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•1

Seminario de Guadalupe, diciembre 2004Seminario de Guadalupe, diciembre 2004Las Humanidades y el Patrimonio Cultural: Los Monumentos y la MeLas Humanidades y el Patrimonio Cultural: Los Monumentos y la Memoriamoria

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS

Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio

Juan M. GonzálezInstituto de Recursos Naturales y Agrobiología

Consejo Superior de Investigaciones CientíficasSevilla


Curso anterior (2006):

Que son los microorganismos, como crecen y otras características de interés

Muy pequeños

Son muchos

Muy diversos

En esta ocasión

Como podemos detectar y estudiar los microorganismos

El punto de partida es determinar que microorganismos participan en procesos de biodeterioro

•2

TTéécnicas avanzadas de diagncnicas avanzadas de diagnóóstico. Cesstico. Cesááreo reo SSááiziz

INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGIA, SEVILLA Y RED TEMATICA DEL CSIC DE PATRIMONIO HISTORICO Y CULTURAL


I. Introducción

II. Métodos Moleculares

III. Resultados (13 Marzo)

Ecología y diversidad microbiana

Detección por cultivos

Otras técnicas

Pasos básicos

Técnicas empleadas y análisis

Cultivos vs. Técnicas moleculares

Apartados

Microscopía




Recordemos que:

Son muy pequeños y están en todas partes

Muchos de ellos son desconocidos

Pueden presentar metabolismos muy diferentesAerobios, Anaerobios, Heterotrofos, Autotrofos, etc.

Microorganismos

Frecuentemente viven asociados

Existen muchos tipos diferentes de microorganismos

El biodeterioro dependeráde los microorganismos existentes

de las condiciones ambientales

•3




La diversidad más alta se observa entre los microorganismos

ArchaeaBacteria Eukarya

Euryarchaeota

Crenarchaeota

Animals

Fungi

Plants

Ciliates

Flagellates

Slimemolds

Entamoebae

Trichomonads

Diplomonads

Microsporidia

Termotogales

FlavobacteriaCyanobacteria

Purple bacteria

Gram positivebacteria

Green non-sulfurbacteria

Pyrodictium

HaloarchaeaMethanosarcina

Methanobacterium

ThermoproteusThermococales

Methanococcus

Diversidad Microbiana

Arbol universal de formas vivientes basado en secuencias de genes ARN ribosómicos




Microscopía

Dibujos y microscopio

de Robert Hooke

Hongos

•4




Cianobacterias

Bacteria y ArchaeaHongos

Microalgas

10 µm

10 µm

Microscopía y Diversidad Microbiana



Microscopía

Recuentos directosCámaras de recuento

(hemocitómetros o Hausser)

Recuentos directosSobre filtros

•5



Microscopía




Microbiología clásica ⇒ cultivos

DilucionesMuestra

Most-Probable Number

(MPN)

Placa Petri

Incubación

Recuentos

Sólo detectamos células que somos capaces de cultivar

Cultivos de Microorganismos

•6





Métodos de recuento en placa





Recuento de “Unidades Formadoras de Colonias” (CFU)

Recuentos totales por Microscopía

•7





Cultivo de microorganismos anaerobios estrictos

Cámara de anaerobiosisCultivos anaeróbicos




Cultivo y Aislamiento de microorganismos


•8





1. Detectar microorganismos (“CFU”)

2. Identificar esos microorganismos

(métodos moleculares)




Cultivos vs. Técnicas Moleculares

Bacterias

cultivablesAmbiente

~1 %Suelos, monumentos

0.1-1 %Ríos y lagos

<0.1 %Mares

Bacterias totales

Número/ml

~108

~106-107

~0.5-1×106

Comparación de recuentos de microorganismos cultivables y totales

•9




Cultivos vs. Técnicas Moleculares

123

45

67

Técnicas Moleculares

(gen 16S rRNA)

