Métodos de esterilización y desinfección.

Medios de cultivo.

Curso: Diagnóstico de enfermedades vegetales

27 de mayo de 2011

Ing. Agr. MSc. Vivienne Gepp

Objetivo

• Que el estudiante se familiarice con los procesos de desinfección y esterilización comúnmente utilizados en un Laboratorio de Fitopatología.

• Conocer los medios de cultivo más usados.

DefinicionesEsterilización = proceso mediante el cual se

matan o eliminan todas las formas de vida microbiana.

estéril o no estéril.

Desinfección = eliminar microorganismos patógenos total o parcialmente

niveles de desinfección.

Asepsia = exclusión continuada de microorganismos contaminantes.

Métodos de esterilización

• FISICOS:– Calor

• seco (llama, horno)

• húmedo (autoclave)

– Radiaciones

• MECÁNICOS– Filtración

• QUIMICOS– Gaseosos

– No gaseosos

Calor seco

• Esterilización directa en la llama

Calor seco

alcohol 96% + mechero

Calor seco

alcohol 96% + mechero

Calor seco

Horno

Calor seco - Horno

• Se utiliza para: vidrio seco instrumentos quirúrgicos objetos metálicos aceites, vaselinas y polvos

• Temperaturas:180 ºC ---------- 30 - 60 min.170 ºC ---------- 60 - 120 min

T ºC

horas

Calor seco

• Recipientes de metal o envolver en papel (usar temp. menor en este caso)

• Dejar que vuelva a temp. ambiente antes de abrir

Calor húmedo

• Con presión: autoclave, olla presión

• Para sustancias estables al calor – ¿combinaciones reactivos a temp altas?

• Temperatura – presión – tiempo

Temp. 100 110 115 121 125 130

Tiempo 20 h 2,5 h 51 min. 15 min. 6,4 min. 2,4 min.

Autoclave

Autoclave

Presión

(lb/in.)

Temperatura interna (ºC) según % aire eliminado

100% 66% 50% 33% 0%

5 109 100 94 90 72

10 115 109 105 100 100

15 121 115 112 109 100

25 130 126 124 121 115

30 135 130 128 126 121

Calor húmedo - Autoclave

• ¿cómo optimizar eficacia? – eliminar aire,– contenidos similares, – no apretados, dejar espacios verticales,

• Precauciones: – tapas sueltas, – recipientes con hasta 1/3 de volumen, – vuelta a presión normal lenta.

Controles de esterilización

a. Físicos

b. Químicosc. Biológicos

Controles de esterilización

a. Físicos

b. Químicos

c. Biológicos

Esterilización química

• Ventajas: no requiere altas temperaturas ni aparatos costosos

• Desventajas: mayor tiempo, sustancias inflamables y muy tóxicos y alto costo

• Ejemplos: óxido de etileno, formaldehído

Esterilización por filtrado

• Elimina microorganismos >virus• Ventaja: no modifica composición• Para: cantidades pequeñas• Para: vitaminas, hormonas, antibióticos, etc.• Requiere bomba de vacío• Ejemplo membranas de ésteres de celulosa: 1 uso,

“poros” de 0,22 µm

CAMPANAS DE FLUJO LAMINAR

Radiaciones UV

Desinfección superficial

Desinfección superficial

Técnicas comunes en Fitopatología:

• Lavado previo en agua corriente – detergente? cepillo?

• Agua corriente 2 o más horas

• Alcohol 70%

• Hipoclorito de sodio: – 1% Cloro activo, 2 %, 0,35% etc.– minutos– enjuague posterior

Desinfección superficial

Selección de técnica(s) según:

• tejido: grosor, consistencia

• hongo a aislar: ej. Oomycetes,

Rhizoctonia

• dónde pensamos que está el patógeno

Medios de cultivo

• Componentes básicos

• ¿Sólido o líquido?

• Ajuste de pH

• Inhibidores de “contaminantes”:– bacterias – hongos no deseados

Clasificación de medios de cultivo

• Sintéticos – más complicados para elaborar, muchos componentes

• Naturales – raíces y frutos aportan lo necesario para hongos, ¿bacterias necesitan más?

• Semi-sintéticos

¿Qué aportan los medios?

• Soporte - Agentes solidificantes:– gelatina: fusión a 37ºC, solidifica 25-30ºC, se

descompone a 121ºC– agar: fusión a 80-100ºC, solidifica a 35-50ºC

• Carbono orgánico– Azúcares inducen crecimiento micelio, pueden inhibir

esporulación temporal- o permanentemente.

• Vitaminas y otros factores de crecimiento• Inhibidores• Sustancias que permiten diferenciar spp. o biotipos• Indicadores

Medios comunes:

• Agar papa dextrosa

• Agar agua

• Agar malta

• Agar harina de maíz

• Agar V8

• Nutriente agar dextrosa

• Extracto de levadura dextrosa con carbonato de calcio (Yeast Dextrose CaC03)

• B de King

Dispensado de medios

• Temperatura: 45-50ºC– mayor: condensa H2O– menor: solidificación prematura

• Placas de Petri: aprox. 20 ml c/u

• Tubos de ensayo: vertical o pico de flauta