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METODOLOGÍA Y TÉCNICAS DE TRABAJO EN EL

LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA. ERRORES FRECUENTES Y SU SOLUCIÓN

Título original: Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio de Patología Anatómica.

Errores frecuentes y su solución Autores: Francisco Javier Torres Gómez, Facultativo Especialista del Área de Anatomía Patológica

Antonia Martínez Moyano, T.S.S. de Anatomía Patológica y Citología Pilar Fernández Machín, Facultativo Especialista del Área de Anatomía Patológica Rocío González Rodríguez, T.S.S. de Anatomía Patológica y Citología

Edita e imprime: FESITESS ANDALUCÍA C/ Armengual de la Mota 37 Oficina 1 29007 Málaga Teléfono/fax 952 61 54 61 www.fesitessandalucía.es

Diseño y maquetación: Alfonso Cid Illescas Edición Octubre 2011

ÍNDICE

UNIDAD DIDÁCTICA I PRESENTACIÓN Y METODOLOGÍA DEL CURSO 5 1.1 Sistema de Cursos a Distancia 7 1.2 Orientaciones para el estudio 8 1.3 Estructura del Curso 10 UNIDAD DIDÁCTICA II FAMILIARIZACIÓN CON EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA. 13 2.1 Familiarización con el Laboratorio de Anatomía Patológica 15 2.2 La muestra 16 UNIDAD DIDÁCTICA III HISTOTECNOLOGÍA. TÉCNICAS TINTORIALES 19 3.1 Histotecnología. Introducción 21 3.2 Tipos de coloraciones 22 3.3 Técnicas tintoriales 22 3.4 Tipos de coloraciones del tejido conjuntivo 28 3.5 Coloraciones para material amiloide 37 3.6 Técnicas para la identificación de glucógeno 40 3.7 Técnica de tinción para mucina 42 3.8 Técnicas para la identificación de fibrina 43 3.9 Técnicas para la identificación de grasas 44 3.10 Técnicas para la identificación de pigmentos e iones metálicos 47 3.11 Técnica para la detección de iones cálcicos 48 3.12 Técnicas para la identificación de microorganismos 49 UNIDAD DIDÁCTICA IV EL PAPEL DEL TEAP EN EL PROCESADO DE LIQUIDOS 53 4.1 Introducción 55 4.2 Procesamiento de líquidos 55 4.3 Obtención de un botón celular 57 UNIDAD DIDÁCTICA V PAPEL DEL TEAP EN LA CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES HISTOLÓGICOS 59 5.1 Papel del TEAP en la confección de los bloques histológicos 61 UNIDAD DIDÁCTICA VI PAPEL DEL TEAP EN EL PROCESAMIENTO DE MUESTRAS HISTOLÓGICAS 67 6.1 Introducción 69 6.2 Pasos del procesamiento de las muestras 71 6.3 Posibles errores y soluciones en el procesamiento de las muestras 73 6.4 Corte al mocrotomo 75 UNIDAD DIDÁCTICA VII PAPEL DEL TEAP EN LA SALA DE MACROSCOPÍA 81 7.1 Papel del TEAP en la sala de macroscopía 83 7.2 Parte de tallado 87

UNIDAD DIDÁCTICA VIII PAPEL DEL TEAP DURANTE LA REALIZACIÓN DE PAAF (PUNCIÓN-ASPIRACIÓN CON AGUJA FINA) 89 8.1 Papel del TEAP durante la ralización de PAAF (Punción-aspiración con aguja fina) 91 UNIDAD DIDÁCTICA IX EL TEAP COMO ASISTENTE DEL PATÓLOGO DURANTE LA BIOPSIA INTRAOPERATORIA 95 9.1 El TEAP como asistente del patólogo durante la biopsia intraoperatoria 97 9.2 Posibles errores y sus soluciones 99 UNIDAD DIDÁCTICA X EL TEAP EN LA SALA DE AUTOPSIAS 101 10.1 El TEAP en la sala de autopsias 103 UNIDAD DIDÁCTICA XI EL TEAP Y LAS TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS 107 11.1 EL TEAP y las técnicas inmunohistoquímicas 109 UNIDAD DIDÁCTICA XII PAPEL DEL TEAP EN EL ARCHIVO DE CASOS 115 12.1 Papel del TEAP en el archivo de casos 117 UNIDAD DIDÁCTICA XIII EL TEAP EN EL CONTROL DE LAS TEMPERATURAS 119 13.1 El TEAP en el control de las temperaturas 121 UNIDAD DIDÁCTICA XIV 125 PREVENCIÓN DE RIESGOS LABORALES (PRL) EN EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA 125 14.1 Prevención de Riesgos Laborales (PRL) en el Laboratorio de Anatomía Patológica 127 14.2 Recomendaciones generales para minimizar los riesgos en el Laboratorio 128 14.3 Normas generales de seguridad para el almacenamiento de sustancias químicas 129 14.4 Recomendaciones particulares 132 UNIDAD DIDÁCTICA XV ARTEFACTOS EN PREPARACIONES HISTOLÓGICAS Y CITOLÓGICAS 137 15.1 Artefactos en preparaciones histológicas y citológicas 139 CUESTIONARIO 147 Cuestionario 149

UNIDAD DIDÁCTICA I PRESENTACIÓN Y METODOLOGÍA DEL CURSO

Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución

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Presentación, normas y procedimientos de trabajo. Introducción

Antes de comenzar el Curso, es interesante conocer su estructura y el método que se ha de seguir. Este es el sentido de la presente introducción.

Presentación 1. Sistema de Cursos a Distancia

En este apartado aprenderá una serie de aspectos generales sobre las técnicas de formación que se van a seguir para el estudio.

2. Orientaciones para el estudio.

Si usted no conoce la técnica empleada en los Cursos a Distancia, le recomendamos que lea atentamente los epígrafes siguientes, los cuales le ayudarán a realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario, sólo tiene que seguir los pasos que se indican en el siguiente índice:

Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del proceso de aprendizaje propuesto por el equipo docente.

3. Estructura del Curso

Mostramos cómo es el Curso, las Unidades Temáticas de las que se compone, el sistema de evaluación y cómo enfrentarse al tipo test.

1.1 Sistema de Cursos a Distancia 1.1.1 Régimen de Enseñanza

La metodología de Enseñanza a Distancia, por su estructura y concepción, ofrece un ámbito de aprendizaje donde pueden acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo individual de dedicación, estudio y aprendizaje, a los conocimientos que profesional y personalmente le interesen. Tiene la ventaja de estar diseñada para adaptarse a las disponibilidades de tiempo y/o situación geográfica de cada alumno. Además, es participativa y centrada en el desarrollo individual y orientado a la solución de problemas clínicos.

La Formación a Distancia facilita el acceso a la enseñanza a todos los Técnicos Especialistas/Superiores Sanitarios.

1.1.2 Características del Curso y del alumnado al que va dirigido Todo Curso que pretenda ser eficaz, efectivo y eficiente en alcanzar sus objetivos,

debe adaptarse a los conocimientos previos de las personas que lo estudiarán (lo que saben y lo que aún no han aprendido). Por tanto, la dificultad de los temas presentados se ajustará a sus intereses y capacidades.

Un buen Curso producirá resultados deficientes si lo estudian personas muy diferentes de las inicialmente previstas.

Los Cursos se diseñan ajustándose a las características del alumno al que se dirige.

Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología

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1.1.3 Orientación de los Tutores Para cada Curso habrá, al menos, un tutor al que los alumnos podrán dirigir todas

sus consultas y plantear las dificultades.

Las tutorías están pensadas partiendo de la base de que el aprendizaje que se realiza en esta formación es totalmente individual y personalizado.

El tutor responderá en un plazo mínimo las dudas planteadas a través de correo electrónico exclusivamente.

Diferenciamos para nuestros Cursos dos tipos de tutores:

• Académicos. Serán aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso, planteamientos sobre cuestiones test y casos clínicos. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico.

• Orientadores y de apoyo metodológico. Su labor se centrará fundamentalmente en cuestiones de carácter psicopedagógicas, ayudando al alumno en horarios, métodos de trabajo o cuestiones más particulares que puedan alterar el desarrollo normal del Curso. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico.

1.2 Orientaciones para el estudio Los resultados que un estudiante obtiene no están exclusivamente en función de

las aptitudes que posee y del interés que pone en práctica, sino también de las técnicas de estudio que utiliza. Aunque resulta difícil establecer unas normas que sean aplicables de forma general, es más conveniente que cada alumno se marque su propio método de trabajo, les recomendamos las siguientes que pueden ser de mayor aprovechamiento.

Por tanto, aún dando por supuestas la vocación y preparación de los alumnos y respetando su propia iniciativa y forma de plantear el estudio, parece conveniente exponer algunos patrones con los que se podrá guiar más fácilmente el desarrollo académico, aunque va a depender de la situación particular de cada alumno y de los conocimientos de la materia del Curso:

Decidir una estrategia de trabajo, un calendario de estudio y mantenerlo con regularidad. Es recomendable tener al menos dos sesiones de trabajo por semana.

• Elegir el horario más favorable para cada alumno. Una sesión debe durar mínimo una hora y máximo tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo que se necesita de preparación, mientras que más de tres horas, incluidos los descansos, puede resultar demasiado y descendería el rendimiento.

• Utilizar un sitio tranquilo a horas silenciosas, con iluminación adecuada, espacio suficiente para extender apuntes, etc.

• Estudiar con atención, sin distraerse. Nada de radio, televisión o música de fondo. También es muy práctico subrayar los puntos más interesantes a modo de resumen o esquema.


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a) Fase receptiva.

• Observar en primer lugar el esquema general del Curso.

• Hacer una composición de lo que se cree más interesante o importante.

• Leer atentamente todos los conceptos desarrollados. No pasar de uno a otro sin haberlo entendido. Recordar que en los Cursos nunca se incluyen cuestiones no útiles.

• Anotar las palabras o párrafos considerados más relevantes empleando un lápiz o rotulador transparente. No abusar de las anotaciones para que sean claras y significativas.

• Esquematizar en la medida de lo posible sin mirar el texto el contenido de la Unidad.

• Completar el esquema con el texto.

• Estudiar ajustándose al horario, pero sin imbuirse prisas o impacientarse. Deben aclararse las ideas y fijarse los conceptos.

• Resumir los puntos considerados primordiales de cada tema.

• Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos detenidamente. No insistir de momento más sobre ellos.

b) Fase reflexiva.

• Reflexionar sobre los conocimientos adquiridos y sobre las dudas que hayan podido surgir, una vez finalizado el estudio del texto. Pensar que siempre se puede acudir al tutor y a la bibliografía recomendada y la utilizada en la elaboración del tema que puede ser de gran ayuda.

• Seguir paso a paso el desarrollo de los temas.

• Anotar los puntos que no se comprenden.

• Repasar los conceptos contenidos en el texto según va siguiendo la solución de los casos resueltos.

c) Fase creativa.

En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolución de pruebas de autoevaluación y a los casos concretos de su vivencia profesional.

• Repasar despacio el enunciado y fijarse en lo que se pide antes de empezar a solucionarla.

• Consultar la exposición de conceptos del texto que hagan referencia a cada cuestión de la prueba.

• Solucionar la prueba de cada Unidad Temática utilizando el propio cuestionario del manual.


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1.3 Estructura del Curso 1.3.1 Contenidos del Curso

• Guía del alumno.

• Temario del curso en PDF, con un cuestionario tipo test.

• FORMULARIO, para devolver las respuestas al cuestionario.

• ENCUESTA de satisfacción del Curso.

1.3.2 Los Cursos Los cursos se presentan en un archivo PDF cuidadosamente diseñado en Unidades

Didácticas.

1.3.3 Las Unidades Didácticas Son unidades básicas de estos Cursos a distancia. Contienen diferentes tipos de

material educativo distinto:

• Texto propiamente dicho, dividido en temas.

• Bibliografía utilizada y recomendada.

• Cuestionario tipo test.

Los temas comienzan con un índice con las materias contenidas en ellos. Continúa con el texto propiamente dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la redacción del mismo se evita todo aquello que no sea de utilidad práctica.

El apartado de preguntas test serán con los que se trabajen, y con los que posteriormente se rellenará el FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo test se adjuntan al final del temario.

Cuando están presentes los ejercicios de autoevaluación, la realización de éstos resulta muy útil para el alumno, ya que:

• Tienen una función recapituladora, insistiendo en los conceptos y términos básicos del tema.

• Hacen participar al alumno de una manera más activa en el aprendizaje del tema.

• Sirven para que el alumno valore el estado de su aprendizaje, al comprobar posteriormente el resultado de las respuestas.

• Son garantía de que ha estudiado el tema, cuando el alumno los ha superado positivamente. En caso contrario se recomienda que lo estudie de nuevo.

Dentro de las unidades hay distintos epígrafes, que son conjuntos homogéneos de conceptos que guardan relación entre sí. El tamaño y número de epígrafes dependerá de cada caso.


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1.3.4 Sistema de Evaluación Cada Curso contiene una serie de pruebas de evaluación a distancia que se

encuentran al final del temario. Deben ser realizadas por el alumno al finalizar el estudio del Curso, y enviada al tutor de la asignatura, con un plazo máximo de entrega para que pueda quedar incluido en la edición del Curso en la que se matriculó y siempre disponiendo de 15 días adicionales para su envío. Los tutores la corregirán y devolverán al alumno.

Si no se supera el cuestionario con un mínimo del 80% correcto, se tendrá la posibilidad de recuperación.

La elaboración y posterior corrección de los test ha sido diseñada por el personal docente seleccionado para el Curso con la intención de acercar el contenido de las preguntas al temario asimilado.

Es IMPRESCINDIBLE haber rellenado el FORMULARIO y envío de las respuestas para recibir el certificado o Diploma de aptitud del Curso.

1.3.5 Fechas El plazo de entrega de las evaluaciones será de un mes y medio a partir de la

recepción del material del curso, una vez pasado este plazo conllevará una serie de gestiones administrativas que el alumno tendrá que abonar.

La entrega de los certificados del Curso estará en relación con la fecha de entrega de las evaluaciones y NUNCA antes de la fecha de finalización del Curso.

1.3.6 Aprendiendo a enfrentarse a preguntas tipo test La primera utilidad que se deriva de la resolución de preguntas tipo test es

aprender cómo enfrentarnos a las mismas y evitar esa sensación que algunos alumnos tienen de “se me dan los exámenes tipo test”.

Cuando se trata de preguntas con respuesta tipo verdadero / falso, la resolución de las mismas está más dirigida y el planteamiento es más específico.

Las preguntas tipo test con varias posibles respuestas hacen referencia a conocimientos muy concretos y exigen un método de estudio diferente al que muchas personas han empleado hasta ahora.

Básicamente todas las preguntas test tienen una característica común: exigen identificar una opción que se diferencia de las otras por uno o más datos de los recogidos en el enunciado. Las dos palabras en cursiva son expresión de dos hechos fundamentales con respecto a las preguntas tipo test:

• Como se trata de identificar algo que va a encontrar escrito, no va a ser necesario memorizar conocimientos hasta el punto de reproducir con exactitud lo que uno estudia. Por lo tanto, no debe agobiarse cuando no consiga recordad de memoria una serie de datos que aprendió hace tiempo; seguro que muchos de ellos los recordará al leerlos formando parte del enunciado o las opciones de una pregunta de test.

• El hecho de que haya que distinguir una opción de otras se traduce en muchas ocasiones en que hay que estudiar diferencias o similitudes. Habitualmente se les pide recordar un dato que se diferencia de otros por


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ser el más frecuente, el más característico, etc. Por lo tanto, este tipo de datos o situaciones son los que hay que estudiar.

Debe tenerse siempre en cuenta que las preguntas test hay que leerlas de forma completa y fijándose en determinadas palabras que puedan resultar clave para la resolución de la pregunta.

La utilidad de las preguntas test es varia:

• Acostumbrarse a percibir errores de conceptos.

• Adaptarse a los exámenes de selección de personal.

Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser planteados en estas preguntas, conceptos que se retienen con facilidad.

1.3.7 Envío Una vez estudiado el material docente, se contestará la encuesta de satisfacción, la

cual nos ayudará para evaluar el Curso, corregir y mejorar posibles errores. Cuando haya cumplimentado la evaluación, envíe las respuestas a la dirección indicada.

UNIDAD DIDÁCTICA II FAMILIARIZACIÓN CON EL LABORATORIO DE

ANATOMÍA PATOLÓGICA.


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2.1 Familiarización con el Laboratorio de Anatomía Patológica El técnico especialista en Anatomía Patológica (TEAP), en consecuencia con su

titulación, debería estar preparado para asumir las distintas labores desempeñadas en la práctica habitual de un laboratorio de Anatomía Patológica (Histotecnología); no obstante, las limitaciones propias de la docencia de los centros de formación, junto al gran número de técnicas y métodos incorporados a la rutina de los laboratorios, establece una serie de necesidades y conocimientos por parte del TEAP que en muchos casos sólo se conseguirán con el estudio y la experiencia.

Pretendemos con este manual, realizar una sencilla aproximación a la rutina diaria de un laboratorio de Anatomía Patológica, haciendo hincapié en los problemas más comunes que puedan surgirle al TEAP en el desempeño de sus funciones, ofreciendo soluciones o propuestas que puedan ayudarle a salir airoso de los problemas que le puedan surgir.

El TEAP debe de adquirir un compromiso vital y profesional en el desempeño de sus funciones, y debe de ser plenamente consciente de la repercusión que sus actos pueden significar en la cadena diagnóstica y en colectivo de profesionales del laboratorio.

El TEAP tiene responsabilidades, y debe de asumirlas en el contexto del trabajo en equipo; para ello, es fundamental una formación adecuada, capacidad de autocrítica, aptitud y actitud, que se reflejarán en la efectividad y eficacia del trabajo realizado.

El TEAP es una parte fundamental del equipo que trabaja en el laboratorio de Anatomía Patológica, y es imprescindible para que el trabajo global del laboratorio “luzca” en su medida. Si bien el patólogo es el facultativo responsable en último término de la emisión de diagnósticos, su labor se ve mermada sin el acompañamiento de una adecuada técnica, de la que el técnico es el responsable. El TEAP es asimismo “carta de presentación” de un laboratorio en cuanto su trabajo puede llegar a traspasar los límites físicos del mismo (presentaciones, ponencias, ilustraciones de manuales, etc…), es eslabón imprescindible en la consecución de objetivos y es fundamental al hacer posible el diagnóstico con su buen hacer. Por todo ello, el TEAP debe de ser consciente y consecuente con el papel real que desempeña, y actuar en consecuencia;

Una de las primeras cosas que debe de hacer el TEAP a la hora de formar parte del equipo de trabajadores del laboratorio de Anatomía Patológica es familiarizarse con las rutinas del mismo; ello conlleva un proceso gradual de adaptación. Recomendamos dejarnos guiar por el personal más experimentado, que a buen seguro será el método más eficaz para esta primera aproximación en la que aun no hemos adquirido criterio.

Uno de los pilares básicos en la organización de un laboratorio de Anatomía Patológica es el establecimiento y seguimiento de una serie de protocolos individualizados para cada una de las tareas a realizar.

El TEAP debe de familiarizarse con las distintos tipos de muestras que se reciben en el laboratorio, diferentes según la categoría del centro, su cartera de servicios y su volumen de trabajo.


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2.2 La muestra Se entiende por muestra cualquiera de los especimenes orgánicos que son

remitidos al laboratorio de Anatomía Patológica con el fin de obtener un diagnóstico. Existen múltiples tipos de muestras, las cuales pueden ser categorizadas en una primera aproximación como:

1. Citologías

2. Biopsias

3. Piezas quirúrgicas

4. Necropsias

Si exceptuamos las necropsias debido a su peculiar naturaleza, pasamos a exponer el circuito normalizado que deben de seguir los distintos especimenes desde su obtención hasta la emisión de un diagnóstico, proceso complejo en el que el TEAP juega un papel primordial.

A. Obtención de la muestra

B. Identificación de la muestra en origen

C. Envasado de la muestra

D. Transporte

E. Recepción

F. Distribución

G. Registro

H. Procesado

I. Estudio

No hace falta especificar que la persona responsable de la obtención de la muestra es el facultativo responsable en origen. Según organización interna, la muestra será identificada y envasada por la persona asignada a tal función (auxiliar de enfermería, DUE, etc…), con las suficientes garantías para que no se produzcan errores preanalíticos. Tras el transporte, se produce la recepción de la muestra en el laboratorio de Anatomía Patológica. Digamos que es aquí donde interviene por primera vez el TEAP, que será el encargado de supervisar la entrega y comprobar la concordancia entre número y tipo de muestras con sus respectivos informes de petición de estudio anatomopatológico (el impreso de petición debe de ser el normalizado para tal fin, estando debidamente cumplimentados los datos básicos requeridos) . En el caso de que se reciban varias partidas de muestras al mismo tiempo, el técnico es el responsable de priorizar y organizar la citada recepción, de modo que se clasifiquen las muestras según su orden de llegada y procedencia. Asimismo, será el TEAP el encargado de realizar la primera valoración macroscópica del espécimen recibido, pudiendo detectar errores de etiquetado, de presentación, relativos al líquido fijador, relativos al envase, etc… Se trata de un paso de vital importancia pues a partir de entonces la muestra es asumida por el laboratorio, que será responsable, en su medida, de posibles errores detectados con posterioridad.


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La distribución dependerá del método de trabajo adoptado por cada laboratorio y no se pueden hacer generalizaciones al respecto. La clasificación de las muestras según su categoría y naturaleza en citologías y biopsias-piezas quirúrgicas parece ser la más adecuada e intuitiva.

El registro de las muestras es un paso sumamente importante en cuanto que de su incorrecta realización se pueden derivar errores de gran trascendencia. Hoy en día existen programas informáticos sumamente eficaces en el registro de las muestras si bien no hay que olvidar que es la mano humana la que introduce tales datos en el mismo. Por tanto, habrá que ser muy cuidadoso a la hora de afrontar este paso. Generalmente es el programa informático el que asigna un número de identificación a la muestra, pero el TEAP y el patólogo van a trabajar “a pie de campo” con los informes de petición de estudio anatomopatológico; esta hoja de petición debe de estar correctamente identificada y para ello el TEAP la rotulará con el número identificativo asignado (Ej. B09-1204), comprobando en un segundo tiempo la concordancia entre los datos de filiación del paciente con los consignados en el contenedor de la muestra. En muchos centros se lleva a cabo un registro paralelo en formato papel que si bien no es considerado “oficial” en algunos casos, permite localizar con rapidez y eficacia distintos errores para los que el programa informático no está familiarizado. Estos pasos contribuyen a elevar el nivel de seguridad y trazabilidad de la muestra.

La labor del TEAP constituye un filtro inestimable a la labor propia del patólogo. Esta función se pone de manifiesto de forma importante en este paso de la cadena diagnóstica, es decir, en el registro de la muestra:

Llegamos a otro punto de vital importancia en cuanto al papel del TEAP se refiere: el procesado de las muestras; aquí cobra vital importancia la naturaleza de la muestra a procesar pues el proceder será completamente distinto si nos referimos a una muestra citológica que cuando nos referimos a una muestra histológica. No nos detendremos en este punto en un análisis y descripción detallada del proceso, que será abordado en otro momento. Baste decir que del correcto procesado de la muestra dependerá en parte la posibilidad de que el patólogo pueda considerar valorable la muestra y por tanto emitir un diagnóstico en consecuencia.

No nos cansaremos de recalcar el importante papel que juega el TEAP en este momento. De una mala técnica derivan gran parte de los errores interpretativos y, por tanto, será el punto de mayor tensión en la relación del TEAP con el facultativo. El patólogo, preocupado con el resultado de la técnica, exigirá corrección en la misma y rechazará las muestras que no cumplan con unos estándares mínimos de calidad. Si bien hoy en día el procesado de gran parte de las muestras es realizado con la ayuda de tecnología avanzada, la mano del TEAP será la que guíe su manejo, convirtiéndose en el responsable último del mismo así como de la subsanación de los errores que se pudieran derivar de su incorrecto funcionamiento.

No debe el TEAP perder perspectiva y olvidarse de la técnica manual por la que se ha caracterizado tradicionalmente; la tecnología ayuda, pero no suple el saber que el técnico debe de atesorar para la realización de sus funciones pues no se entiende la figura del TEAP sin esta última cualidad; no es exagerar decir que la mayor parte del trabajo ejecutado por el técnico en su quehacer diario se realiza de modo manual. Es por ello fundamental dominar las técnicas manuales.


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Tras el procesado, las preparaciones citológicas e histológicas obtenidas serán debidamente presentadas y entregadas al patólogo para su estudio y diagnóstico.

A continuación, iremos desgranando las distintas actividades desarrolladas por el TEAP. A las definiciones y protocolos intentaremos añadirles reflexiones, trucos o consejos, muchos de ellos fruto de la experiencia personal.