Proteobacteria

ChloroflexiPlanctomycetes

Bacteroidetes

Acidobacteria

Actinobacteria

Técnicas

de cultivo

1234567

Proteobacteria

FirmicutesActinobacteria

Composición de comunidades microbianas de la cueva de Altamira (Cantabria)





Detección de microorganismos cultivables y no cultivables

El fragmento (gen) más utilizado: 16S (18S) rRNA

Universal

Varias copias en cada célula

Secuencia con alto valor filogenético

Buenas bases de datos

Permite fácil identificación

Técnicas moleculares no requieren cultivo de los microorganismos

Disponibilidad de primers y sondas específicas

Extracción de ADN Amplificación específica análisis

•10





ADN

ARN

Proteinas

Información celular. Genoma

Información de los genes

Moléculas funcionales

Transcripción

Traducción

Los ácidos nucleicos (ADN) contienen la información de la célula.

Cuatro bases: Adenina (A), Citosina (C), Guanosina (G), and Timidina (T)

ADN, ARN y proteinas

Azul NRojo OBlanco CAmarillo P





1. Extracción de ADN

2. Amplificación de secuencias específicas de ADN

3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”

4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados

Pasos básicos:

5. Otros análisis

•11




Técnicas Moleculares MuestraExtracción RNA

DNA

cDNA

DNA Amplificado

TranscripcióninversaAmplificación

por PCR

DGGE(“Fingerprint”)

Clonación(genotecas)Screening

Secuenciación

Comparación con bases de datos

Identificación de microorganismosTiempo

Protocolo

paso a paso









Pasos básicos:

5. Otros análisis

•12





Muestra

Lisis celular

Extracción con fenol

Lisozima

Extracción con cloroformo

Precipitación con etanol

Disolución

Estimar la concentración de ADN

Detergentes

Proteasa

(1% Sodium Dodecyl Sulfate)

(OD at 260 nm)

(TE buffer, pH 8.0)

(2.5x vol. Ethanol 99% at –20ºC)

(24:1 Chloroform:isoamyl alcohol)

(tamponado pH 8.0)

(0.3-0.4 mg/ml, 37ºC 30 min)

(1.5 mg/ml, 50ºC 3 h)

Dos fases durante las extraccionescon fenol y cloroformo

Fase acuosacon el DNA

Fase inferior

(Suspender en TNE buffer, pH 8.0) Congelación/descongelación(3x)

Extracción de ADN. Método clásico









Pasos básicos:

5. Otros análisis

•13





Objectivo:

Generar muchas copias de las secuencias de interés

Pares de primers para la amplificación del gen rRNA:

PCR o “Polymerase-chain reaction”

Bacteria:

Archaea:

27F AGA GTT TGA TCC TGG CCA G

1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T

2OF TTC CGG TTG ATC CYG CCR G

1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T

Eucariotas: 21F AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT

1392R ACG GGC GGT GTG TRC





Desnaturalización (95ºC)

Annealing(40-65ºC)

Extensión (72ºC)

25-35 ciclos

Multiples copias de lasecuencia específica

DNA (doble hebra)PCR

“Polymerase-chain reaction”

•14





PCR o “Polymerase-chain reaction”

Componentes de la reacción

ADN molde

Tampón (Buffer)

MgCl2

Primer “Forward”

Primer “Reverse”

DNA polimerasa

H2O

10-100 ng

1x; pH 7.5-9.5

1.5 (1-5) mM

0.1-1 µM

0.1-1 µM

0.25-2 u.

