Metodología.

Condiciones de fermentación

Precultivo.

Para disminuir la fase de adaptación del microorganismo al medio de

fermentación, las levaduras fueron previamente activadas por medio de un

precultivo. Se tomaron tres asadas de los tubos inclinados de conservación las

cuales fueron incubadas en un matraz Erlenmeyer de 250 mL (100 mL de medio e

incubado a 250 rpm y 30° C). Después de 12 h de incubación, 6 x 106 células

viables/mL fueron tomadas e inoculadas en un segundo matraz. Después de 12 h,

el mismo número de células fueron tomadas para las cinéticas con jugo de

cebolla.

Efecto del tratamiento térmico en el jugo de cebolla.

Con el fin de evaluar el efecto térmico en el procesamiento del jugo de cebolla

sobre el crecimiento de C cerevisiae y B bruxellensis, se realizaron cinéticas

empleando jugo de cebolla esterilizado a diferentes tiempos () o tratado

térmicamente a 90° C por 15 minutos. Los experimentos se realizaron por

duplicado en matraces Erlenmeyer de 500 mL (250 mL de medio e incubado a 250

rpm y 30° C). Los tiempos de fermentación fueron 36 y 72 h para S. cerevisiae y B

bruxellensis, respectivamente.

Efecto de nutrientes.

Para evaluar el efecto de los nutrientes, se realizaron cinéticas añadiendo

cantidades conocidas de nutrientes al jugo de cebolla. Se establecieron un total de

8 experimentos (Tabla x)

Tabla x

Cinética Nutriente

I Jugo de cebolla Sin nutrientes

II Jugo de cebolla + 2gL-1 de (NH4)2S04

III Jugo de cebolla + 5 gL-1de KH2PO4

IV Jugo de cebolla + 0.4 gL-1 de MgS04.7H20.

V Jugo e cebolla +

2 gL-1 de (NH4)2S04 + 5 gL-1 de

KH2PO4

VI Jugo de cebolla +

2 gL-1 de (NH4)2S04 + 0.4 gL-1 de

MgS04.7H20.

VII Jugo de cebolla +5 gL-1 de KH2PO4 + 0.4 gL-1 de

MgS04.7H20.

VIII Jugo de cebolla + 2 gL-1 de (NH4)2S04 + 5 gL-1 de

KH2PO4 + 0.4 gL-1 de MgS04.7H20.

Efecto del oxígeno.

Para evaluar el efecto del oxígeno en la actividad fermentativa de B bruxellensis

IHEM-6037 se realizaron cinéticas en matraces de 500 mL a diferentes relaciones

entre el volumen total y el volumen de medio (Vt/Vm). Las relaciones Vt/Vm

fueron 2, 3.3, 5 y 10.

Resultados.

Efecto térmico en el jugo de cebolla sobre el crecimiento de S. cerevisiae

ITV01

Se presentan los resultados del efecto térmico en el jugo de cebolla sobre el

crecimiento de S cerevisiae. Como ya se mencionó en metodología se planteó

usar tres tiempos de esterilización y un calentamiento a 90° C por 15 min, sin

embargo, los experimentos empleando éste último tratamiento no se realizaron

debido a que los cultivos con se contaminaron. El pH en todos los experimentos

fue aproximadamente de 4.5.

Primeramente se expone el efecto en el consumo de azúcares fermentables,

considerados como la suma de glucosa y fructosa. La figura x muestra el consumo

de azúcares en los tres tratamientos. Como se puede observar el tratamiento III

presentó inicialmente mayor cantidad de azúcares que los otros dos tratamientos.

Esto probablemente se deba a que el tiempo en los tratamientos I y II no fue

suficiente para hidrolizar la sacarosa presente. El total de azúcares fermentables

inicial (68.77 gL-1) en el tratamiento III fue similar al encontrado por Horiuchi et

al., (2000), sin embargo esta cantidad aumentó ligeramente (hasta 73 gL-1) a las 4

h debido, probablemente, a la actividad de la invertasa extracelular de la levadura

(D’amore et al., 1988; sugar utilisation by yeast during fermentation. La cantidad

de fructosa y glucosa en el tratamiento III es cerca de 2.2 veces mayor que en los

otros dos experimentos. En los tratamientos I y II sólo se registró un pequeño

aumento en las concentraciones de glucosa y fructosa entre las horas 2 y 4, de

menos de 1 gL-1. En todos los experimentos el consumo de glucosa fue

ligeramente más rápido que el consumo de fructosa, lo que concuerda con lo

reportado en otros trabajos (Fernández, et al., 2011: citar trabajo de Lorena ; D’

