MICROBIOLOGÍA 2ºCFS DIETÉTICA MATERIAL EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

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En un laboratorio de Microbiología además del material habitual de laboratorio,

estudiado en el Módulo de 1º de “Control alimentario”, utilizamos otros materiales más

específicos. Además de repasar todo el material general de laboratorio estudiado en el

curso pasado estudiaremos, en este tema, el material y aparatos más específicos del

laboratorio de Microbiología.

1. MATERIAL ESPECÍFICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Pipetas de seguridad, son pipetas graduadas con un trozo de algodón graso o lipófilo en la

boquilla (extremo de aspiración). El algodón hace de filtro protector, para evitar la

contaminación y para impedir la llegada de líquido al sistema de succión. Bajo ningún

concepto se debe pipetear con la boca una muestra microbiológica.

Tubos de cultivo. Utilizados en el laboratorio de microbiología para cultivar muestras con

microorganismos (el tubo lleva medio de cultivo). Suelen ser de vidrio y suelen ser de

fondo plano. Pueden ser:

sin cierre hermético: deben ir tapados con una torunda de algodón graso

con cierre hermético. Tubos con un tapón de rosca o similar.

Algodón graso o hidrófobo. Se emplea para tapar la boca de recipientes de vidrio (tubos,

matraces...). Al ser lipófilo es un buen aislante de productos de naturaleza acuosa.

Campana de Durham. Es un pequeño tubo (de unos 5x30 mm) que se coloca en forma

invertida dentro de los tubos de ensayo que contienen medio de cultivo líquido. Sirven

para verificar la producción de gas por parte de los microorganismos.

Placas de Petri. Es un recipiente redondo, de vidrio o plástico, de diferentes diámetros

(siendo más comunes los de 9 cm de diámetro), de fondo bajo, con una cubierta de la

misma forma que la placa, pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar

encima y cerrar el recipiente. Se utiliza en el laboratorio de microbiología para el cultivo

de bacterias y otros microorganismos. En el fondo de la placa lleva un medio de cultivo

sólido, distinto según el microorganismo que se quiera cultivar.

Portaobjetos y cubreobjetos. Para la visualización de microorganismos al microscopio.

Portaobjetos: Placa rectangular de vidrio donde se coloca la muestra a examinar al

microscopio.

Cubreobjetos: Placa cuadrangular de vidrio de menor espesor que la anterior.

Sirve para proteger la muestra colocada en el porta y para mejorar su visualización al

microscopio.

Portaobjetos excavado. Es un portaobjetos con una cavidad semiesférica en la zona

central. Se utiliza para observar la movilidad de microorganismos al microscopio

(exámenes, en fresco, con “gota pendiente”).

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Asas o hilos de siembra. Se utilizan en el laboratorio de microbiología para la recogida y

manipulación de muestras microbiológicas. El asa puede ser:

desechables (de plástico estériles), o

no desechables. Éstas últimas consisten en un mango al que se le acopla un hilo de

platino o de nicrón cerrado en el extremo en forma circular (asa). Si no está cerrado se

denomina hilo de siembra. Existen asas calibradas: el volumen de líquido que es capaz

de recoger está estandarizado (las desechables son todas calibradas).

Asa o espátula de Drigalsky (o “cayado”). Es un

instrumento de una sola pieza con una acodadura en el

extremo. Pueden ser:

desechables (de plástico estériles),

no desechables, Varillas de vidrio macizo acodadas (el

extremo acodado puede ser triangular).

Se utiliza para distribuir los microorganismos de una

muestra líquida sobre la superficie del medio de cultivo

contenido en una placa de Petri (siembras en superficie).

2. APARATOS ESPECÍFICO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Mechero Bunsen. Es un mechero de gas, que puede recibir el aporte del mismo por

conducción central o a partir de una bombona (camping-gas), con la característica de

poder regular la calidad de la llama mediante el aporte mayor o menor de oxígeno a la

combustión. Esto se lleva a cabo manejando una válvula que el mechero debe portar y

que permite variar la entrada del oxígeno.

