1ª. EXPLICACION DE TRABAJOS PRACTICOS -2007– MICROBIOLOGIA GENERAL- BIOQUIMICA

MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCION

Las bacterias son organismos muy versátiles. Presentan un gran potencial en su capacidad de utilizar disitntas fuentes de alimentos, desde sustancias inorgánicas hasta materias orgánicas sumamente complejas. Muchas especies han aprendido a crecer en una amplia diversidad de nichos ecológicos con temperatura, acidez o tensiones de oxígeno extremas.

Es muy difícil estudiar microorganismos en forma individual; lo más práctico es trabajar con poblaciones de los mismos. Para lograr estas poblaciones es necesario disponer de un medio artificial que brinde a los microorganismos todos los requerimientos nutricionales para desarrollarse. Este ambiente artificial se denomina MEDIO DE CULTIVO.

* MEDIO DE CULTIVO es toda preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que suministra al microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de energía y condiciones ambientales adecuadas para la síntesis y mantenimiento de su protoplasma.

CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de cultivo.Los cultivos pueden ser:a) puros o axénicos, cuando la población está constituida por una única clase de microorganismos.b) mixtos, cuando la población está constituida por más de una clase de microorganismos.

En la actualidad, la mayoría de los gérmenes patógenos se pueden cultivar fuera de su hábitat natural. Ciertos parásitos obligados como las Rickettsias, nunca han podido cultivarse en medios artificiales; requieren células vivas, cultivos de tejidos o embriones de pollo.

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS SEGÚN LA FUENTE DE ENERGIA Y CARBONO QUE UTILIZAN

Al diseñar un medio de cultivo es importante conocer los requerimientos de energía y carbono de las especies a cultivar.

- Fuente de energia , puede ser:

- luz: energía luminosa que se convierte en energía química. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energía se denominan fototrofos.

- reacciones de oxido-reducción a partir de compuestos químicos inorgánicos u orgánicos. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energía se denominan quimiotrofos.

Todos los organismos requieren una fuente de energía para obtener ATP y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los siguientes metabolismos:

- respiración aerobia : aceptor final de electrones O2

- respiración anaerobia: aceptores finales de electrones: NO3-,

SO4=, CO2, fumarato

- fermentación : conjunto de reacciones donde compuestos orgánicos sirven como donadores y receptores de electrones. Se produce ATP por fosforilación a nivel de sustrato.

- Fotosíntesis

- Fuente de carbono , puede ser: - CO2: los microorganismos que utilizan esta fuente de carbono se denominan autotrofos.

- compuestos orgánicos carbonados (azúcares, aminoácidos, ácidos grasos, etc). Los microorganismos que utilizan estas fuentes de carbono se denominan heterotrofos.

De la combinación de estas categorías surge la sig. clasificación de microorganismos:

Fuente de energía Fuente de carbono CategoríaEjemplos

Luz CO2 Fotoautotrofos Algas,cianobacterias

acetato FotoheterotrofosAlg. bacterias

Reacciones CO2 QuimiolitotrofosBacterias oxidantes de

de óxido-reducción H2, del azufre, de Fe2+

compuestos orgánicos QuimioorganotrofosHongos, bacterias

Fotoautotrofos = fotolitotrofosFotoheterotrofos = fotoorganotrofos

COMPOSICION QUIMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cuando se diseña la fórmula del medio de cultivo, es necesario conocer en qué categoría está incluido el microorganismo a cultivar para elegir acertadamente los componentes del medio: generalmente compuestos inorgánicos para microorganismos fototrofos y quimiolitotrofos, y orgánicos para quimioorganotrofos.

Un medio de cultivo está integrado por:1. Elementos energéticos y constitutivos:

a) Macroelementos (g/l): Fuente de carbono : puede ser CO2 ó compuestos carbonados

orgánicos. Se utilizan en la construcción de innumerables moléculas necesarias para la célula. Los hidratos de carbono se consideran fuente de carbono y energía por excelencia en los quimioorganotrofos. Los más comunes son:

- hexosas como glucosa, fructosa, galactosa; - pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa; - disacáridos como lactosa, sacarosa, maltosa; - trisacáridos como rafinosa; - polisacáridos como almidón, glucógeno; - alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y - glucósidos como salicina, y esculina.