Amore, et al., 1988:Sugar utilization by yeast during fermentation; Cason et al.,

1986:on the difference rates of fructose and glucose utilisation in saccharomyces

cerevisiae)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 400

10

20

30

40

50

60

70

80

Trat. ITrat. IITrat. III

t (h)

Azúc

ares

tota

les (

gL-1

)

Figura x.- Consumo de azúcares totales por S. crevisisiae ITV-01 en jugo de

cebolla tratado a diferentes tiempos de esterilización.

Por otro lado, la producción de biomasa y etanol se presentan en las figuras x y x.

Como se puede observar las mayores concentraciones se obtuvieron en el

tratamiento III, 32.8 gL-1 de etanol (, aproximadamente a las 17 horas y 12.5 gL-1

de biomasa aproximadamente a las 30 h. La incapacidad de S. cerevisiae para

crecer en los experimentos con los tratamientos I y II, puede deberse a la

presencia de compuestos derivados de la aliina (producidos durante el

procesamiento mecánico) que no fueron volatilizados durante la esterilización.

Horiuchi reportó problemas para hacer crecer a S. cerevisiae en jugo de cebolla

sin esterilizar, sin embargo no profundizó en este hecho.

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 400

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Trat. ITrat. IITrat. III

t (h)

EtO

H (g

l-1)

La tabla x, muestra algunos parámetros cinéticos y estequiométricos de las tres

cinéticas realizadas.

Tratamientoµ

(h-1)

Vs

(gg-1h-1)

Vp

(gg-1h-1)Yx/s Yp/s

P

(gL-1h-1)

I 0.37 0.826 0.4+0.001 0.27 0.4 0.94

II 0.33 1.11 0.42+0.003 0.25 0.42 0.67

III 0.62 1.48 0.66+/- 0.0012 0.18 0.45 2.07

Los valores calculados que en términos cinéticos y de productividades, el

tratamiento III fue superior a los otros, indicando que el mejor tiempo de

esterilización de jugo de cebolla es de 20 min. Por otro lado, los rendimientos de

biomasa con respecto a sustrato son cerca de 50 % mayores en los tratamientos I

y II que en el tratamiento III, mientras que los rendimientos de producto con

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 400

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Trata. ITrata. IITrata. III

t (h)

Biom

asa

(gL-

1)

respecto a sustrato son similares en los tres casos. Cabe señalar que los

rendimientos del glicerol producido son también similares en todos los

experimentos.

Esto podría indicar que el metabolismo de los azúcares no fue inhibido en ninguno

de los casos. Estos resultados, junto al hecho de que las glucosa y fructosa fuesen

consumidas en su totalidad en los experimentos I y II, y que aparentemente no se

vio reflejado un aumento considerable de éstos por acción hidrolítica de la

invertasa extracelular, podría indicar la incapacidad de la levadura para utilizar la

totalidad de la sacarosa presente en el jugo de cebolla esterilizado por debajo de

los 20 min. Algunos trabajos reportan la represión de la expresión de invertasa por

diferentes motivos, como la presencia de urea o por altas concentraciones de

glucosa, lo que promovería el transporte de sacarosa dentro de la célula (Santos

et al., Uptake of sucrose by saccharomyces cerevisiae, 1982;), sin embargo,

dicho proceso es energéticamente desfavorable y contrariamente, se produciría

una disminución en rendimiento de biomasa y un aumento en el rendimiento de

etanol (Basso et al., Topology and kinetics of sucrose metabolism in

saccharomyces crevisiae for improved ethaol yiedl: Chase et al., 1982: The non

competitive inhibition and irreversible inactivation of yeast invertase by urea) lo que

en este caso no ocurrió. A partir de estos resultados se concluye que el mejor

tiempo de esterilización del jugo de cebolla para el crecimiento y fermentación con

S. cerevisiae es de 20 min.

Efecto de los nutrientes en S. cerevisiae ITV-01.

En esta sección se evaluó el efecto de la adición de nutrientes sobre el jugo de

cebolla. Los experimentos fueron realizados empleando jugo de cebolla

esterilizado durante 20 min de acuerdo con los resultados de la sección anterior.

