Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados
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Peroxidase And
Nuclear Density Analysis
Lic. T.M. Jose Luis Vargas
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Mètodo de IMPEDANCIAMMèètodotodo de IMPEDANCIAde IMPEDANCIA
•• Ley de Ley de OhmOhm: : U=RIU=RIU= U= VoltajeVoltajeR=R= ResistenciaResistenciaI= I= CorrienteCorriente
•• Mala Mala conducciònconducciòn de la electricidadde la electricidad
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HISTOGRAMA G. ROJOSHISTOGRAMA G. ROJOSHISTOGRAMA G. ROJOS•• ADE:ADE: DistribuciDistribucióónn
HeterogHeterogèèneanea: : A. AdquiridaHomogHomogèèneanea: : A. Genética
•• VCM:VCM: TamaTamaññooMacrocMacrocììticoticoNormocNormocììticoticoMicrocMicrocììticotico
•• HCM,CHCM:HCM,CHCM: CantidadCantidadNormocròmicaNormocròmicaHipocròmicaHipocròmica
•• RBC,HTO,HbRBC,HTO,Hb::PoliglobuliaPoliglobuliaNormalidadNormalidadAnemiaAnemia
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SUBPOBLACIONES WBCSUBPOBLACIONES WBC• LINFOCITOS:
Variantes de Linfocitos y Linfocitos maduros
• CEL GRANDES MONONUCLEARES: Monocitos, Linea Mieloide, Promonocitos, Prolinfocitos
• GRANULOCITOS: Todos los PMN màs cayados o segmentados
• Gràfica Normal segùn poblaciòn predominante acorde a la edad: NIÑOS ( LINFOCITOS )ADULTOS ( PMN )
• LINFOCITOS: Variantes de Linfocitos y Linfocitos maduros
• CEL GRANDES MONONUCLEARES: Monocitos, Linea Mieloide, Promonocitos, Prolinfocitos
• GRANULOCITOS: Todos los PMN màs cayados o segmentados
• Gràfica Normal segùn poblaciòn predominante acorde a la edad:NIÑOS ( LINFOCITOS )ADULTOS ( PMN )
LINFOCITOSLINFOCITOSLINFOCITOS
CELULASMONONUCLEARESGRANDES
CELULASCELULASMONONUCLEARESMONONUCLEARESGRANDESGRANDES
GRANULOCITOSGRANULOCITOSGRANULOCITOS
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HISTOGRAMA DE PLAQUETAS
HISTOGRAMA DE HISTOGRAMA DE PLAQUETASPLAQUETAS
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Generalidades de dispositivo Láser• Láser es un acrónimo de Light Amplification by Stimulated Emission of
Radiation (Emisión de luz por emisión estimulada de radiación).
• La energía generada por un Láser está dentro de la porción óptica del espectro electromagnético, según ilustra la figuraUn haz Láser es no ionizante y abarca desde el ultravioleta (100 – 400 nm), visible (400-700 nm) e Infrarrojo (700 nm – 1 mm).
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Propiedades de un haz Láser
1. Monocromaticidad
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Propiedades de un haz Láser
2. Direccionabilidad
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Propiedades de un haz Láser
3.Coherencia
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Low Angle Scatter DetectorMeasures: Size/Volume
High Angle Scatter DetectorMeasures:Density/HGB conc/Refractive Index
Zero Angle:Retic Absorption/Staining
Laser
RBC/PLT/RTC MethodsRBC/PLT/RTC Methods
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Reacción:
- Los eritrocitos son hemolizados para liberar la hemoglobina. - El grupo Hem se oxida de su forma ferrosa a férrica
y se combina con el cianuro para formar:
ReacciReaccióónn::
-- Los Los eritrocitoseritrocitos son son hemolizadoshemolizados parapara liberarliberar la la hemoglobinahemoglobina. . -- El El grupogrupo Hem se Hem se oxidaoxida de de susu forma forma ferrosaferrosa a a fféérricarrica
y se y se combinacombina con el con el cianurocianuro parapara formarformar::
HEMOGLOBINA+ HEMOGLOBINA+ reactivoreactivo HGB META HEMOGLOBINA CIANOMETA HB.HGB META HEMOGLOBINA CIANOMETA HB.