Hemos decidido dar el primer paso analizando las distintas técnicas tintoriales usadas en el laboratorio. El TEAP que se precie se serlo debe de conocerlas. Existen distintos manuales que abordan el tema; creemos que la progresión que vamos a seguir en este manual es de fácil entendimiento. Aparte de conocer las distintas técnicas, no está de más que el TEAP conserve un manual en un lugar asequible, próximo a su puesto de trabajo, pues el desempeño de las labores diarias genera dudas que deben de ser resueltas.

UNIDAD DIDÁCTICA III HISTOTECNOLOGÍA. TÉCNICAS TINTORIALES


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3.1 Histotecnología. Introducción Sería sumamente difícil, si no imposible, distinguir los distintos componentes

tisulares y celulares sin el auxilio de técnicas tintoriales que pusieran de manifiesto estructuras diferenciadas. La distinta afinidad, cualitativa o cuantitativa de dichas estructuras por uno u otro colorante será decisiva para el éxito de la técnica tintorial aplicada.

Existe un amplio número de técnicas tintoriales, utilizadas con distinta frecuencia en los laboratorios de Anatomía Patológica de modo que podríamos hacer una subdivisión ficticia de la mismas en tinciones de uso frecuente o rutina y tinciones de uso infrecuente.

La coloración como método de diferenciación estructural tiene sus orígenes en el siglo XVIII, utilizada por Van Leeuwenhoek para teñir fibras musculares estriadas de tejido animal con azafrán en vino.

La esencia de una técnica tintorial es el colorante; estos pueden ser divididos según su origen en naturales o artificiales. También podemos dividirlos según su afinidad tintorial, tal como pasamos a detallar:

• Colorantes básicos: son los que presentan afinidad por estructuras aniónicas (ácidas).

- Hematoxilinas

- Azul de metileno

- Azul de toloudina

- Violeta de metilo

- Verde de metilo

- Rojo nuclear…

• Colorantes ácidos: son los que presentan afinidad por estructuras básicas.

- Eosinas

- Fascina ácida

- Orange G

- Verde brillante

- Eritrosina…

• Colorantes neutros + sal: son los que presentan afinidad tanto por las estructuras ácidas y básicas.

- Giemsa

• Colorantes indiferentes: actúan como disolventes dentro del tejido.

- Sudán

- Escarlata


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• Colorantes metacromáticos

- Azul de tolouidina

- Tionina

- Azul de Cresil

- Azul B de metilo…

3.2 Tipos de coloraciones a) Coloración progresiva: la coloración actúa hasta que se alcance la

intensidad deseada.

b) Coloración regresiva: es a lo que se le llama diferenciación; se sobrecolorea y luego se elimina lo que no se quiere.

c) Coloración terminal: la coloración dependerá del tiempo que la dejemos actuar.

d) Coloración de la muestra incluida en el bloque tisular: nos referimos a la tinción realizada sobre la muestra o tejido previamente a la inclusión.

e) Coloración de cortes: la tinción se realiza tras haber incluido y realizado los cortes

f) Coloración de inclusión sobre el porta: en este caso el porta no es el que se introduce en el colorante sino que se vierten unas gotas del colorante sobre el porta y secamos con papel de filtro el sobrante.

g) Coloración sucesiva: como su nombre indica se van añadiendo los colorantes de modo sucesivo.

h) Coloración simultánea: la solución que aplicamos contiene varios colorantes.

i) Impregnación: esta forma de colorear con sales metálicas, hace que se originen precipitados en las estructuras que queremos ver.

3.3 Técnicas tintoriales Las técnicas para histotecnología se pueden clasificar en:

3.3.1 Técnicas de rutina Se denominan “de rutina” o rutinarias aquellas técnicas se uso común y

frecuente en el laboratorio de Anatomía Patológica, bien para la tinción de muestras tisulares o bien para la tinción de muestras citológicas. Constituyen uno de los pilares fundamentales del trabajo diario del TEAP y por ello su conocimiento teórico y práctico son imprescindibles y exigibles, sirviendo para evaluar de modo primario las habilidades profesionales de quien las ejecuta.

Debido a que el patólogo necesita una buena técnica para realizar su trabajo, exigirá al técnico la excelencia de la misma; por tanto, una buena técnica no sólo será la carta de presentación del técnico sino una de los principales motivos de conflicto en el caso de que la calidad no alcance los niveles mínimos exigibles.


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Relacionando en cierto modo el término técnica con el término tinción o coloración, vamos a repasar las técnicas tintoriales más utilizadas en los laboratorios de Anatomía Patológica:

3.3.2 Técnicas tintoriales en histología. Hematoxilina-Eosina La más utilizada es la conocida como HEMATOXILINA- EOSINA, utilizada cada día

en todos los hospitales del mundo por poseer gran poder de resolución, por ser una técnica económica, y por tanto eficiente, y por ser fácil de realizar.

La tinción manual con hematoxilina-eosina está siendo relegada al desuso debido a la emergente introducción en los laboratorios de Anatomía Patológica de teñidores automáticos que simplifican el trabajo. No obstante, el TEAP debe de conocer el protocolo o pasos a seguir para la realización de dicha técnica, y es lógica esta aseveración. Existen numerosas eventualidades en las que será necesario recurrir a técnicas manuales (fallos técnicos, averías…) y el TEAP debe de afrontarlas con naturalidad. Empecemos por conocer el fundamento de la técnica de hematoxilina-eosina:

La Hematoxilina es un colorante natural que se extrae del árbol del Hematoxyloncumpechianum, palo de campestre o palo azul de Centroamérica. Al oxidarse, adquiere un color morado oscuro, pasando a ser denominado hemateína. Al proceso de oxidación también se le conoce como “maduración de la hematoxilina”.

La hematoxilina se utiliza en histología para teñir componentes aniónicos (ácidos) de los tejidos, a los que aporta una coloración violeta (tiñe intensamente los núcleos de las células, ya que estos contienen ácidos nucleicos ricos en radicales ácidos).

Tal como se obtiene de la planta, e incluso tras sufrir el proceso de oxidación, su capacidad de tinción es muy limitada. Por lo tanto, debe combinarse con iones metálicos, especialmente sales de hierro o aluminio, que actúan como “mordiente”; de ahí la importancia que tienen tanto una buena oxidación como un buen mordiente y su proporción adecuada.

Las hematoxilinas que más se utilizan son: la hematoxilina de Harris y la hematoxilina de Gill.

• Hematoxilina de Harris( composición)

- Hematoxilina ............................................................................ 500 gr.

- Alumbre aluminio potasio sulfato 12-hidrato ................ 10 gr.

• Hematoxilina de Gill II (composición)

- Hematoxilina ............................................................................ 400 gr.

- Alumbre aluminio sulfato 18-hidrato ............................ 3.52 gr.

En cuanto a la eosina, se utiliza para teñir los citoplasmas que son los componentes básicos de la célula, a los que aporta una coloración rosada– anaranjada. Tiñe intensamente el citoplasma de las células y los componentes extracelulares. Se emplea en solución acuosa y alcohólica; centrémonos en la solución alcohólica. En su preparación intervienen dos pasos.

• Solución stock o solución madre:

- Eosina Y ......................................................................................... 10 gr.

- Agua destilada ......................................................................... 200 ml.


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Se disuelve removiendo y calentando la solución. Cuando esté disuelta, enfriar y añadir:

- Etanol 96º ................................................................... 800 ml.

• Solución de trabajo o eosina hija:

- Solución stock madre ............................................ 250 ml.

- Alcohol 80º ................................................................ 750 ml.

Añadir 0.5 ml de ácido acético por cada 100 ml. de solución de trabajo.

Tanto la eosina madre (solución stock) como la hija (solución de trabajo), deben almacenarse en frascos opacos. El TEAP será el responsable tanto del tratamiento como del almacenamiento, conservación y revisión de las reservas. El resultado final de la tinción dependerá mucho de la manipulación y la conservación de los reactivos, especialmente en el caso de la eosina pues la hematoxilina generalmente se suministra en soluciones prediluidas con lo cual, el riesgo de pérdida de intensidad de tinción tras su uso es menor.

La eosina alcohólica es una fórmula que está comercializada; aunque la calidad de contraste no es la misma, es preciso valorar otros aspectos interesantes como pueden ser: el ahorro de tiempo y de espacio (no se almacenan tantos reactivos), y la perdida de calidad tintorial debida a una mala manipulación del colorante.

Además de los dos colorantes “base” de la tinción, la realización de la técnica requiere: alcoholes de diferentes graduaciones (70º ,96º, 100º), xileno, alcohol ácido, carbonato de litio y agua corriente.

Realización de la técnica:

1. Retirar los restos de parafina: utilizaremos un disolvente siendo el xileno el más utilizado.

2. Hidratación de la muestra: después de la retirada de la parafina, hay que hidratar esa preparación y lo haremos con una batería de alcoholes de gradación decreciente: 100º o absoluto, 96º, 70º.

3. Coloración nuclear con hematoxilina.

4. Diferenciación: ahora nos tocaría retirar el exceso de hematoxilina con alcohol ácido (eliminamos tinción no selectiva a de baja afinidad). La retirada del sobrante tiene como finalidad dejar libre la entrada al colorante citoplasmático.

5. Viraje: este paso hace que la coloración morada de la hematoxilina se intensifique.

6. Coloración citoplasmática con eosina: en este paso hay que tener cuidado con el exceso de eosina, para que haya un buen contraste núcleo-citoplasma.

7. Deshidratación: retiraremos el agua del tejido para poder más tarde poder introducir el medio de montaje.

8. Aclarado: se llama así al paso anterior al montaje y consiste en pasar los cortes histológicos por xileno, que los limpiará de restos de alcohol absoluto y al mismo tiempo servirá como medio de disolución para el DPX (medio de montaje).


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9. Montaje: el montaje se realizará después de haber pasado la muestra con anterioridad por el disolvente, para la retirada de los alcoholes.


1. Fijación y desparafinación con calor ............................... aprox.20 m.

2. Xileno ...................................................................................................... 10 m.

3. Xileno ...................................................................................................... 10 m.

4. Alcohol absoluto ..................................................................................... 5 s.

5. Alcohol 96º ................................................................................................ 5 s.

6. Alcohol 70º ................................................................................................ 5 s.

7. Hematoxilina .................................................................................. 10-20 m.

8. Agua corriente ........................................................................................ 1 m.

9. Alcohol ácido ............................................................................................ 5 s.

10. Carbonato de litio ................................................................................ 15 s.

11. Agua corriente ........................................................................................ 1 m.

12. Eosina .................................................................................................. 20-30 s.

13. Agua corriente .......................................................................................... 5 s.

14. Alcohol 70º ................................................................................................. 5s.

15. Alcohol 96º ................................................................................................. 5s.

16. Alcohol 100º .............................................................................................. 5 s.

17. Alcohol 100º .............................................................................................. 5 s.

18. Alcohol 100º ............................................................................................ 1 m.

19. Xileno ......................................................................................................... 1 m.

20. Xileno ......................................................................................................... 1 m.

21. Xileno ......................................................................................................... 1 m.

22. Montaje con DPX

Tras su montaje, las preparaciones histológicas son revisadas, etiquetadas y presentadas al patólogo, quien en última instancia valorará la calidad de la técnica.

3.3.3 Técnicas utilizadas en citología Las más utilizadas son la tinción de PAPANICOLAOU y el PAPNÓPTICO RÁPIDO.

Las técnicas nombradas con anterioridad se diferencian en el tiempo de respuesta ante el diagnostico aunque su finalidad sea la misma.

3.3.3.1 Técnica de Papanicolau La técnica de Papanicolau (Pap), técnica de elección para la tinción de las muestras

de citología ginecológica exfoliativa requiere una fijación previa de las muestras, labor que debe de ser ejercida en el mismo momento de la toma. Generalmente es el personal auxiliar o el mismo facultativo quien realiza la fijación. Para ello sólo hace falta disponer de un fijador en spray (cytospray o similar) siendo asimismo posible realizar una fijación utilizando lacas comunes.


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Una vez recibida la muestra citológica fijada, se procederá a su registro y posterior tinción. Resumimos a continuación los diferentes pasos de la misma:


1. Alcohol70º (para retirar el exceso de citospray) ............................ 5 s.

2. Hematoxilina de Harris ........................................................................ 2.5m.

3. Agua corriente ........................................................................................... 1 m.

4. Alcohol ácido ............................................................................................... 5 s.

5. Agua corriente ........................................................................................... 1 m.

6. Carbonato de litio ................................................................................... 15 s.

7. Agua corriente ........................................................................................... 1 m.

8. Orange G ................................................................................................. 2.5 m.

9. EA 50 ............................................................................................................. 3 m.

10. Alcohol 70º ................................................................................................... 5 s.

11. Alcohol 96º ................................................................................................... 5 s.

12. Alcohol 100º................................................................................................. 5 s.

13. Alcohol 100º................................................................................................. 5 s.

14. Alcohol 100º................................................................................................. 5 s.

15. Xileno .............................................................................................................. 5 s.

16. Xileno .............................................................................................................. 5 s.

17. Xileno ............................................................................................................ 1 m.

18. Montaje con DPX.

Las preparaciones citológicas se repasarán y se etiquetarán previamente a ser entregadas a los patólogos.

3.3.3.2 Técnica del panóptico rápido Como su denominación indica, se trata de un método de tinción rápido y eficaz,

utilizado principalmente en aquellos casos en los que urge hacer un diagnóstico o bien hacerse una idea de las características generales de la muestra. Es por ello por lo que su uso principal se desarrolla tanto en el acto intraoperatorio como en las muestras obtenidas por PAAF. Durante el acto intraoperatorio, es crucial aportar el diagnóstico más exacto posible en el menor tiempo posible y por tanto será muy importante contar con una tinción rápida que nos proporcione resultados óptimos. Por su parte, las muestras obtenidas mediante punción con aguja fina (PAAF), en ciertas ocasiones precisan de esta rapidez, en concreto en aquellos casos en los que es necesario comprobar si hay suficiente material en aras de realizar nuevas punciones si éste no lo fuera.

Esta tinción se practica principalmente sobre material sin fijar si bien puede ser aplicada a muestras fijadas, previamente deshidratadas mediante inmersión en solución alcohólica de 70º.

Se trata de una de las variantes de la tinción de Romanowski, “morada”, que permite observar la morfología nuclear pero no la estructura del núcleo.


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Realización de la técnica

1. Sumergir la/s preparaciones en la solución 1 (fijador) durante 30 s.

2. Sumergir la/s preparaciones en la solución 2 (colorante citoplasmático) 15 s.

3. Sumergir la/s preparaciones en al solución 3 (colorante nuclear) 30 s.

Posteriormente se realiza un baño con agua destilada. Los portaobjetos se dejan secar al aire libre para proceder a continuación a su montaje (este montaje puede diferirse a un segundo tiempo tras la visualización del patólogo).

En aquellos casos en los que nos urja en exceso la visualización de la muestra, podemos realizar un baño de “diez pasadas o inmersiones” en cada una de las soluciones previas al aclaración con agua.

3.3.3.3 Técnicas especiales para histología y citología Podemos definir, en un primer tiempo, las técnicas especiales como aquellas que

no son de rutina. Se trata de una definición vaga e imprecisa pero en cambio útil desde el punto de vista didáctico. Se trata de técnicas a las que se recurre cuando se quieren poner de manifiesto estructuras o componentes tisulares para los que las técnicas de rutina no son lo suficientemente específicas o aclaradoras. El TEAP realizará dichas técnicas tras la petición específica por parte del patólogo o bien siguiendo las directrices dictadas por los protocolos de cada laboratorio: muchas técnicas de las consideradas “especiales” han pasado a formar parte de la rutina de determinados laboratorios e incluso su realización podría ser considerada de rutina de modo generalizado; tal es el caso de la realización de un Giemsa a todas las biopsias gástricas antrales con el fin de poner de manifiesto el microorganismo Helicobacter Pylori o bien la realización de un PAS a todas las biopsias esofágicas remitidas con sospecha de Esófago de Barrett. En otras ocasiones es imprescindible la realización de las técnicas especiales para el estudio de determinados tejidos, como es el caso de las biopsias hepáticas (se realiza un PAS, un Tricrómico de Masson, una reticulina y una tinción específica para el hierro) o renales.

Las técnicas especiales pueden ser divididas de acuerdo con el tejido o estructura diana que queramos poner de manifiesto. Esta será la clasificación que tomaremos como referencia en este manual:

• Técnicas para tejido conjuntivo (conectivo).

Los métodos de tinción para este tejido son muy variados, dependiendo del componente o estructura del mismo que queramos poner de manifiesto/resaltar:

- Los fibroblastos son los principales componentes celulares del tejido conectivo. Su identificación se ve facilitada con la aplicación la Hematoxilina fosfotúngstica de Mallory si bien a tal efecto también será útil el Tricrómico de Masson.

- Los mastocitos se identifican fácilmente con Azul de toluidina, que tiñe los gránulos con una tonalidad rojiza (fenómeno conocido como metacromasia: adquisición de un color diferente aplicado) También se puede aplicar un Azul Alcián-PAS.

- Los adipositos o células grasas poseen problemas para la fijación; sin embargo se pueden identificar son la Solución de Flemming.

- Las fibras de colágeno se tiñen de color verde con el Tricrómico de Masson.


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- Las fibras elásticas adquieren un color pardusco con la tinción de Orceína de Van Gieson.

- La fibras de reticulita son positivas con la tinción de PAS aunque se ponen mejor de manifiesto tras la aplicación de impregnaciones argénticas.

FIBRAS DE COLÁGENO→ ACIDÓFILAS, H-E: ROSA→TRICROMICO DE MASSON (VERDES).

FIBRAS ELÁSTICAS→SE TIÑEN MAL CON H-E→ORCEÍNA DE VAN-GIESON (NEGRAS PARDUSCAS).

FIBRAS DE RETICULINA→NO SON VISIBLES CON H-E→IMPREGNACIONES ARGENTICAS (NEGRAS).

3.4 Tipos de coloraciones del tejido conjuntivo 3.4.1 Coloración para fibras de colágeno

El principal componente del tejido conectivo es el colágeno. La aplicación de una tinción tricrómica de Masson facilita la detección de las mismas debido a la adquisición de un tono verdoso atribuible a la afinidad de los componentes tintoriales por las fibras de colágeno tipo I.

La técnica se fundamenta en la permeabilidad del tejido conectivo a los diferentes colorantes y al grado de dispersión de los mismos. Para ello utilizaremos una hematoxilina férrica que tiña los núcleos (hematoxilina de Weigert), un mordiente para bloquear los residuos existentes en el tejido (solución de ácido fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico en disolución) y colorantes ácidos de diferente densidad para el citoplasma, el colágeno, etc…(fucsina ácida para los citoplasmas, azul de anilina o en su defecto verde luz para las fibras de colágeno).

Reactivos utilizados en la técnica:

Hematoxilina de Weigert. Para su preparación seguiremos los siguientes pasos.

Solución A:

Hematoxilina base ....................................................................... 1 gr.

Etanol de 95º ........................................................................... 100 ml.

Solución B:

Cloruro férrico anhidro .............................................................. 4 gr.

Agua destilada ......................................................................... 100 ml.

Solución de trabajo: mezclar a partes iguales las soluciones A y B.

Preparar en fresco y añadir:

CLH concentrado………………………………………….1 ml.

La fuscina ácida, el azul de anilina y el verde luz están en el mercado en forma soluciones preparadas. No obstante, el TEAP puede prepararlos manualmente siguiendo las siguientes indicaciones.


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Procedimiento a seguir para la realización de la técnica TRICRÓMICO DE MASSON:

1. Desparafinar el corte histológico

2. Hidratar hasta llegar al agua destilada (alcoholes con graduación decreciente)

3. Teñir con la hematoxilina de Weigert durante 5 minutos.

4. Lavar con abundante agua corriente aprox. 2 minutos y en un segundo paso, lavar con agua destilada.

5. Teñir con fucsina ácida durante 5 minutos.

6. Lavar con agua destilada.

7. Aplicar la solución de ácido fosfotúngstico y fosfomolíbdico durante 10 minutos.

8. Teñir con azul de anilina durante 5 minutos.


10. Diferenciar con la solución de ácido acético al 1% durante 1-1’30 minutos.

11. Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados:

Núcleos .......................................................................... Azul-morado

Citoplasmas, fibras musculares, queratina ........................ Rojo

Fibras de colágeno y reticulina ............................................... Azul

También podemos utilizar otra variante de la técnica tricrómica de Masson, más sencilla, que sería la siguiente:

1. Desparafinar el corte histológico.

2. Hidratar hasta llegar al agua destilada.

3. Aplicar cloruro de mercurio en saturación durante 30 minutos (*)


5. Teñir con hematoxilina de Harris durante 5 minutos.


7. Teñir con fucsina ácida escarlata durante 5 minutos.


9. Solución de trabajo de ácido fosfotúnsgtico / ácido fosfomolíbdico (**)

10. Teñir con azul de Anilina durante 5 minutos.

11. Ácido acético al 1% durante 1-1.5 minutos.


(*) Solución de cloruro de mercurio:

Cloruro de mercurio en polvo, añadir agua destilada hasta saturación.

(**) Solución de trabajo ácido fosfotúngstico / ácido fosfomolíbdico:


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1 parte de ácido. Fosfotúngstico ........................................... 1 ml.

1 parte de ácido. Fosfomolíbdico ......................................... 1 ml.

2 partes de agua destilada ...................................................... 2 ml.

Mezclar bien y usar en el momento (la solución pierde su función si su acción se prolonga en el tiempo).

Los resultados obtenidos en cuanto a tonalidad son similares a los obtenidos en la variante de la técnica anteriormente descrita.

3.4.2 Coloración para fibras elásticas Las fibras elásticas se encuentran principalmente en vasos sanguíneos, pulmón,

piel, etc... Estas fibras absorben muy poca eosina cuando se tiñen con H-E ya que la elastina tiene una baja concentración en aminoácidos polares; es por eso por lo que acudimos a las técnicas de Orceína y Hematoxilina de Verhoeff.

3.4.2.1 Técnica de la orceína El fundamento de esta técnica consiste en colorear las fibras elásticas presentes en

el tejido conjuntivo con un colorante ácido de origen natural. La orceína es un colorante selectivo pero no específico.

Reactivos utilizados en la técnica:

a) Solución de orceína:

Orceína ............................................................................................. 1 gr.

Alcohol al 70º ............................................................................ 99 ml.

Ácido clorhídrico concentrado ........................................... 0.6 ml.

b) Solución de picrocarmín de índigo:

Solución acuosa saturada de ácido pícrico ........................ 100 ml.

Carmín de índigo......................................................... de 0.25 a 0.4 gr.

Procedimiento:


2. Hidratar hasta el agua destilada.

3. Teñir con la solución de orceína de 15-30 minutos.

4. Lavar con abundante agua destilada y con rapidez.

5. Teñir con picrocarmín durante 20 segundos.

6. Diferenciar el exceso de orceína con baños de alcohol absoluto, aclarar y montar

Resultados:

Fibras y membranas elásticas ............................... pardo- negruzco

Citoplasma y otras estructuras ..........................verde- amarillento

Puede utilizarse cualquier fijador, pero los más idóneos son los alcoholes y la formalina.


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3.4.2.2 Técnica de la Hematoxilina de Verhoeff El fundamento de esta otra técnica consiste en la tinción de las fibras elásticas con

la laca que proporciona la hematoxilina férrica que le vamos a añadir ya que hay una atracción electrofísica entre la laca y elastomucina.

Esta tinción también es poco selectiva (tiñe estructuras tales como la mielina)

Reactivos para la técnica:

a) Solución acuosa de cloruro férrico al 10%:

b) Solución yodo-yodurada de lugol:

Yodo metálico ..................................................................................... 2 gr.

Yoduro potásico ................................................................................. 4 gr.

Lugol ................................................................................................. 100 ml.

c) Solución de Verhoeff :

Se disuelven 1.5 gr. de hematoxilina en 30 ml. de alcohol de 100º, aplicando suavemente calor; se enfría y se filtra. A continuación se le añaden:

- 12 ml. de solución de cloruro férrico al 10%.

- 12 ml. de la solución de lugol.

Se le añadirán en este orden, agitando bien para su óptima mezcla y para su posterior aplicación.

d) Solución de diferenciación acuosa de cloruro férrico al 2%.

Procedimiento:

1. Desparafinar.


3. Teñir con la solución de Verhoeff durante 15- 45 minutos, hasta que los cortes aparezcan de color negro.

4. Diferenciar con la solución de cloruro férrico durante varios minutos e ir verificando mediante agua destilada(lavados) y el microscopio que solo se han coloreado las fibras elásticas y los núcleos estando el resto del tejido de color gris. Este paso es el más importante ya que si nos excedemos en la diferenciación, podemos provocar una tinción deficiente de las fibras elásticas. Si esto sucediera, tan solo tendríamos que volver a aplicar la solución de Verhoeff al tejido y diferenciar de nuevo.


