Mejora u optimizacion de la aptitud (capacidad) microbiana en el intestino mamfero por metagenmica funcional temporal in vivo.Resumen.Dilucidar las funciones de los genes microbianos comensales en el intestino de mamferos es un reto, ya que muchos comensales son recalcitrantes (o reacios) al cultivo en laboratorio y a su manipulacin gentica. Presentamos la secuenciacin metagenmica funcional temporal (TFUMseq), una plataforma para minar funcionalmente (extraer datos de manera funcional de) genomas bacterianos, genes que contribuyan a la aptitud de las bacterias comensales in vivo. Nuestro enfoque utiliza metagenmica ADN para construir bibliotecas de expresin heterlogas a gran escala que son monitorizadas in vivo en el transcurso del tiempo, mediante secuenciacin profunda y mtodos computacionales. Para demostrar nuestro enfoque, hemos construido una biblioteca de plsmidos TFUMseq utilizando Bacteroides thetaiotaomicron comensales de intestino (Bt), y se introdujo en ratones libres de grmenes Escherichia coli los cuales transportaban esta biblioteca. La dinmica de poblaciones de la biblioteca de clones revel genes de Bt confiriendo ventajas de aptitud significativas en E. coli en el transcurso del tiempo, incluyendo genes de utilizacin de hidratos de carbono, con una galactoquinasa Bt primordial para la colonizacin temprana, y el dominio posterior de una glicsidasa Bt permitiendo el metabolismo de la sacarosa acoplada con la co-evolucin de la biblioteca del plsmido y el genoma de E. coli llevando a una mayor utilizacin de la galactosa. Nuestros resultados ponen de relieve la utilidad de la metagenmica funcional para la ingeniera de bacterias comensales con propiedades mejoradas, incluyendo la capacidades ampliadas de colonizacin in vivo.Introduccin.El tracto gastrointestinal de mamferos (GI) es un entorno hostil para los microbios mal adaptados. Sin embargo, diversos grupos de microbios han evolucionado para prosperar en el tracto gastrointestinal, en el marco de la intensa competencia entre especies, factores estresantes fsicos y qumicos, y el sistema inmune del husped (Ley et al, 2006; Dethlefsen et al, 2007). Estos microorganismos tambin soportan las funciones homeostticas normales del husped, ayudando a extraer nutrientes, estimular el sistema inmune, y proporcionan proteccin contra la colonizacin por patgenos (Stappenbeck et al, 2002; Hooper, 2004; Bckhed et al, 2005; Gill et al, 2006; Ley et al, 2006). La secuenciacin de nueva generacin ha permitido estudios sistemticos de la microbiota de los mamferos, y se han hecho grandes avances en la caracterizacin de la estructura de las comunidades bacterianas y su potencial gentico in vivo. Por ejemplo, el Proyecto Microbioma Humano (HMP) (Turnbaugh et al, 2007; Peterson et al, 2009; Huttenhower et al, 2012) y MetaHIT (Qin et al, 2010) han generado mapas de abundantes especies bacterianas a lo largo de todo el cuerpo humano, genomas de referencia y catlogos de ms de 100 millones de genes microbianos ensambladas a partir de Shotgun Sequencing (Secuenciacion Escopeta o Clonacion Escopeta) de comunidades in vivo. Aunque estos estudios han generado grandes cantidades de datos descriptivos, las funciones de la mayora de los genes bacterianos en estas colecciones siguen siendo pobremente caracterizadas o totalmente desconocidas.Los mtodos tradicionales para caracterizar las funciones de los genes microbianos requieren el aislamiento, cultivo, y la introduccin de ADN extrao en un organismo receptor. Sin embargo, se estima que el 60-80% de las especies de microbiota asociada a mamferos permanecen sin cultivar (Walker et al, 2014). Incluso despus del cultivo xitoso y la introduccin de material gentico en un microorganismo, el ADN debe integrarse en el genoma microbiano o