Mecanismos de reparación de lesiones en el...

Mecanismos de reparación de lesiones en el DNA

Además, existen secuencias

naturales que adoptan

conformaciones diferentes

de la clásica doble hélice del

DNA (B-DNA):

Z-DNA, H-DNA, G-cuartetos,

cruciformes, horquillas, y

series de uno o mas

nucleótidos repetidos.

Lesiones espontáneas, causadas por actividades

metabólicas, o por agentes en el medio ambiente:

Adaptado de Nature, 411:366-374, 2001

Rayos X Luz ultravioleta Rayos X Errores de

replicación*Radicales de oxígeno* Hidrocarbonos Cis-platino

Reacciones espontáneas* Agentes alquilantes Mitomicina C

Agentes dañinos Consecuencias

Arresto del

ciclo de división

celular

Apoptosis

(muerte celular)

Cancer

Envejecimiento

Enfermedade

s congénitas

Inhibición de:

•Transcripción•Replicación

•Segregación

cromosómica

Mutaciones

Aberraciones

cromosómicas

Uracilo Photoproductos 6-4 Entrecruzamientos

MisapareamientoSitio abásico Dímeros ciclobutanos de cadena Inserción

8-Oxoguanina de pirimidinas Corte de cadena doble Deleción

Corte de cadena simple Aductos abultados

*: Resultado de procesos endógenos

Diversidad del sistema inmune: la conmutación

de clase de las inmunoglobulinas depende de la

actividad de enzimas que cortan y empalman el DNA

del gen de la cadena pesada, creando un isotipo

diferente.

Algunas mutaciones pueden resultar ventajosas y

permiten la evolución de las especies..

Terapias contra el cáncer basadas en agentes

genotóxicos.

G. Spivak©

No todas las lesiones en el DNA son dañinas

Mecanismos de reparación del DNA

Reversión enzimática

Reparación por escisión de bases (BER)

Reparación por escisión de nucleótidos (NER)

Reparación de desapareamientos (MMR)

Reparación de cortes de cadena simple

Reparación post-replicación

Reparación de cortes de cadena doble

G. Spivak©

Reparación de entrecruzamientos de cadenas

Reparación de dímeros de pirimidinas por reversión directa:

fotoreactivación

timinas o

citosinas

fotodímero

luz

ultravioleta

240-260 nm

fotoliasa y

luz blanca

(300-500 nm)

Fotoliasas específicas para los dímeros ciclobutanos y los 6-4 fotoproductos.

Codificadas en fagos; activas en la mayoría de bacterias y algunos vertebrados

(marsupiales) pero no en mamíferos placentarios.

Reparación de lesiones alquilantes por reversión directa

La metiltransferasa de O6-metil-guanina es una enzyma suicida









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1. Escisión de la base

2. Incisión del sitio AP

3. Modificación de las

puntas

4. Síntesis reparativa

5. Ligado

8-oxoG

Sp

Gh

FapyG MeFapyG

8-oxoA

FapyA

Tg DHT 5OHMH

5OHC 5OHU DHU

Las Lesiones

8-oxoG es una de las lesiones endógenas mas

frecuentes

Dizdaroglu, DNA Repair 2012

Lesiones en ratones x 106 bases

Órgano 8-oxoG FapyAdenina FapyGuanina

Hígado 2.6 0.2 0.55

Riñón 3.5 0.2 1.0

Cerebro 3.2 0.2 1.0

C

G

C

GO

A

GO

GO

C

GO

C

C

G

C

GO

MutM (Fpg)

reparación

reparación

MutY

replicación

oxidación

Tres mecanismos para procesar oxidación de guanina en E. coli

dGTP 8-oxodGTP 8-oxodGMPoxidación MutT

(hMYH)

(MTH1)

(hNeil1,

hNeil2,

hNeil3)

hOGG1

Aunque los productos de oxidación del DNA

son los daños mas frecuentes, hay otras

lesiones y sustratos de BER

Alquilación (1 o 2 carbonos)

Pérdida espontánea de la base

Desaminación de citosina uracilo

Incorporación de ribonucleótidos en DNA

Roturas de cadena

Total ≥ 20.000 lesiones / célula / dia

Glicosilasas que reconocen y remueven bases modificadas en el DNA de humanos

hNTH1 Tg, hoU, hoC, urea, FapyG

hOGG1 8-oxoG, FapyG

hMYH A:8-oxoG

hNEIL1 Tg, hoU, hoC, urea, FapyG, FapyA

hNEIL2 sitio AP, hoU, 8-oxoG en cadena simple

hNEIL3 Tg, hoU, hoC, urea, FapyG, FapyA

UNG U

hSMUG1 U, hoU, hmU, fU

TDG T:G desapareamiento

MBD4 T:G desapareamiento

Aag 3-meA, 7-meG, hipoxantina, etenoA

MPG 3-meA, hipoxantina

AlkB reversión de bases metiladas en cadena simple

& productos de superoxidaciónde guanina









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Reparación por escisión de ribonucleótidos (RER)