6. Aclarar con alcohol 96º para eliminar la tinción debida al yodo.

7. Lavar con agua destilada durante 5 minutos.

8. Contrastar con la tinción de Van Gieson durante 1-2 minutos.

9. Aclarar con alcohol 96º.



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Resultados:

Fibras elásticas ................................................................................ Negro

Núcleos ................................................................... Gris oscuro a negro

Fibras de colágeno ........................................................................... Rojo

Citoplasmas .................................................................................. Amarillo

3.4.3 Coloración para las fibras de reticulina Se ha demostrado que las fibras de reticulina son argirófilas, es decir, que tienen

gran afinidad por los iones argénticos (plata). Las técnicas más usadas para poner de manifiesto las fibras de reticulina tisulares son las impregnaciones argénticas.

Las impregnaciones argénticas tienen como fundamento el precipitar plata metálica a partir de sus sales para que ésta se deposite sobre el tejido. La sal más utilizada es el nitrato de plata ya que es soluble al agua.

Toda la técnica se fundamenta en reducir el nitrato de plata hasta obtener plata metálica.

Como en las técnicas de impregnación argéntica se utilizarán múltiples lavados y los tratamientos serán largos, se recomienda utilizar portaobjetos albuminados o silanizados y que los cortes sean lo más finos posible para que no se desprendan del portaobjetos. Las dos variantes más utilizadas de la técnica para poner de manifiesto la red de reticulina tisular son la técnica de Gomori y la técnica de Gordon –Sweet.

3.4.3.1 Técnica de Gomori Se trata de una impregnación argéntica en dos tiempos. Utiliza procedimientos

químicos para obtener plata metálica a partir del nitrato de plata mediante varias reacciones sucesivas.

Reactivos de la técnica:

a) Solución acuosa de permanganato potásico al 1%.

b) Solución acuosa de metabisulfito potásico al 2%.

c) Solución acuosa de alumbre férrico al 2% (preparar antes de usar).

d) Solución de plata amoniacal: se cogen 10 ml. de solución de nitrato de plata al 10% y se le añaden 2 ml. de hidróxido potásico al 10%; el precipitado que se forma se disuelve con amoniaco concentrado, después se le añade nitrato de plata hasta que empiece a formarse de nuevo el precipitado (diluir con agua a partes iguales).

e) Formol al 10%.

f) Solución acuosa de hiposulfito sódico al 2%.

Procedimiento:

1. Desparafinar los cortes histológicos.

2. Hidratar hasta agua destilada.

3. Oxidar con permanganato potásico durante 2 minutos.

4. Lavar con agua corriente.


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5. Blanquear con metabisulfito.

6. Lavar con abundante agua corriente.

7. Aplicar la s. de alumbre férrico durante 1 minuto.

8. Lavar con abundante agua corriente durante 5 minutos.

9. Lavar 2 veces con agua destilada.

10. Aplicar la s. de plata amoniacal durante 1 minuto.

11. Lavar con agua destilada como máximo 10 segundos.

12. Reducir con formol al 10% durante unos segundos.


14. Pasar rápidamente por la s. de hiposulfito sódico.



Resultados:

- Fibras de reticulina .................................................................... Negro

- Fibras de colágeno ................................................................ Amarillo

Cuanto más tiempo permanezcan los cortes histológicos en el permanganato potásico, más tiempo debemos dejarlos en metabisulfito para el blanqueo

3.4.3.2 Técnica de Gordon-Sweet Es también una técnica en dos tiempos muy similar a la de Gomori.

Reactivos de la técnica:

a) Nitrato de plata al 0.1%

b) Hidróxido sódico al 0.3%

c) Cloruro de oro al 0.002%

d) Ácido oxálico al 0.05%

e) Alumbre de hierro al 0.025

f) Tiosulfato sódico al 0.05%

g) Permanganato potásico al 0.05%

h) Ácido sulfúrico al 3%

i) Formol al 10%

Procedimiento de la técnica:


2. Hidratar hasta llegar a agua destilada.

3. Oxidar con permanganato potásico durante 5 minutos.


5. Blanquear con ácido oxálico durante 1 minuto.


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6. Lavar 3 cambios con agua destilada.

7. Tratar con mordiente de alumbre de hierro en solución acuosa al 2% durante 30 minutos.

8. Lavar con 2 cambios de agua destilada.

9. Tratar con la s. de trabajo de plata amoniacal: se toman 5 ml. de nitrato de plata, se le añade amoniaco gota a gota hasta que el precipitado casi se disuelva. Se precipita de nuevo la solución con 5 ml. de hidróxido sódico y a continuación amoniaco gota a gota hasta que la solución quede clara.

10. Completar con agua destilada hasta 50 ml.

11. Lavar suavemente y a fondo con agua destilada.

12. Añadir formol al 10% durante 10 minutos.

13. Lavar en agua destilada, si los cortes parecen claros repetir la operación desde el paso 8.

14. Contrastar con la solución de cloruro de oro durante 5 minutos.


16. Fijar la impregnación con tiosulfato sódico durante 10 minutos.



Resultados:

- Fibras reticulare .............................................................................. Negro

- Resto de estructuras ........................................................... Sin teñir.(*)

(*) Si se desea un contraste nuclear para conseguir mayor contraste, se puede utilizar el rojo nuclear al final de la técnica, después del paso 15, durante 3-5 minutos.

- Núcleos ................................................................................................. Rojo

Algunos datos que debe de tener en cuenta el TEAP a la hora de realizar las técnicas de impregnación argéntica son los siguientes:

• El material de vidrio utilizado para las diluciones ha de estar perfectamente limpio con el fin de evitar impurezas que puedan precipitar al hacer la solución de plata amoniacal.

• Al emplear el oxidante (permanganato potásico), los cortes se blanquearán con ácido oxálico.

• El agua utilizada para las técnicas será agua destilada y, si es posible, agua bidestilada.

• Los cortes han de ser fijados al portaobjetos con albúmina, gelatina o silano.

• El tiosulfato sódico posee la capacidad de retirar la sal de plata no reducida y la metálica que no ha impregnado las estructuras.


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• Es muy importante el lavado entre reactivos con el fin de no dejar residuos que produzcan artefactos.

• Esta técnica es otra de las comercializadas en forma de kit.

Además de estas dos técnicas, existen otras dos que, aunque menos utilizadas, también son conocidas: la técnica de Masson Fontana y el método de Grimelius.

3.4.3.3 Técnica de Mason Fontana Se trata de una técnica de impregnación argéntica en dos tiempos, en la cual el

amoniaco realizará la 1ª reducción del nitrato de plata y el tejido la 2ª, precipitando la plata sobre las granulaciones con capacidad reductora.

En esta técnica lo más difícil está en la preparación de la solución de plata hasta el momento en el que esté a punto de precipitar sin llegar a hacerlo (aspecto turbio-nuboso). Se trata de una técnica prolongada, de larga duración debido a que el periodo de incubación en plata amoniacal será aproximadamente de 24 horas en la oscuridad (para que no precipite con la luz solar).

Reactivos:

a) Solución de nitrato de plata Fontana:

Nitrato de plata ................................................................................ 10 gr.

Agua destilada............................................................................... 100 ml.

Añadir a 95 ml. de esta solución, hidróxido amónico hasta obtener una solución clara sin precipitados; luego añadiremos gota a gota lo necesario de los restantes 5 ml. de la solución de nitrato de plata hasta que la solución se vuelva ligeramente turbia.

Dejar reposar 1-2 horas en la oscuridad antes de usar.

b) Solución de cloruro de oro:

Cloruro de oro acuoso al 1% ..................................................... 10 ml.

Agua destilada................................................................................. 40 ml.

c) Solución de tiosulfato sódico al 5% :

Tiosulfato sódico ............................................................................... 5 ml.


d) Rojo nuclear rápido.

Procedimiento:

1. Desparafinar los cortes histológicos

2. Incubar en la solución de nitrato de plata Fontana a 56º durante i hora en la estufa, o bien de 24-48 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Al pasar dicho tiempo los cortes han de ser de un tono pardusco claro.


4. Añadir la solución de cloruro de oro durante 10 minutos.

5. Lavar 3 veces en agua destilada.

6. Añadir la solución de tiosulfato sódico durante 5 minutos.


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8. Contrateñir con rojo nuclear rápido durante 5 minutos.

9. Lavar bien 2 veces con agua destilada.


Resultados:

- Sustancias reductoras de la plata (gránulos argentafines y melanina) .......... Negro

- Núcleos ...................................................................................................................................... Rojo

Importante: hay que tener en cuenta que este procedimiento no es específico; por lo tanto, los pigmentos incluidos en el formol, los pigmentos lipofucsínicos y gránulos argentafines pueden ser positivos.

A pesar de que la técnica está diseñada para la demostración de melanina, por los problemas antes descritos será siempre conveniente realizar otras técnicas para confirmar los resultados.

3.4.3.4 Técnica o método Grimelius Esta impregnación se realiza en un tiempo; se emplea la hidroquímica para reducir

el nitrato de plata. Si las muestras que vamos a teñir vienen fijadas con formol, las volveremos a fijar toda la noche con líquido de Bouin en un paso previo a su tinción.

Reactivos:

a) Solución de tampón acetato 0.1 M a ph 5.8:

Solución 1:

Acetato de sodio puro ............................................................... 1.64 gr.

Acetato de sodio trihidrato ...................................................... 2.72 gr.

Agua destilada .............................................................................. 100 ml.

Solución 2:

Ácido acético glacial .................................................................... 1.2 ml.

Agua destilada ............................................................................. 98.2 ml.

Solución de trabajo:

Solución 1 ......................................................................................... 95 ml.

Solución 2 ............................................................................................ 5 ml.


b) Solución de impregnación:

Tampón acetato 0.1 M a ph 5.8 .............................................. 100 ml.

Nitrato de plata ............................................................................ .0.05 gr.

c) Solución reductora de Bodian:

Sulfito de sodio anhidro .................................................................. 5 gr.

Hidroquinona ...................................................................................... 1 gr.



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d) Solución fijadora :

Tiosulfato sódico ................................................................................ 2 gr.


Procedimiento:


2. Lavar 4 veces en agua destilada.

3. Colocar la solución de impregnación durante 3 horas a 60º (los portaobjetos junto a la solución de impregnación irán cogiendo la temperatura progresivamente).

4. Transferir durante 5 minutos a solución reductora de Bodian recién preparada y previamente calentada a 60º.Controlar al microscopio. Si no aparece el color negro, lavar en cuatro cambios de agua destilada. Fijar en tiosulfato sódico al 2% durante 30 segundos a 1 minuto y volver a colocar en solución de impregnación recién preparada a temperatura ambiente 30 minutos. Transferir a solución de Bodian 5 minutos, recién preparada.


6. Fijar con tiosulfato sódico al 2% durante 30 segundos.



Resultados:

- Células argirófilas ........................................................................... Negro

- Células alfa de los islotes de Langerhans (páncreas)........ Negro

Consejos a seguir en la práctica de esta técnica:

• Es fundamental utilizar soluciones tamponadas pues el resultado óptimo o no de la técnica depende en gran medida del equilibrio del ph.

• El resultado de técnica es mejor si después del desparafinado se fijan de nuevo con fijador de Bouin durante 1 hora a 37º y luego pasándolo por alcohol de 70º hasta que desaparezca el color amarillento.

• Hay que intentar no utilizar objetos metálicos en la realización de los reactivos y soluciones de trabajo para que no precipiten los restos con el nitrato de plata y produzcan artefactos.

3.5 Coloraciones para material amiloide El amiloide es una sustancia que normalmente no está en el organismo, es

insoluble en agua alcohol, éter y ácidos fuertes. Con la tinción de H-E, el material amiloide adquiere una tonalidad rosada inespecífica. El rojo congo aporta una tonalidad rojiza característica que permite la identificación de dicho material. Esta tinción muestra birrefringencia con luz polarizada (color verde manzana), definitiva en el diagnóstico de los depósitos amiloides.


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El patólogo sospecha la presencia de material amiloide tras leer los datos clínicos del paciente y visualizar microscópicamente el tejido. Si esta sospecha persiste realizará la petición de técnicas especiales que permitan identificar con garantías los depósitos de este material.

3.5.1 Técnica del rojo congo El rojo congo es un colorante que se utiliza en industria textil para teñir el algodón.

Esta tinción no es del todo específica ya que es capaz de teñir las fibras de colágeno y las elásticas.

El fundamento de técnica es la demostración del material amiloide a través de los puentes de hidrógeno que se forman entre las moléculas de rojo congo atrapadas en la red fibrilar y los propios aminoácidos de la cadena AA o AL.

- Cadena AA: es producida por el hígado en condiciones patológicas. El depósito patológico de este tipo de cadenas es el responsable de la amiloidosis secundaria.

- Cadena AL: es producida por las células plasmáticas secretoras de anticuerpos y su depósito se relaciona con algunos tipos de neoplasias derivadas de linfocitos B.

Reactivos:

a) Solución de hematoxilina de Harris.

b) Solución de Rojo Congo:

1. Solución de almacenamiento:

Rojo Congo .................................................................................. 1 gr.

Cloruro sódico al 1% en alcohol de 80º ..................... 200 ml.

Agitar antes de usar y filtrar.

2. Solución de trabajo:

Solución de almacenamiento .................................................. 100 ml.

Hidróxido sódico al 1% ................................................................... 1 ml.

Procedimiento:




4. Aclarar rápidamente con agua corriente.

5. Lavar en alcohol de 80º.

6. Aplicar la solución de Rojo Congo durante 20 minutos.


Resultados:

- Núcleos .................................................................................................. Azul

- Amiloide ............................................................................ Naranja rojizo

- Fibras elásticas ................................................................ Naranja rojizo


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• Nunca se debe utilizar material que haya sido fijado con agentes oxidantes (Zenker, ácido crómico, etc..)

• El Rojo Congo en medio ácido o neutro también tiñe las fibras colágenas, y da falsos positivos, por ello se utiliza Rojo Congo alcalino.

• Si se deja demasiado tiempo en hematoxilina podemos sufrir una sobrecoloración y la técnica no tendrá el mismo resultado.

3.5.2 Método de la tioflavina T Es la mejor técnica para la tinción del amiloide aunque no es específica ya que

también tiñe material fibrinoide, la hialina arteriolar, las queratinas y algunas estructuras celulares tales como las células de Paneth ,las células principales del páncreas y el aparato yuxtaglomerular. El fundamento de la técnica no es bien conocido; se cree que la tioflavina T se une a los mucopolisacáridos que forman el amiloide por un mecanismo fisico-quimico. Este colorante posee la capacidad de producir fluorescencia verde-amarillenta cuando es iluminado con luz ultravioleta.

Reactivos:

a) Solución de hematoxilina de Harris.

b) Solución acuosa de tioflavina T al 1%.

c) Solución de ácido acético al 1%.

Procedimiento:


2. Teñir con hematoxilina de Harris durante 2 minutos el núcleo, debido a su carga de ADN, no produzca fluorescencia espontánea (falsos positivos).

3. Lavar con abundante agua corriente durante 3 minutos.

4. Lavar con agua destilada para aclarar. no produzca

5. Teñir con tioflavina T durante 3 minutos.


7. Diferenciar con ácido acético al 1% en 2 cambios de 10 minutos cada uno.


9. Montar en medio acuoso o deshidratar, aclarar y montar en medio no fluorescente.

Resultados:

- Amiloide ............................................................................................. Amarillo o verde amarillento sobre fondo azul, dependiendo del filtro que se utilice.

Consejos y datos a tener en cuenta para esta técnica:

• Para la fijación, se deben evitar fijadores que tengan mercurio entre sus componentes, ya que pueden producir autofluorescencia espontánea.

• Pueden utilizarse cortes en parafina o en congelación.


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• Para la observación de la tinción se debe utilizar un foco de luz ultravioleta con filtro de excitación BG-12, asociado a otros de barrera de tipo OG-4 y OG-5 o bien un excitador de tipo UG-2 con filtro de radiación ultravioleta.

• Si realizamos la técnica a ph 1.4 se realza el resultado obtenido debido al incremento de la selectividad de la tioflavina T por el amiloide.

3.6 Técnicas para la identificación de glucógeno El glucógeno es un polisacárido que constituye el componente más importante de

almacenamiento de carbohidratos a nivel intracelular. Se forma a partir de la glucosa y se almacena fundamentalmente en el hígado y en menor grado en las células musculares.

El glucógeno se puede determinar principalmente mediante 2 técnicas:

- Técnica del PAS, considerada técnica histoquímica.

- Técnica del carmín de Best, considerada técnica no histoquímica.

3.6.1 Técnica de Pas El fundamento de esta tinción consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido

periódico para aumentar los grupos carbonilos (aldehidos o acetonas) presentes en ellos, de forma que puedan ser demostrados posteriormente por el reactivo de Schiff.

Reactivos:

a) Ácido periódico al 5%.

b) Reactivo de Schiff:

- Fucsina básica ...................................................................................... 1 gr.

- Agua destilada .............................................................................. 200 ml.

Llevar el agua destilada hasta ebullición y añadir la fucsina, disolver y enfriar a50º, filtrar y añadir:

- Metabisulfato sódico anhidro ....................................................... 1 gr.

Dejar en reposo 24 horas y filtrar a través de carbón activo. Se almacenará en el frigorífico.

c) Hematoxilina de Harris.

Procedimiento:


2. Llevar los cortes hasta agua destilada.

3. Añadir el ácido periódico al 0.5% durante 10 minutos.


5. Añadir el reactivo de Schiff durante 15 minutos.

6. Lavar con agua corriente durante 5 minutos.

7. Teñir con hematoxilina de Harris durante 1 minuto.




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Resultados:

- Núcleos ............................................................................... Azul-morado.

- Glucógeno y material PAS positivo ...... Rojo oscuro a magenta.

Para la realización de esta técnica es recomendable utilizar cortes histológicos de control, y si es posible utilizar reactivo de Schiff hecho comercialmente para evitar falsos positivos.

3.6.2 Técnica del Carmín de Best Esta técnica se utiliza para la detección de glucógeno en biopsias endometriales, la

presencia de glucógeno determina que se está iniciando o no la fase postovulatoria. Esta técnica no es tampoco muy específica porque también tiñe otros elementos. Los fijadores utilizados son: Bouin alcohólico o normal, Carnoy y alcohol 80º.

Reactivos:

a) Solución de stock de carmín de Best:

Carmín .................................................................................................... 2 gr.

Cloruro de potasio ............................................................................. 5 gr.

Carbonato de potasio ....................................................................... 1 gr.


Se enfría, se filtra y luego se añade:

Amoniaco concentrado ............................................................... 20 ml.

b) Líquido de dilución :

Amoniaco ............................................................................................ 2 vol.

Alcohol metílico ................................................................................ 3 vol.

c) Líquido de diferenciación :

Alcohol metílico absoluto ........................................................... 20 ml.

Alcohol etílico absoluto ............................................................... 40 ml.


d) Hematoxilina de Harris.

e) Solución de trabajo (carmín de Best):

Solución stock de carmín ....................................................... 2 partes.

Líquido de dilución ................................................................... 2 partes.

Procedimiento:


2. Colidonar.

3. Llevar el corte hasta agua destilada.




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6. Solución de carmín de Best + solución de C durante 20-30 minutos.

7. Se diferencia con la solución C sin lavar con agua hasta que cese toda la extracción de rojo.

8. Se deshidrata directamente con alcohol absoluto.

9. Aclarar y montar.

Resultados:

Glucógeno ........................................................................................... Rojo

Núcleo ............................................................................... Azul-negruzco

3.7 Técnica de tinción para mucina Para la mucina la mejor tinción es el AZUL ALCIÁN, a un ph 2.5. Hay otra técnica

que se utiliza generalmente para muco polisacaridos ácidos (Azul Alcián –PAS ).

Reactivos:

a) Solución de Azul Alcián :

Azul Alcián ............................................................................................ 1 gr.

Ácido acético ...................................................................................... 3 ml.

Agua destilada ................................................................................ 97 ml.

b) Hematoxilina de Harris.

Procedimiento:


2. Hidratar el corte hasta llegar a agua destilada.



5. Teñir con solución de Azul Alcián durante 10 minutos


Resultados:

Núcleos ........................................................................................... Morado

Mucina ..................................................................... Azul claro brillante

También se puede hacer una técnica modificada del Azul Alcián, que sería para la determinación de los MPSA.

Procedimiento:



3. Teñir con Azul Alcián durante 5 minutos.




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6. Añadir el ácido periódico durante 10 minutos.


8. Lavar seguidamente con agua destilada.

9. Aplicar el reactivo de Schiff durante 15 minutos.



12. Hematoxilina de Harris durante 3 minutos.

13. Lavar con agua corriente durante 3 minutos


Resultados:

- Núcleos ............................................................................. Azul – morado

- Mucina ....................................................................... Azul claro brillante

- Mucopolisacaridos ácidos ....................................................... Púrpura

3.8 Técnicas para la identificación de fibrina La fibrina es una proteína específica formada a partir del fibrinógeno de la sangre.

La fibrina es eosinófila, homogénea y generalmente dotada de PAS –Positiva.

La fibrina es muy representativa con la tinción de Weigert, apareciendo la fibrina de color azul o negro.

3.8.1 Técnica de Weigert Es una variante de la coloración de Gram para las bacterias. No es especifica

porque tiñe también otros elementos (amiloide, queratina, etc.)

Reactivos:

a) Solución de eosina acuosa al 5%.

b) Solución de Weigert: violeta de Genciana en aceite de anilina:

1* 5 gr. de violeta de metilo + 10 gr. De alcohol etílico absoluto.

2* 2 ml. de aceite de anilina + 88 ml. de agua destilada.

Se mezclan 1 y 2 y se deja en reposo 1 día y se filtra.

c) Solución yodada de Gram:

- Yodo ........................................................................................................ 1 gr.

- Yoduro potásico ................................................................................. 2 gr.

- Agua destilada............................................................................... 300 ml.

d) Solución de aceite anilina – xilol:

- Aceite de anilina ............................................................................. 50 ml.

- Xileno .................................................................................................. 50 ml.


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Procedimiento:



3. Añadir eosina acuosa al 5% durante 5 minutos.


5. Cubrir el corte con la solución de Weigert durante 5 minutos.

6. Cubrir el corte con solución yodada de Gram durante 5 minutos.


8. Secar con papel de filtro.

9. Diferenciar con aceite de anilina-xilol, agitando en todo momento.

10. Aclarar y montar.

Resultados:

- Fibrina y bacterias Gram positivas ............................................... Azul

- Otros elementos y estructuras ..................................................... Rosa

3.9 Técnicas para la identificación de grasas Hablar de grasas es hablar de tejido adiposo. El tejido adiposo está presente en

múltiples localizaciones: en el tejido conjuntivo laxo, en la hipodermis (tejido celular subcutáneo), en torno a vísceras corporales, etc…El tejido adiposo supone el 10-20% de la masa corporal.

Podemos distinguir dos tipos de tejido adiposo:

A. Tejido adiposo blanco.

Representa el 95% del tejido adiposo en adultos y es blanquecino- amarillento debido al caroteno celular. La técnica para visualizarlo es la Hematoxilina – eosina, y con ella podremos ver:

- Componentes ácidos de las células: son teñidos de color oscuro por la hematoxilina.

- Componentes básicos de las células: son teñidos por la eosina.

B. Tejido adiposo pardo.

Es el tejido adiposo predominante en algunos animales invernantes, en los recién nacidos etc…Este tejido tiene función térmica.

La clasificación de lípidos desde el punto de vista histoquímico sería:

• Lípidos homofásicos: se encuentran en estado puro en un lugar concreto de la célula (sudán y oil red O).

• Lípidos heterofásicos: se encuentran dispersos en determinadas estructuras (PAS y otros métodos).


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3.9.1 Técnica de Sudán IV (escarlata R) Los cortes para esta técnica deben tener un grosor aproximado de 10 micras por lo

que deben ser realizados mediante congelación.

Reactivos:

a) Solución de Sudán IV:

- Sudán IV ................................................................................................. 1 gr.

- Acetona .............................................................................................. 50 ml.

- Alcohol 70% ..................................................................................... 50 ml.

b) Solución de dicromato potásico:

- Gelatina ............................................................................................... 0.2 gr

- Dicromato potásico ....................................................................... 0.2 gr.

- Agua destilada............................................................................ 1000 ml.

Procedimiento:

1. Se congela el tejido y se hacen cortes a 10 micras.

2. Colocamos los cortes en la solución de dicromato potásico y se montan sobre portaobjetos.

3. Se dejan secar al aire libre.

4. Se sumergen los cortes en alcohol de 70º.

5. Se tiñe con solución de Sudan durante 5 minutos , los cortes han de estar congelados (para los cortes en parafina 30 minutos).

