MTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGAM.C.D. Ma. De Lourdes Urquizo RuvalcabaEsp. Patologa y Medicina Bucal

MTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGAHISTOLOGAEstudia la microanatoma de las clulas, los tejidos y los rganos y correlaciona su funcin.

HISTOTECNOLOGAConjunto de tcnicas que se llevan acabo para la preservacin y preparacin de los tejidos y clulas, para su estudio con microscopio de luz y sus variantes

MTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGAOBJETIVOS DE LA HISTOTECNOLOGA

Preservacin optima y funcional de los diferentes materiales tisularesy celulares que llegan al laboratorio.

Conocer los principios de las tcnicas rutinarias y especiales, as como sus indicaciones precisas para el estudio de los tejidos

TCNICA HISTOLGICAComprende la preparacin de tejidos para su estudio microscpico.

Se logra sometindolos a una serie de procesos:Obtencin del tejido a estudiarFijacinDeshidratacinAclaramientoInclusin Corte MontajeObservacin (Diagnstico)

TCNICA HISTOLGICAOBTENCIN DEL TEJIDO A ESTUDIARBIOPSIAS IncisionalExcisionalNECROPSIA O AUTOPSIA CITOLOGA EXFOLIATIVA FROTIS

TCNICA HISTOLGICA: FIJACINSe refiere al tratamiento del tejido con sustancias qumicas que tienen varias finalidades:

Preservar el tejido de la putrefaccin, autolisis, etc.

Conserva la estructura morfolgica y qumica de las clulas y tejidos al estado vivo (citoarquitectura y ultraestructura)

Aumenta la dureza del tejido para facilitar la preparacin de finas pelculas de ste.

Y permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloracin o de identificacin que facilitan el completo conocimiento de su constitucin ntima

TCNICA HISTOLGICA: CUALIDADES DE UN FIJADORActuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan autlisis, desintegracin, etc.)

Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas.

Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo

TCNICA HISTOLGICA: CUALIDADES DE UN FIJADORPermitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.)

No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales

No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

TCNICA HISTOLGICA:Cmo actan los fijadores?Vara con la composicin o naturaleza Coagulando las protenas sin combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor)

Formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales), o reducindose en contacto con las mismas y originando un precipitado sumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).

La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes, favorece la coloracin ulterior de los tejidos.

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES QUMICOSSon los ms utilizadosPueden ser:Fijadores simplesconstituidos por una sola sustancia qumica

Fijadores compuestoscuando varias fijadores simples intervienen en su constitucin racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus efectos

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES QUMICOSFIJADORES SIMPLES Formol al 10%es el ms usado. Reacciona con los grupos aminos de las protenas, formando enlaces transversales y conservando las estructuras de la clula. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos.

Alcohol etlico absoluto o de 96% Se usa generalmente en microqumica. Preserva el glucgeno. Causa distorsin del detalle nuclear y comprime el citoplasma.

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES QUMICOSFIJADORES SIMPLESAlcohol metlico. Se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.)

cido smico al 1 2%Es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares.

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES QUMICOSFIJADORES SIMPLESBicromato de potasio al 3-5%. Fija el citoplasma y no se precipita. Nunca se usa solo. Despus de la fijacin loes especmenes deben ser lavados exhaustivamente para remover el oxido que se forma

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES QUMICOSFIJADORES COMPUESTOSLquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica.Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica.Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol.Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica.Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouinalcohlico

TCNICA HISTOLGICA: FIJADORES FSICOS

Desecacin. Calor seco.Coagulacin de las protenasNo es buena ya que las clulas se destruyen. Calor hmedo.Fro y Congelacin .Se congela el tejido con dixido de carbono o N liquidoEs mejor que el calor pero se pueden formar cristales.

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALI. FIJACINFijacin en formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs.II. DESCRIPCIN MACROSCPICA Y CORTESe describe forma, color, textura, superficie, consistencia al corte y se mide.Se le da el tamao deseado a la piezaEnjuaga durante 15 min.

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALIII. DESHIDRATACINDebido a que una gran parte del tejido est constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante.Se debe deshidratar el tejido, ya que la parafina nos es hidrosoluble

Alcohol 70, 1h30'.Alcohol 96, 1h30'.Alcohol 100 (l), 1h30'.Alcohol 100 (ll), 1h30'.Toluol O Xilol , entre 1h30' y 3hs. (Aclaramiento)

NOTA: si se colocara el tejido en una solucin al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldra muy rpido del tejido y se deformara.

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALACLARAMIENTOLuego de deshidratar el tejido, se pasa a una solucin de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusin (PARAFINA) a utilizar.