1 µl

5 µl

0-5 µl

1 µl

1 µl

0.2-1 µl

hasta 50 µl

10 x

50 mM

20-50 µl

20-50 µl

1-5 u/µl

Componentes Concentración final Volumen Stocks

dNTPs 0.2 mM 1 µl 10 mM





El número de copias aumenta exponencialmente en cada ciclo

Copias = (Número de copias inicial)2 n

n = Número de ciclos

•15





Examinando productos de PCR

Geles de agarosa (1% en 0.5x TAE)

Marcador detamaño

Productosde PCR

Unos 5 µl de la solución de amplificación + 1 µl solución de carga por pocillo

El ADN se tiñe con Bromuro de Etidio o SYBR Green I

Transiluminador









Pasos básicos:

5. Otros análisis

A. Perfiles de comunidades microbianas (Fingerprints). DGGE

B. Clonación

•16





Visualizar la diversidad microbiana en la muestra

Existen diferentes técnicas:

Muy útil para comparar comunidades de distintas muestras

Util para seleccionar bandas características

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)

T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms)

SSCP (Single Strand Conformational Polymorphisms)

Perfiles de comunidades microbianas (“Fingerprints”)





DGGE o “Denaturing Gradient Gel Electrophoresis”.

Separación en gradiente químico (urea y formamida)

Gra

dien

te

Un primer debe tener una cola rica en G y C

Pares de primers (16S):

Bacteria:

Archaea:

341F-GC cola GC + CCT ACG GGA GGC AGC AG

518R ATT ACC GCG GCT GCT GG

344F-GC cola GC + ACG GGG CGC AGC AGG CGC GA

518R

Cola GCFragmento de

DNA a amplificar

CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G

Perfiles de comunidades microbianas (“Fingerprints”) por DGGE

•17





Gra

dien

te

Gel de Agarosa DGGE






Unidad de electrophoresis para DGGE

Preparación de gelesPreparador de

gradientes

Cámara de

electroforesis

Fuente de alimentación

Transiluminador


•18





Construcción de genotecas a partir de productos de PCR

Reacción de ligación

Fragmentos amplificados se insertan en un vector (plásmido)

Plásmido

Transformación. El plásmido se inserta en una célula huésped (E. coli)

Fragmento DNA

Célula de E. coli

Cada célula sólo contiene un plásmido sólo un fragmento amplificado

Purificación de plásmido y secuenciación

Limpieza de productos de PCR1.

2.

3.

5.

(Kits comerciales para purificación de productos de PCR)

(Kit comercial de purificación de plásmidos o por otros métodos) Ligación

Transformación

(Kit comercial TOPO-TA cloning kit; otras estrategias)

Screening genotecas. Selección de los clones a secuenciar4.

Construcción de genotecas





Purificación de plásmidos

Ligación (TA-TOPO kit)

Producto de PCR

Reacción:Vector de clonación

Incubación

5 min a temperatura ambiente

Producto de PCR

Buffer y Ligasa o Topoisomerasa

Transformar células de E.coli

y sembrar en placa (LB+Amp)

(Aproximadamente 1:30 h)

Incubar 12-24 h a 37ºC

Cultivo (una noche)

Unión a la

membrana

DNA plasmídico purificado

Resuspender

Lisar

Neutralizar

Lavado

Disolución

Vector de clonación

TA-TOPO

Clonación

Transformación

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Pasos básicos:

5. Otros análisis





Servicios de secuenciación profesionales (ADN y 1 primer/reacción)

Electroferograma

Software: Chromas, EditView, Phred/Phrap, etc.

Ejemplo: http://www.technelysium.com.au/chromas.html

Identificación de los fragmentos de ADN amplificados

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Edición de secuencias

Eliminar lectura inicial Eliminar lectura final

Si es posible, corregir las ‘N’

Eliminar la secuencia del vector (editor de texto)

Primer Vector Fragmento de DNA insertado Vector






En: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

Búsqueda de secuencias similares en bases de datos: Algoritmo BLAST

Encontrar aquellas secuencias conocidas más cercanas a la nuestra

Guarda tus secuencias en formato “fasta” como texto

>Seq1. Description of the sequence and other information

TGGTTTTGGGTGGAAAGTTTTACGGCAATTCGGTCTGGGAA

GTGAGTAACACGTGAGTAACCTCCCCTGGA

>AY450613. Pseudomonas aeruginosa 16S ribosomal RNA GACGAACGCTGNCGGCGTGCTTAACACATACAAGTCGAACGATGAACCTGGAGCTTGCTCTGGGGGATTA GTGTCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTCCCCTGGACTCTGGGATAACCCCGAGAAATCGGAGCT AATACCGGATAGGACCTGGAACCGCATGGTTTTGGGTGGAAAGTTTTTTCGGTCTGGGATGGACTC