6. Inmersión en alcohol 70º.


8. Teñir con hematoxilina de Harris durante 30 segundos, para contrastar.


10. Montar en medio acuoso.

11. Sellar el cubreobjetos con bálsamo.

Resultados:

- Núcleos .................................................................................................. Azul

- Lípidos .................................................. Rojo intenso/Naranja – rojizo

3.9.2 Técnica del Sudán negro Es la más usada para la identificación específica de lípidos.

Reactivos:

c) Solución de Sudán negro :

Sudán negro B ................................................................................. 0.5 gr.

Propilenglicol ................................................................................. 100 ml.


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Se añade una pequeña cantidad de propilenglicol al colorante y se mezclan. Después se agrega lentamente el propilenglicol y se calienta hasta los 95º, agitando.Se filtra en papel de Whatman nº 2 en caliente.

d) Solución de propilenglicol al 100%.

e) Propilenglicol al 85% en agua destilada.

f) Rojo neutro al 1 %.

Procedimiento:

1. Se llevan los cortes hasta agua destilada.

2. Añadir propilenglicol al 100% durante 3 minutos.

3. Añadir solución Sudán negro durante 5 minutos.

4. Cubrir con propilenglicol al 85% durante 2 minutos.


6. Contrateñir con rojo neutro al 1% durante 30-60 segundos


8. Se colocan los cortes en el portaobjetos.

9. Se retira el exceso de agua y se procede a montarlos en medio acuoso.

Resultados:

- Núcleos y citoplasma ..................................................................... Rojo

- Lípidos ................................................................................................ Negro

- Mielina ................................................................................................ Negro

3.9.3 Técnica de Azul de Nilo (método de Lillie). Se utiliza para diferenciar las grasas neutras de las ácidas. La propiedad del azul de

Nilo es que al ser impuro disuelve las grasas de carácter ácido mientras que el rojo de Nilo disuelve las neutras. De esta manera se identifican dos tipos de lípidos.El azul de Nilo es un colorante que siempre viene contaminado por rojo Nilo en una proporción del 2% por cada 98% de azul.

Fijación:

a) Azul de Nilo .................................................................................... 0.10 gr.

Agua destilada ........................................................................ 198.00 ml.

b) Ácido sulfúrico ................................................................................... 2 ml.

Procedimiento:

1. Rescatar los cortes histológicos del agua .

2. Teñir con azul de Nilo durante 20 minutos.

3. Lavar con agua del grifo durante 10 minutos.

4. Montar en medio acuoso.


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Resultados:

- Ácidos grasos ........................................................................ Azul oscuro

- Grasas .......................................................................................... Rosa-rojo

Consejos para la técnica.

• Los lípidos no reaccionan con ningún colorante; si se quieren identificar habrá que recurrir a las técnicas expuestas.

• Hay que tener en cuenta que las grasas se disuelven en alcohol y xileno; la mayoría de las grasas se van disolviendo si utilizamos disolventes colorantes.

• La fijación para las células la realizaremos con formol tamponado al 10%.

3.10 Técnicas para la identificación de pigmentos e iones metálicos

3.10.1 Técnica para detección de iones férricos Es la técnica más importante para identificar hierro en los tejidos. El fundamento

de la técnica es aprovechar la propiedad que tiene el ferrocianuro potásico para transformarse en presencia de hierro férrico, en ferrocianuro férrico (azul) por acción del ácido clorhidrico, que actúa como desencadenante de la reacción.

Reactivos:

a) Solución de ferrocianuro potásico al 10% :

Ferrocianuro potásico .................................................................... 10 gr.


b) Ácido clorhídrico al 2% :

Ácido clorhídrico concentrado ..................................................... 2 ml.


c) Solución de ferrocianuro potásico-ácido cclorhidrico.Se prepara a partes iguales a y b en el momento de su uso.

Procedimiento:


2. Hidratar los cortes hasta agua destilada.

3. Tratar los cortes con la solución c (ferrocianuro potásico-ácido clorhidrico) durante 20 minutos.


5. Contrateñir con rojo nuclear durante 1-2 minutos.




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Resultados:

- Hierro férrico ........................................................................................ Azul

- Núcleos ................................................................................................. Rojo

3.11 Técnica para la detección de iones cálcicos El fundamento de esta técnica es la sustitución de los iones cálcicos intratisulares

en forma de fosfatos o carbonatos, por iones de plata en solución acuosa. Lo que detectamos con la técnica de Von Kossa son los iones fosfatos y carbonatos, que en el organismo se encuentran ligados al calcio.

3.11.1 Técnica de Von Kossa Reactivos:

a) Solución acuosa de nitrato de plata al 1%.

b) Solución de tiosulfato sódico al 2.5%.

c) Solución de rojo neutro al 1%.

d) Solución de pirogalol al 1%.(para la técnica en la oscuridad)

Procedimiento:



3. Tratar los cortes con solución de nitrato de plata entre 30-60 minutos(en la claridad).


5. Lavar con tiosulfato sódico durante 5 minutos.


7. Contrastar con rojo neutro durante 2-5 minutos.


Resultados:

Hueso mineralizado y calcificaciones ..................................... Negro

Núcleos ................................................................................................. Rojo

Procedimiento en la oscuridad:



3. Tratar con nitrato de plata al 5% durante 10-60 minutos en la oscuridad.


5. Tratar con la solución de pirogalol al 1% para revelar durante 2 minutos.

6. Añadir el tiosulfato sódico al 5% durante 3-5 minutos.


8. Contrateñir con rojo neutro durante 1-3 minutos.


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Resultados:

- Depósitos cálcicos ......................................................................... Negro

- Núcleos ................................................................................................. Rojo

- Estructuras restantes ................................................. Amarillo dorado

3.12 Técnicas para la identificación de microorganismos 3.12.1 Técnica para la determinación de bacterias

Las técnicas histológicas de rutina no permiten identificar de modo específico las bacterias por lo que necesitamos de técnicas específicas. Las técnicas más comunes para lograr dicho propósito son la técnica de Gram y la técnica de Ziehl-Neelsen.

3.12.1.1 Técnica de Gram Su fundamento es similar al de la técnica de Weigert, de manera que las bacterias

poseerían una cápsula rica en grupos sulfhidrilos, susceptibles de formar enlaces estables con el violeta de metilo.

Reactivos:

a) Solución acuosa de violeta de metilo al 1%.

b) Solución yodada de Gram:

Yodo sublimado .................................................................................. 1 gr.



c) Tintura de yodo:

Yodo sublimado .................................................................................. 2 gr.


Agua destilada..................................................................................... 2 gr.

Alcohol etílico 90º .......................................................................... 74 ml.

Disolver el yoduro potásico en el alcohol en caliente. Añadir el yodo y disolver.

d) Solución alcohólica yodada:

Tintura de yodo ................................................................................. 1 ml.

Alcohol etílico absoluto ............................................................... 99 ml.

e) Rojo nuclear al 1%.

Procedimiento:



3. Aplicar Violeta de metilo al 1% durante 3 minutos.

4. Añadir solución yodada de Gram durante 3 minutos.

5. Lavar bien los cortes con agua corriente.


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6. Diferenciar con solución alcohólica yodada hasta que deje de salir color.

7. Lavar en agua corriente durante 3-5 minutos.

8. Contrateñir con rojo nuclear al 1% durante 2 minutos.


10. Aclarar con alcohol absoluto hasta eliminar el exceso de rojo nuclear . Secar con papel de filtro.

Resultados:

- Bacterias Gram (+) .............................................................. Azul-Negro

- Bacterias Gram (-) ............................................................................. Rojo

- Núcleos ................................................................................................. Rojo

3.12.1.2 Técnica del Ziehl-Neelsen Algunas micobacterias son difícilmente identificadas con la técnica de Gram

porque poseen una gruesa cápsula protectora que la atravesaremos con derivados de la fucsina utilizando calor.

Reactivos:

a) Solución de Ziehl (fucsina+ácido fénico), está comercializada.

b) Solución diferenciadora :

Alcohol de 70º ................................................................................ 100 ml

Alcohol clorhídrico puro ................................................................... 1ml

c) Azul de metileno al 1%.

Procedimiento:



3. Teñir con fucsina fenicada durante 30 minutos.


5. Diferenciar con alcohol-ácido hasta que la coloración sea de color rosa palo entre 1-3 minutos.

6. Lavar bien con agua corriente durante 3 minutos.

7. Teñir con azul de metileno al 1% durante 1 miinuto.


9. Deshidratar aclarar y montar.

Resultados:

- Bacilos ácido- alcohol resistentes ............................................... Rojo

- Núcleos .................................................................................................. Azul

Es especialmente útil contar con hojas de petición de estudios histoquímicas o técnicas especiales con el fin de facilitar no sólo su clasificación sino también su posterior


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búsqueda y localización. Existen muchas variantes. Ponemos aquí un ejemplo sencillo y abreviado:

UNIDAD DIDÁCTICA IV EL PAPEL DEL TEAP EN EL PROCESADO DE LIQUIDOS


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4.1 Introducción Los líquidos orgánicos enviados al laboratorio de Anatomía Patológica deben de

ser procesados en un paso previo a su estudio. Con el procesamiento de los mismos pretendemos conseguir unas condiciones óptimas que permitan su correcta lectura microscópica. El TEAP jugará un importante papel tanto en la recepción, registro, distribución y procesado de los líquidos orgánicos. La recepción y registro seguirá unos cauces similares a los comentados acerca de las muestras histológicas. Con distribución nos queremos referir a la asignación de dichos líquidos al protocolo oportuno para cada uno de ellos según su naturaleza y características (celularidad y volumen).

Según el modo de obtención de las células podemos hablar de:

• Citología exfoliativa. Nos referimos a las células desprendidas de cavidades cerradas del organismo (peritoneo, cavidad pleural, raquídea y sinovial), de sistemas comunicados con el exterior tales como el aparato respiratorio, digestivo urinario y genital femenino así como de las superficie corporal (piel). La exfoliación puede ser espontánea (no instrumentada) e instrumentada; en este último caso se utilizará instrumental que será el encargado de obtener las células.

• PAAF. Con tal acrónimo se describe la punción –aspiración con aguja fina. A su vez, se puede realizar una primera distinción entre PAAF de órganos superficiales y PAAF de órganos profundos. El papel del TEAP en relación a la PAAF se detalla en la unidad didáctica correspondiente. Aquí sólo nos detendremos en los aspectos técnicos del procesado.

En ambos casos es deseable obtener preparaciones citológicas homogéneas que faciliten su lectura microscópica. Aquí es donde cobra su importancia un buen procesado de las muestras.

Muchas muestras citológicas son recibidas una vez han sido extendidas y fijadas en el punto de origen, generalmente por el facultativo responsable del paciente o bien, en su defecto, por el personal auxiliar. En este caso se reciben portaobjetos que pasan directamente a ser teñidos. Es recomendable realizar una fijación temprana, tras la obtención de la muestra y por ello es conveniente adiestrar al personal facultativo y auxiliar encargado de la obtención de las muestras: tenemos que hacer hincapié en la importancia de una correcta fijación para conseguir un diagnóstico preciso.

El TEAP debe de estar familiarizado con el procesado de las diferentes muestras y será el encargado de decidir qué protocolo aplicar a cada caso individualizado. El fin del procesado de un líquido orgánico es obtener el mayor número de células que puedan ser utilizadas con fines diagnósticos. Para conseguirlo habrá que recurrir en muchas ocasiones a métodos de concentración celular; para ello se utilizan centrífugas (líquidos con gran celularidad) y citocentrífugas (líquidos con escasa celularidad). Bv

4.2 Procesamiento de líquidos 4.2.1 Líquidos con alta celularidad

En primer lugar se comprobará si el líquido está fijado; en caso de no estarlo se fijará con alcohol de 50º a partes iguales (al 50%). Este procesado se realizará en


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centrifuga convencional a unas 3500 r.p.m durante 10 minutos. Para ello se utilizan tubos cónicos desechables en los que se debe de consignar el número de estudio correspondiente. Estos tubos deben cerrarse adecuadamente, bien con tapones o papel de parafilm. Una vez realizada la centrifugación se desechará el sobrenadante existente vertiéndolo en el envase original y, ayudados por una pipeta Pasteur, aspiraremos el sedimento que se ha quedado en el fondo del tubo (es recomendable obtener unos 3-6 extensiones de cada líquido procesado). A continuación se deposita una gota del sedimento en la mitad de los portaobjetos previamente identificados y colocamos sobre los mismos la otra mitad de portaobjetos, también identificados, que deslizaremos, primero en posición horizontal y luego en posición vertical. Se cubrirán todos los portaobjetos así obtenidos con líquido fijador “citospray” que será aplicado respetando una distancia aproximada de 10-15 cm. Después de aplicar la solución fijadora es muy importante volver a extender los portas para evitar que se formen grumos y se dejarán secar al aire hasta el día siguiente estando entonces en condiciones para ser teñidos. En el caso de que sea necesario un diagnóstico precoz o urgente, se puede aplicar calor a los portaobjetos para acelerar la adhesión- fijación celular.

4.2.2 Líquidos acelulares o con escasa celularidad Los líquidos acelulares o con escasa celularidad (orina y líquido cefalorraquídeo) se

procesarán de la siguiente manera:

Las muestras se recibirán en fresco y se centrifugan en un paso previo a la utilización de la citocentrífuga. Se etiquetan-identifican los portaobjetos que van ser utilizados en la citocentrífuga. A continuación se depositan entre 1-3 ml. del líquido orgánico dentro del depósito del citocontenedor y lo tapamos. Procedemos a la centrifugación, con rangos entre 1500 y 1800 r.p.m. durante 5-10 minutos (dependiendo de protocolo y programa a utilizar). Una vez finalizado el programa, se retirarán los citocontenedores que albergan los portaobjetos sobre los que ya se ha depositado el botón celular.

Debido a la escasa celularidad/ acelularidad de estos líquidos, utilizamos portaobjetos tratados (silano…) que facilitan la adhesión celular y minimizan la pérdida de material diagnóstico.


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Las extensiones obtenidas se dejan secar al aire y podrán teñirse al día siguiente. La técnica tintorial a utilizar dependerá de los protocolos existentes en cada laboratorio o a las preferencias de patólogo responsable del diagnóstico. En nuestra experiencia se obtienen buenos resultados si de cada muestra se obtienen extensiones teñidas tanto con una tinción de Romanowski (giemsa, panóptico rápido) como de Papanicolaou (Pap) o HE.

4.3 Obtención de un botón celular Recurriremos a la obtención de un botón celular cuando el líquido que recibimos

es poco celular o bien en el caso de que exista sospecha de algún tipo de patología para la que es importante convertir la muestra celular en una “microbiopsia”. Las ventajas de este proceder son las propias de una biopsia, aunque con limitaciones (realmente no se trata de una microbiopsia si hablamos con propiedad, sino de un acúmulo o condensación celular). En cambio se tratará de un material en condiciones óptimas para la aplicación de técnicas tales como las histoquímicas o inmunohistoquímicas.

Para la obtención de un botón celular se deben de seguir los siguientes pasos:

• En primer lugar, hay que asegurarse que el líquido esté fijado. La fijación debe hacerse con alcohol de 50º al 50% (a partes iguales de líquido y alcohol).

• Se centrifuga el líquido durante 10 minutos a 3500 r.p.m

• Se decanta el líquido, y al sedimento restante se le añade alcohol de 70º, centrifugando otros 10 minutos a 3500 r.p.m

• Se vuelve a decantar y al sedimento restante se le añade formol; volveremos a utilizar la centrifuga, pero esta vez durante 5 minutos, entre 1500-1800 r.p.m.

• Ya podemos observar el botón celular, sólido, flotando en el formol.

• Por último, el botón obtenido se introduce en un casete histológico y se procesa según el protocolo de biopsias (realmente estamos ante una microbiopsia).

4.3.1 Procesado de esputos Las muestras procedentes de la expectoración espontánea o inducida (esputos) se

reciben en fresco en el laboratorio. El TEAP procederá a añadir alcohol de 50º al 50% para posteriormente disgregar el moco utilizando el agitador automático (Vórtex)(bastarán unos cuantos minutos de agitación). Una vez que se observa la disgregación del moco (macroscopicamente es posible hacerlo), se captura el sobrenadante. Si éste es escaso, se extiende directamente sobre un portaobjetos y se fija con citospray para proceder posteriormente a su fijación. En el caso de que se obtuviera bastante material, éste se centrifugaría durante 10 minutos a 3500 r.p.m., desechando el sobrenadante y capturando el sedimento para su extensión, fijación y tinción.


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No queremos terminar esta unidad didáctica sin hacer referencia al método de filtración-adhesión en citología urinaria, existiendo trabajos que comunican incluso mejores resultados que los obtenidos por la centrifugación en relación ala detección de lesiones del aparato urinario expresadas en la orina. Se trata de un método sencillo, sensible y de bajo coste con el que se obtienen excelentes resultados.

Hasta la aparición de los filtros de membrana y de las citocentrífugas, la centrifugación ha sido el único método de concentración celular de la orina. Los resultados no siempre han sido todo lo satisfactorios que hubiera sido deseable. Los filtros de membrana son muy útiles en este sentido aunque requieren por parte del TEAP una cuidadosa manipulación técnica y mayor observancia en cuanto a procesado y conservación. Las citocentrífugas, por su parte, han simplificado el manejo técnico de las muestras y han facilitado asimismo la observación microscópica pues concentran el material citológico en un área de observación reducida

Cuando hablamos de un sistema de filtración-adhesión en citología urinaria nos estamos refiriendo al uso de filtros de nitrocelulosa de 25 mm. de diámetro con un poro de 0.45 micras (Millipore) expandidos previamente en agua y colocados sobre la rejilla de un sistema de filtración. Del fondo del recipiente de la orina se obtiene una pequeña cantidad mediante una pipeta Pasteur, que se deposita sobre el filtro, dejándolo filtrar sin utilizar presión negativa. La velocidad de goteo nos indicará el grado de saturación del filtro y cesará cuando ésta sea total. La superficie del filtro debe de quedar húmeda, sin líquido sobrenadante y mientras, se preparan portaobjetos extendiendo sobre una de sus caras una pequeña cantidad de gelatina de alumbre de cromo sobre la que se improntará la cara celular del filtro. Con una pinza plana se retira el filtro, con mucho cuidado, y el disco celular resultante se fija y se tiñe según rutina.

UNIDAD DIDÁCTICA V PAPEL DEL TEAP EN LA CONFECCIÓN DE

LOS BLOQUES HISTOLÓGICOS


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5.1 Papel del TEAP en la confección de los bloques histológicos La confección de los bloques histológicos es un proceso mediante el cual se

incluye un tejido en un medio de inclusión. Conseguimos con ello aportar al tejido un medio sólido y homogéneo con la dureza y plasticidad adecuadas para poder realizar cortes de hasta tres micras de espesor con el mocrotomo.

Este proceso se realiza en las llamadas estaciones de blocaje, constituidas esencialmente por:

• Placa caliente

• Dispensador de parafina

• Placa fría (enfriamiento lento a 10-15º C)


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Actualmente, las nuevas estaciones de blocaje están compuestas por dos equipos diferentes: la placa fría y la unidad dispensadora de parafina. Ambas se pueden instalar según convenga a la rutina de cada laboratorio.

En la unidad dispensadora de parafina encontramos:

• Un depósito de parafina para la confección de bloques: Esta parafina será pura y sólo se utilizará para la elaboración de los bloques.

• Un cuadro de control desde donde se podrán cambiar los valores de las temperaturas del aparato.

• Un sistema de iluminación y lupa, muy útil para la orientación de piezas milimétricas.

• Ajuste de caudal de la parafina.


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• Dos receptáculos con control de temperatura, uno para los moldes y el otro para los casetes donde estos recibirán su último baño de parafina (también debe ser pura) antes de ser encastrados en un molde. Ambos receptáculos son intercambiables y extraíbles.

• Dispensador de parafina. Puede controlarse de forma manual, gracias a un interruptor, o mediante un pedal. La distancia entre la superficie de trabajo y el dispensador es aproximadamente de unos cuatro centímetros.

• Pocillos calefactados para las pinzas.

• Placa caliente, con un sistema de canalización para la parafina, evitando de esta manera que se acumule en la superficie de trabajo.

• Dos recipientes de gran volumen, calentados y extraíbles, para el vaciado de la parafina sobrante.


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• Zona de enfriamiento integrada dentro de la placa caliente que facilita la orientación de las muestras.

• Reposabrazos ergonómico.

Para la realización de los bloques utilizamos moldes metálicos de distintos tamaños. Su elección dependerá únicamente del tamaño del especimen. Se recomienda escoger el que mejor se adapte a la muestra.

Una vez abierto el casete y comprobadas las dimensiones de la muestra, se toma el molde y se vierte un poco de parafina en la base; a continuación se deja caer la pieza en la parafina líquida y con la ayuda de unas pinzas (se recomienda que no tengan dientes) o de una aguja histológica se le dará la orientación deseada.

Es muy importante la correcta orientación del bloque teniendo en cuenta que la cara inferior del mismo será finalmente la superficie de corte. Por lo general, la superficie de sección debe encontrarse de forma plana. Si se trata de múltiples fragmentos, estos se colocarán sobre un mismo plano.

Si la pieza posee una consistencia heterogénea, habrá que orientar la pieza de tal modo que sean las áreas de menor consistencia (áreas blandas) las primeras en contactar con la hoja del mocrotomo (ej. en las pieles, la epidermis debe de estar orientada hacia arriba). En el caso de las muestras tubulares, con luz central, será necesario realizar una orientación tal que la superficie luminal quede paralela a la superficie de corte.


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Se recomienda que sea el mismo técnico que asiste la macro el que realice al día siguiente los bloques correspondientes. Si el trabajo lo realizara otro técnico, deberá revisar las hojas de trabajo donde estarán anotada las características de la muestra con el fin de realizar una adecuada orientación de la misma.

Realizada la orientación de las muestras, se coloca el molde en la zona de enfriamiento y una vez fijada la muestra, con la ayuda de pinzas o pesas, y comprobado que ha quedado inmovilizada en el fondo del molde se procede a poner encima el casete con el número identificativo de la biopsia. A continuación, se terminará de rellenar con parafina y se trasladará el molde a la placa fría para que la parafina termine de solidificarse; por último, se procederá al desmoldado del bloque, acción facilitada con la contracción que presenta la parafina en contacto con la superficie fría.

Después se eliminarán los restos de parafina solidificada que hayan podido quedar alrededor con la ayuda de una navaja o cuchillo dejando el bloque listo para que éste encaje sin problemas en el cabezal del mocrotomo.


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Una vez finalizada la confección de los bloques, el TEAP debe proceder a la limpieza de la estación de blocaje y sus accesorios:

Los moldes se lavan con una solución de alcohol de 70º y glicerina líquida aunque también se pueden lavar en el procesador de tejidos junto con las pinzas (pero ello supondría un alto e innecesario consumo de reactivo).

Se deben escurrir las cubetas de contención de la parafina que ha sido canalizada. Estos contenedores, al estar calientes, se limpian de forma fácil eliminándose el exceso con una espátula y papel secante.

Quitar el exceso de parafina que se haya solidificado en la zona de trabajo y seguidamente pasar un paño por toda la superficie. Si está muy sucia, se recomienda que el paño esté humedecido con xilol, teniendo precaución de no pasarlo por zonas de plástico.

Desenchufar la placa fría y eliminar los restos de parafina de la misma.

Rellenar de parafina pura el contenedor correspondiente con el fin de que éste se encuentre con la cantidad suficiente para la realización de los bloques del día siguiente.

UNIDAD DIDÁCTICA VI PAPEL DEL TEAP EN EL PROCESAMIENTO DE

MUESTRAS HISTOLÓGICAS


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6.1 Introducción La mayoría de las muestras recepcionadas en el laboratorio de Anatomía

Patológica para un estudio histopatológico tienen que ser incluidas en un medio sólido, para aportar a los tejidos la dureza necesaria para la obtención de cortes finos, regulares y homogéneos.

El objetivo fundamental del procesado consiste en rellenar los espacios o huecos de los tejidos tanto intra como extracelulares que anteriormente contenían agua pero que al realizar la deshidratación del tejido preparan esos espacios para ser ocupados por otro medio sólido (parafina)

Esta labor es realizada por los procesadores automáticos, que dependiendo de cada centro hospitalario y del volumen de trabajo serán de un tipo u otro.

Por un lado, contamos con el procesador automático de carrusel con un volumen para 100 casetes aproximadamente, formado por diez frascos de cristal y dos metálicos. Estos últimos poseen las resistencias necesarias para mantener la parafina en su punto de fusión.


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Por otro lado, el procesador de tejidos al vacío, más moderno y funcional se compone de:

o Una unidad de procesamiento formada por tres estaciones de parafina y una retorta de acero inoxidable de 4,3 litros de capacidad en la que se pueden llegar a procesar 300 casetes de forma simultánea. Aquí se ubica tanto la pantalla táctil como los componentes electrónicos. En la retorta se realiza el procesamiento de las muestras tisulares aplicándose los parámetros de presión, vacío y temperatura, anteriormente seleccionados.

o Una unidad de reactivos en la que se localizan 14 contenedores de los cuales diez contienen los reactivos para el procesado, tres se utilizan para el lavado y un último contenedor de condensación. La capacidad máxima de cada uno es de 5 litros.