Las figuras x muestran el consumo de azúcares, producción de biomasa y la

producción de etanol. El consumo de los azúcares totales fue similar en todos los

casos, y se llevó a cabo dentro de las 4 y 16 h. Las velocidades de consumo

sustrato estuvieron en un rango 1.5 y 1.7 gg-1h-1.

En cuanto a la producción de biomasa la figura x muestra que aproximadamente a

entre las 16 se alcanzaron los máximos valores. La concentración final en todos

los tratamientos estuvo entre 10.2 y 11.6 gL-1, con una viabilidad mayor al 90% en

todos los casos después de las 36 h.

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 400

2

4

6

8

10

12

IIIIIIIVVVIVIIVIII

t (h)

Azúc

ares

tota

les (

gL-1

)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 400

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

IIIIIIIVVVIVIIVIII

t (h)

Biom

asa

(gL-

1)

De la misma forma, la producción de etanol al parecer tampoco fue afectada por la

adición de nutrientes, obteniéndose valores entre 24 y 28 gL-1 de Etanol entre las

12 y 16 h.

La tabla x muestra los rendimientos y productividades en estos experimentos

Tratamiento µ Yx/s YP/S P

I 0.17 0.18 0.4 2.1

II 0.14 0.17 0.4 1.32

III 0.14 0.16 0.4 1.54

IV 0.14 0.17 0.4 1.47

V 0.13 0.18 0.4 1.54

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 400

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

IIIIIIIVVVIVIIVIII

t (h)

Biom

asa

(gL-

1)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 400

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

IIIIIIIVVVIVIIVIII

t (h)

EtO

H (g

L-1)

VI 0.14 0.16 0.4 1.52

VII 0.14 0.17 0.38 1.46

VIII 0.14 0.17 0.37 1.46

Las velocidades específicas de crecimiento, así como los rendimientos de

biomasa y producto fueron similares, lo que sugeriría que la adición de nutrientes,

y en concreto, de sulfato de amonio, no tuvieron en efecto en el crecimiento y el

metabolismo. Estos resultados coinciden por los obtenidos por Mendes – Fereira

et al., (2004), los cuales encontraron que las velocidades específicas de

crecimiento no se ven afectadas por la cantidad de nitrógeno presente inicialmente

en el medio. Estos mismos autores encontraron que la cantidad mínima de

nitrógeno requerido para el crecimiento y producción de etanol es de 0.267 gL-1,

por lo que estos requerimientos se ven cubiertos en un medio complejo como lo

es el jugo de cebolla, el cual contiene cerca de 3.77 gL-1 de aminoácidos

(Horiuchi, 1999). Además, estos autores encontraron que el consumo de glucosa

y el tiempo de fermentación dependen de la cantidad de nitrógeno disponible, al

menos en un rango de 0.267 – a 0.8 gL-1; sin embargo este fenómeno no se

registró en este trabajo, lo que sugeriría que la cantidad de aminoácidos presente

sobrepasa el límite donde se presenta este fenómeno. En otro trabajo realizado

por Fernández et al., (2010), empleando la misma cepa que en este estudio, se

realizaron experimentos añadiendo diferentes concentraciones de sulfato de

amonio, extracto de levadura, urea y fosfato de potasio a soluciones de melazas

tipo “B” provenientes caña de azúcar, encontrando que no existieron diferencias

en la producción de biomasa y etanol en todos los tratamientos, sin embargo, las

velocidades específicas de crecimiento se vieron favorecidas en aquellos

experimentos con adición de fuente de nitrógeno.

Brettanomyces bruxellensis IHEM-6037.

Tratamiento térmico

Resultados similares a los anteriores se presentaron con B. bruxellensis IHEM-

6037. Las figuras X muestran el efecto del tratamiento térmico en el jugo de

cebolla sobre el crecimiento de B bruxellensis. Se puede apreciar que los

azúcares son consumidos cas en su totalidad a las 20 h en el tratamiento III,

mientras que el consumo de éstos en los tratamientos I y II se da hasta las 24 h.