El reactivo ADVIA 120 HGB contiene:
- Cianuro de potasio, 20 mmol/L- Oxido de Dimethilaurilamina, 2.0%
El El reactivoreactivo ADVIA 120 HGB ADVIA 120 HGB contienecontiene::
-- CianuroCianuro de de potasiopotasio, 20, 20 mmolmmol/L/L-- OxidoOxido de de DimethilaurilaminaDimethilaurilamina, 2.0%, 2.0%
UFC Filtro +Fotodiodo
Cámara de reacción de HGB
Lámpara
ADVIA 120HEMOGLOBINA
ADVIA 120ADVIA 120HEMOGLOBINAHEMOGLOBINA
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GLOBULOS ROJOSGLOBULOS ROJOSGLOBULOS ROJOSLo
w A
ngle
/ Vo
lum
e (
Low
Ang
le /
Volu
me
( fLfL))
High Angle / High Angle / HgbHgb ConcentrationConcentration
120ƒL
Macrocrocytic
MicrocrocyticH
ypoc
hrom
ic
Hyperchrom
ic60ƒL
28 gm/dL 41 gm/41 gm/dLdL
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CONCENTRACION DEHEMOGLOBINA
CONCENTRACION DECONCENTRACION DEHEMOGLOBINAHEMOGLOBINA
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MICROCITOSISMICROCITOSISMICROCITOSIS
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MACROCITOSISMACROCITOSISMACROCITOSIS
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HIPOCROMIAHIPOCROMIAHIPOCROMIA
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HIPERCROMIAHIPERCROMIAHIPERCROMIA
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ANISOCITOSISANISOCITOSISANISOCITOSIS
Aniso HCVAR
Se relaciona con el VCM: grande, mediano, pequeño
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ANISOCITOSISANISOCITOSISANISOCITOSIS
ANEMIA DIMORFA HETEROGENEA
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LEUCOCITOS (Perox)LEUCOCITOS (LEUCOCITOS (PeroxPerox))ReacciReaccióónn::
- El Surfactante Sulfato dodecyl sódico y el Brij-35 en combinación con el calor, lisa las células rojas.El formaldeído fija las células blancas. El medio hipertónico produce crenación y contracción de las células blancas, lo cual incrementa el índice de refracción y permite la mejor identificación de los linfocitossobre el ruido.
Lámpara de tungsteno
Filtro
Detector de absorción
Corriente AnalíticaDetector de dispersión
Separador de luzCampoObscuro
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# gr
anul
os
Maduración Celular
Blastos
PromielocitosMielocitos
MetamielocitosBandas
PMN Maduros
Médulo Oséa Sangre
Número de Gránulos NeutrófilosNúmero de Gránulos Neutrófilos
El método de peroxidasasEl El mméétodotodo de de peroxidasasperoxidasas
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Neutrophils
Eosinophils
MonocytesLarge
UnstainedCells
Lymph and Basophil
PlateletClumps
NRBC
Noise
Perox Cytogram
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METODO PEROXIDASAMETODO PEROXIDASAMETODO PEROXIDASASc
atte
r / V
olum
eSc
atte
r / V
olum
eSc
atte
r / V
olum
e
Absorption / StainingAbsorption / StainingAbsorption / Staining
Scat
ter /
Vol
ume
Scat
ter /
Vol
ume
Scat
ter /
Vol
ume
Absorption / StainingAbsorption / StainingAbsorption / Staining
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12 uL de sangre
ADVIA 120 BASO contiene:
- Acido Hydroclórico, 9.00 mmol/L- Acido ftálico, 21.49 mmol/L- Preservativo- Surfactante
12 12 uLuL de de sangresangre
ADVIA 120 BASO ADVIA 120 BASO contienecontiene::
- AcidoAcido HydroclHydroclóóricorico, 9.00 , 9.00 mmolmmol/L/L-- AcidoAcido ftftáálicolico, 21.49 , 21.49 mmolmmol/L/L-- PreservativoPreservativo-- SurfactanteSurfactante
Reacción:
- El reactivo ADVIA 120 BASO contiene ácido ftálico y un surfactanteel cual lisa las células rojas y destruye las membranas de lasplaquetas y leucocitos, excepto basófilos.