Por encima de los contenedores de esta unidad también se localiza el filtro de carbón activo y por debajo, la bandeja colectora de reactivos.

Este tipo de procesadores tienen unas ciertas prestaciones:

• Sistema de gestión de reactivos. Indica duración y frecuencia de uso de cada reactivo individualmente.

• Sistema de recirculación.

• Sistema para llenado/vaciado a distancia de los reactivos.

• Vaciado a distancia de las estaciones de parafina.

• Medidor óptico de nivel de llenado.

• Ciclo de depuración activa de la parafina.

• Agitador magnético.

• Hora de finalización programable, para los programas de procesamiento.

• Vaciado de retorta en tres fases.

• Procesamiento a presión ambiente, presión, vacío o presión/vacío combinados.

• Cuatro programas de lavado programables.


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El TEAP es el encargado del mantenimiento y conservación de esta máquina, así como de la preparación de los líquidos necesarios que se utilizan en ella

6.2 Pasos del procesamiento de las muestras 6.2.1 Fijación

El objetivo de esta fase es impedir la descomposición o transformación de los componentes celulares. Por tanto, el líquido fijador tiene que poseer la capacidad de conservar la estructura y/o composición química de los tejidos. Para obtener unos buenos resultados, habrá que realizar una buena fijación. El líquido fijador por excelencia es el formol.

El volumen del fijador debe ser 30-40 veces el volumen de las piezas y se aconseja el pase por más de un baño, para evitar el endurecimiento de las muestras y el envejecimiento prematuro del líquido fijador.

Algunos centros hospitalarios prescinden del formol en el procesador, utilizando un mayor número de baños de alcohol ya que además de deshidratante también actúa como fijador.

6.2.2 Deshidratación La finalidad es obtener un grado de consistencia (dureza) idóneo de las muestras

así como la eliminación del agua tisular ya que ésta no es miscible con los medios de inclusión.

Hay muchos tipos de agentes deshidratantes pero el más usado y el que da mejores resultados es el alcohol etílico en concentraciones crecientes, por lo que es indispensable que el laboratorio disponga en todo momento de alcohol puro o absoluto ya que a partir de él podemos obtener los demás alcoholes de graduación inferior.

Una función muy importante que el agente deshidratante debe cumplir es la no alteración de las estructuras tisulares.

6.2.3 Aclaramiento Consiste en eliminar el alcohol presente en los tejidos ya que éste no es miscible

con el medio de inclusión. Los líquidos que eliminan el alcohol y disuelven la parafina se llaman líquidos intermedios. El liquido intermedio más utilizado es el xileno, que también puede ser sustituido por la isoparafina con la única ventaja de no ser ecotóxico.

6.2.4 Inclusión En esta fase, la parafina ocupa los huecos resultantes de la eliminación del agua

tisular aportando la consistencia necesaria para la realización posterior de cortes de 3–4 micras de espesor.

La inclusión se realiza a una temperatura de fusión de la parafina comprendida entre 45-60º C.

Aquí acaba la función del procesador. Posteriormente, se trasladarán los bloques a la estación de blocaje en la que las muestras serán incluidas en bloques de parafina siendo esta última pura, evitando en todo momento permanecer en contacto con vapores del disolvente intermedio.


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Una vez mostrados los pasos del procesamiento, podemos citar la labor que desempeña el TEAP:

- Colocar la cestilla en la retorta con la precaución de que esté debidamente cerrada.

- Idear el programa de procesado que más se adecue al tipo de muestras que se reciban.

Veamos un ejemplo:

Baños Duración del procesamiento

• Formol

• Formol

• Alcohol 50º

• Alcohol 70º

• Alcohol 96º

• Alcohol de 100º

• Alcohol de 100º

• Xilol

• Xilol

• Xilol

• Parafina

• Parafina

• Parafina

• 1 hora

• 1 hora

• 1 hora

• 1 hora

• 1 hora

• 1 hora y 30 minutos


• 1 hora

• 1 hora

• 1 hora




- Realizar la puesta en marcha del procesador, indicando el número de bloques que se van a procesar, asegurándose de que arranque sin problemas y que terminará a la fecha y hora a la que se le indica. A continuación, bloquear el procesador para evitar problemas.

- Comprobar que los líquidos estén en perfecto estado. Si el procesador no cuenta con un dispositivo de alarma sobre el estado de los líquidos, habrá que observar si los alcoholes están muy turbios ya que sería indicativo de que están hidratados y no realizarían bien su función; por tanto, el corte al mocrotomo no sería el adecuado.

- Realizar el cambio de reactivos. Parece una afirmación obvia pero queremos resaltar su gran importancia. Si no se recambian la técnica presentará numerosos sesgos.


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- Comprobar el estado de la parafina, sus niveles y su aspecto.

- Cada 3 meses aproximadamente, cambiar el filtro de carbón activo para evitar los olores y los vapores tóxicos de los reactivos que se utilizan durante el procesamiento. La durabilidad dependerá del funcionamiento y del tipo de reactivos utilizados.

- Limpiar el procesador pasando un paño ligeramente humedecido con xileno o alcohol por el interior de la retorta, para quitarle en lo posible el exceso de parafina que haya quedado adherida en sus paredes. A continuación, seleccionar el tipo de lavado que se desea realizar (corto, estándar o largo). Se pasará un paño seco por la pantalla y se limpiara el exterior del equipo.

- Realizar un registro de control y calidad del aparato, anotando qué líquidos han sido cambiados y quién ha sido el responsable de hacerlo.

6.3 Posibles errores y soluciones en el procesamiento de las muestras

6.3.1 Puesta en marcha del procesador Es necesario asegurarse de que la tapa de la retorta se cierra de forma adecuada, y

que el procesador se chequea convenientemente, comprobando que todos sus reactivos se encuentran en los niveles adecuados para su puesta en marcha. Si no se comprueba, el procesador no arranca y, por tanto, las muestras no se procesan, implicando un retraso en el laboratorio y un fallo en los plazos de entrega establecidos por el centro. Para evitar que esto ocurra, el TEAP debe esperar a que la máquina confirme el chequeo y comience su funcionamiento.

El procesador debe acabar a la hora y fecha señalada por el TEAP ya que, de lo contrario, supondría un retraso en el laboratorio a la hora de entregar el trabajo.

6.3.2 Utilización de reactivos Los reactivos utilizados durante el procesado tienen que ser compatibles en todo

momento. El técnico debe verificar que estos sean miscibles unos con otros para que cada reactivo actúe de forma adecuada y deje paso al siguiente reactivo en la realización de su función.


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No preparar los reactivos necesarios para el procesamiento en lugares inapropiados para dicha tarea. El TEAP deberá prepararlos bajo la campana de extracción de gases y utilizar los medios de protección necesarios (guantes, mascarilla y protector de ojos) ya que estos productos son tóxicos.

6.3.3 Fijación Controlar el tiempo de fijación de los especimenes:

Una excesiva fijación provocaría que los bloques, al corte, resultaran muy duros, mellando la cuchilla y no siendo adecuados para su observación al microscopio. Es indispensable controlar los tiempos con el fin de que esto no suceda puesto que un exceso en la fijación no se puede subsanar.

Si la fijación es escasa, los especimenes no adquieren la dureza necesaria y al corte, el resultado sería la obtención de un hueco en el lugar del tejido. La solución supone dar la vuelta al proceso y empezar de nuevo partiendo de la fijación, aumentando los tiempos de ésta.

6.3.4 Deshidratación Si los alcoholes no se ubican de forma adecuada, es decir, en graduación

ascendente, los especimenes presentarán un aspecto gelatinoso, y al corte será imposible obtener muestra alguna. Esto se puede subsanar dando la vuelta al proceso hasta el paso de la deshidratación y realizarla correctamente. En caso de duda, un método práctico para comprobar si los alcoholes están en graduación ascendente sería coger en un frasco el último alcohol que hemos colocado en la deshidratación y añadirle con una pipeta un poco de xilol. Si este no se mezcla y se muestran separados como el aceite y el agua se trata de un signo indicativo de que la graduación del alcohol no es de 100º.

Si la deshidratación es incompleta, se producirán grietas en el tejido. La solución consiste en volver hasta al paso de la deshidratación y comenzar de nuevo el proceso aumentando el tiempo del paso por los alcoholes.

6.3.5 Xilol Es necesario controlar el tiempo de permanencia de los tejidos en xilol ya que

mucho tiempo los endurece.

6.3.6 Parafina Si la parafina se sobrecalienta, se vuelve amarilla y una vez que se enfría se

saponifica, debido a su oxidación. El tamaño de los cristales de la parafina solidificada es un punto importante, de esto va a depender la mayor o menor facilidad con que se deje cortar. Por consiguiente, debemos controlar la temperatura de la parafina manteniéndola en los niveles de fusión de la misma (45-60º C) y no sobrepasarla.

Si los bloques obtenidos son friables, granulosos y sembrados de pequeñas manchas blanquecinas, es debido a la presencia de vapores de formol en la parafina por lo que la solución sería rehacer la inclusión y para evitar que esto suceda, hay realizar un control de los contenedores de la parafina, depurándola y renovándola en caso necesario.


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6.4 Corte al mocrotomo Una vez realizados los bloques, estos han de ser cortados con el mocrotomo. El

mocrotomo más utilizado en los laboratorios de Anatomía Patológica es el denominado mocrotomo de rotación o tipo Minot con el que se realizan secciones delgadas de tejidos incluidos en parafina de hasta tres micras de espesor.

Existen varios modelos de mocrotomos de rotación cuya característica común es que todos son de construcción rígida.

En general, los mocrotomos están formados por tres partes fundamentales:

1. El porta-bloques, en el que se deposita el bloque de parafina. Éste va a permitir una doble posibilidad de posicionamiento tanto vertical como horizontal y consta de una pinza de fijación rápida y un sistema de orientación en todos los ejes, asegurando una orientación simple y exacta de la superficie de la muestra. El porta-bloques colocado en posición vertical se mueve arriba y abajo delante del filo de la cuchilla; tal movimiento tiene como objetivo la obtención de cortes delgados además de seriados. Se recomienda que el brazo del porta-bloques se encuentre próximo a la caja del mocrotomo, para evitar vibraciones durante el proceso de corte.

2. Soporte para cuchillas. Como su nombre indica, es el encargado de sujetar con firmeza la cuchilla. Este soporte se localiza en el “carro” del mocrotomo, que a su vez se encuentra sujeto a la base del mismo por medio de unos raíles, evitando su movimiento con una palanca de seguridad. La base para cuchillas dispone de un mecanismo de ajuste lateral, lo que nos va a permitir el aprovechamiento de la totalidad del filo de la cuchilla sin tener que estar modificando continuamente el ajuste del ángulo libre del porta-cuchillas La palanca que controla el ángulo de corte esta situada a la derecha del carro y posee una escala de grados de angulación que oscila entre 0º y 10º, siendo su posición adecuada la mitad, es decir, 5º.

Existen distintos tipos de cuchillas para los mocrotomos .

• Bicóncava.

• Plano-concava tipo a y b, para cortes en celoidina.

• Biplanas con faceta tipo d que se emplean en casos especiales como por ejemplo en huesos.

• Biplana con cuña tipo c. Sus caras planas dan gran rigidez a la cuchilla y el hecho de que sus facetas sean planas configura rigidez y no se producen vibraciones. Es la más usada ya que nos permite cortar tanto tejidos blandos como duros. También es utilizada en criostato.

3. Sistema de avance mecánico. Permite seleccionar distintos avances del portabloques respecto a la cuchilla, inmóvil. Dicha distancia de avance, medida en micras puede ser regulada de modo que el rango de distancias recorridas por el portabloques en cada movimiento oscila entre 0 y 60 micras (Estas micras pueden ser visualizadas en una ventanilla situada en la parte superior derecha del mocrotomo). Esta versatilidad permite realizar un desbastado inicial del bloque histológico objeto de corte utilizando para ello entre avances amplios, de 15-20 micras, utilizando posteriormente avances cortos al realizar las secciones de hasta


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3 micras (cuanto más finas sean, mejor). Contamos además con un sistema de retorno en cada recorrido con el fin de que el retroceso no provoque el roce del bloque con la cuchilla.

A la izquierda del mocrotomo, se encuentra una manivela de recuperación del avance del brazo porta-bloques que mueve el porta-bloques hacia atrás y hacia delante. A la derecha hay una manivela que hace que el porta-bloques se mueva de arriba hacia abajo. Cuando el movimiento de rotación del brazo del mocrotomo se convierte en lineal se produce además el avance automático y constante del porta-bloques

Podemos destacar algunas ventajas e inconvenientes de este tipo de mocrotomo:

Ventajas:

Es pesado, aportando más precisión en los cortes, lo que permite obtener secciones seriadas muy finas.

El mecanismo de avance es exacto.

Nos permite cambios de ángulo de la cuchilla

Nos permite cortar bloque de mayor tamaño.

La cuchilla es grande y gracias a su estabilidad y sujeción no transfiere vibraciones.

Inconvenientes:

Se utiliza exclusivamente para realizar cortes de tejidos incluidos en parafina no pudiéndose realizar cortes de tejidos incluidos en celoidina, gelatina y propilenglicol.


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6.4.1 Factores que influyen en la calidad de los cortes 6.4.1.1 Temperatura: La temperatura ideal para la realización de los cortes de los bloques es de unos

10º, consiguiendo con ello uniformar la consistencia del bloque, es decir, su grado de dureza para obtener un corte uniforme y fino.

6.4.1.2 Filo de la cuchilla: La cuchilla debe estar siempre en perfecto estado a la hora de realizar los cortes

con el fin de evitar los siempre desagradables rayados. Por tanto es importante desbastar utilizando un lado de la cuchilla y cortar con el otro.

6.4.1.3 Ángulo de inclinación de la cuchilla: El ángulo debe seleccionarse según el tipo de tejido que se vaya a cortar.

Cuanto mayor sea este ángulo, mejor se cortarán los tejidos blandos y cuanto menor sea éste mejor se cortarán los tejidos duros. El ángulo de inclinación de la cuchilla ideal oscila entre los 10 y 15 º ya que con menos ángulo se acumularían restos de secciones en la faceta que mira al bloque.

6.4.1.4 Velocidad de corte La velocidad de corte varía con el tipo de tejido que se vaya a cortar; los tejidos

blandos se cortarán mejor a una baja velocidad y los tejidos duros se cortarán mejor si se aumenta la velocidad de corte.

6.4.2 Técnica del corte Obtenidos los bloques, estos son enfriados bien en una placa fría, en un recipiente

con hielo o frotando la superficie de corte con un cubito de hielo.

Antes de empezar a cortar hay que preparar el material que vamos a utilizar durante el proceso: portaobjetos, lápices, agujas histológicas, pinzas, pincel, alcohol de 50º, cuchillas para el mocrotomo, gasas, cestilla para la colocación de los cortes y baño de flotación.

En primer lugar se realiza el desbastado de los bloques, que consiste en retirar la parafina en exceso que existe en el bloque y parte del tejido hasta obtener la superficie total del tejido para realizar el corte. El desbastado se realiza a unas 15-20 micras.

Cuando se alcanza la zona de interés se cambia la cuchilla, se enfría el bloque y se procede al corte. Los primeros cortes quedarán enrollados en el filo de la cuchilla y con la ayuda de un punzón serán recogidos sin que se produzca roce con el filo de la cuchilla evitando así que se mellen hasta conseguir que salga una fila seriada de cortes, desechando los primeros cortes.

Una vez obtenida esta fila de secciones, se puede observar que la cara superior de las mismas muestra un aspecto mate mientras que la inferior es brillante.

A continuación, el corte se coloca sobre el portaobjetos con la cara brillante mirando siempre hacia


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abajo, se humedece el portaobjetos con alcohol de 50º y se deja caer cuidadosamente en el baño de flotación. Hay algunos tejidos que no precisan del alcohol, por lo que una vez obtenido el corte, y con la ayuda de unas pinzas y el punzón, se vierten directamente en el baño con la cara brillante siempre hacia abajo.

El interior de los baños de flotación está fabricado con aluminio anonizado de color negro, para una mayor visualización de los cortes. El baño de flotación se debe de encontrar a una temperatura de 45-50º y contiene agua corriente. Al dejar caer el corte en el baño, éste se estira debido a la tensión superficial, y flota; si existiesen pliegues se estirarían al ponerlos en el baño.

Una vez estirados los cortes se procede a su captura ayudándose también del punzón y del porta-objetos, el cual se introducirá verticalmente en el baño, se aproximará al corte que hemos seleccionado y se sacará despacio para posteriormente etiquetarlo con el número de biopsia que le corresponde. Hay que tener especial cuidado con la eliminación completa de cualquier rastro de secciones de cortes anteriores entre el corte de una biopsia y otra para evitar contaminaciones. Esto se consigue quitando los restos con una aguja o pasando una gasa por la superficie del agua.

Por último, se procede al secado de los cortes antes de iniciar el proceso de coloración con el fin de evitar desprendimientos respecto portaobjetos.


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6.4.3 Algunos errores y su solución Para que el diagnóstico de las muestras sea posible es necesario disponer de

material de calidad; al hablar de material estamos incluyendo unos buenos cortes histológicos.

El TEAP debe de realizar buenos cortes con el menor grosor posible con ausencia de artefactos que dificulten posteriormente la lectura microscópica. El TEAP que no cumpla con estos requisitos debe de practicar hasta cumplirlos pues se trata de un punto de conflicto con el patólogo, persona encargada del control de calidad de los mismos.

El primer y más común error es presentar cortes histológicos que no han sido primeramente contrastados. La simple inspección visual del aspecto macroscópico de los cortes debe de aportar al TEAP suficiente información como para proceder a la entrega de los mismos o bien considerar su repetición.

Cuando los cortes no son buenos, significa que algo está fallando. Aquí exponemos algunos de los errores más comunes:

- Que la cuchilla no esté bien fijada al portacuchillas. Se nos presentará el problema de no poder cortar el bloque debido a las vibraciones; podemos incluso producir mellas en el bloque histológico a desbastar. Es fundamental ser sistemáticos a este respecto y revisar, previamente al corte, cada una de las palancas y mecanismos que puedan influenciar la fijación tanto del bloque histológico como de la cuchilla. Así, el enfrentamiento entre el bloque y la cuchilla será estable y homogéneo.

- Que el portabloques no esté bien orientado. Tanto a la hora de desbastar como de realizar los cortes comprobaremos que el bloque está más gastado en uno de sus extremos (desgastamiento heterogéneo). Este hecho puede tener consecuencias no deseables tales como la pérdida de material durante el proceso de homogenización del corte. Cuando nos demos cuenta de que el corte no es homogéneo será prudente y aconsejable orientar de nuevo el portabloques respecto a la cuchilla.

- Obtención de cortes de diferente grosor. En este caso el problema se deberá a la orientación de la cuchilla (o bien no es la adecuada o no está fijada de un modo adecuado).Cortes de diferente pueden asimismo ser consecuencia de una mala fijación del soporte de la cuchilla. En el primer caso la solución reside en orientar correctamente la cuchilla y ajustarla; en el segundo caso, fijar bien la cuchilla al soporte apretándola con el tornillo de ajuste o palanca (según modelo del mocrotomo).

- Los cortes que salen tienen estrías. Seguramente en este caso el problema lo esté dando la cuchilla. La solución es cambiar el campo de la cuchilla que estamos usando o limpiarla con una gasita o papel seco con el fin de eliminar restos de otra biopsia que estén produciendo el problema.

- Si por el contrario los cortes se desquebrajan y/o pulverizan, el problema puede venir de la cuchilla o del tejido que estamos cortando. La cuchilla puede estar muy mellada y también puede ser que el tejido que estemos cortando sea muy hemático, duro o esté demasiado frío. En este caso si es por la cuchilla la moveremos de campo, si es por el tipo de tejido solo debemos dedicarle un par de cortes más hasta que el tejido haya cogido la


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temperatura que necesita para estirarse al entrar en la cuchilla y no desquebrajarse y, aparte un cambio de micras (+-1) tampoco le vendrá muy mal ; es a lo que se le llama “jugar con el corte para engañarlo hasta que salga”.

- También puede ocurrir que el corte salga enrollado (no se forma una cinta de cortes). En este caso podemos decir que la temperatura de la cuchilla no es la adecuada ya que el corte se estira con la diferencia de temperatura. Tampoco habría que descartar el exceso de grosor de los cortes (en este caso solo tendríamos que disminuirlo para obtener un corte optimo).

UNIDAD DIDÁCTICA VII PAPEL DEL TEAP EN LA SALA DE MACROSCOPÍA


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7.1 Papel del TEAP en la sala de macroscopía El estudio macroscópico de las piezas quirúrgicas en el laboratorio de Anatomía

Patológica recibe el nombre familiar de “tallado” y comprende tanto la visualización de la pieza en estudio como su corte e inclusión en bloques histológicos.

El TEAP juega un importante papel en la asistencia al patólogo a lo largo de todo el proceso. El proceso comienza en el mismo momento en el que se reciben los especimenes en el laboratorio pues, al ser registrados, reciben el número identificativo con el que serán reconocidos. El TEAP dispondrá los distintos especimenes en el lugar asignado para tal efecto tras asegurarse de que existe una correcta correspondencia entre peticiones de estudio anatomopatológico y muestras, y de que los primeros cumplen con los estándares de cumplimentación.

El TEAP es el encargado de la disposición y mantenimiento del material necesario para realizar el estudio macroscópico de las muestras de modo que cuando el patólogo comienza el estudio, todo debe de estar dispuesto:

- Casetes de inclusión histológica debidamente numerados

- Recipientes y frascos ordenados y con el adecuado volumen de fijador

- Instrumental debidamente dispuesto para su uso:

o Mango y hojas de bisturí

o Tijeras

o Cuchillos

o Regla de acero inoxidable

o Colador

o Guantes de látex

- Recipiente con agua para limpieza de instrumental

- Papel secante sobre el que se realizará el proceso

- Tinta para tinción de piezas (márgenes)

- Pincel o torunda que facilite la aplicación de la tinta


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- Fijador de tinta (solución de Bouin, ácido acético…)

- Esponjillas para inclusión de muestras pequeñas (endoscópicas), o en su defecto, papel de fumar o similares.

- Contenedor destinado a desechar objetos punzantes (hojas de bisturí…)

- Recipiente con decalcificante

El patólogo deberá de realizar una primera visualización del espécimen a la que seguirá una detallada descripción del mismo. Si bien esta descripción puede ser recogida por un sistema de grabación para su posterior trascripción, son aun muchos los centros que carecen de esta tecnología. En tales casos será el TEAP quien supla esta carencia ejerciendo de transcriptor de las descripciones del patólogo; ésta consistirá en el dictado de las descripciones. Será útil a tal efecto la elaboración de códigos de descripción que reduzcan la fatiga al realizar las transcripciones (ver epígrafe de parte de tallado).

Una vez realizado el tallado del espécimen y la inclusión en los casetes, estos son introducidos en líquido fijador (formaldehído) hasta que llega la hora de procesar las muestras. Es muy importante el papel del TEAP en este paso pues debe de comprobar que los casetes estén correctamente cerrados: la pérdida de material supone un serio problema para el técnico y para el patólogo.

En ocasiones, el TEAP se enfrenta a la desagradable situación de descubrir casetes abiertos y/o muestras que forman parte del sobrenadante del líquido fijador. Recomendamos en estos casos incluir dicho espécimen en un nuevo casete identificado de tal manera que podamos reconocerlo posteriormente. Se comentará el caso con el


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patólogo, que finalmente será el encargado de intentar identificar a qué caso puede corresponder la muestra (esto no siempre es posible).

El TEAP procede a la limpieza del material utilizado. También será el encargado del orden y estructuración de la sala de macroscopía para su ulterior uso.

Aquellas muestras que no hayan sido incluidas en su totalidad serán correctamente identificadas y clasificadas en armarios, estanterías o cualquier otro dispositivo habilitado para tal fin con el objeto que el acceso a las mismas sea cómodo y rápido pues en ocasiones es necesario volver a valorar el remanente conservado en un segundo o tercer tiempo diagnóstico.

A la hora de procesar los tejidos, el TEAP procederá a introducir los casetes en la cestilla del procesador de tejidos e introducirá la misma en su ubicación.