Fuente de nitrógeno: muchos organismos son autotrofos respecto de la fuente de nitrógeno y pueden crecer utilizando moléculas sencillas como NO3

-, NH3 ó N2. El nitrógeno es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de pared. Otros microorganismos pueden incorporar nitrógeno en forma de aminoácidos, bases púricas o pirimídicas.** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el aporte de nitrógeno es realizado por las peptonas, que son los productos de la hidrólisis ácida o enzimática de proteínas de origen animal o vegetal (carne, soja, caseína, gelatina,

harina de maíz y girasol). Esos productos de hidrólisis pueden tener longitud variable, desde aminoácidos, hasta dipéptidos, tripéptidos, polipéptidos, albumosas, proteosas.La hidrólisis ácida puede ser realizada con HCl ó H2SO4 y presenta las siguientes desventajas:

- el triptofano se destruye- se pierde el 10% de vitaminas presentes- desaparecen casi completamente los polipéptidos

Se prefiere la hidrólisis enzimática que emplea diferentes proteasas actuando a pH específicos, ej. papaína a pH 6.5, tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2.Las peptonas son fuente de nitrógeno y, en ausencia de hidratos de carbono en el medio de cultivo complejo, cumplen la función de fuente de carbono y energía. Aportan vitaminas del grupo B, trazas de metales y fosfatos que dan carácter “buffer” al medio. Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos fermentables.

Fuente de fósforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o potasio que también confieren poder buffer al medio de cultivo (pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de cultivo, el aporte de P es realizado por los glicerofosfolípidos de la yema. El fósforo se incorpora a ácidos nucleicos, fosfolípidos, polímeros de membrana, ATP, y sustancias de reserva (gránulos de volutina)

Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o metionina.

En la célula se incorpora a aminoácidos y diferentes coenzimas.

Fuente de calcio, magnesio y potasio : potasio, calcio y magnesio se adicionan como sales inorgánicas. Son cationes que estabilizan macromoléculas aniónicas. K+ actúa como coenzima y estabilizador de RNA. Mg2+ se integra a colorofila en organismos fotosintéticos. Ca2+ abunda en esporas como dipicolinato de calcio.

Fuente de sodio: sodio contribuiría a equilibrar la presión osmótica del medio extracelular. Es un catión requerido por bacterias halofílicas. Se suele suministrar como NaCl.

b) Microelementos o trazas (mg ó ug/ml): suelen estar naturalmente presentes como contaminantes de los macroelementos. * Frecuentemente esenciales:

Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulación.

Fe: cofactor de enzimas para la función respiratoria en citocromos, catalasa y flavoproteínas. En adecuada concentración favorece la síntesis de toxina diftérica.

Co: interviene en la síntesis de vitamina B12.Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena respiratoria.

Esenciales en casos especiales : B, Al, Si, V, As, Se, Mo, Sn, Be, F, etc.

Inhibidores del crecimiento : Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y cualquier microelemento a concentración mayor que 10-4 M puede resultar tóxico para el desarrollo de los microorganismos.

2. Factores de crecimientoSon compuestos orgánicos específicos requeridos en muy

bajas concentraciones que no pueden ser sintetizados por la célula que los necesita. Por esta razón, deben ser agregados al medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B, algunos aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos. Hay ejemplos clásicos como los factores X y V (porfirinas) de la sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para crecer. El suero fetal bovino, que aporta numerosos factores de crecimiento, es imprescindible para el cultivo de células animales.Cómo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La capacidad de sintetizar un compuesto esencial está relacionada con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genéticas, alguna enzima de la secuencia no puede ser sintetizada, la serie de reacciones se bloquea en algún paso y no finaliza con éxito. El compuesto que por esta razón dejó de sintetizarse, se convierte en un factor de crecimiento.** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los factores de crecimiento pueden ser aportados por diversos extractos:-Extracto de carne: su función es ser complemento vitamínico de las peptonas. Pero también aporta sustancias nitrogenadas como: aminoácidos, bases púricas y pirimídicas, ácidos orgánicos, creatina, xantina, hipoxantina, ácido úrico, urea, y sustancias no nitrogenadas como glucógeno, fosfatos de hexosas, ácido láctico, sales inorgánicas. La calidad de este tipo de extracto varía con la carne empleada, el tiempo y la temperatura de extracción.-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de las células de levadura. Su función es ser suplemento vitamínico

de las peptonas, pero también aporta mezclas de aminoácidos y péptidos, y carbohidratos.-Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de levadura ya que posee adecuado contenido de vitaminas, carbohidratos y aminoácidos. Es el extracto soluble en agua de la malta de cebada.