Se utilizan para flamear asas e hilos de metal, bocas de recipientes de vidrio,

mantenimiento de atmósfera estéril.

Partes del MECHERO BUNSEN:

a) Entrada de gas, puede

provenir el gas de

tuberías

centralizadas (A y B)

o de botellas a

presión (e).

b) Llave de apertura o

cierre.

c) Regulador de

intensidad de llama,

es un anillo metálico

con un orificio que

gira sobre el cilindro

quemador. Según el

grado de giro varía el aporte de aire a la llama, lo que dará lugar a distintas calidades

de ésta (la ideal es de color azul con un cono nítido).

d) Cilindro quemador, es el tubo metálico vertical donde se produce la combustión.

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e) Base de sustentación, es la porción metálica inferior donde se apoya el cilindro

quemador (en las botellas de gas a presión es la misma botella).

f) Adaptador del mechero a la fuente (sólo en botellas a presión).

La llama será de buena calidad cuando el aporte de oxígeno sea suficiente como para

que su color sea azul (estamos quemando el gas óptimamente desde el punto de vista

energético y produciendo dióxido de carbono).

Una llama amarilla supone una combustión incompleta con producción de monóxido de

carbono (gastamos el gas sin obtener toda la energía que lleva y producimos un tóxico

importante).

Mechero eléctrico, es un dispositivo cilíndrico que dispone de un orificio donde se

introduce el asa o hilo de platino o nicrón. En su interior existe una resistencia eléctrica

incandescente. Se utiliza, por lo tanto, para esterilizar asas e hilos de siembra

metálicos.

Estufa de cultivo. Son aparatos que nos permiten mantener en su interior una

determinada temperatura a lo largo de un tiempo, desde la temperatura ambiente hasta

aproximadamente 60-70ºC. Suelen llevar dos puertas, una interior de cristal.

Se emplea en el laboratorio de microbiología para el cultivo de bacterias y otros

microorganismos (hongos).

Estufa Poupinel (horno Pasteur). Con temperaturas entre 50-300º C. Se utilizan para:

Secar el material de vidrio lavado (se suelen utilizar a temperaturas de unos 60º C)

esterilizar en seco material que soporta altas temperaturas: de vidrio o metálico (p.e.

160ºC durante 90 minutos).

Autoclave. Aparato que sirve para esterilizar (vapor de agua saturado a presión). En el

laboratorio de microbiología es muy utilizado para:

esterilizar los medios de cultivo, algunos materiales y

para esterilizar residuos (material o cultivos potencialmente peligrosos ya usados).

Stomacher (homogenizador de palas). Sirve para homogeneizar muestras de alimentos.

Es un aparato dotado de unas palas que golpean la muestra sin entrar en contacto con

ella. Se introduce la muestra y el diluyente en una bolsa estéril y se homogeniza cierto

tiempo (1-2 minutos, según el alimento). Las paletas golpean la muestra y los posibles

microorganismos del alimento pasan al diluyente.

Contador de colonias. Sirve para contar el número de colonias de una placa. Una colonia

grupo de bacterias en un cultivo sólido surgido a partir de un solo microorganismo. Poseen

una lupa, para amplificar la visión, luz y una cuadrícula.

Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso

del aire a través de un filtro HEPA (acrónimo del término anglosajón High Efficiency

Particulate Air) barriendo la superficie de trabajo, con un flujo de aire “limpio”. El flujo

de aire puede ser vertical u horizontal. Estas cabinas ofrecen protección al material que

se maneja en su interior, pero nunca al operador. Son, sin embargo, un instrumento de

trabajo imprescindible en las denominadas "zonas limpias".

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Las cabinas de seguridad biológica son recintos ventilados diseñados para limitar al

máximo el riesgo del personal de laboratorio expuesto a agentes infecciosos. Algunas de

ellas ofrecen además, protección al material que se manipula en su interior. Utilizan

barreras de aire (permiten que éste fluya en una sola dirección y a una velocidad

constante creando una verdadera "cortina" que se conoce como flujo de aire laminar, es

decir, sin turbulencias) y filtros HEPA.