Como podemos deducir de la anterior exposición, el TEAP es un pilar fundamental en el buen fluir de la actividad desarrollada en la sala de macroscopía. Los errores pueden surgir en cualquier eslabón de la cadena de acontecimientos; algunos serán achacables a la labor del patólogo. Los atribuibles al TEAP, intentaremos analizarlos a continuación:

Incorrecta identificación de los frascos contenedores de las muestras: se trata de un error grave en un principio si bien la experiencia demuestra que puede subsanarse en la mayoría de las ocasiones. Es fundamental prestar gran atención a la labor: cuanto más cuidadoso se sea menor será el número de errores de este tipo. La incorrecta identificación de la muestra puede haber sido originada fuera del laboratorio de Anatomía


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Patológica, pero ello no constituye una excusa pues al ser dada de alta la muestra en el mismo, la responsabilidad es asumida por nosotros.

Debemos tomarnos nuestro tiempo en identificar correctamente las muestras y asignarles el número correspondiente, las prisas no son buenas consejeras.

Numeración borrosa: la situación ideal es contar con un rotulador automático de casetes pero lo cierto es que se trata de tecnología de altos precios y hoy día, en la mayoría de los laboratorios, éste es sustituido por el simple lápiz de grafito. El TEAP debe de evitar pasar los dedos por el rótulo una vez identificados los casetes pues puede borrar total o parcialmente la inscripción, con la consiguiente repercusión.

Incorrecto cierre de los casetes: si bien debería ser el patólogo el responsable del cierre de los casetes, el TEAP debe de comprobar dicha operación en un paso previo al depósito de los mismos en un recipiente con fijador. Las esponjillas de inclusión han constituido una agradable aportación a la labor en la sala de macroscopía pues al tempo que evitan la pérdida de muestras de muestras de muy pequeño tamaño, sirven de contraste cromático con el tono blanquecino de la mayoría de los especimenes endoscópicos; en cambio si no son correctamente ubicadas y ajustadas en los casetes, pueden impedir el correcto cierre de los mismos, permitiendo la salida de la muestra en cualquier paso del procesado.

Incorrecta limpieza del material quirúrgico: de ello se derivarían obviamente contaminaciones de las muestras, hecho del todo injustificado.

Decalcificante envejecido: es fundamental llevar a cabo un estricto control del tiempo que lleva preparado el decalcificante; decalcificantes envejecidos no cumplen su función los tejidos no se ponen blandos y por tanto no se pueden cortar. La solución más recomendable es, además de rotular correctamente el frasco que albergue la solución, señalar la fecha y hora en la que fue preparado y/o cambiado.


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Decalcificante ineficaz por error en la preparación de la solución: el TEAP debe de ser riguroso y observador a la hora de hacer las diluciones.

7.2 Parte de tallado Debido al alto número de muestras que se procesan a diario en el laboratorio de

Anatomía Patológica es necesario controlar cada uno de los pasos necesarios en el procesamiento de las mismas. Tras el registro de las muestras a la hora de su recepción, el segundo paso más importante en el control de los especimenes es el registro de las distintas actuaciones que tienen lugar durante el estudio macroscópico de las mismas.

Será responsabilidad del patólogo comprobar que los distintos parámetros derivados de la correcta inclusión de los especimenes queden correctamente reflejados en


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el parte de tallado. Será misión del TEAP reflejar en el parte de tallado cualquier incidencia que se derive del posterior procesado de las muestras; por tanto, dicho documento pasa a cumplir al mismo tiempo la función de parte de incidencias.

Se podrá recurrir a dicho registro en casos en que sea necesario. Por tanto debe permanecer en un lugar que permite su fácil acceso. Además, deberá ser actualizado cada vez que se realicen estudios macroscópicos.

Se consideran sinónimos los términos “parte de tallado” y “parte de estudios macroscópicos”. “Hojas de tallado será cada una de las unidades constitutivas del “parte de tallado”.

7.2.1 Descripcción del parte del tallado En cada parte de tallado deben aparecer obligatoriamente los siguientes

apartados:

• FECHA

• NÚMERO DE ESTUDIO

• NÚMERO DE BLOQUES TISULARES

• NÚMERO DE FRAGMENTOS INCLUIDOS

• INCLUSIÓN TOTAL O REPRESENTATIVA (material agotado/ material de reserva)

• TÉCNICAS TINTORIALES SOLICITADAS

• TÉCNICAS ESPECIALES

• INCIDENCIAS

Si es necesario se identificará al patólogo responsable del estudio macroscópico del espécimen / grupo de muestras.

El parte de tallado estará constituido por “hojas de tallado”, unidades constitutivas del parte de tallado y por tanto del conjunto de documentos constitutivo del Registro de estudios macroscópicos

UNIDAD DIDÁCTICA VIII

PAPEL DEL TEAP DURANTE LA REALIZACIÓN DE PAAF (PUNCIÓN-ASPIRACIÓN CON AGUJA FINA)


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8.1 Papel del TEAP durante la ralización de PAAF (Punción-aspiración con aguja fina) El técnico especialista en Anatomía Patológica juega un importante papel en la

asistencia del facultativo patólogo a la hora de realizar una PAAF. Si bien será siempre el facultativo quien ejecute la punción, y por tanto quien obtenga el material, el técnico aportará el soporte material y asistencial para culminar el proceso. La punción aspiración con aguja fina puede llevarse a cabo tanto a la cabecera del paciente como en una sala habilitada o no para tal propósito. En el primero de los casos será el TEAP quien prepare y disponga el material necesario al tiempo que será la persona encargada de su traslado al lugar en el que vaya a ser realizada la prueba. En aquellos casos en los que exista un lugar habilitado permanentemente o temporalmente para la realización de punciones, el TEAP será el encargado de disponer y mantener los distintos componentes del equipo de punciones de manera que éstas puedan ser realizadas en cualquier momento sin necesidad de perder tiempo en la preparación del material.

El equipo de punciones es sencillo, estando constituido por una pistola de aspiración, jeringuillas, agujas, portaobjetos, cestilla para portaobjetos, spray fijador y lápiz; además, será necesario disponer de un equipo de tinción (panóptico) que permita realizar tinciones rápidas que puedan ser evaluadas a la cabecera del paciente.

Una vez realizada la/s punción/es por el patólogo, éste procederá a se depósito y extendido sobre el portaobjetos, que previamente ha debido ser rotulado correctamente por el TEAP, consignando el nombre y apellidos de la paciente en el extremo esmerilado. El TEAP en ese momento se hace custodio de la muestra procediendo a su fijación (en el caso que la muestra deba de ser fijada) y tinción, montaje y etiquetado. Es fundamental que el técnico lleve a cabo la trazabilidad de la muestra en este paso de modo que el número de extensiones obtenidas tras la punción coincida con el número de punciones que van a ser procesadas.


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Hay muestras que deben de ser procesadas con mayor celeridad pues tanto el facultativo solicitante como el patólogo ejecutor desean conocer si el material obtenido ha sido suficiente para que en caso de no serlo se pueda proceder a realizar nuevas punciones. En esos caso el material no se fija y se tiñe utilizando una tinción rápida, procediendo el patólogo a realizar una evaluación inicial del material; tras esta primera evaluación, el patólogo puede asesorar sobre la idoneidad del material obtenido y por tanto, sobre la necesidad de realizar nuevas punciones; al mismo tiempo podrá comunicar al clínico solicitante de la prueba, sus primeras impresiones diagnósticas. Tras este primer paso, el TEAP procederá al montaje y etiquetado de los extendidos, que serán presentados nuevamente al patólogo.

La tinción rápida de uso más extendido en los laboratorios de Anatomía Patológica es la de Diff-Quick, existiendo un protocolo de tiempos estipulados para que el extendido permanezca sumergido en cada uno de las tres soluciones si bien hemos comprobado que en situaciones que requieran un diagnóstico más rápido, bastará con realizar diez pases del extendido por cada uno de los colorantes, con el posterior enjuague y secado de las muestras.

El TEAP será el encargado en gran número de ocasiones de aplicar el antiséptico a la lesión objeto de estudio así como de la colocación del apósito tras la realización de la prueba. También será el encargado de acomodar al paciente y asistirlo mientras se desviste, indicándole la postura que debe de adoptar para que pueda ser realizada la punción con comodidad.

En todo momento, el TEAP actuará como testigo del proceder del patólogo mitigando con su testimonio posibles acusaciones que puedan surgir del acto médico.

Una vez realizada la punción, el TEAP procederá a ordenar el material, disponiéndolo para una próxima punción, y trasladará la muestra obtenida al laboratorio para su posterior procesado, asegurándose de que cada muestra lleva aparejado su correspondiente informe de petición de estudio anatomopatológico y de que éste reúne los estándares asignados a su cumplimentación.

De un modo esquemático:

1. Preparación y traslado del material necesario al lugar de la punción

2. Preparación y asistencia del paciente previas a la punción

3. Aplicación de antiséptico a la zona lesional

4. Asistencia del paciente durante el acto de la punción (ayudarle a adoptar distintas posturas, mantener dichas posturas, ayudar en la incorporación del paciente, etc…)

5. Identificación correcta de los portaobjetos

6. Custodia de las muestras.

7. Fijación de la muestra en caso de que sea necesario (según criterio del facultativo)

8. Tinción de la muestra en caso de que sea necesario (según criterio del facultativo)

9. Traslado del material de punción a lugar de origen


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10. Procesado de muestras según rutina

11. Limpieza del material utilizado durante el proceso

12. Preparación del equipo para una siguiente punción.

13. El TEAP es el responsable de supervisar el estocaje de reactivos y su conservación de modo que se encuentren en óptimas condiciones a la hora de proceder a la tinción.


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Consejo práctico: en todos los casos en los que el TEAP es el responsable de la extensión sobre los portaobjetos del material obtenido mediante punción, recomendamos agitar y golpear repetidamente el émbolo de la aguja contra el citado portaobjetos: la experiencia nos dice que en aquellos casos en que existen pequeños fragmentos titulares, estos quedan adheridos al émbolo y no revierten sobre el portaobjetos a menos que forcemos la recuperación de material. Este consejo cobra especial importancia en aquellas punciones en las que se obtiene escaso material.

UNIDAD DIDÁCTICA IX EL TEAP COMO ASISTENTE DEL PATÓLOGO DURANTE

LA BIOPSIA INTRAOPERATORIA


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9.1 El TEAP como asistente del patólogo durante la biopsia intraoperatoria Mediante el estudio o biopsia intraoperatoria, el patólogo debe de emitir una

diagnóstico o en su defecto una orientación diagnóstica o bien asesorar sobre el estado de los márgenes quirúrgicos de una muestra enviada al laboratorio de Anatomía Patológica al mismo tiempo que el/la paciente está siendo intervenido en quirófano. La información emitida servirá para adoptar la conducta quirúrgica más adecuada: Por tanto, es fácil deducir la gran trascendencia intrínseca del diagnóstico intraoperatorio y la gran premura con la que hay que acometerlo. Si bien en algunos laboratorios es el patólogo en solitario el que se enfrenta a la biopsia intraoperatoria, en la mayoría de ellos éste debe de ser asistido por el TEAP asignado a tales funciones.

Generalmente es un celador o el personal auxiliar del quirófano el que trae la muestra al laboratorio. A su recepción, el TEAP debe de comprobar que ésta se acompaña del correspondiente informe de petición del estudio, asegurándose de que están correctos los datos identificativos del paciente así como el motivo que justifica el estudio.

Una vez hemos recibido la muestra comienza la presión: el patólogo debe de dar un diagnóstico en el menor tiempo posible con lo cual el proceso debe de ser rápido. El patólogo examinará la pieza remitida y se puede encontrar con dos situaciones:

• La pieza quirúrgica es de gran tamaño y debe seleccionar cortes representativos

• La pieza es de pequeño tamaño y puede ser incluida completamente.

Es habitual realizar sobre la muestra seleccionada una impronta y/o un raspado con el fin de obtener información citológica adicional:

Impronta: presionar un portaobjetos contra la superficie de la muestra con el fin de que se desprendan células de la superficie de la misma. Posteriormente se conducirá la extensión según el protocolo de citologías.

Raspado: se trata de un proceso similar pero en vez de presionar un portaobjetos contra la muestra, se realiza un raspado de la superficie de la misma con la hoja de un bisturí. La muestra obtenida se extenderá sobre un portaobjetos y se procesará como una citología.

Se trata de dos métodos realizados sobre muestras en fresco. Es común dejar sin fijar las citologías resultantes y aplicarles una tinción con panóptico rápido con el fin de disponer de material diagnóstico con la mayor celeridad.

Mientras tanto la muestra en estudio debe de ser congelada. Para esta función está el criostato. Congelar la muestra es el método más rápido para solidificar y homogenizar el tejido para que su corte sea factible. Si bien se puede introducir el tejido en fresco directamente en el criostato y esperar a que se congele lentamente, es habitual embeber el tejido en un gel-medio sintético tal como el OCT (alcohol de polivinilo, polietilenglicol y excipientes). Se coloca una base de gel sobre la platina del criostato asignada a la inclusión de tejidos, se coloca la muestra sobre el mismo y se cubre con otra gota de gel. La platina se deja descansar dentro del criostato sobre la base destinada a tal efecto, se clausura el criostato y esperamos a que la congelación de la pieza tenga lugar (este proceso puede ser visualizado directamente).


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Para que la congelación tenga lugar de modo adecuado es esencial que el criostato haya sido revisado y puesto a punto en un paso previo a la realización del estudio intraoperatorio. El mantenimiento del mismo es responsabilidad del TEAP, y en caso de incidencias se delegará en el Servicio de Electromedicina o en la casa comercial suministradora. El TEAP es el encargado de evitar el acúmulo de capas de hielo, de la limpieza del aparato y del control de las temperaturas.

Una vez que se ha producido la congelación del tejido y del gel, tenemos un bloque compacto con la platina que pasamos a colocar en la pinza del mocrotomo, orientable (se debe de orientar el bloque congelado con respecto al ángulo de la cuchilla). A partir de entonces, el proceso de corte es similar al empleado con los bloques de parafina. Las secciones obtenidas son rescatadas de la misma superficie de la cuchilla con tan solo depositar un portaobjetos sobre las mismas. En caso de obtener secciones sumamente plegadas, podemos recurrir a la ayuda de un “antiroll” o platina de plástico, opcional, situada sobre la superficie de la cuchilla. Esta labor puede ser tamizada e incluso sustituida por la acción de un pequeño pincel que extienda las secciones.

Improntas, raspados y secciones deben de ser teñidas para poder observadas al microscopio. La aplicación de un panóptico rápido puede ser útil en la mayoría de los casos si bien la tinción a utilizar dependerá en último caso de las normas del laboratorio o bien de las preferencias del patólogo responsable del caso.

Nuestra experiencia nos confirma que la realización de diez pases en cada uno de los tres reactivos del panóptico rápido es más que suficiente para conseguir una adecuada visualización microscópica.

El patólogo procederá al estudio de las muestras y a la emisión del informe intraoperatorio. El TEAP procederá mientras tanto a la realización de nuevos cortes o nuevas tinciones si fueran necesarias.

Tras la emisión y comunicación del resultado, el TEAP procederá a limpiar el equipo y prepararlo para el siguiente acto intraoperatorio. Asimismo, en un segundo tiempo, etiquetará y realizará el montaje reglado de las preparaciones citológicas e histológicas ya valoradas. Éstas pueden ser desteñidas y volver a teñirse con la técnica solicitada por el patólogo si bien lo frecuente es archivarlas con la tinción original.

Una vez explicado el proceso, queremos hacer unas consideraciones:

a) El corte de muestras congeladas entraña cierta dificultad. Obtener cortes finos es difícil y requiere cierta pericia de quien los ejecuta. Es recomendable practicar bastante en un paso previo a “entrar en acción”. Por supuesto, las prácticas pueden realizarse sobre remanentes de muestras e incluso con muestras animales que no signifiquen material diagnóstico.

b) La presión ejercida por los cirujanos requiere una respuesta rápida y eficaz por parte del Patólogo y del TEAP. No hay que ponerse nerviosos, pero hay que actuar con premura y decisión.

c) Es necesario un control estrecho de las temperaturas del criostato.


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9.2 Posibles errores y sus soluciones La temperatura del criostato no es óptima en el momento del estudio

intraoperatorio: se trata de un fallo inadmisible pues el TEAP es el responsable de la supervisión de las temperaturas del mismo. En algunos centros, el acto intraoperatorio está programado; en estos casos el TEAP deberá revisar el equipo el día previo a la realización del acto. En cambio, en muchos centros se trata de un acto no programado pudiendo requerirse en el transcurso de cualquier intervención quirúrgica. Es por ello por lo que no está mal generalizar y comprobar el buen estado y el perfecto funcionamiento del criostato a diario.

El conjunto gel-muestra histológica está blando al tacto: aún no hemos conseguido el nivel óptimo de congelación. Se dejará reposar la platina más tiempo en el criostato.


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La superficie de corte del bloque por congelación presenta aristas: la muestra no ha sido correctamente embebida en el medio de inclusión-gel. En estos casos podemos homogeneizar la superficie de corte por medio de finos cortes con la cuchilla del Mocrotomo, pero perderemos material, y por tanto información, Es más conveniente aplicar agua caliente al bloque de congelación y proceder a incluir y congelar de nuevo la muestra una vez haya sido colocada correctamente.

Las secciones de tejido salen enrolladas o apergaminadas: este hecho dificulta enormemente la interpretación microscópica de la muestra. Se recomienda el auxilio de un pincel o de la lámina antirroll para conseguir extender las secciones. Por otro lado, la premura con la que se realice el depósito de los cortes en el portaobjetos será inversamente proporcional al artefacto por plegamiento.

Realización de un corte tan grueso que signifique la pérdida de gran parte de la muestra: se trata de una imprudencia. Es conveniente aproximar la cuchilla al bloque de un modo cuidadoso y lento. El criostato dispone de un modo de aproximación rápido y otro lento. Si utilizamos el lento en el primer contacto reduciremos este error. También evitaremos el mismo colocando adecuadamente la platina en su soporte, orientándola correctamente respecto al plano de corte de la cuchilla.

El criostato muestra restos de secciones previas: obviamente el TEAP se descuidó en la limpieza del aparato, necesaria tras la realización de cada acto intraoperatorio.

UNIDAD DIDÁCTICA X

EL TEAP EN LA SALA DE AUTOPSIAS


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10.1 El TEAP en la sala de autopsias Dentro de las funciones de los TEAP se encuentra el colaborar con el patólogo en

la realización de las necropsias clínicas o médico-legales.

La autopsia tiene unos 2000 años de antigüedad, pero en los últimos 150 años ha contribuido de manera sustancial al avance de varios campos de la medicina. En España, no tiene el mismo peso específico en todos los hospitales (volumen heterogéneo de peticiones de estudio necrópsico), y aunque no va a desaparecer su realización a corto plazo, el número de las mismas está en franco descenso, dificultando la docencia y el control de calidad que tales autopsias debieran de proporcionar.

En muchos centros las autopsias se clasifican en:

o Autopsias clínicas: son las autopsias de pacientes que mueren debido a causas naturales o a enfermedad conocida.

o Autopsias fetales: las practicadas a los fetos fallecidos en fase fetal intermedia o tardía. La OMS clasifica estas muertes en función del tiempo de gestación y peso del feto

o Autopsia legal o judicial con la colaboración de los médicos forenses y a demanda de estos.

Son competencias del TEAP:

Identificar y registrar los datos de cadáver, según protocolos establecidos. Esto supone que cuando llegue el cadáver hay que comprobar y verificar los documentos necesarios para la realización de la autopsia:

• Datos de identificación del cadáver

• Solicitud de necropsia realizada por el facultativo responsable

• Autorización de la familia que permita la realización de la autopsia. En este mismo documento se debe de especificar la extensión a la que se refiere el permiso (autopsia completa, sólo algunas cavidades, sólo una cavidad…)

• Historia clínica o resumen de la misma que permita al patólogo hacerse una composición de lugar y poder dirigir la ejecución al enfoque de determinadas patologías. Si bien el estudio necrópsico debe de ser global y exhaustivo, el dirigir el estudio al hallazgo de ciertos signos facilita enormemente la labor y reduce al mismo tiempo el número de autopsias “en blanco” (sin hallazgos morfológicos significativos).

• Autorización de orden judicial, en caso necesario

El registro de los datos se hace según el protocolo de registro de muestras que exista en cada Servicio de Anatomía Patológica. Todas las muestras derivadas de dicho estudio tendrán el mismo código de identificación.

Realización de la necropsia clínica, siguiendo los protocolos establecidos y las indicaciones del patólogo/forense:

• El cadáver se coloca en la mesa de autopsias en posición adecuada

• El instrumental debe de estar preparado dependiendo del tipo de estudio


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• Los órganos extraídos se colocan en recipientes adecuados e identificados para su posterior estudio macroscópico

• Realización de fotos macroscópicas

• Recomponer el cadáver para su posterior traslado al tanatorioDesinfectar los materiales utilizados, según protocolos

• Dejar la sala de autopsias limpia y ordenada con los equipos preparados para su próxima utilización

Asistencia al patólogo en el estudio macroscópico de los órganos y vísceras; consiste en el estudio detallado de las piezas extraídas, normalmente según protocolo de estudio y piezas de cada laboratorio

- registro de las características físicas, peso, color y volumen

- tallado de las vísceras

- procesado de las muestras

Si bien en primera instancia estas son las labores básicas del TEAP en la sala de necrópsias, el protocolo se adapta a las necesidades del Centro y a las del propio acto de modo que en algunos centros, el TEAP realiza íntegras las funciones del aun no obsoleto mozo de autopsias, es decir, es el que eviscera el cadáver en un paso previo a que entre en juego el patólogo para el estudio de los órganos.

Comprendemos que pueda parecer extraña esta aseveración, pero así ocurre en algunos centros. Nosotros no somos partidarios de este último método pues el patólogo pierde la información que pueda derivarse del estudio macroscópico de las vísceras in situ así como de su interrelación. Lo normal es que el TEAP sea el asistente del patólogo (a del forense) de modo que le ayude a eviscerar el cadáver. Las vísceras deberán ser limpiadas, pesadas y dispuestas de tal modo que su inspección sea facilitada al facultativo. Con tal fin, las salas de autopsias suelen estar habilitadas con mesas auxiliares o dispositivos afine en los que pueden ser dispuestos los órganos. Cuando se produce una evisceración en bloque, el paquete visceral debe de ser manipulado con cuidado de modo que se eviten desgarros innecesarios. Es más prudente la actitud de muchos patólogos de realizar una primera disección in situ en la cual se abren estructuras y se separan órganos.

Al igual que ocurre en quirófano, el TEAP es el instrumentista de situación en la sala de autopsias y por tanto deberá entregar al patólogo el instrumental que le sea requerido. Este, debe de disponerse de modo ordenado en una tabla o mesa auxiliar en un paso previo a la disección; de tal modo se podrá visualizar de un solo vistazo el instrumental que tenemos a nuestra disposición.

La mayor parte de las salas de autopsias cuentan con un sistema de grabación de voz utilizado por el facultativo para realizar las descripciones macroscópicas y los comentarios surgidos en torno a los hallazgos observados. Dichas grabaciones serán transcritas en un segundo tiempo por el personal administrativo correspondiente. En aquellos centro que carezcan del citado sistema de grabación de voz (magnetófono…), será el TEAP el que supla sus funciones, tomando nota de los distintos comentarios y datos que vayan surgiendo, siempre a petición del facultativo responsable.


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La autopsia en un “acto sucio”. En la medida de lo posible el TEAP deberá ser un transcriptor “limpio”, realizando las anotaciones de forma que puedan ser entendidas en un segundo tiempo.

Finalizada la autopsia, el TEAP se encargará de preparar el cadáver para su retirada por los miembros de la funeraria. Esta preparación consistirá en la limpieza corporal, relleno de cavidades (se suele utilizar algodón o sustancia afín) y el cierre con puntos de sutura (grapas, lazadas, nudos colchoneros o similares).

Algunas autopsias son verdaderamente dificultosas y su realización origina contratiempos que el TEAP debe de solventar tales como cortes en zonas faciales o perianales, recomposición del cuero cabelludo tras apertura craneal, etc…La imaginación del TEAP será muy apreciada en este sentido siempre que no se aleje de los cánones estéticos prevalentes.

Tras la realización del estudio macroscópico visceral por parte del patólogo, haya habido o no tallado de los diferentes órganos, estos se colocarán dentro de recipientes habilitados para tal efecto, con el correspondiente volumen de líquido fijador necesario (formaldehído). Dichos recipiente deben de ser correctamente etiquetados e identificados y deben de ser colocados en un lugar de fácil acceso a la hora de realizar posteriores estudios.

También será el TEAP el que organice la primera limpieza de la sala de autopsias así como del instrumental utilizado. Para la limpieza a fondo de la sala se necesitará la concurrencia del Servicio de Limpieza del centro.

