede de laboratórios para sequenciamento: rede ONSA• Instituto virtual.• Criado e financiado pela FAPESP
Estudos de genômica comparativa ou sintenia
• Uma análise comparativa entre monocotiledôneas mostrou que o genoma do cloroplasto da cana de açúcar é muito semelhante ao do milho mas não ao do arroz e do trigo.
Fonte: Zimmer et al. (2003)
Bioinformática• Análise da informação biológica utilizando a ciência da computação.• Envolve desenvolvimento de bancos de dados on-line e de algoritmos (programas) para comparação de dados genéticos.• Genômica Estrutural e Funcional• Proteômica e Metabolômica• Construção de mapas genéticos e mapeamento de QTLs
Diferentes abordagens para o estudo da Biotecnologia em plantas e suas interrelações
Desafios...
• Produzir mais alimentos em menor área, com menos água e menos insumos• O desenvolvimento de uma agricultura sustentável é a chave para a diminuição da pobreza, segurança alimentar e proteção ambiental
Considerações finais
A aplicação criteriosa e segura da biotecnologia na agricultura, juntamente com a utilização racional dos recursos genéticos, podem aumentar a lucratividade dos agricultores, produzir melhores alimentos, e menor dependência de agroquímicos.