G. Spivak©

r

1.000.000 / célula / dia

ribonucleótidos incorporados por DNA replicasas en mamíferos

rr

rNTP:dNTP ~100:1

rr r


G. Spivak©

r

Ribonucleasa H2

DNA pol β

Flap endonucleasa FEN1

ligasa

Thomas Kunkel









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Medio ambiente + estilo de vida: cientos de lesiones en DNA

NER no necesita glicosilasas específicas

La luz solar es el mutágeno mas abundante

Los dímeros ciclobutanos de pirimidinas

(CPDs) son los fotoproductos mas frecuentes de

la radiación ultravioleta.

Los fotoproductos 6-4 pirimidina-pirimidona (6-4

PP) se forman con menos frecuencia, pero

causan mayores distorciones en la estructura del

DNA y son reconocidos mas facilmente por las

enzimas de reparación.

Benzo(a)pireno Benzo(g)criseno

Los hidrocarbonos policíclicos aromáticos (PAH) son

convertidos en metabolitos reactivos que forman aductos

de purinas.

Benzopireno diol

epóxido (BPDE) B(g)CDE

Ejemplos de lesiones “abultadas” reparadas por NER

Luz UV Dímeros de pirimidinas

Tabaco, humo Hidrocarbonos aromáticos policíclicos

Oxidación Ciclopurinas, peroxidación de lípidos

Alquilación Grupos alquilos de >2 carbonos

Entrecruzamientos con proteínas

Quimioterapia Ligado de bases vecinas por cisplatino: GG, GNG

Mostazas de Aductos alquilantes de purinas

nitrógeno

⌃ ⌃

Reconocimiento de la lesión por UvrA

UvrB es reclutado por UvrA

Complejo de pre-incisión

UvrC es reclutado por UvrBIncisión doble por UvrC

Escisión por UvrD

Síntesis de reparación y ligado

UvrC

UvrD

LigasePol I

(UvrA)2

(UvrB)2

(UvrB)2

Reparación por escisión de nucleótidos (NER) en E. coli

(UvrA)2

XPE-DDB2 ?centrin1

centrin1

centrin1

XPF-ERCC1

Ligase I

NER global en seres humanos

x

Cuando la síntesis de ácidos nucleicos es detenida:

RNA polimerasa

DNA polimerasa

1. El producto puede

resultar truncado

o defectuoso

2. El acceso para la

reparación

queda

restringido

3. Se genera una

señal para la

apoptosis

G. Spivak©

DNA polimerasa

de traspaso:

3 en E. coli

15 en humanos

a. Pausa y continuación;

mutagénesis transcripcional

b. Retroceso, corte del RNA naciente,

1. probar de nuevo

2. reparar y continuar

Cuando la transcripción se detiene: Opciones?

c. Remoción y destrucción de la

polimerasa y del mRNA, reparación.

Ub

señal para apoptosis

muerte celular

G. Spivak©

TC

RG

GR

(UvrA)2

(UvrB)2

XMfd

RNAP

RNA

(UvrA)2

UvrC

UvrD

LigasePol I

UvrA

Mfd

(UvrB)2

(UvrB)2

Reparación por escisión de nucleótidos (NER) en E. coli

La RNA polimerasa se detiene al

llegar a una lesiónMfd se une a la RNAP y recluta UvrA

RNAP y el RNA son liberados

UvrB es reclutado por UvrA

Reconocimiento de la lesión por UvrA y verificación por UvrB

Complejo de pre-incisión

UvrC es reclutado por UvrBIncisión doble por UvrC

Escisión por UvrD

Síntesis de reparación y ligado

Reparación del gen lacZ en E. coli irradiadas con UV

3’ 5’

RPA

XPF-ERCC1

XPC-HR23B-Centrin

XPE-DDB2

TFIIH

XPA

XPG

RNA

RNAPII

CSACSBUVSSA

XAB2TFIIS

GGR TCR

XPDTFIIHXPB

Reparación por escisión de nucleótidos (NER) en humanos

HMGN1p300

USP7

remoción del 30-mero con la lesión, síntesis, ligado

RNAPII

nuclear membrane

nuclear

pore RNA export

complex

RNA biogenesis

complexes elongation factors

UVSS

A

USP7

CSB

reassembled

nucleosomes

disassembled

nucleosome

HMGN1 p300

CRL4

E3-ubiquitin ligase

NER

RNAPII

nuclear membrane

nuclear

pore RNA export

complex

RNA biogenesis

complexesUVSSA

USP7

disassembled

nucleosome

CSA

TFIIS

XAB2

clipped

nascent

RNA

CSB

Reparación por excisión de nucleótidos: dos caminos

Reparación global del genomio (GGR)

• Lesiones en todo el genomio

• La eficiencia depende del grado de distorsión creado por la lesión,

de la secuencia local, de la estructura cromatínica y de otros

factores

Reparación acoplada a la transcripción (TCR)

• Lesiones en cadenas transcritas de genes activos

• Requiere que la RNA polimerasa esté configurada para elongación

• La RNA polimerasa detenida recluta enzimas de la reparación

G. Spivak©

¿Por qué existe la reparación acoplada a la transcripción?