UNIDAD DIDÁCTICA XI EL TEAP Y LAS TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS


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11.1 EL TEAP y las técnicas inmunohistoquímicas Las técnicas inmunohistoquímicas y las técnicas de biología molecular han entrado

con fuerza en la rutina de muchos laboratorios de Anatomía Patológica. Si bien las segundas aun se reducen a laboratorios de gran peso y tamaño, las técnicas inmunohistoquímicas forman parte del día a día de laboratorios incluso de pequeño tamaño y por tanto corresponde hacer referencia a ellas en este manual. No pretendemos hacer un repaso exhaustivo de dichas técnicas ni pretendemos en este momento hacer un curso intensivo de las mismas. En cambio, debido al importante papel que juega el TEAP en relación a las mismas, nos extenderemos en los pormenores de esta relación.

Comenzaremos recordando que el TEAP es el encargado de realizar la técnica inmunocitoquímica y presentarla al patólogo, responsable de la interpretación de los resultados. Asimismo será el responsable de velar por el adecuado cuidado de los productos y reactivos necesarios para su realización.

Si bien la técnica optimizada es fundamental en todas las actividades desarrolladas en el laboratorio de Anatomía Patológica, las características intrínsecas de la técnica inmunocitoquímica exigen un plus de tensión, necesario para obtener los resultados adecuados. No es un secreto afirmar que cualquiera de los distintos pasos implícitos en la técnica va a ser necesario y decisivo en relación a los resultados y por tanto, creemos conveniente describirlos de manera somera.

Es esencial contar con reactivos de calidad conservados en condiciones óptimas. La calidad del producto depende directamente de la casa comercial suministradora si bien el TEAP es el encargado de la correcta conservación de los mismos. Cada reactivo debe de venir acompañado de unas instrucciones de uso y conservación que es conveniente seguir; ya se comentan en la unidad didáctica dedicada al control de temperaturas la importancia que dicho control supone en la conservación de los reactivos. Los anticuerpos son muy sensibles a los cambios de temperatura lo cual condiciona un estrecho control de las mismas para que ejerzan correctamente su función. Se estiman adecuadas temperaturas comprendidas entre los 2 y 8 º C para las soluciones prediluidas preparadas para su uso directo. Las soluciones concentradas pueden almacenarse a temperaturas bajo cero. El calor provoca desnaturalización proteica; como los anticuerpos son proteínas, el calor no les va a hacer ningún bien y por tanto debe de ser evitado en la fase de conservación del producto. En aquellos casos en los que existe un fallo del sistema de refrigeración, el TEAP, tras intentar solucionar la incidencia, procederá a comunicar la misma a la persona o servicio pertinente tras lo cual trasladará los reactivos-anticuerpos que necesiten refrigeración a otra nevera que cumpla correctamente tal fin.

Una vez que el producto está en condiciones óptimas de conservación, podemos pasar a realizar la técnica cuando el patólogo la pide.

La esencia de la técnica inmunohistoquímica, como su nombre indica, consiste en el marcaje de ciertas moléculas celulares que actúan como antígenos a los anticuerpos utilizados. Estos anticuerpos, más o menos específicos o afines a tal molécula o antígeno se asocian a un cromógeno que posibilita la identificación del complejo antígeno-anticuerpo formado tras la reacción. Se trata por tanto de un tipo de reacción química mediada por anticuerpos. Los anticuerpos, como hemos comentado, son un tipo específico de proteínas.

Cuando el anticuerpo marcado con un cromógeno reacciona con la molécula diana, ésta última puede ser identificada por la localización del cromógeno. Así es como el


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patólogo identifica la diana que está buscando. Si no hay diana, no hay reacción, y por tanto no se identifica el cromógeno y viceversa. La presencia del cromógeno indica la presencia de células o moléculas diana.

Pero este proceso que parece tan fácil requiere de una técnica precisa y depurada que es la que realmente debe de dominar el TEAP: el TEAP debe de velar por la calidad del proceso, que de la interpretación ya se encarga el patólogo.

Definimos técnica correcta aquella en la que se tiñen las células/moléculas diana sin que se produzca la tinción simultánea de otras células/moléculas que no son diana (tinción de fondo y tinción errónea).

Para que la tinción sea correcta, también deberá ser correcto el título de anticuerpos, entendiendo por tal la dilución óptima del mismo

Cuanto más afín sea un anticuerpo por la diana, mejor será la tinción obtenida

Hemos explicado de una forma muy básica en qué consisten los fundamentos de la inmunohistoquímica. Obviamente, se trata de un proceso más complejo, con más variantes, las cuales intentaremos resumir a continuación:

La base de la inmunohistoquímica es una reacción o reconocimiento antígeno-anticuerpo. Nosotros aportaremos el anticuerpo que deberá identificar el antígeno diana o problema al que debe de unirse; al unirse, lo pondrá de manifiesto. Para que esta reacción sea posible, el antígeno diana debe de ser localizable y ello no siempre es posible: las muestras más comúnmente usadas en los laboratorios de Anatomía Patológica están fijadas con formaldehído e incluidas en parafina, la cual puede enmascarar los citados antígenos (no se produce reacción porque el anticuerpo no encuentra el antígeno). En estos casos es necesario un proceso de desenmascaramiento antigénico (recuperación antigénica) previo a la reacción propiamente dicha.

Existen distintos métodos de desenmascaramiento antigénico y entre los más usados en los laboratorios están la digestión proteolítica enzimática y la recuperación antigénica inducida con calor.

Digestión proteolítica enzimática: las enzimas más utilizads son la tripsina, las proteasas y la neuraminidasa aunque otras enzimas proteolíticas pueden igualmente ser utilizadas. La efectividad de la digestión enzimática dependerá del tejido sobre el que se apliquen y de las condiciones de fijación y procesado. Cada laboratorio deberá de elaborar sus propios protocolos en función de las condiciones propias del proceso.

Desenmascaramiento mediante calor: se trata de un método muy popular, es efectivo y es más barato. Su utilidad queda limitada al desenmascaramiento de antígenos termorresistentes; su acción lleva aparejado el uso de soluciones de desenmascaramiento, tamponantes con ph básico (6) del tipo citrato.

Para realizar el desenmascaramiento con calor se puede utilizar un microondas, una olla a presión o un autoclave; todos ellos han demostrado ser eficaces para la recuperación antigénica. Se deben de utilizar portaobjetos silanizados que potencien la adhesión del corte, impidiendo el posible despegamiento inducido por el calor.

El calor producirá una desnaturalización proteica eliminando por tanto los enlaces cruzados que pudieran enmascarar el antígeno. La recuperación de la estructura proteica debe de hacerse de modo gradual y por tanto el enfriamiento posterior debe de ser lento.


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Una vez desenmascarados los antígenos diana debemos de poner de manifiesto su presencia. Tendremos que añadir un anticuerpo que reaccione con el mismo. Para detectar esta reacción debemos de utilizar un sistema sencillo. El marcaje cromogénico resulta eficaz en este sentido. Ligamos un cromógeno al anticuerpo y evaluamos la tinción obtenida. Previamente debemos de ligar un sustrato enzimático al anticuerpo: Este sustrato será el que reaccione con el cromógeno produciendo la señal (coloración). Los sustratos más utilizados en la práctica diaria son la peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina de carnero. Entre los cromógenos más comunes destacamos la diaminobenzidina (DAB), obteniéndose un color marrón, el amino-etil-carbazol (AEC), obteniéndose un color rosado, el cloro-naftol (ON), obteniéndose un color azulado y el reactivo de Hender-yates, obteniéndose un color negruzco.

Múltiples y avanzadas tecnologías tales como la estreptavidina biotina son utilizadas en inmunohistoquímica. Su conocimiento es fundamental para el TEAP encargado de la técnica. En esta unidad sólo hemos realizado un acercamiento o introducción a la técnica de modo que remitimos al técnico que lea este capítulo a la ampliación de conocimientos en textos versados sobre el tema. En cambio, sí nos parece muy importante señalar, de acuerdo con el espíritu de este manual, la importancia del cuidado que cada uno de los pasos del proceso requiere.

• Debemos de realizar una correcta y homogénea fijación tisular

• La inclusión tisular debe de ser asímismo homogénea y protocolizada

• Los distintos anticuerpos y reactivos deben de ser transportados y conservados en condiciones óptimas.

• Debemos de respetar las fechas de caducidad de los productos

• Se debe de desenmascarar el antígeno diana cuando las condiciones así lo requieran.

• La elección de recuperación antigénica mediante digestión enzimática o calor dependerá del tipo de tejido y de la experiencia de cada laboratorio.


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• Habrá que tener en cuenta qué antígenos son termolábiles y cuáles son termorresistentes

• Adaptar los protocolos de trabajo a los resultados obtenidos

• Poner en marcha controles de calidad que faciliten la optimización de la técnica.

El resultado de la técnica es valorado por el patólogo responsable del caso, que comunicará al TEAP los posibles fallos de procedimiento que haya podido detectar. Es conveniente que el TEAP realice un primer juicio crítico de la técnica; por tanto, no viene nada mal que exista en el laboratorio un microscopio destinado al uso por el personal técnico.

Existe una serie de factores que irremediablemente van a influir en el resultado de la técnica:

o Daño tisular

o Fijación parcial o incompleta

o Desecación tisular

o Restos de parafina

o Necrosis tisular…

Todos ellos pueden conllevar una tinción tisular difusa no selectiva.

La falta de observancia del protocolo o el mal estado tanto de anticuerpos como de reactivos puede ocasionar falsos negativos por falta de tinción de los antígenos diana.

La necesidad de un control de calidad de los reactivos y tejidos se hace fundamental. Son varios los sistemas de control de calidad externos (fuera del laboratorio) que se pueden llevar a cabo. Aquí nos interesan los controles de calidad internos. Su fundamento puede asimilarse al de los controles de calidad en histoquímica: al mismo tiempo que se realiza la tinción problema con fines diagnósticos realizamos una tinción paralela utilizando una muestra para la que estamos seguros que va a haber reacción. La positividad en el caso control valida la interpretación de la reacción en el caso problema. Si bien se trata de un método eficaz para el control de calidad de la técnica, es un procedimiento de alto coste en cuanto se utiliza el doble de reactivos y anticuerpos. Una alternativa más humilde consiste en evaluar la positividad o negatividad de estructuras presentes en la muestra problema que sepamos con certeza que son reactivas.

A continuación vamos a citar algunos de los fallos más frecuentes en referencia a las tinciones inmunohistoquímicas:

Tinción débil o negativa: fallan los anticuerpos o los reactivos. Debemos revisar sus fechas de caducidad y especificaciones. Si éstas son correctas, tendremos que comprobar si las diluciones, temperaturas y tiempos de incubación son los adecuados. Debemos asimismo comprobar el tipo y estado de buffer utilizado en la reacción.

Importantes causas de tinción negativa son la baja reactividad antigénica o la escasa afinidad del anticuerpo, errores de fijación del tejido o inclusión en medios inapropiados, etc…en resumen, si los controles también muestran defectos de tinción debemos de replantear todo el protocolo con el fin de adaptarlo a los resultados y descubrir el punto en el que la cadena falla.


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Tinción débil o inespecífica: hay que pensar en una pérdida de antigenicidad bien debida a errores en la fijación, a daño tisular o a enmascaramiento antigénico. El desenmascaramiento antigénico o la estandarización de los protocolos de fijación pueden solucionar el problema.

Si existe una tinción de fondo difusa debemos de pensar en un “exceso de tinción” bien por excesivo tiempo de incubación o por reacción cruzada del anticuerpo con distintos antígenos titulares.

Obviamente estamos simplificando la cuestión. Cada error en la tinción debe de conllevar una exhaustiva revisión del protocolo con el fin de alcanzar unos estándares de tinción aceptables.

Finalmente, no queremos terminar esta unidad didáctica sin mencionar las hojas de petición de estudio inmunohistoquímico. Son muchos los laboratorios que las tienen integradas en el programa informático de rigor. A pesar de ello, creemos de utilidad contar con un registro de técnicas solicitadas y realizadas al que poder recurrir en casas de duda, conflicto o revisión. En cada hoja debiera de figura el número de identificación de la muestra problema, el número de estudio inmunohistoquímico, las diferentes técnicas solicitadas, el facultativo responsable de la solicitud y el TEAP responsable de la ejecución del proceso.

Veamos un sencillo ejemplo:

Cuanto más rigurosos seamos en cada paso, menor será el número de errores resultante.

UNIDAD DIDÁCTICA XII PAPEL DEL TEAP EN EL ARCHIVO DE CASOS


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12.1 Papel del TEAP en el archivo de casos Todo laboratorio de Anatomía Patológica debería tener archivos perfectamente

sistematizados y ordenados de modo que la búsqueda del material archivado pueda realizarse de modo rápido y eficaz. El TEAP juega un importante papel en este sentido pues será el encargado del mantenimiento y cuidados del archivo así como de sus entradas y salidas. Podemos distinguir distintos tipos de archivos de muestras:

1. Archivo de informes de petición y Archivo de informes emitidos (esta situación está siendo suplida por la incorporación de programas informáticos

2. Archivo de bloques de parafina

3. Archivo de preparaciones histológicas

4. Archivo de preparaciones citológicas

5. Archivo de técnicas histoquímicas y/o inmunohistoquímicas (estos pueden ser incorporados a los anteriores no existiendo necesidad de mantenerlos independientes)

La actividad asistencial origina diariamente un gran número de muestras que deben de ser archivadas correctamente (esta labor debe de ser efectuada de modo sistemático cada día para evitar acúmulo de muestras sin ordenar y permitir la correcta identificación y acceso a las mismas desde el mismo momento del diagnóstico por parte del patólogo). Del correcto archivo de las muestras dependerá en gran medida la eficacia del laboratorio pues son muchas las ocasiones en las que hay que recurrir al estudio de muestras que ya han sido diagnosticadas bien como segunda opinión bien como contraste con muestras procedentes del mismo paciente con el objeto de establecer correlaciones.

Hay que ser muy rigurosos a la hora de proceder al archivo de muestras; el sistema de identificación de las muestras ha de ser uniforme, utilizando los mismos criterios para todas las muestras, debiéndose consignar en cada una el año y el número de identificación. La letra debe de ser legible, circunstancia que desafortunadamente ocasiona errores en la práctica diaria, e indeleble (de forma que no se borren fácilmente los datos de identificación). Asimismo, es recomendable tener a mano las muestras más recientes, pudiendo quedar aquellas más antiguas en zonas más inaccesibles.

Si bien el patólogo puede consultar los archivos libremente, en muchas ocasiones solicitará al TEAP la localización de alguna muestra, y éste debe de ser eficiente en esta labor.

UNIDAD DIDÁCTICA XIII EL TEAP EN EL CONTROL DE LAS TEMPERATURAS


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13.1 El TEAP en el control de las temperaturas Todos los laboratorios de Anatomía Patológica deben de contar con un protocolo

específico de control de temperaturas tanto ambientales como del aparataje con el fin de optimizar su funcionamiento y asegurar la eficacia de reactivos. Será el TEAP el encargado de velar por el cumplimiento de los rangos de temperaturas así como de su registro diario. En aquellos casos en que existan desviaciones del margen óptimo de temperaturas, será quien se encargue de manipular los aparatos para que aquel sea recuperado lo antes posible. En caso de no poder, será el encargado de emitir el aviso correspondiente al Servicio de Electromedicina o su equivalente con el fin de abreviar el periodo fuera de rango del control climático.

El control de temperaturas en el laboratorio de Anatomía Patológica queda reducido a:

• Control de la temperatura de las estufas

• Control de la temperatura de las neveras-frigoríficos

• Control de la temperatura de funcionamiento del aparataje

Centrémonos en las dos primeras. El principal papel de la estufa en el Laboratorio de Anatomía Patológica consiste en desparafinar el material utilizado. La temperatura, o mejor dicho, el rango de temperaturas óptimo para tal función oscila entre 56 y 72 ºC (recordemos que la temperatura de fusión de la parafina es de 56ºC). El TEAP debe de comprobar, al menos una vez al día, esta temperatura y anotarla en una hoja de registro que preferentemente será colocada sobre una de las caras laterales del aparato, o bien en un lugar de fácil acceso y lectura. El papel de la nevera en el laboratorio es más amplio y variopinto. La llegada al laboratorio de las técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas ha introducido nuevos reactivos y anticuerpos que deben de conservar una correcta refrigeración. Se considera óptima una temperatura comprendida entre los 4 y los 8ºC, la cual debe de ser revisada y consignada en la correspondiente hoja de registro al menos una vez al día, recomendándose que esta acción se lleve a cabo a primera hora de la mañana, antes de que comience la actividad en el laboratorio.

No hace falta decir que la nevera es el lugar idóneo de almacenaje de los líquidos biológicos en espera de diagnóstico.

Para el control de las temperaturas contamos con el siguiente aparataje:

- Termómetro digital. Modelo electrónico “TFA” con dos lecturas (una con la anotación de la temperatura ambiental o externa y otra con la temperatura interna del equipo a controlar; dispone de una sonda que está unida por un cable al módulo de lectura, botón de temperatura max./min. y reset; sin alarma;

- Termógrafo o registrador de temperatura. Dispositivo electrónico que realiza medidas continúas de la temperatura en el tiempo e intervalos determinados y que permite exportar los datos registrados a tablas/gráficos que reflejan la evolución de la temperatura a lo largo del tiempo.

- Otros. Todas las estufas disponibles en el laboratorio disponen de su propio termostato ajustable para fijar la temperatura deseada.


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Para el control de la temperatura ambiental (o del local) se recurrirá al los controles propios del sistema de climatización propio del laboratorio.

La hoja de registro de temperaturas debe de ser sencilla e intuitiva y en ella se deben de recoger como datos imprescindibles la temperatura ambiente, la temperatura del interior de la nevera o estufa (según el caso), la hora y el día de recogida de los datos y el nombre de la persona (TEAP) responsable de la recogida. Cada nevera o estufa poseerá su propia hoja de temperaturas.

Conforme se vayan cumplimentando las hojas de temperatura, éstas serán archivadas en el libro de temperaturas, que deberá encontrarse en un lugar de fácil acceso para su consulta

Cuando lo que falla es la temperatura del aparataje del laboratorio, es común solicitar ayuda al Servicio de Electromedicina o a la casa comercial suministradora del aparataje, según el caso pues suele tratarse de auténticas averías para las que el TEAP no está formado. En cambio es fundamental recalcar el importante papel que posee a la hora de dar la voz de alarma sobre la incidencia: recordemos que cuanto más tardemos en dar parte de la misma, mayores serán las posibilidades de que podamos estar perjudicando las muestras.

La mayoría de los centros hospitalarios poseen hojas o partes de incidencias que el TEAP deberá de cumplimentar, esta vez con la supervisión del patólogo responsable.

Queremos llamar la atención sobre un error común a la hora de hacer las mediciones de temperatura con el termómetro digital, sistema más utilizado en el control de las temperaturas. Si el termómetro se encuentra situado sobre la nevera, como suele ocurrir, y el sensor es el que se introduce en el interior de la nevera, la temperatura registrada como interior (“in”) será la referida al ambiente y la temperatura registrad como exterior (“out”), será la correspondiente al interior de la nevera, recogida por el sensor satélite.

No está de más recoger también la humedad ambiental, dato suministrado por la mayoría de termómetros.


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Ante una contingencia del tipo incidencia irresoluble, hasta contactar con el

Servicio de Electromedicina o el Servicio Técnico Oficial, el personal técnico debe de seguir esta secuencia:

1.-Proceder al traslado de aquellos contenidos vulnerables desde el equipo averiado a otro con espacio disponible y funcionamiento correcto

2.-Realizar un inventario de las muestras y reactivos afectados.

3.-Calcular el tiempo durante el cual las muestras y reactivos han permanecido fuera del rango establecido.

4.-Determinar a qué temperatura han estado expuestos.

5.- Registrar de la incidencia.

UNIDAD DIDÁCTICA XIV PREVENCIÓN DE RIESGOS LABORALES (PRL) EN EL

LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA


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14.1 Prevención de Riesgos Laborales (PRL) en el Laboratorio de Anatomía Patológica El 8 de noviembre de 1995 se publica la Ley de Prevención de Riesgos Laborales

LPRL) que transpone al ordenamiento jurídico español las normas europeas en materia de salud laboral. Esta ley supone un cambio en la concepción de salud laboral; en primer lugar, se cambia el concepto de salud como ausencia de enfermedad física, al nuevo concepto de bienestar físico, psíquico y social (incorporándose problemas del área psicosocial y salud mental laboral). Además, la ley apuesta por la prevención como instrumento principal para salvaguardar la seguridad y la salud de los trabajadores, basada fundamentalmente en tres pilares:

• Desarrollo de una cultura preventiva que garantice la seguridad y salud de los trabajadores

• Obligaciones del empresario de asegurar las condiciones de trabajo con eliminación de riesgos

• Integración de la prevención en la organización de la empresa a través de los servicios de prevención.

14.1.1 Condiciones de trabajo de los técnicos en el Servicio de Anatomía Patológica

El personal sanitario se olvida en muchas ocasiones de la existencia y manejos de productos posiblemente nocivos. La persona que manipula las sustancias desconoce, en la mayoría de las ocasiones, el tipo de producto y las repercusiones que sobre su salud puede originar la exposición al mismo.

Consideramos, por tanto, necesaria una información específicamente orientada que esté a disposición de los trabajadores que van a trabajar en este campo.

Hay que realizar una evaluación de riesgos, y para ello es fundamental determinar:

1. Actividades que realizan los técnicos:

• Recepción de muestras

• Sala de macroscopía

• Confección de bloques, corte y tinción

• Técnicas especiales y de inmunohistoquímica

• Archivo de muestras e informes

2. Equipos y útiles de trabajo:

• Ordenador

• Mocrotomo, criostato, citocentrífiga

• Estación de parafina, estufa

• Pinza, bisturís, agujas, cuchillos


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3. Condiciones de riesgos específicos:

1. Exposición a contaminantes químicos: fundamentalmente formol y xilol

2. Riesgos biológicos

3. Riesgo físico

4. Riesgo psicológico

14.2 Recomendaciones generales para minimizar los riesgos en el Laboratorio

1. El personal ha de tener a su disposición vestuario y calzado adecuado, así como todo el material necesario para realizar su trabajo: mascarillas, guantes, delantales y gafas de protección.

2. Todo el personal debe de llevar uniforme o bata de manga larga, mientras se encuentre en el área de trabajo.

3. Las batas y demás prendas de trabajo se deben de cambiar dos veces a la semana

4. Debe de existir un catálogo con los productos y técnicas que impliquen riesgos, detallando las medidas protectoras necesarias

5. Consultar los manuales o protocolos para los procesos:

• Eliminación de residuos

• Manipulación y almacenaje de productos químicos

• Agentes biológicos

• Centrífugas

6. El traslado de las muestras debe hacerse en envases cerrados

7. No se puede comer, beber ni fumar en el laboratorio

8. No utilizar lentes de contacto

9. No guardar comida ni bebida en los refrigeradores

10. No utilizar termómetros de mercurio

11. Se debe de tener un dispositivo de seguridad para agentes biológicos

14.2.1 Requisitos de la zona de trabajo 1. Las puertas de acceso a cada área deben de tener la señalización de peligro

que les corresponda

2. Las superficies de trabajo y los suelos deben de estar construidos con materiales adecuados, impermeables, no resbaladizos, fáciles de limpiar y desinfectar; en los laboratorios tiene que existir un protocolo de limpieza y eliminación de residuos, tanto urbanos como no urbanos.

3. Las instalaciones eléctricas y de agua y gases deben de cumplir la normativa vigente


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4. El sistema acondicionado debe de ser independiente y el aire del laboratorio no debe recircular

5. Tiene que cumplir la normativa contra incendios

14.2.2 Agentes químicos Los técnicos del laboratorio están expuestos a una serie de riesgos como

consecuencia del uso de agentes químicos en su labor diaria. La evaluación de riesgos de tipo higiénico, pasa por la medición de unas variables que indiquen en qué magnitud se encuentra el contaminante en el ambiente y en qué medida afecta a los trabajadores

Para la gran parte de los contaminantes químicos existen unos valores límites de exposición, establecidos como niveles de seguridad específicos en función de su peligrosidad (TLV)

o Las posibles vías de penetración son: inhalación, deglución y contacto

o Los agentes químicos se clasifican según sus propiedades y sus efectos sobre la salud:

o Propiedades físico-químicas: explosivos, comburentes, extremadamente inflamables, fácilmente inflamables, inflamables

o Propiedades toxicológicas: tóxico, muy tóxico, nocivo, corrosivo, irritante y sensibilizante

o Efectos sobre la salud: carcinogénicos, mutagénicos, tóxicos para la reproducción

o Efectos sobre el medio ambiente: peligrosos para el medio ambiente

14.3 Normas generales de seguridad para el almacenamiento de sustancias químicas Todas las sustancias deben de estar etiquetadas (FOTO CON LEYENDA), en donde

constará: denominación de la sustancia, nombre común, concentración, nombre de la persona natural o jurídica, que fabrique, envase o comercialice; además, las sustancias químicas tienen un etiquetado donde aparecen las frases S (información para su manipulación segura) y R ( informes sobre riesgos) y sus combinaciones

Símbolo de riesgo y nombre Significado (Definición y Precaución) Ejemplos

C Corrosivo

Clasificación: Estos productos químicos causan destrucción de tejidos vivos y/o materiales inertes. Precaución: No inhalar y evitar el contacto con la piel, ojos y ropas.