mantenerse epismicamente. Esto requiere conocidos sistemas de replicacin compatibles y de restriccin-modificacin, que pueden no ser factibles para muchos microbios. Si se pueden superar estas barreras, se pueden emplear mtodos de bajo rendimiento estndar para la caracterizacin funcional de genes, o nuevos enfoques tales como mutagnesis de transposones podran acoplarse con la secuenciacin de nueva generacin. En este ltimo mtodo, posiciones aleatorias en el genoma se interrumpen con un transposn que contiene un marcador seleccionable; la biblioteca resultante se somete a condiciones de seleccin y secuenciado profundo para determinar mutantes enriquecidos y empobrecidos (Van Opijnen et al, 2009). Una limitacin de esta tcnica es que los genes esenciales o aquellos que son importantes para la aptitud de clulas son difciles de analizar, ya que la inactivacin de estos genes por mutagnesis de transposones sera letal para el organismo en estudio. Una restriccin adicional es que el transposn mutagnico puede alterar la expresin de genes testigo que estn cerca del locus relevante, lo que provoca efectos fenotpicos contradictorios.Aqu, empleamos un enfoque alternativo, mediante la construccin de bibliotecas de expresin escopeta a gran escala que pueden conferir ganancia de funcin en la cepa bacteriana receptora. Nuestro mtodo utiliza fraccionamiento fsico o digestin restrictiva del ADN donante para generar fragmentos que se clonan en un vector de expresin y se transformaron en la cepa receptora, para un rastreo funcional de alto rendimiento e identificar los genes que confieren una ventaja en la aptitud en un contexto particular. Este enfoque tiene la ventaja de que el organismo donante no tiene que ser fcilmente cultivable o genticamente manipulable en el laboratorio; Adems, permite la investigacin de genes esenciales o genes que confieren una sinrgica ventaja en la aptitud con el organismo receptor. La metagenmica funcional utilizando muestras ambientales se provo por primera vez en comunidades derivadas de materias primas lignocelulsicas (Healy et al, 1995), el agua de mar (Stein et al, 1996), y el suelo (Rondon et al, 2000). El uso de bibliotecas escopeta para la metagenmica funcional de la microbiota asociada con mamferos se ha demostrado ex vivo, como por el aumento de la biblioteca en medios con diferentes sustratos para caracterizar enzimas activas de hidratos de carbono (Tasse et al, 2010), metabolismo prebitico (Cecchini et al, 2013), actividad glucuronidasa (Gloux et al, 2011), tolerancia a la sal (Culligan et al, 2012), y genes de resistencia a antibiticos (Sommer et al, 2009), o mediante el uso de lisado filtrado de la biblioteca para detectar la modulacin de seal en cultivos de celulas de mamferos (Lakhdari et al, 2010). Este enfoque de la biblioteca escopeta metagenmica an no se ha llevado a cabo a gran escala in vivo.Para demostrar nuestro enfoque de secuenciacin metagenmica funcional temporal (TFUMseq), se utiliz fragmentos genticos de alta cobertura del genoma del comensal Bacteroides thetaiotaomicron (Bt) de intestino humano , secuenciado en su totalidad (Xu et al, 2003) y se clonaron los fragmentos en una biblioteca de plsmido en una cepa K-12 de Escherichia coli. Elegimos Bt porque es una cepa comensal comn en el intestino humano que persistentemente coloniza y posee un repertorio amplio y bien caracterizado de las actividades catablicas, tales como la deteccin de polisacridos y la reorientacin del metabolismo para buscar alimento en el husped versus suplemento con glicanos (Sonnenburg et al, 2005 ; Bjursell et al, 2006; Martens et al, 2008). Sometimos la biblioteca TFUMseq a presiones selectivas in vitro e in vivo, se recogio muestras de salida en diferentes tiempos (temporal) para la secuenciacin de