ReacciReaccióónn::
- El El reactivoreactivo ADVIA 120 BASO ADVIA 120 BASO contienecontiene áácidocido ftftáálicolico y un y un surfactantesurfactanteel el cualcual lisalisa laslas ccéélulaslulas rojasrojas y y destruyedestruye laslas membranasmembranas de de laslasplaquetasplaquetas y y leucocitosleucocitos, , exceptoexcepto basbasóófilosfilos. .
BASOFILOSBASOFILOSBASOFILOS
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Baso Cytogram
BasoSuspect
Basophils
Blasts
MN
PMN
Noise
BasoSaturation
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METODO BASOLOBULARIDAD
METODO METODO BASOLOBULARIDADBASOLOBULARIDADLo
w A
ngle
/ Vo
lum
eLo
w A
ngle
/ Vo
lum
eLo
w A
ngle
/ Vo
lum
e
High Angle / Density/Lobularity High Angle / Density/Lobularity
Low
Ang
le /
Volu
me
Low
Ang
le /
Volu
me
High Angle / Density/High Angle / Density/LobularityLobularity
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Indice de Lobularidad
1.- Mononucleares
2.- Polimorfonucleares
3- Valle
El índice de lobularidad (LI) proporciona una indicación del grado de maduración de la curva leucocitaria
Relación 2:1
BASOFILOSBASOFILOSBASOFILOS
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BASOFILOSBASOFILOSBASOFILOSGranulocitos Inmaduros
La presente muestra fue tomada a un paciente con Leucemia mieloblástica aguda.La alarma de GI apareció porque [(%NEUT+%EOS)-%PMN] fue mayor de 5.0%.
1 Neutrófilos 2 Eosinófilos 3 Polimorfonucleares
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Mapa de plaquetas Mapa de plaquetas 22--DD
Palquetas
Plaquetas Gigantes
Fantasmas RBC
Fragmentos de RBC’s
Detritus
Microcitos....
Indice de Refracción
Volu
men
(fL)
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ADVIA 120 PLAQUETAS ADVIA 120ADVIA 120
PLAQUETASPLAQUETAS
•• 1.1.-- AreaArea cubierta por el cubierta por el citogramacitograma de de plaquetasplaquetas
•• 2.2.-- Fragmentos Fragmentos de de RBCRBC’’ss
•• 3.3.-- Plaquetas Plaquetas GigantesGigantes
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Quality Of Results
Impedance 3Impedance 2
Impedance 1ADVIA 120
0
50
100
150
200
0 20 40 60 80 100Immunophenotypic Count (x 10 9/L)
‘ADVIA 120/2120 Very Close To Immuno Method’
Lipemic
ITP
British Journal of Haematology 2000, 108:2,228-235, Machin
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![Page 33: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/33.jpg)
RETICULOCITOSRETICULOCITOSRETICULOCITOS
El reactivo ADVIA 120 autoRETIC contiene:
- Oxazina 750, 11.4 mg/L- Buffer- N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate, 0.023 mmol/L
Reacción:
El El reactivoreactivo ADVIA 120 ADVIA 120 autoRETICautoRETIC contienecontiene un un detergentedetergente ((surfactantesurfactante))queque hacehace esfesfééricosricos ((isovolumisovoluméétricamentetricamente) a los ) a los eritrocitoseritrocitos. . TambiTambiéénn contienecontiene un un colorantecolorante caticatióóniconico, , OxazinaOxazina 750, 750, queque titiññee laslas ccéélulaslulasde de acuerdoacuerdo a a susu contenidocontenido de RNA. de RNA.
![Page 34: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/34.jpg)
RETICULOCITOSRETICULOCITOSRETICULOCITOS
Absorption
![Page 35: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/35.jpg)
BENEFICIOS RETICULOCITOSBENEFICIOS RETICULOCITOSBENEFICIOS RETICULOCITOS•• La La ferritinaferritina es una es una evaluacionevaluacion indirecta de la deficiencia indirecta de la deficiencia
funcional de hierrofuncional de hierro•• Monitorear el porcentaje de cMonitorear el porcentaje de céélulas lulas hipocrhipocróómicasmicas
permite un monitoreo directopermite un monitoreo directo•• El contenido de hemoglobina (El contenido de hemoglobina (CHrCHr) de los ) de los reticulocitosreticulocitos
ha demostrado ser mas sensible que el porcentaje de ha demostrado ser mas sensible que el porcentaje de hipocromiahipocromia
El uso de El uso de CHrCHr permite un monitoreo mpermite un monitoreo máás s eficiente, que nos da la optimizacieficiente, que nos da la optimizacióón del n del uso de EPO y tratamientos con hierro, lo uso de EPO y tratamientos con hierro, lo que como consecuencia tiene un mejor que como consecuencia tiene un mejor manejo del paciente anmanejo del paciente anéémicomico
InicioDespués de 4 días
Después de 2 semanas Después de 1 mes
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Antecedentes
• Guideline for Reference Leukocyte Count (Proportional) And Evaluation of Instrumental Methods.