Muy por arriba de éstos se encontró el consumo en el tratamiento IV, donde se dio

hasta las 40 h. Aguilar

La producción de biomasa también se vio afectada. El máximo valor obtenido se

presentó, en el tratamiento III (19.5 gL-1), y fue disminuyendo conforme a la

disminución del tiempo al que fueron sometidos los tratamientos (15.77, 11.4 y

8.28 gL-1 en los tratamientos II, I y IV respectivamente). Además se puede

apreciar una fase lag de 24 h en el tratamiento IV, lo que representaría el doble

que en los demás tratamientos. Después de las 36 h en los tratamientos I, II y IV

se presentó una disminución en la viabilidad de 90 a 80 %.

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 600

10

20

30

40

50

60

70

80

IIIIIIIV

t (h)

Azúc

ares

tota

les

(gL-

1)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 600

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

IIIIIIIV

t (h)

Biom

asa

(gL-

1)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 600

10

20

30

40

50

60

70

80

IIIIIIIV

t (h)

Azúc

ares

tota

les

(gL-

1)

Contrario a los resultados obtenidos con S. cerevisiae, la producción de etanol con

B bruxellensis no se vio afectada en términos absolutos en los cuatro

tratamientos, pero sí en el tiempo de fermentación. Es decir, la concentración final

fue similar en todos los casos (20 gL-1, aproximadamente), pero esta cantidad es

alcanzada a las 18 h en el tratamiento III, 24 h en el II, 32 h en el I y a las 40 h en

el I.

Para visualizar mejor estos resultados la tabla x muestra algunos parámetros

estequiométricos y cinéticos de estos experimentos.

Tratamiento µ VS VP YX/S YP/S Pt16

I0.03+-

0.005

-0.53 +-

0.250.24 0.21 0.37 0.91

II0.03 +-

0.01-0.55+0.18 0.18 0.3 0.34 0.66

III 0.058 +- -1.18+-0.2 0.38 0.28 0.29 0.465

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 600

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

IIIIIIIV

t (h)

EtO

H (g

L-1)

0.01

IV0.028+ --

0.01-0.44 +- 0.2 0.24 0.15 0.36 0.051

Los resultados revelan varias cosas. La primera que el tiempo de esterilización

tuvo un efecto positivo en las velocidades específicas, de producción y consumo

de sustrato. En cuanto al rendimiento de biomasa y etanol no se observa

claramente algún efecto. Al parecer el tiempo de esterilización favoreció el

rendimiento en biomasa (los mejores fueron los obtenidos en los tratamientos II y

III), sin embargo ésto no se vio reflejado en el rendimiento de etanol (tanto en I, II y

IV, se obtuvieron rendimientos mayores que con el tratamiento III), debido a que

en términos absolutos la concentración de etanol fue similar en todos los casos.

Estos rendimientos más altos sugerirían probablemente que la sacarosa no

hidrolizada por el efecto térmico fue consumida y empleada en la producción de

etanol por sobre la producción de biomasa. Debido a que B bruxellensis

probablemente no exprese la invertasa extracelularmente o que la velocidad de

consumo sea mayor a la hidrólisis, (Aguilar et al., 2003) no se registró un aumento

de azúcares totales, lo que explicaría el incremento en el rendimiento de etanol.

Además, la disminución en las velocidades específicas y en la producción de

biomasa, además del aumento de la fase de adpatación podría indicar algún tipo

de inhibición en el crecimiento por los componentes no volatilizados del jugo de

cebolla (Horiuchi, 1999).

Efecto de los nutrientes

Al igual que en la sección anterior, los resultados en torno al efecto de los

nutrientes son prácticamente iguales que en S. cerevisiae. La tabla X muestra los

valores de algunos parámetros cinéticos y estequiométricos de las 8 cinéticas

realizadas.

Tratamientoµ

(h-1)

VS

(gg-1h-1)

VP

(gg-1h-1)

YX/S

(gg-1)

YP/S

(gg-1)

P

(gL-1)

I 0.27 0.31 1

II 0.3 0.31 1

III 0.29 0.31 0.9

IV 0.29 0.33 0.97

V 0.29 0.31 1

VI 0.3 0.32 0.96

VII 0.28 0.32 1

VIII 0.27 0.31 0.91

Así como en los cultivos de S. cerevisiae la adición de nutrientes en el jugo de

cebolla no tuvo efecto alguno sobre el metabolismo y crecimiento, tampoco en B

bruxellensis se observó un efecto de éstos. La tabla x muestra que los valores de

los parámetros cinéticos y estequiométricos son similares en los 8 experimnentos.