3. Agentes solidificantes Su agregado al medio de cultivo es opcional. El más usado:

- el agar, es un polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato cada 10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en pequeñas concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de composición química estrictamente definida destinados a autotrofos. Se usa sin problemas en medios de cultivo complejos para quimioorganotrofos. Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia sólida normal, al 0.2-0.3% en medios semisólidos o blandos, al 5% en medios de consistencia muy firme para detener el crecimiento de gérmenes muy móviles, y al 0% cuando se preparan medios líquidos (caldos).Sus características:

- Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C.- A 45-55°C se pueden agregar suspensiones de células sin afectar

la viabilidad (supervivencia) de las mismas.- Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la

mayoría de las bacterias patógenas del hombre.- No es tóxico para las bacterias, ni es degradado por éstas.- Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias

(poblaciones de microorganismos derivadas de una única célula), lo que resulta imposible en medios líquidos!

- Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.- Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para

permitir la difusión de los nutrientes del medio de cultivo en todas direcciones, y suficientemente cerrada –según la concentración empleada- para impedir la movilidad de los microorganismos.

Otros solidificantes:- Agarosa : es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa

intensamente para fines específicos en Inmunología y Biología Molecular.

- Silicagel : es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de cultivo para autotrofos, cuando debe excluirse materia orgánica del medio de cultivo.

- Gelatina : es una proteína obtenida por hidrólisis del colágeno. Fue el primer solidificante usado en Microbiología, pero es degradado por la mayoría de las bacterias (lo comen, por lo que el medio inicialmente sólido termina convertido en medio líquido) y la temperatura de incubación no puede ser mayor a 22°C (es el punto de fusión) con lo que cultivos sólidos a temperaturas más altas resultan inviables.

- Albúmina de huevo, suero : a 80°C estas proteínas coagulan y solidifican el medio de cultivo.

4. AguaEl agua representa una altísima proporción (80-90%) del peso total de una célula y es fundamental para la realización de todos los procesos metabólicos, funciones enzimáticas, solvatación de materiales orgánicos e inorgánicos, donación de electrones para organismos fotosintéticos. Los medios de cultivo se preparan en el laboratorio con agua destilada lo que estandariza su composición y asegura la ausencia de iones como Ca2+ y Mg2+

que pueden precipitar con fosfatos o generar reacciones indeseables.

CONDICIONES FISICAS DE UN MEDIO DE CULTIVO

Aún cuando las condiciones químicas del medio de cultivo estén cubiertas, el crecimiento y desarrollo de los microorganismos no tendrá lugar si se desconocen las siguientes condiciones físicas:

- temperatura: cada especie tiene su temperatura óptima de crecimiento.

* mesófilos: 35-37°C* psicrófilos: 15-20°C* termófilos: 50-60°C

-presión osmótica: la mayoría de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl. Las halófilas requieren concentraciones superiores.-presencia de oxígeno: según sus requerimientos de O2 las bacterias se clasifican en:

* aerobios estrictas: requieren oxígeno para crecer. Metabolismo respiratorio.

* microaerófilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una atm enriquecida en CO2. Pueden

realizar respiración aerobia. *anaerobios obligados: el O2 les resulta tóxico. Crecen en medios muy reducidos (sin O2).

Metabolismo fermentativo.* anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2

(metabolismo fermentativo) y cuando son expuestos al O2 no mueren.

*anaerobios facultativos: pueden crecer en condiciones aerobias (metabolismo respiratorio)

como anaerobias (metabolismo fermentativo).