• CLSI (Clinical and Laboratory Standars Institute).
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SISTEMA DE AUTOMATIZACIÓN DE
ANALISIS DE HEMOGRAMASMEDIANTE PROCESAMIENTO
DIGITAL DE IMÁGENES
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Esquema de Captacion de Imagen
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![Page 40: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/40.jpg)
Los resultados serán presentados visualmente vía monitor del computador o impresión en papel. En esos resultados seespecificará lo siguiente:
· Número de elementos contabilizados en la muestra de sangre.· Número de glóbulos rojos contabilizados, en cantidades y en porcentaje.· Numero de glóbulos blancos contabilizados (en cantidades y porcentaje) y clasificados según su tipo: monocitos, linfocitos,eosinófilos, etc.· Número de plaquetas encontradas en la muestra analizada.· Área y perímetro medio de los glóbulos rojos analizados.· Área y perímetro medio de los glóbulos blancos analizados?
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![Page 42: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/42.jpg)
Introducción• Contadores Automatizados.
• Clasificación de Sistemas Automatizados para el conteo Diferencial.
• Limitaciones. (Alarmas, Experiencia, Sensibilidad Analítica y Funcional, Especificidad, etc.).
![Page 43: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/43.jpg)
Causas de Variabilidad
• Fuentes de Variación.(preanalitica, analítica, biológica, fisiológica y patológica).
• Rutina vs. Tiempo Optimo para el Test.
![Page 44: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/44.jpg)
Principios
• Selección de Método de Referencia.– Exactitud.– Subjetividad.– Seguridad y Efectividad del conteo
diferencial.
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Desempeño del Test
• Comparación.• Consistencia
Interna.• Establecer Valores
de Referencia.• Sensibilidad
Clínica.
• Seguridad y Efectividad.
• Evaluación Célula por Célula.
• Datos tabulados vs. Alarmas del fabricante.
• Comparación.• Consistencia
Interna.• Establecer Valores
de Referencia.• Sensibilidad
Clínica.
• Seguridad y Efectividad.
• Evaluación Célula por Célula.
• Datos tabulados vs. Alarmas del fabricante.
![Page 46: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/46.jpg)
Definiciones• Anormalidad.• Arbitro.• Sistema Automatizado.• Sensibilidad Clínica.
(concordancia con método de Referencia VP).
• Especificidad Clínica (concordancia con método de Referencia VN).
• Evaluación de Elementos Formes.– Tabular leucocitos.– Anormalidades de RBCs.– Suficiencia, morfología,
exceso o aglutinación PLT.
• Falso Positivo.• Falso Negativo.• Verdadero Positivo.• Verdadero Negativo.
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Grafica de Bayes
Método de Referencia
Positivo Negativo
Positivo VP (Verdadero Positivo)
FN(Falso Negativo)
Negativo FP(Falso Positivo)
VN(Verdadero Negativo)
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Conteo Diferencial de Referencia
• Colección de Espécimen.• Condición de la Muestra.• Prep. Lamina.• Requerimientos.• Coloración.
– Leucocitos Aceptables.– Coloración reproducible.
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Células Nucleadas Hematológicas
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Calificación
Calificacion Conteo Neutrofilos
0102030405060708090
0 20 40 60 80 100
Serie1
Serie2
Serie3
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Calificación
Calificacion Conteo Monocitos
02468
101214
0 5 10 15
Conteos Individuales
Prom
edio
de
Con
teos
Serie1
Serie2
Serie3
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Diseño de la Evaluación• Preparación de la muestra.
• Comparación de Leucocitos para Inexactitud e Imprecisión.
• Sensibilidad Clínica.
• Métodos Estadísticos.