3. MANIPULACIÓN DEL MATERIAL DE MICROBIOLOGÍA

Normas generales de trabajo

Todo el material (tubos, placas, asa e hilo de siembra, pipetas, medios de cultivo...)

empleado en el manejo de microorganismos deberá ser estéril.

Es imprescindible trabajar en condiciones asépticas (para mantener las condiciones

de esterilidad):

­ en campana de flujo laminar o

­ en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen: radio de 10-20 cm (zona

aséptica) alrededor de la llama del mechero.

Se procurará disponer de todo el material para el procesamiento de una muestra al

alcance de la mano, para evitar desplazamientos innecesarios y el abandono de la

misma.

Es necesario adquirir rapidez y automatismo, indispensable para una buena ejecución

de las técnicas.

Manipulación del material: En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele

realizarse utilizando cultivos axénicos o puros, es decir, que contienen organismos de

una sola especie microbiana. La posibilidad de contaminación está siempre presente

porque los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: en el aire, en el agua,

en nuestra piel… Para evitar las contaminaciones hemos de observar las siguientes

normas:

El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estériles.

Los tubos o matraces deben estar tapados con algodón hidrófobo estéril o cubiertos

con un capuchón metálico o con tapón de rosca, para impedir la entrada de

microorganismos. Si se usan placas de Petri deben mantenerse

tapadas. En todos los casos, sólo se abrirán para permitir la

manipulación de los cultivos.

Asa e hilo de siembra:

platino o nicrón. Debe esterilizarse antes y después de su uso por

flameado, para lo cual, se colocan lo más vertical posible, haciendo

que el filamento se ponga al rojo en toda su longitud. Se coge del

mango como si fuera un lápiz.

Cuando se quiere introducir en recipientes de cuello estrecho

(tubos, matraces, frascos, etc.) se debe flamear también la parte

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del mango que quede dentro del recipiente durante la manipulación.

Para tomar microorganismos de una muestra: tras la esterilización se debe dejar

enfriar unos segundos en la zona aséptica, pues si contactan inmediatamente con

una fuente de microorganismos (colonias, muestra…), éstos se esterilizarían.

Una vez utilizados, deben flamearse de nuevo con el objeto de eliminar los

microorganismos que quedan en ellos.

De un solo uso (plástico): se adquieren ya estériles envasadas individualmente; se

sacarán de su envoltorio justo antes de su uso. Una vez utilizado se desecha en un

contenedor diseñado para tal fin.

Asa de Drigalsky (cayado).

Varillas de vidrio macizo acodadas: Se esterilizan, impregnándolas en alcohol y

pasándolas posteriormente por la llama del mechero.

De un solo uso: se adquieren ya estériles envasadas individualmente; se sacarán

de su envoltorio justo antes de su uso. Una vez utilizado se desecha en un

contenedor diseñado para tal fin.

Pipetas. Se utilizan pipetas de seguridad (con filtro de algodón en su boquilla) y

prepipetas o auxiliares de pipeteo para aspirar: está prohibido pipetear

directamente con la boca:

Si la pipeta es de vidrio: para algunos deberá flamearse la punta de la pipeta y

toda la longitud de la misma que contacte con el recipiente de la muestra. Para

otros esto no es necesario, ya que la pipeta está envuelta y protegida; únicamente

la desenvolveremos en el momento de su utilización, colocando previamente en la

boquilla un auxiliar de pipeteo.

Si la pipeta es de un solo uso, obviamente no la flamearemos, desenvolviéndola

justo en el momento de su manipulación (colocar previamente en la boquilla un

auxiliar de pipeteo, si es preciso).

En cualquier caso la pipeta se manejará con la punta dirigida hacia abajo,

manteniéndola oblicuamente (lo más vertical posible), pero nunca horizontalmente.