-humedad: todas bacterias necesitan un ambiente mucho más húmedo para su desarrollo que los hongos. En condiciones ambientales adversas, algunas especies producen estructuras de resistencia a la desecación llamadas esporas que permanecen viables durante tiempo prolongado hasta que el ambiente sea propicio para la germinación. Producen esporas los géneros Clostridium (ej. C. tetani,, C. botulinum), Bacillus (ej. B. cereus, B. subtilis), Sporosarcina, entre otros. - luz: es importante para los microorganismos fotosintéticos.-pH: la mayoría de las bacterias crece en medio neutro o ligeramente alcalino (7 – 7.6). Excepciones son los lactobacilos (pH 5, acidófilos), Vibrio cholerae (pH 8.6,). Los hongos crecen a pH menor que 7.

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

a) Por su consistencia (esto depende de la inclusión o no de un agente solidificante)

-líquidos (no permiten el aislamiento de colonias) -sólidos (permiten el aislamiento y observación de

colonias)

b) Por su origen (esto depende de que la fórmula se pueda describir químicamente con precisión)

-sintéticos: estrictamente definidos desde el punto de vista químico, generalmente

se usan para cultivar fototrofos y quimiolitotrofos.

-naturales o complejos: se preparan a partir de sustancias naturales de origen ani-

mal o vegetal de composición química no rigurosamente

constante: leche, suero, macerado de maíz, peptonas, ex

tractos de carne, levadura. Son aptos para el cultivo de

quimioorganotrofos. Son los que prepararemos y usaremos en el Laboratorio de Microbiología.

c) Por su composición: - comunes: incluyen una fórmula nutritiva básica que permite el crecimiento de microorganismos poco exigentes.

- enriquecidos: mejoran su calidad nutritiva por el agregado de componentes muy ricos como leche, sangre, huevo, líquido ascítico, extracto proteico de cianobacterias. Se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes.

d) Por su función: - Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que sembrados con poblaciones mixtas de microorganismos, favorecen la multiplicación de ciertos grupos e inhiben el desarrollo de las especies restantes. Para funcionar de esta manera incluyen compuestos químicos específicos o requieren condiciones físicas especiales (temperatura, pH).Ej.: agua peptonada alcalina favorece el desarrollo de Vibrio cholerae tolerante a pH alto e inhibe otros microorganismos presentes en la misma muestra; caldo selenito contiene selenito de sodio que favorece la proliferación de especies como Salmonella y Shigella pero inhibe otras enterobacterias; caldo EC a 44.5°C, una temperatura que favorece a Escherichia coli y no a otras bacterias.

- Medios selectivos: son medios sólidos que de manera parecida a los anteriores, permiten el desarrollo de ciertos microorganismos e impiden el desarrollo de otros. La selectividad se logra alterando las condiciones físicas del medio de cultivo o agregando compuestos químicos inhibidores. Ej:- cambiando pH: para favorecer el desarrollo de Lactobacillus, un género implicado en la producción de yogur, se puede agregar ácido acético a los medios de cultivo para obtener un pH final de 5.4, totalmente inadecuado para muchas bacterias acompañantes. - altas concentraciones osmóticas: en agar manitol salado con una concentración de NaCl de 7.5% muy pocas bacterias pueden crecer, salvo las que presenten una elevada tolerancia a NaCl, como Staphylococcus aureus

- agregando antisépticos: colorantes como verde brillante, cristal violeta y eosina, se utilizan para inhibir gérmenes Gram positivos mientras los Gram negativos desarrollan sin dificultad. Las sales biliares se usan con el mismo propósito.- agregando antibióticos: en Ingeniería Genética es práctica rutinaria la inclusión de antibióticos (ampicilina, tetraciclina) en los medios de cultivo para poner en evidencia la presencia de bacterias genéticamente manipuladas. Estas células son resistentes a uno o más antibióticos y pueden desarrollar en un medio que los incluye, mientras las células acompañantes, sensibles a los antibióticos, no pueden crecer. En Microbiología Clínica, se usan antibióticos de espectro de acción reducido que inhiben o destruyen microorganismos cuyo estudio no interesa, a la vez que no afectan los gérmenes que se están investigando.

-Medios diferenciales: permiten demostrar características metabólicas de un determinado grupo de microorganismos. Por ej.: puede el germen A utilizar glucosa por una vía fermentativa? Si agregamos glucosa a un medio de cultivo sólido y un indicador de pH que indique por cambio de color si el azúcar ha sido fermentado o no, estaremos analizando una característica metabólica de A. Existen medios diferenciales donde se pueden detectar varias características metabólicas distintas. La clave es incluir en la fórmula del medio de cultivo a usar: , el sustrato adecuado para la característica metabólica que se desea estudiar y un sistema indicador que refleje por variación de color u otro fenómeno perceptible, los cambios que hayan tenido lugar. Las pruebas bioquímicas que veremos en los Trabajos Prácticos son claros ejemplos de medios de cultivo diferenciales.