Se sustituye el alcohol por un lquido intermediario normalmente el hidrocarburo bencnico (xilol, benceno, toluol).

Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su ndice de refraccin.

Nota: El alcohol y el xileno disuelven los lpidos de la clula y por lo cual al extraerse tambin se extraen las grasas y los lpidos de la clula.

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALIV. INCLUSINA fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme.gelatina y parafina.

El objeto de la inclusin es:Distinguir entre s las clulas superpuestas en un tejido y la matriz extracelular. Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.La parafina penetra en los vasos, en los espacios intercelulares y en el interior de las clulas embebiendo el tejido y haciendo ms fcil la obtencin de cortes en el microtomo.

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALIV. INCLUSINInfiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusin en estado lquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido.1.Secado de la muestra con gasa.2) Parafina 56 (l), 1h30'.3) Parafina 56 (ll), 1h30'.4) Formacin de la barra.5) 30' de frezzer.6) Fractura del taco NOTA: Debido al calor, el xilol se evapora y los espacios anteriormente ocupados por el son ahora ocupados por la parafina

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALV. CORTEEl taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia ptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrmetros (5)MICROTOMO.

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALVI. COLORACIN Y MONTAJELos cortes todava no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen de color.

Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequea cantidad de Albmina, la cual acta como adhesivo.

La parafina se elimina en un solvente orgnico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata hacindola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etlico hasta llegar a una solucin 100% y agua.

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALVI. COLORACIN Y MONTAJEYa rehidratado se TIE EL TEJIDO. Los colorantes ms utilizados son la HEMATOXILINA Y la EOSINA. Una vez teido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que pueda fijarse de modo permanente el CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el MONTAJE (por ejemplo una gota de Blsamo de Canad o similar).

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALVI. COLORACIN Y MONTAJE1.Xilol o toluol(I), 15' en estufa.2. Xilol o toluol(II), 2'.3. Alcohol 100, 30".4. Alcohol 96, 30".5. Alcohol 70, 30".6. Alcohol 50, 30".7.Agua destilada, 30".8. Hematoxilina, 130".9. Agua corriente, 2.10. Alcohol 50, 15".11. Eosina, 30".12. Alcohol 96, 10".13. Alcohol 100, 10".14. Xilol, 1 por lo menos.15. Montaje con Blsamo de Canad sinttico.

VI. COLORACIN Y MONTAJELos colorantes pueden agruparse en 3 clases:Colorantes que diferencian los componentes cidos y bsicos de la clula.Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz extracelular.Sales metlicas que se precipitan en los tejidos y forman depsitos de metales con ellos

HEMATOXILINA Y EOSINA

Tincin PAS (cido perydico-reactivo de Schiff)Es uno de los mtodos qumicos ms empleados en histologa.Tie carbohidratos y macromolculas ricas en carbohidratos.Se usa para detectar :glucgeno en las clulasMoco en diversos tipos celularesMembrana basal subyacente a los epiteliosFibras reticulares del tejido conectivoLos anillos de las hexosas (carbohidratos) poseen carbonos adyacentes, cada uno con un grupo hidroxiloEl ac, perydico rompe la unin entre estos tomos de carbono adyacentes y forma grupos aldehdo.Estos aldehdos reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un color prpura intenso (rojo luminoso)

Tincin PAS (cido perydico-reactivo de Schiff)

Tincin PAS (cido perydico-reactivo de Schiff)

Tricromico de Masson

Es una tcnica para la coloracin de fibras colgenas y elsticas. Se observan tres colores distintos:Ncleos: NegroMsculo, citoplasma y queratina: rojoColgeno: azul o verde

COLORACION DE WRIGHT

TEJIDO CONECTIVO LQUIDO: SANGRE

NEGRO SUDNLos colorantes Sudn tien fuertemente los TRIGLICRIDOS, como por ejemplo:Rojo de sudn o sudn III, en la coloracin de clulas adiposas. El negro de sudn o sudn IV, se emplea en la coloracin de las vainas mielnicas de las fibras nerviosas compuestas por lipoprotenas.

TINCION ARGNTICA

TCNICA HISTOLGICA: INMUNICITOQUMICA

INMUNICITOQUMICA DIRECTA

INMUNICITOQUMICA INDIRECTA

AUTORRADIOGRAFIA

CRIOFRACTURA

CRIOFRACTURA

TCNICA HISTOLGICAVII. OBSERVACIN(DIAGNSTICO)

TCNICA HISTOLGICAVII. OBSERVACIN(DIAGNSTICO)

TCNICA HISTOLGICA: PROTOCOLO GENERALVII. OBSERVACIN (DIAGNSTICO)MICROSCOPIO

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