Sólo una línea

Secuencia


•21





>gi|20429035|emb|AJ318041.1|MST318041 Nanoarchaeum equitans Kin4-M 16S rRNA gene,strain Kin4-M Length = 1500Score = 2974 bits (1500), Expect = 0.0Identities = 237/240 (99%) Gaps = 1/240Strand = Plus / Plus

Query: 1 actcccgttgatcctgcgggaggccaccgctatctccgtccggctaacccatggaaggcg 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct: 1 actcccgttgatcctgcgggaggccaccgctatctccgtccggctaacccatggaaggcg 60

Query: 61 agggtccccgggtaagggggcccgccgcacggctgagtaacacgtcggtaacctaccctc 120 |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| |||||||||

Sbjct: 61 agggtccccgggtaagggggcccgccgctcggctgagtaacacgtcggta-cctaccctc 120

Query: 121 gggacggggataaccccgggaaactggggctaatccccgataggggatgggtgctggaag 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||

Sbjct: 121 gggacggggataaccccgggaaactggggctaatcccagataggggatgggtgctggaag 180

Resultados:Sequences producing significant alignments: (bits) E Valuegi|20429035|emb|AJ318041.1|MST318041 Nanoarchaeum equitans ... 2974 0.0gi|18892044|gb|AE010139.1| Pyrococcus furiosus DSM 3638, se... 381 e-102gi|13435348|gb|AY017182.1| Pyrococcus sp. MZ14 16S ribosoma... 381 e-102gi|5457433|emb|AJ248283.1|CNSPAX01 Pyrococcus abyssi comple... 381 e-102gi|2982621|emb|Z70247.1|PSAL58516 Pyrococcus sp. 16S riboso... 381 e-102gi|2995286|emb|AJ225071.1|PAA225071 Pyrococcus abyssi ST549... 381 e-102

Porcentaje de similitud

Homologo más próximo

Secuencias

próximas

Alineamiento










Pasos básicos:

5. Otros análisis

•22





0.1

66

100

100

9257

90

54

100

100100

99

8086

100

91

100

60

Arboles filogenéticos

0.01

D45052.

D45054.

D45053

D45056.

AB023359.

AB023356.

AF389342.

AB023357.

AB023358.X77447.

1345.

X77448.

D45061.

D45060.

100

96

75

100

0.1

99

744

8963

7589

Programas: ClustalW, Philip, ARB, treepuzzle, …





FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)

Utilización de sondas específicas marcadas fluorescentemente para detectar microorganismos

Microscopia de

contraste de fase

Células marcadas con

sondas fluorescentes

Identificación de células in situ

Fluorescently-labelled probe

CellDNA/RNA

5 µm 5 µm

•23





Otras técnicas moleculares

Microarrays

Distintos procedimientos de amplificación

Genómica, proteómica, …

Muchos métodos y programas bioinformáticos

Hibridaciones (Northern, Southern, Western, …)

Ingeniería genética y expresión de genes recombinantes

PCR cuantitativo

Distintos tipos de PCR.

Amplificaciones con adaptadores y substracción




Resultados

Métodos moleculares:

ADN Microorganismos presentes

ARN Microorganismos activos

Cultivos:

Conocer la capacidad metabólica y otras propiedades de

los microorganismos

Microscopía:

Enumeración y relaciones espaciales de los microorganismos

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Instituto de Recursos Naturales y AgrobiologíaCSIC, Sevilla

http://www.irnase.csic.es/~micro/

Juan M. González([email protected])

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