Tubos y matraces de vidrio. Siempre que contengan algún

producto en su interior (medio de cultivo, suspensión de

microorganismos…) deben estar tapados con una torunda de

algodón o con su tapón hermético (capuchón metálico o con

tapón de rosca), para impedir la entrada de

microorganismos. Se manipularán del siguiente modo:

No se abrirán en posición vertical, se realizará

oblicuamente, dirigiendo su abertura hacia la llama.

El algodón o tapón hermético se recoge con el dedo

meñique de la mano opuesta a la que sostiene el recipiente.

Nunca deben dejarse sobre la mesa.

La boca se flameará después de retirar el tapón y antes de volver a reponerlo, para

lo cual se expone a la llama unos segundos mediante un movimiento de rotación.

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Placas de Petri. Deben mantenerse tapadas, mientras no se estén manipulando.

Deben manipularse:

con una mano semiabiertas y con la abertura orientada hacia la llama del mechero.

Cuando la técnica no permita la manipulación anterior, se manejará con la

superficie de la placa orientada de forma oblicua hacia la llama del mechero,

dentro de la zona aséptica. Una forma bastante habitual de manipular placas de

Petri consiste en colocar éstas en posición invertida (tapa abajo) sobre la mesa de

trabajo. A continuación tomamos la base de la placa, con el medio de cultivo, en la

palma de la mano orientándolo de forma oblicua hacia la llama del mechero. Una vez

tomada la colonia o sembrada la placa se coloca encima de su tapa.

Los tubos y las placas deben permanecer abiertos el menor tiempo posible con el fin

de evitar contaminaciones.

4. MANIPULACIÓN DE CULTIVOS Y MUESTRAS

Medio líquido (tubo). Si el medio es líquido, se debe agitar el tubo antes de tomar la

muestra, porque los microorganismos tienden a sedimentar.

Con asa de platino o nicrón:

Coger el asa como un bolígrafo y flamearlo (en personas diestras con la mano

derecha).

Coger el tubo con la mano izquierda y destaparlo (el tapón se sujetará con el dedo

meñique de la mano derecha en este caso).

Flamear la boca del tubo.

Introducir el asa estéril y sumergirla en el medio líquido.

Extraer el asa del tubo; la muestra queda formando una película circular en la luz

de la misma. Sólo se puede conocer el volumen de muestra utilizando asas

calibradas.

Se flamea de nuevo la boca del tubo y se tapa. Depositar el contenido donde sea

preciso. Volver a flamear el asa.

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Con pipeta estéril

Desenvolver la parte de la boquilla de la pipeta, colocar la prepipeta (chupete en el

caso de pipeta pasteur de vidrio, pera de goma o cualquier otro dispositivo de

aspiración en el caso de pipetas volumétricas). Las pipetas pasteur de un solo uso

llevan el chupete de aspiración incorporado.

Destapar el tubo, flamear la boca del mismo, desenvolver totalmente la pipeta e

introducirla en el tubo. La muestra se toma por aspiración.

Se debe mantener limpia la parte exterior de la pipeta, por lo que se dejará gotear

el líquido adherido a sus paredes externas sobre el borde del tubo antes de sacar

la pipeta del mismo.

Flamear la boca del tubo y tapar el mismo. Depositar el contenido donde sea

preciso.

Medio sólido (tubo o en placa) con asa o hilo

Flamear el asa o hilo y:

Tubo: destapar el tubo y flamear su boca.

Placa: semiabrirla

Enfriar el asa o hilo en una zona donde no haya crecimiento. A continuación contactar

suavemente con el hilo o asa estéril alguna colonia visible (se recomienda tomar la del

borde del cultivo, para mantenerlo íntegro el máximo tiempo posible). Los

microorganismos quedan retenidos sobre el asa o el hilo. Sacar el asa o el hilo.

Flamear de nuevo la boca del tubo y tapar o bien cerrar la placa.

Depositar el contenido donde sea preciso y flamear el asa de nuevo.