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Protocolo Estudio de Sensibilidad200 Muestras
100 Normales 100 Anormales
Método de Referencia Método Automatizado
Intervalo de Referencia
Sensibilidad Clínica
Comparar DiscrepanciasMorfológicas y Numéricas
ArbitroReconteo & Reasignación
Sensibilidad Clínica Final
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Tipos de Muestra para Estudio de Sensibilidad
Condición Clínica
Hallazgo del conteo Leucotitario
Conteo Absoluto
Conteo Relativo
Inflamación Aguda GranulocitosisDesv. Izq (Bandas)
>=9.0 x 10 9/ L >80 %
Inflamación Crónica
Monocitosis >=0.8 x10 9 /L > 10%
Inf. Parasitaria reacción Alérgica
Eosinofilia >=0.5 x 10 9 /L > 7%
Inf. Viral Linfocitosis y Variantes
>=3.5 x10 9 /L > 50%
Anemia AplasicaQuimioterapia
Granulocitopenia >= 1.5 x10 9 /L < 10%
Inf. HIV Linfopenia <= 0.1 x10 9 /L > 2%
Leucemia Aguda Cells. Inmad 0.1 x 10 9 /L > 2%
Anemia Severa NRBC >= 0.02 x 10 9 /L > 2%
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…PREGUNTAS??
![Page 56: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/56.jpg)
Tendencias en Hematologia Automatizada
![Page 57: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/57.jpg)
EXTENSIÓN DE LAS APTITUDES DE SISTEMAS AUTOMATIZADOS CON EL USO DE MARCADORES
LINFOIDES
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(American Journal of Clinical Pathology)
Automated Cell Counts in Cerebrospinal FluidThis article was written with the cooperation of our 10 CSF clinical trial sites reporting results on 325 samples. The sites include Roswell Park Cancer Institute - Buffalo, NY; Children's Hospital - Boston, MA; Brigham and Women's Hospital - Boston, MA; St. Mary Medical Center - Long Beach, CA; Memorial Health University Medical Center - Savannah, GA; University of Heidelberg - Heidelberg, Germany; Haukeland University Hospital - Bergen, Norway; University of Mainz - Mainz, Germany; Aarhus University Hospital - Aarhus Amtssygehus, Denmark; and Karolinska University Hospital - Stockholm, Sweden. Key message:Study results demonstrate that the automated ADVIA 120 CSF Assay is an acceptable alternative to the labor-intensive manual method.
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Análisis de LCR Automatizado
• Diferencial de 5 estirpes en LCR de forma automática y citograma propio.
• Posibilidad de hacer controles periódicos de patologías del SNC.
• Análisis cuantitativo y cualitativo de las sospechas de alarma.
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Análisis de Liq. Amniótico Automat.
• Cuerpos lamelares (relación lecitina- esfingomielina).
• SDR (síndrome de Distress Respiratorio.• Maduración Pulmonar Fetal.
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Cat WBC
This area includes nonlysed MN’s that are included in the MN count. Samples should be run at room temp to minimize nonlysis.
Eos’s average 2%-12% but may be as high as 35%
Eos’s not counted here
Eos’s are counted in the retic channel (even without ordering a retic). Retic reagent must be available on the analyzer at all times when running cats.
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Dog WBCMono’s about 1% higher on ADVIA 120
Baso positioned lower
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Dog Retic
%Retic low on dogs (but can be 5%)
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Guinea Pig HGB, Platelet and RBC
Small Platelets
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Horse WBCEos’s are located out to the side and are giant in size
Mono’s
LUC’s
Unlysed MN - can warm the blood but non-lysis may not be eliminated
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Monkey-Cyno WBCPerox cytogram looks like a weak staining human
![Page 71: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/71.jpg)
Pig WBCLUC’s
Mono’s
Neutrophils sometimes weak stainers
![Page 72: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/72.jpg)
Rabbit WBCMany Baso’s
Very little noise
Lymph threshold is low due to small size of lymphs
Baso’s can equal 4-10%
![Page 73: Metodos de Peroxidasa en analizadores automatizados](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022012305/5571f28e49795947648cb689/html5/thumbnails/73.jpg)
Sheep WBCLUC’s
Mono’s
Lymphs
Inverted Diff
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Sheep Retic
Low %Retic
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…..el Laboratorio como Fuente de Informacion ….AHORA.
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• ….GRACIAS POR SU ATENCION