TCR es importante para la sobrevivencia celular porque:

• Remueve RNA polimerasas bloqueadas que podrían interferir con

la replicación.

• Remueve lesiones que interrumpen la transcripción de genes

esenciales.

• Elimina una señal muy fuerte para iniciar apoptosis.









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Mecanismo conservado en organismos de unicelulares a

humanos. Corrige errores durante la replicacion del DNA.

Asociado con el replisoma, repara únicamente la cadena

hija para conservar la secuencia original.

Requiere detección de nucleótidos normales, apareados

incorrectamente.

Sustratos incluyen los 8 desapareamientos de bases

posibles, ademas de horquillas causadas por inserciones

o deleciones.

Reparación de desapareamientos

MutS se une al error y recluta

MutH y MutL

MutH se une a un sitio GATC

hemimetilado, indicando cual es la

cadena hija que contiene el error,

e inicia escición creando una

mella en la cadena hija en el sitio

GATC

Las cadenas son desenroscadas

por la helicasa II, exonucleasas

digieren la cadena mellada en

dirección hacia el error

DNA polimerasa III sintetiza el

parche. La región no apareada es

protegida por la proteina SSB

DNA ligasa completa la

reparación; la metilasa DAM metila

el sitio GATC en la cadena hija

Reparación de desapareamientos en E. coli

GATC GATC

CH3

GATC

CH3

Reparación de desapareamientos en humanos

El mecanismo y la maquinaria son similares pero no hay metilación de GATC.

La cadena hija se distingue porque

• es discontinua?

• contiene ribonucleótidos?

E. coli Homólogos humanos

MutS heterodímeros Msh2 / Msh6 = MutSα

Msh2 / Msh3 = MutSβ

MutL heterodímeros 2x Mlh1 / Pms1 = MutLα

Mlh1 / Pms1 = MutLβ

Mlh1 / Mlh3 = MutLγ

MutH no homólogos; la función de endonucleasa es

llevada a cabo por los homólogos de MutL









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Fases G1 / S: fusión no homóloga de extremos (NHEJ)

Fases S / G2: recombinación homóloga (HR)

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Causas naturales:

o recombinación meiótica y mitótica

o reordenación V (D) J de inmunoglobulinas

o replicación del DNA

o ROS productos del metabolismo

Agentes ambientales:

o radiaciones ionizantes

Reparación de cortes de doble cadena por fusión no homóloga de extremos

(NHEJ) no requiere cromosoma homólogo

Cuando el corte no es directamente

ligado, Ku se une a los extremos y los

mantiene juntos

Polinucleótido-kinasas y artemis

digieren los extremos hasta encontrar

regiones homólogas

Búsqueda de microhomología

puede resultar en pérdida de material

y deleciones

DNA polimerasas sintetizan parches y

el complejo ligasa IV-XRCC4 restora

la doble cadena

NHEJ es importante antes de la

replicación, pues no utiliza al

cromosoma homólogo como plantilla

and artemis

Reparación de cortes de doble cadena por recombinación homóloga requiere grandes regiones de homología

nucleasa, helicasa

invasión del cromosoma homólogo

síntesis copiando el cromosoma homólogo

síntesis reparando el cromosoma dañado

ligado

resolvasa, ligasa

unión Holliday de hebras cruzadas

5’5’

restitución de la secuencia original









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Entrecruzamientos de cadenas impiden la

replicación, transcripción y segregación.

Psoralenos Mostaza de nitrógeno

endonucleasa 1 (?) corta a un lado del XL

endonucleasa 2 (XPF-ERCC1) corta al otro lado del XL

polimerasa de traspaso repara la mella

NER remueve el fragmento con el XL

Reparación de entrecruzamientos de cadenas durante G1 / G0

(esquema hipotético)

Reparación de entrecruzamientos de cadenas durante la replicación

La DNA polimerasa se detiene al

encontrar cadenas entrecruzadas.

El complejo FA (anemia de

Fanconi) reconoce la lesión y

estabiliza la horquilla de

replicación que retrocede;

endonucleasas Eme1/Mus81

cortan la cadena a un lado del

entrecruzamiento generando un

corte de doble cadena.

La endonucleasa XPF-ERCC1

desengancha el entrecruzamiento.

Síntesis de traspaso: Pol ζ

Recombinación homóloga repara

el corte de doble cadena.

¡no NER!

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