alto rendimiento, y utilizamos mtodos computacionales para reconstruir la dinmica de poblaciones de clones que albergan genes donantes (Fig 1). Nuestro trabajo es un avance sobre los estudios anteriores en dos aspectos principales. En primer lugar, a nuestra comprension, nuestro estudio es el primero en emplear bibliotecas de expresin escopeta para metagenmica funcional in vivo. Las caractersticas importantes del intestino de los mamferos son difciles de recapitular in vitro, tales como la respuesta inmune del husped. Por lo tanto, los experimentos in vivo son esenciales para investigar la funcin de los genes de la microbiota comensal en el husped. En segundo lugar, nuestro estudio aprovecha la secuenciacin de alto rendimiento y mtodos computacionales para generar dinmicas detalladas de toda la poblacin sometidas a seleccin con el tiempo. Esta informacin cintica es crucial para la comprensin de la secuencia de eventos durante los procesos dinmico inherentes y complejos de la colonizacin del huesped.MATERIALES y METODOS.Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento.Se cultiv anaerbicamente Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 (ATCC # 29148) en un medio rico basado en infusin de cerebro-corazn con otros suplementos aadidos (ver Materiales y Mtodos complementarios). La biblioteca genmica se mantuvo en una cepa K-12 de Escherichia coli, NEB Turbo (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.). Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas en caldo Luria (LB) y se suplement con carbenicilina (concentracin final 100 g/ml) segn lo necesario. Para el crecimiento anaerobio, se utiliz un recipiente anaerbico (Sistema GasPak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se preparo comida para ratn filtrado (MC) aadiendo 150 ml de agua desionizada a 8 g de comida para ratones triturado (Dieta de Cra de Ratn 5021, LabDiet, St. Louis, MO, EE.UU.). La mezcla se calent a 95 C durante 30 min con agitador, pasado por un filtro de 0,22-m, y en autoclave. La esterilidad del filtrado MC se confirm mediante la incubacin a 37 C en condiciones aerbicas y anaerbicas y sin observar ningn crecimiento despus de varios das.Generacin de la Biblioteca.Se aisl el ADN genmico de Bacteroides thetaiotaomicron (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, Venlo, Pases Bajos), fragmentado por sonicacin a 3-5 kb (Covaris E210, Covaris, Woburn, MA, EE.UU.), y seleccionados por tamao y extrado por electroforesis en gel (Pippin Prep, Ciencias Sage). Los fragmentos fueron reparados en sus extremos (kit End-It End-Repair ADN , Epicentro, Madison, WI, EE.UU.) y se clonaron en un vector soporte GMV1c amplificado por PCR mediante la ligadura de extremo romo. La reaccin se transform en NEB clulas Turbo electrocompetentes E. coli (New England Biolabs). El tamao de la biblioteca se cuantific contando colonias formadas en un medio selectivo (LB carbenicilina) despus de sembrar una fraccin de las clulas transformadas. Para evaluar el tamao de los insertos clonados con xito en la biblioteca, elegimos colonias para amplificacin por PCR utilizando cebadores ver2_f / r (Tabla S2) que flanqueaban el sitio de insercin. Adems, se confirm la presencia de insertos mediante la presentacin de los insertos amplificados por secuenciacin de Sanger (GENEWIZ, South Plainfield, Nueva Jersey, EE.UU.) y alineado de secuencias con el genoma donante de B. thetaiotaomicron. Un protocolo ms detallado se incluye en Materiales y Mtodos Complementarios.Retencin del plsmido.Grnulos individuales de heces de 0,75, 1,5, 1,75, 2,5, 4, 10, 14, 21, 25, 28 Das se homogeneizaron en PBS al 10% y se sembraron en agar LB con o sin carbenicilina (carb). Para obtener recuentos exactos, se realizaron plaqueos de colonias por triplicado y