-Medios de transporte: se usan cuando se transcurre cierto tiempo entre la toma de una muestra y su procesamiento. Incluye compuestos que aseguran la supervivencia de las células hasta que sean sembradas en un medio de cultivo adecuado.

IMPORTANTE: un gran número de medios de cultivo tienen funciones mixtas. Ej.: puede ser enriquecido porque lleva sangre y selectivo porque incluye algún antibiótico. Puede ser selectivo porque incluye inhibidores y diferencial porque pone en evidencia propiedades metabólicas.

EJERCICIOS DE APLICACIÓN

1. Para un microorganismo fotoautotrofo mencione qué componentes tendría en cuenta para diseñar un medio de cultivo químicamente definido o sintético que incluye:

- fuente de carbono:- fuente de energía:- fuente de nitrógeno:

2. Para un microroganismo quimioorganotrofo qué componentes tendría en cuenta para diseñar un medio de cultivo complejo o químicamente indefinido que incluye:

- fuente de carbono:- fuente de nitrógeno:- fuente de energía:

3. En el Trabajo Práctico tendremos ocasión de preparar algunos de los siguientes medios de cultivo:a) Caldo nutritivo

Extracto de carne………. 0.3 g a.1. Qué aporte realiza cada componente?

Peptona de carne ………. 0.5 g a.2. Si no hay hidratos de carbono, qué componente aporta C?

NaCl ……………………………. 0.5 g a.3 Cuál es la fuente de energía en el medio de cultivo?

Agua destilada…………. 100 ml a.4. Clasifique este medio por su consistencia, origen y composi-

pH: 7- 7.2 ción. Qué clase de microorganismos –según fuente de C y

energía- crecerían en él?b) Agar nutritivo

Extracto de carne………. 0.3 g b.1. Qué aporte realiza cada componente?

Peptona de carne ………. 0.5 g b.2. Qué componente aporta los factores de crecimiento?

NaCl ……………………………. 0.5 g b.3 Cuál es la fuente de energía en el medio de cultivo?

Agar ………….………………… 1.5 g b.4. Clasifique este medio por su consistencia, origen y composi-

Agua destilada……………. 100 ml ción. Qué clase de microorganismos –según fuente de C y

pH: 7 -7.2 energía- crecerían en él?

c) Medio BW3

K2HPO4 ……………... 0.25 g c.1. Mencione fuente de carbono y fuente de nitrógeno

CO2 …………………… burbujeo constantec.2 Cuál sería la fuente de energía?

MgSO4 ……………... 0.0375 g c.3. Por su consistencia y su origen, cómo clasificaría este medio?

Na2MoO4…………... 2.5 x 10-3 g c.4. Para qué clase de gérmenes –según fuente de C y de energía-

NaVO3 …………….. 1.24 x 10-4 g sería adecuado?KNO3 …………………. 1 gAgua destilada…… 1000 ml

d) Cuál de los siguientes componentes agregaría a un medio de cultivo común para convertirlo en un medio enriquecido?

- agua destilada -penicilina -suero fetal bovino -colorantes

- sangre de oveja -leche -extracto proteico de cianobacterias

-sales biliares -antisépticos -yema de huevo-agar

e) Se desea propiciar el desarrollo de un grupo A de microorganismos quimioorganotrofos, acidófilos y resistentes a penicilina, incluidos en una población mixta formada por los grupos A, B y C. Los grupos B y C pertenecen a flora acompañante. e.1. Qué medio de cultivo sería más adecuado para lograr ese propósito? (marque la/s respuesta/s correcta/s)

- un medio de transporte - un medio enriquecido-un medio de enriquecimiento - un medio selectivo-un medio sólo diferencial

e.2. Diseñe un medio de cultivo complejo semisólido que incluya una fuente de C, una fuente de energía, una fuente de N y factores físicos y/o químicos que favorezcan sólo el desarrollo del grupo A.