Aguilar et al.,(2000) determinó que tanto el sulfato de amonio y el extracto de

levadura (componente rico en aminoácidos y vitaminas) son esenciales para el

crecimiento de esta cepa , por lo que el alto contenido nutrimental del jugo de

cebolla provee (en especial por el alto contenido de aminoácidos, ácidos orgánicos

y minerales.) a la levadura de todos los requerimientos necesarios.

Efecto de la aireación en B bruxellensis.

A continuación se expone el resultado de los experimentos realizados en

condiciones de semiaerobiosis, variando el volumen del medio. Las figuras X

muestran la producción de etanol, biomasa y ácido acético.

0 20 40 60 80 100 120 1400

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

R = 10R = 5R = 3.3R = 2

t (h)

EtO

H (g

L-1)

0 20 40 60 80 100 120 1400

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

R = 10R = 5R = 3.3R = 2

t (h)

Biom

asa

(gL-

1)

0 20 40 60 80 100 120 1400

0.5

1

1.5

2

2.5

3

R = 10R = 5R = 3.3 R = 2

t (h)

Ácid

o ac

ético

(gL-

1)

Podemos apreciar en las Figuras anteriores 4 etapas (al menos

fenomenológicamente) de la evolución de las cinéticas. Una primera etapa

consistió en la producción paralela de biomasa, etanol, y una pequeña cantidad de

ácido acético (menor a 0.2 gL-1), así como el consumo de los azúcares totales

(gráfica no mostrada) ocurrida durante las primeras 20 h (8 h de fase de

adaptación), aproximadamente. Una segunda etapa se aprecia de las 20 a 40 h

donde no ocurre síntesis de biomasa (segunda fase lag), pero sí un consumo lento

de etanol y paralelamente, la producción de ácido acético (en los experimentos

R10 y R5, al parecer en R2 y R3.3 esto ocurre después). En esta etapa se alcanzó

una máxima concentración de 2.1 gL-1 en R10 y 0.47 gL-1 en R5. Una tercera

etapa comienza con la reanudación de síntesis de biomasa y el consumo de

etanol (más rápido que en la etapa anterior) y de ácido acético. Dentro de esta

última etapa se aprecian que la síntesis de biomasa pasa a una tercera fase lag,

para luego nuevamente crecer (lentamente).

Etapas similares fueron reportadas para B. intermedius en condiciones de

aireación por Wijsman et al., (1984), con la diferencia que la cantidad de ácido

acético fue superior a la de este trabajo. En efecto, la cantidad de ácido acético

producido está muy por debajo por lo reportado en otros trabajos para esta misma

cepa, empleando flujos de aire controlado (0.015 gg-1 contra 0.15 gg-1 obtenido

por Ortiz, et al., 2013). Al parecer las condiciones de semiaerobiosis no fueron

suficientes para que se presentaran cantidades altas ácido acético (efecto Custer).

Aguilar et al., (2003) encontró que bajas tasas de aireación (0.05 y 0.1 vvm, OTR=

21.4 y 43 mg O2/L, respectivamente) favorecen la síntesis de biomasa sobre la

producción de ácido acético y etanol y que a esas condiciones el O2 se vuelve un

factor limitante (la concentración de O2 a cierto tiempo se vuelve cero). Para

poder estudiar con más detalle si el jugo de cebolla es adecuado para la

producción de ácido acético, se necesitarán realizar experimentos en biorreactor y

con flujos de aire controlado.

Conclusiones.

Debido a los componentes inhibitorios (Horichi, 1999) el jugo de cebolla tiene que

ser esterilizado para poder volatilizar estos compuestos. El mejor tiempo de

esterilización de jugo de cebolla encontrado en este trabajo para el crecimiento de

S. cerevisiae ITV01 y B bruxellensis IHEM-6037 es de 20 min.

Por otra parte, dada el contenido nutrimental del jugo de cebolla (2.77 gL-1 de

aminoácidos) se encontró que la adición de los nutrientes probados no tuvo efecto

sobre la fermentación del mismo con ninguna de las dos levaduras.

Finalmente, las condiciones de semiaerobiosis probadas no arrojaron un valor

considerable de ácido acético, por lo que se requerirán experimentos posteriores

(por ejemplo, emplear un flujo de 0.6 vvm y/o añadir glucosa para obtener

mayores rendimientos de ácido acético).

El tiempo de fermentación empleado fue de 36 h para S. cerevisiae y 72 h para B

bruxellensis.

Resultados.