• Ácido clorhídrico • Ácido fluorhídrico


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E Explosivo

Clasificación: Sustancias y preparaciones que pueden explotar bajo efecto de una llama o que son más sensibles a los choques o fricciones que el dinitrobenceno. Precaución: evitar golpes, sacudidas, fricción, flamas o fuentes de calor.

• Nitroglicerina

O Comburente

Clasificación: Sustancias que tienen la capacidad de incendiar otras sustancias, facilitando la combustión e impidiendo el combate del fuego. Precaución: evitar su contato con materiales combustibles.

• Oxígeno • Nitrato de potasio • Peróxido de

hidrógeno

F Inflamable

Clasificación: Sustancias y preparaciones: • que pueden calentarse y finalmente

inflamarse en contacto con el aire a una temperatura normal sin empleo de energía, o

• sólidas, que pueden inflamarse fácilmente por una breve acción de una fuente de inflamación y que continúan ardiendo o consumiéndose después de haber apartado la fuente de inflamación, o

• líquidas que tiene un punto de inflamación inferior a 21 ºC, o

• gaseosas, inflamables en contacto con el aire a presión normal, o

• que, en contacto con el agua o el aire húmedo, desenvuelven gases fácilmente inflamables en cantidades peligrosas;

Precaución: evitar contacto con materiales ignitivos (aire, agua).

• Benceno • Etanol • Acetona

F+

Extremadamente inflamable

Clasificación: Sustancias y preparaciones líquidas, cuyo punto de inflamación se sitúa entre los 21 ºC y los 55 ºC; Precaución: evitar contacto con materiales ignitivos (aire, agua).

• Hidrógeno • Etino • Éter etílico


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T Tóxico

Clasificación: Sustancias y preparaciones que, por inhalación, ingestión o penetración cutánea, pueden implicar riesgos graves, agudos o crónicos a la salud. Precaución: todo el contacto con el cuerpo humano debe ser evitado.

• Cloruro de bario • Monóxido de

carbono • Metanol

T+ Muy tóxico

Clasificación: Por inhalación, ingesta o absorción a través de la piel, provoca graves problemas de salud e inclusive la muerte. Precaución: todo el contato con el cuerpo humano debe ser evitado.

• Cianuro • Trióxido de arsenio • Nicotina

Xi Irritante

Clasificación: Sustancias y preparaciones no corrosivas que, por contacto inmediato, prolongado o repetido con la piel o las mucosas, pueden provocar una reacción inflamatoria. Precaución: los gases no deben ser inhalados y el contacto con la piel y ojos debe ser evitado.

• Cloruro de calcio • Carbonato de sodio

Xn Nocivo

Clasificación: Sustancias y preparaciones que, por inhalación, ingestión o penetración cutánea, pueden implicar riesgos a la salud de forma temporal o alérgica; Precaución: debe ser evitado el contato con el cuerpo humano, así como la inhalación de los vapores.

• Etanal • Diclorometano • Cloruro de potasio • Lavandina

N Peligroso para el

medio ambiente

Definición: El contacto de esa sustancia con el medio ambiente puede provocar daños al ecosistema a corto o largo plazo Manipulación: debido a su riesgo potencial, no debe ser liberado en las cañerías, en el suelo o el

• Los líquidos volátiles tóxicos o explosivos deben guardares en cámara refrigerada

• Las sustancias químicas, especialmente las cáusticas, deben de estar colocadas en situación baja, que no les de la luz directamente


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• Los reactivos deben tener etiquetado con la información sobre contenido, condiciones de almacenaje, fecha de preparación, fabricante, caducidad. Especificaciones para el manejo especial si son tóxicos o irritantes. Antídoto si es necesario

• Realizar los trabajos en sitios ventilados

• Utilizar guantes protectores y protecciones oculares

• Si los productos son carcinógenos, manipularlos en cabinas de seguridad

14.4 Recomendaciones particulares 14.4.1 Productos corrosivos

- Se recomiendan guardarlos cerca del suelo para minimizar el riesgo derivado de caídas.

- Usar protectores adecuados como delantales, guantes y protectores de cara y ojos.

- Los productos que desprenden vapores tóxicos se deberían de manejar en campanas extractor

14.4.2 Productos más utilizados Formol

Es una disolución de formaldehído en agua. Es un gas incoloro de olor sofocante, muy soluble en agua. Se utiliza en disolución al 10%; se disuelve fácilmente pasando al ambiente.

Riesgos para la salud: a bajas concentraciones en el ambiente, provoca irritación ocular, del tracto respiratorio y de la piel. A altas concentraciones provoca severa irritación de tracto respiratorio e incluso puede provocar la muerte. En la nueva clasificación está incluido en el grupo de carcinogénico en humanos.

La contaminación en el ambiente se debe a:

• manipulación de piezas

• características de los envases

• ausencia de sistemas de retirada

• manipulaciones indebidas

Medidas preventivas:

• Vitrinas de extracción localizada para manipulación y mesa de tallado con extracción localizada incorporada para el tallado

• Lavado en agua de las piezas fijadas en formol, de 10 minutos, antes de su tallado

• Ventilación adecuada de los locales

• Recipientes bien cerrados para evitar evaporación

• Evitar los derrames


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• Mediciones periódicas de la concentración de los lugares de trabajo

• Utilizar equipos de protección individual: guantes de nitrilo, gafas y mascarillas con filtro específico

• Vigilancia de la salud

• Formación del personal

Primeros auxilios:

• En caso de inhalación importante, trasladar a zonas con aire limpio

• En caso de contacto con la piel, lavar con abundante agua y jabón

• En caso de contacto con los ojos, enjuagar con abundante agua durante varios minutos

14.4.2 Agentes biológicos La totalidad de los puestos de trabajo del ámbito sanitario están sometidos a

riesgos de exposición a agentes biológicos. El Real Decreto 66471997 sobre protección de los trabajadores contra riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo clasifica los agentes biológicos en cuatro grupos:

• Grupo 1: es poco probable que causen enfermedad

• Grupo 2: agentes que causan enfermedad en el hombre y es poco probable que se transmitan a la colectividad; existe tratamiento

• Grupo 3: agentes que pueden causar enfermedad grave con posibilidad de propagación a la colectividad; existe tratamiento y profilaxis

• Grupo 4: agente biológico que causa enfermedad grave en el hombre y supone un serio peligro para la colectividad por su propagación; no existe profilaxis ni vacuna.

14.4.2.1 Accidentes de trabajo con riesgo biológico: Todos los accidentes con riesgo biológico que se producen deben de ser

declarados en el Servicio de Prevención para su registro, todo accidente no declarado no se ha producido y puede tener graves repercusiones en caso de que el accidente tenga como consecuencia una enfermedad crónica

En función del agente y del mecanismo se pueden distinguir:

1. Accidente por agente de transmisión sanguínea (es la principal en nuestro ámbito)

2. Accidente por agentes de transmisión aérea

Los mecanismos de transmisión son la vía sanguínea y la aérea


1. Medidas higiénicas básicas y precauciones universales

2. Vacunación

3. Utilización de guantes

4. Utilización de ropa específica para el trabajo y no llevarla al domicilio

5. Disponer de un cuarto de aseo con productos desinfectantes


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14.4.3 Riesgos físicos Los riesgos físicos a los que están sometidos el personal del laboratorio son:

radiaciones ionizantes, ruidos, temperatura y electricidad

o Radiaciones ionizantes: los más comunes son los rayos X y los elementos radioactivos. Los efectos que pueden producir sobre todo en la médula espinal, el sistema nervioso central o vías gastrointestinales, así como radiodermitis: Es recomendable controlar individualmente a todo trabajador expuesto a radiaciones, La prevención exige que el lugar de trabajo esté diseñado de forma que el trabajador quede adecuadamente protegido de la fuente de radiación. Ello se consigue aislado la fuente de radiación, aunque a veces son necesarias ropas de protección personal

o Los ruidos no constituyen un problema importante en los centros sanitarios, aunque algunas máquinas pueden producir molestias

o La temperatura: Las temperaturas suelen estar reguladas en todos los centros sanitarios

o Electricidad: la instalación eléctrica debe estar diseñada en el proyecto de obra de acuerdo con el Reglamento Electrotécnico de Baja Tensión. Los conejos de prevención del riesgo eléctrico son: disponer de un cuadro general en cada unidad del laboratorio; disponer de un interruptor diferencial adecuado; instalar la fuerza y la iluminación por separado, aplicación del código de colores y grosores

14.4.4 Otros riesgos No podemos olvidar que nuestro trabajo conlleva muchas horas sentados mirando

al microscopio y alternando con trabajos con pantalla de visualización. En ambas situaciones compartimos riesgos, por la postura de sedestación, utilización de las manos con posturas repetitivas, por la utilización de la visión intermedia. Vamos a revisar los principales riesgos y proponer medidas preventivas.

14.4.4.1 Riesgo para la vista (fatiga visual): Síntomas:

• Molestias oculares: sensación de sentir los ojos, pesadez palpebral, picor, quemazón, lagrimeo

• Trastornos visuales: borrosidad, dificultada para enfocar

• Trastornos extraoculares: cefalea,, vértigos, ansiedad, molestias en la nuca

• Mediadas preventivas:

• Iluminación general uniforme en todo el local. Las hileras de luminarias estarán perpendiculares a las mesas de trabajo y serán de baja luminancia.

• La penetración de la luz por las ventanas puede causar disconfort por deslumbramiento; las mesas de trabajo se deben de colocar perpendicular a la ventana


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14.4.4.2 Alteraciones osteomusculares (fatiga física) Afectan fundamentalmente a la columna vertebral y extremidad superior. Se

manifiestan al terminar la jornada y remiten con el reposo. Se deben a posturas incorrectas.

Síntomas:

• Alergias de cuello y nuca

• Dorsalgia y lumbalgia

• Contracturas

• Espondilitis en los músculos del antebrazo

• Síndrome del túnel carpiano


• Van dirigidas a garantizar que todos los elementos que constituyen el puesto de trabajo satisfagan los requisitos ergonómicos.

• La postura de referencia en que las articulaciones y músculos se encuentran en una posición neutra.

14.4.4.3 Riesgos psicosociales Nos vamos a centrar en el estrés laboral, que se define como un conjunto de

reacciones emocionales, cognitivas y fisiológicas y del comportamiento a ciertos aspectos adversos o nocivos del contenido, la organización o el entorno de trabajo.

Factores relacionados con el contexto:

• Clima y cultura de la organización

• Papel o rol de la organización

• Satisfacción laboral

• Poderes de decisión y control

Factores relacionados con el contenido:

• Equipos y ambiente laboral

• Concepción de las tareas del puesto

• Carga y ritmo de trabajo

14.4.4.4 Mobbing Se define como “una situación en la que una persona o grupo de personas ejerce

una violencia psicológica extrema de forma sistemática y recurrente, durante un periodo de tiempo prolongado sobre otra persona o personas en el lugar de trabajo con el fin de destruir las redes de comunicación de la víctima, destruir su reputación, perturbar el ejercicio de sus labores y lograra que finalmente esa persona acabe abandonando el lugar de trabajo”

Frente al Mobbing la empresa debe:

• Evaluar los riesgos psicosociales

• Corregir las deficiencias de organización del trabajo


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• Fomentar el apoyo entre trabajadores frente a la competitividad

• Fomentar la definición de los puestos de trabajo

• Garantizar el respeto y el trato justo

• Políticas de actuación frente a las conductas de acoso

14.4.4.5 Burnot “Estar quemado”. Se trata del estado al que llega una persona como

consecuencia del estrés. Es una respuesta principalmente emocional, siendo los factores laborales y organizacionales los antecedentes y condicionantes.

Se manifiesta como: agotamiento emocional, despersonalización y bajo logro personal.

UNIDAD DIDÁCTICA XV ARTEFACTOS EN PREPARACIONES HISTOLÓGICAS Y

CITOLÓGICAS


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15.1 Artefactos en preparaciones histológicas y citológicas Si bien no es esta la ubicación esperada para esta unidad didáctica queremos con

ello cerrar el manual haciendo hincapié en una serie de artefactos que van a influir en los resultados obtenidos por el TEAP al realizar su trabajo. Terminar el manual de este modo se nos antoja caprichoso pero al tratarse de un tema más visual aspiramos a que las retinas de sus lectores se colmen con él y se pongan en el papel del patólogo que en el seno de su estresante actividad diaria se enfrenta a cortes o preparaciones artefactadas que no hacen más que interrumpir su concentración y retrasar el proceso diagnóstico.

Los artefactos son estructuras que normalmente no están presentes en el tejido. Es importante reconocerlos para no confundir el tejido normal con cambios patológicos; en algunas situaciones pude comprometer un diagnóstico.

Los artefactos se pueden ocasionar en cualquier paso del manejo de la muestra, desde la extracción, hasta el montaje de la preparación. Algunos se producen en el laboratorio, que son precisamente los que hay evitar

15.1.1 Artefacto de prefijación 15.1.1.1 Daño por cauterización Se observa a menudo en los

márgenes de las biopsias quirúrgicas. Se presenta como áreas de tinción fuertemente acidófilas.

Solución: en el laboratorio no lo podemos arreglar

15.1.1.2 Presencia de suturas Son aislados fragmentos de fibras.

Las de seda muestran fuerte birrefringencia con luz polarizada. Estos pueden producir después, en las secciones, daños a nivel del borde de la cuchilla

Solución: debe evitarse incluirlas en los bloques de parafina


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15.1.1.3 Contaminación de celulosa La celulosa está presente en la superficie luminar de los tejidos gastrointestinales,

los cuales no han sido lavados adecuadamente antes del procesado. También se pueden encontrar trozos de papel y de algodón usados durante la preparación del espécimen.

15.1.1.4 Artefacto de “gelfilm” Éste es utilizado para el control de sangrados en algunos procedimientos

quirúrgicos. En las preparaciones se ve una gelatina fuertemente basófila

15.1.1.5 Contaminación por almidón El almidón se utiliza en algunos procedimientos quirúrgicos; normalmente se

requiere luz polarizada para identificarlo.

15.1.1.6 Daño epitelial A veces durante la maniobra quirúrgica de extracción se produce pérdida de la

superficie epitelial

15.1.1.7 Artefacto de aplastamiento Se produce en los tejidos frescos

ricos en linfocitos o células redondas pequeñas, generalmente en la periferia de la biopsia. Los núcleos están distorsionados y aplanados.

15.1.1.8 Cambios postmorten Los cambios degenerativos comienzan inmediatamente. Se produce autolisis por

las enzimas lisosomales que rompen las membranas. Las membranas celulares pierden nitidez.


141

15.1.1.9 Descamación Son signos tempranos de autolisis; se produce sobre todo en los epitelios

columnares.

15.1.2 Artefactos de fijación Estos artefactos se producen cuando las condiciones de fijación no son óptimas, si

el fijador no penetra en el tejido o la naturaleza del producto utilizado

15.1.2.1 Fijación zonal Normalamente se produce en piezas grandes debido a un tiempo inadecuado de

fijación.

15.1.2.2 Artefacto en “riada” Se produce por la precipitación del glucógeno en las secciones de hígado cuando

se realiza una tinción de PAS.


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15.1.2.3 Pigmento de formalina Éste aparece de forma granular, de tono pardusco, birrefringente, próximo a las

células rojas.

15.1.3 Artefactos en el procesado de biopsias Los artefactos que ocurren durante la inmersión en pueden resultar de una

inadecuada fijación. Durante el procesado se produce un cierto encogimiento, que es inevitable parafina.

15.1.3.1 Separaciones perivasculares Se producen principalmente en el tejido cerebral, con retracción de la adventicia

respecto al tejido nervioso.

15.1.3.2 Corto ciclo de procesado Si se utilizan mal los reactivos, se producen extensas disrupciones en el tejido

conectivo.

15.1.3.3 Pérdida de substancias solubles Hay sustancias que con los reactivos se disuelven, por ejemplo los lípidos,

principalmente el colesterol.


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15.1.4 Artefactos por el mocrotomo y secciones Se pueden observar varios daños en las secciones histológicas por el corte y la

flotación y varios contaminantes en la superficie de los cortes

15.1.4.1 Líneas de la cuchilla Muesca o incisión se produce por daño en el borde de la cuchilla; normalmente se

produce una incisión única a lo largo de toda la sección. Suele ocurrir cuando en el bloque de parafina hay alguna zona de calcio, dura, que rompe la cuchilla

Solución: asegurarse de que la cuchilla está bien orientada y sin muescas

15.1.4.2 Desplazamiento de los componentes: Esto afecta sobre todo al tejido óseo, aunque también puede afectar al colágeno,

fibras elásticas o reticulares; se pude producir porque la cuchilla esté desgatada, una técnica inadecuada de flotación o incorrecta técnica de adhesión al porta.


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15.1.4.3 Efecto “visillo veneciano” Este efecto se produce por vibración de la cuchilla en el momento de corte

Solución: realizar cortes más finos

15.1.4.4 “Saltos groseros” Sucede cuando los tejidos para la sección son duros (particularmente útero y

cérvix) y se produce una gran vibración de la cuchilla

Solución: realizar bloques más pequeños

15.1.4.5 Agujero Este tipo de artefacto se produce en las secciones de los órganos muy celulares

15.1.4.6 Burbujas debajo de la sección Son bubujas de aire que quedan atrapadas en las secciones que producen que esa

zona de tejido se seque y se forme una grieta.

Solución: desalojar la burbuja, levantando el cubreobjetos en el baño de xilol.

15.1.4.7 “Estornudos”: Algunas secciones pueden contener células escamosas que proviene de los dedos,

estornudos o toses de la persona que está realizando la sección.

15.1.5 Artefactos de tinción Estos pueden ser de dos tipos: tinción incompleta o parcheada, o por

contaminantes y precipitados de los colorantes. Tipos:

15.1.5.1 Cera residual Esta cera impide la penetración soluciones alcohólicas y acuosas en el tejido por lo

estas áreas están desprovistas totalmente de tinción


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15.1.5.2 Tinción incompleta Esta normalmente se produce en los procedimientos de tinción automáticos por

falta de colorante en el contenedor.

Solución: llenar los contenedores de colorantes

15.1.5.3 No tinción en un área 15.1.5.4 Depósitos de colorante Sucede cuando los solventes volátiles son utilizados con calor o requieren mucho

tiempo.

Solución: contenedores de tinciones precintadas con las preparaciones verticales.

15.1.5.5 Contaminación de la solución de tinción Contaminación por microorganismos que se depositan en las preparaciones.

Solución: filtración de la tinción (foto)

15.1.5.6 Moco contaminante Este se produce cuando se utiliza la saliva para la técnica de PAS

Solución: diluir la saliva con agua o con suero salino, o usar la enzima diastasa liofilizada comercial

15.1.6 Artefacto en el almacenaje de preparaciones Estos artefactos puede que no sean detectados hasta meses o años después del

diagnóstico y pueden presentar problemas al revisar las preparaciones

15.1.6.1 Artefactos de secado Los núcleos pierden el detalle


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15.1.6.2 Agua en las secciones El agua no se mezcla con los agentes aclarantes y si las preparaciones no se

deshidratan se pueden ver opacas

Solución: retorno de la preparación al alcohol

CUESTIONARIO


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Cuestionario

1. A la hora de realizar el bloque éste debe ser enfriado a. De forma rápida entre unos 10-15º C. b. De forma lenta entre unos 5-10º C. c. De forma lenta entre 10-15º C.

2. Los moldes utilizados para la confección del bloque pueden lavarse: a. En el procesador de tejidos. b. En solución de agua y jabón con ph neutro. c. Las respuestas a y b son correctas.

3. Si la pieza tiende a agrietarse ello puede deberse a: a. Parafina fría y enfriamiento demasiado rápido. b. Parafina demasiado caliente. c. Ninguna es correcta.

4. Si una pieza consta de una parte dura y otra blanda, ¿cómo hay que orientarla para la realización del corte?

a. Hay que orientarla de forma que la parte dura se corte antes que la parte blanda. b. Hay que orientarla de forma que la parte blanda se corte antes que la parte dura. c. Es indiferente, lo importante es que el corte se realice bien.

5. Datos que deben ser señalados en el bote que contiene el espécimen con el decalcificante:

a. Nº de biopsia, fecha, hora y nº de cambios de decalcificante realizados b. Con la hora es suficiente. c. Hora y nº de biopsia.

6. ¿Cuál de estas labores no es desempeñada por el TEAP? a. Preparar la sala de macroscopía. b. Apoyar, ayudar y colaborar con el facultativo. c. Descripción macroscópica del espécimen.

7. ¿Qué labores desempeña el TEAP durante el procesamiento de muestras? a. Idear el programa de procesado que más se adecue al tipo de biopsias que se reciben. b. Comprobar el estado de la parafina y comprobar que los líquidos estén en perfecto estado. c. Todas las respuestas son correctas.


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8. Si los bloques obtenidos son friables, granulosos y sembrados de pequeñas manchas blanquecinas es debido a:

a. Sobrecalentamiento de la parafina. b. Presencia de vapores de formol en la parafina. c. Una mala fijación.

9. Los artefactos postmortem: a. Comienzan a las 12 horas del fallecimiento b. Las muestras se observan con gran nitidez c. El mecanismo es por acción de las enzimas lisosomales

10. Los artefactos de tinción: a. Los líquidos de tinción se pueden contaminar por bacterias b. En los teñidores automáticos no se producen artefactos de tinción c. En los artefactos de tinción siempre se producen defectos de tinción

11. ¿En qué año se aprueba la Ley de Prevención de Riesgos Laborales? a. 1994 b. 1995 c. 1996

12. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a. Los productos tóxicos tienen que estar etiquetados b. Es necesario disponer de las fichas de seguridad de los productos tóxicos c. No es necesario tener un plan de emergencia ante derrames de tóxicos

13. ¿Qué factores no están relacionados con el riesgo psicosocial? a. El clima b. El rol de la organización c. Todos están relacionados

14. En los casos en que no haya dictáfono en la sala de macroscopía: a. El patólogo escribirá las descripciones macroscópicas en un papel b. El TEAP será el encargado de anotar las descripciones macroscópicas c. El TEAP será el encargado de buscar un dictáfono

15. El método de tinción más utilizado en citología ginecológica exfoliativa es: a. Pap b. Giemsa c. PAS

16. El método de tinción más usado durante el acto intraoperatorio es: a. Pap b. Panóptico rápido c. Hematoxilina simple


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17. Los tejidos blandos se cortarán mejor a. A baja velocidad. b. A alta velocidad. c. A velocidad media.

18. La temperatura ideal del baño de flotación oscila: a. Entre 25º - 35º. b. Entre 45º - 50º. c. Entre 50º - 60º.

19. En el procesado de esputos una vez que hemos disgregado el moco: a. Se aparta el moco del sobrenadante. b. Se deposita unas gotas de este en un portaobjetos y se realiza la extensión para su posterior fijación y tinción. c. Si es escaso se centrífuga y se extiende el sedimento obtenido en un portaobjetos para su eliminación

20. Antes de colorear las estructuras celulares se debe: a. Deshidratar el tejido. b. Hidratar el tejido. c. Aclarar y deshidratar el tejido.

21. Las preparaciones procedentes de una PAAF de mama vienen sin fijar al laboratorio de Anatomía Patológica:

a. No se podrían procesar. b. Se fijarían inmediatamente. c. Se fijarían y se teñirían según demanda del patólogo.

22. La técnica de Panóptico rápido es utilizada principalmente en: a. Citología. b. Citología ginecológica. c. Citologías sin fijar.

23. El hidróxido sódico es un componente fundamental en la técnica de: a. Reticulina o Gordon-Sweet. b. Masson-Fontana. c. Grimelius.

24. ¿Qué técnica debemos necesita de 24h en la oscuridad para que no se produzca precipitación?

a. Grimelius. b. Tricrómico de Masson. c. Masson-Fontana.


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25. La amiloidosis secundaria se debe al depósito de: a. Las cadenas AA. b. Las cadenas AL. c. Los linfoctos B.

26. Para la técnica del PAS utilizaremos: a. Fucsina ácida. b. Reactivo de Schiff. c. Hematoxilina de Weigert.

27. El Sudan IV tiñe: a. Lípidos heterofásicos. b. Células hemáticas. c. Lípidos homofásicos.

28. Los iones de hierro se tiñen con: a. La técnica de Azul de Perls. b. La técnica de Azul de Genciana. c. La técnica de Sudán negro.

29. Entre los métodos de recuperación antigénica destacamos: a. El autoclave b. La olla a presión c. Todas las respuestas son verdaderas

30. Las temperaturas de los distintos aparatos del laboratorio se deben de comprobar:

a. Diariamente b. Semanalmente c. Mensualmente

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