se repitieron a diluciones 100x si las placas estaban sobrecubiertas. La retencin del plsmido se calcula como el nmero de colonias crecidas en placas de LB-carb dividido por el nmero de colonias que crecen en placas de LB slo.seleccin in vitro.Despus de la inoculacin de la biblioteca en caldo LB o MC, los cultivos se pasaron por dilucin 20 veces en medio fresco. Los cultivos LB se cultivaron en condiciones aerbicas con agitacin y pasadas todos los das durante 2 semanas. Los cultivos MC se hicieron crecer en condiciones anaerbicas sin agitacin y se pasaron cada 2 das durante 2 semanas, ya que los cultivos llevaron ms tiempo para llegar a la saturacin comparada con la condicin LB.(pasar o pases: Proceso de pasar o mantener um grupo de microorganismos o celulas a travez de una serie de cultivos o huespedes.)seleccin in vivo.Todos los ratones utilizados en este estudio fueron manejados de acuerdo con los protocolos aprobados por el rea Mdica del Comit Permanente de Harvard sobre Animales (HMA IACUC). fueron utilizados ratones machos C57BL/6 , 6-8 semanas de edad. Los animales fueron criados en el Centro para la metagenmica Clnica y Traslacional mantenidos en condiciones libres de grmenes antes de los experimentos. Los ratones libres de germenes fueron alimentados via oral con ~2 108 UFC de bacterias en un volumen de 200 l en el da 0. Los ratones que recibieron la biblioteca fueron enjaulados individualmente en un aislador gnotobiticos. Los ratones de control se mantuvieron en una sola jaula en un aislador gnotobiotico separado. los pellets fecales se recogieron en 0,5, 0,75, 1,5, 1,75, 2,5, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 25, y 28 das despus de la inoculacin y se almacenaron a -80 C en 10% de tampn PBS.PCR de colonias y secuenciacin Sanger.Las colonias individuales fueron aisladas a partir de muestras de heces trazados sobre agar LB con carbenicilina (100 mg / ml). Las colonias se cultivaron durante la noche a 37 C en una placa de 96 pocillos con 200 l de LB + carbenicilina. 0,8 l del cultivo fue aadido a un volumen PCR total de 20 l. La mezcla de PCR (kit KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, EE.UU.) contena cebadores ver2_f/r (Tabla S2) que flanqueaba el sitio de insercin. Los amplicones PCR se sometieron a secuenciacin (GENEWIZ), y la secuencia de insercin se mapeo de nuevo al genoma B. thetaiotaomicron utilizando BLASTn. Los primers para el genotipado del locus galK en el genoma de E. coli se enumeran en el cuadro complementario S2. La presencia o ausencia de IS2 en galK se confirm usando cebadores galK16_chk_f/r que flanqueaba el sitio de insercin esperado en galK.Extraccin de ADN y la amplificacin por PCR de insertos para la secuenciacin Illumina.Se extrajo el ADN de las muestras recogidas en el experimento in vitro utilizando el kit DNeasy Tissue & Blood (Qiagen). Los insertos fueron amplificados por PCR utilizando primers ver2_f / r (Tabla S2) en mezcla KAPA HiFi HotStart (Kapa Biosystems) y se purific con perlas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, EE.UU.) en una relacin volumtrica perlas:muestra de 0,5 : 1. Los amplicones se prepararon para la secuenciacin usando el kit Nextera (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.). Para todas las muestras fecales desde el experimento in vivo, se utiliz el Mini kit de heces QIAamp DNA (Qiagen). El ADN aislado se digiri con enzimas AvrII y PspXI (New England Biolabs) antes de la purificacin con el kit de purificacin QIAquick PCR (Qiagen) y posterior amplificacin por PCR con cebadores A_L y A_R (Tabla S2) en KAPA HiFi HotStart Mix. El PCR se purific con perlas de AMPure en una relacin volumtrica perlas:muestra de 0.5:1. Un protocolo detallado est incluido en los materiales y mtodos complementarios.