I - ”

1 2 8 4 2 9 UNIVERSIDAD AUTONOMA

METROPOLITANA

[E1 Papel de los Ietabolitos Secundarios en la Utilización de Semillas de Zonas Aridas 7

PROYECTO DE SERVICIO SOCTAL FI,P,FIORADO PARA OBTENER EL TITULO

DE INGENIERO BIOQUIMICO INDUSTRIAL QUE PRESENTA

MARIA DEL ROSARIO ROJAS ANDRADE i

SEPTIEMBRE 17 DE 1991.

CONTEN I DO

INTRODUCCION OBJETIVOS METODOLOGIA UTILIZADA ACTIVIDADES REALIZADAS OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS RESULTADOS Y CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFIA

1

6

7

28

49

50

6 1

62

INTRODUCCION

La mayor parte del territorio nacional, esta constituido por zonas aridas y semiaridas ( aproximadamente en un 80 % ) , y los recursos naturales provenientes de &stas regiones han sido aprovechados minimamente. El hombre desde tiempos remotos ha aprovechado estos recursos, pero aún hasta nuestros dias la explotaci6n de la vegetación desértica se ha limitado a la recolección de plantas endémicas, sin que se haya propuesto un verdadero cultivo ( Franke, 1983 ) .

Actualmente las plantas económicamente importantes para el hombre se encuentran clasificadas en tres grupos, según Bates - ( Bates, 1985 ) : un primer grupo que cuenta con 100. especies de plantas que aportan los productos básicos tanto de tipo alimentario como industrial indispensables para el hombre: un segundo grupo que tiene 1,000 especies de plantas que complementan la dieta humana además de proveer de maderas, combustibles, forrajes para el ganado y demás insumos: y por último un grupo que cuenta con 50,000

especies de plantas entre las que se encuentran plantas ornamentales y plantas utilizadas ocasionalmente, dentro de éste último grupo se encuentran las plantas desérticas, por que en la actualidad no tienen un sistema de utilizaci6n intensiva.

Estudios realizados sobre plantas que habitan en zonas Bridas y semiáridas han demostrado que producen una variedad de productos que pueden ser utilizados dependiendo de las caracteristicas quimicas que presenten, algunos ejemplos son los siguientes: hidrocarburos energéticos como caucho, hules, ceras y resinas; precursores de productos utilizados en la industria quimico- farmacéutica tales como esteroides, glucósidos cardiotónicos y

alcaloides ; materias primas para la industria alimentaria tales como pectinas, esencias y polisacáridos. Estos son unos cuantos ejemplos de los posibles productos que se pueden obtener de éste tipo de vegetación ( Franke, 1983 ) .

Una perspectiva de uso de las plantas del desierto seria como fuente de alimento, ya sea para consumo humano o del ganado. Esta alternativa aunada a la necesidad de obtener nuevos recursos para producir alimentos debido a la baja productividad que presentan los campos ( como consecuencia del uso indiscrimado de insecticidas y

1

malas tknicas agricolas ) colocarla a las zonas Bridas Y semiaridas como una opci6n altamente productiva ( Felker and Bandurski, 1979 1.

Antes de ini.ciar cualquier posible propuesta sobre la utilización de nuevas especies vegetales, es de vital importancia tomar el punto de vista ecol6gico para contar con un criterio sobre la forma de explotación m8s conveniente para evitar demasiados desequilibrios en la comunidad vegetal. En las zonas Aridas y

semiáridas la depredación de semillas es un proceso muy utilizado por las especies animales que habitan en éstas zonas debido a la escasez o ausencia de frutos carnosos, por otro lado la vegetación presenta un mínimo de follaje y sí se presenta se encuentra cubierto de ceras u otras sustancias que lo hacen inaccesible como alimento ( Armella, 1990 ) . Por consiguiente las semillas pueden constituir la fuente alimenticia más factible de éste tipo de regiones.

Para que estas semillas de zonas áridas y semiAridas puedan ser potencialmente aprovechadas como fuente de alimento, deben cumplir los siguientes requisitos: - Las semillas deben de ser abundantes, es decir, que la planta produzca una cantidad suficiente de semillas con respecto a su biomasa y tiempo de producción ( Felker y Bandurski, 1979 ) .

- Las semillas deben de presentar una calidad nutritiva similar o mejor a la determinada por organismos de nutrición para las semillas usadas actualmente. - Las semillas no deben de contener compuestos t6xicos.

En lo que concierne a los compuestos tóxicos estos se relacionan con la presencia de metabolitos secundarios, tales como: alcaloides, aminoácidos tóxicos, glucósidos cianogénicos, isoflavonas ( principios estrogénicos ) , nitrocompuestos, inhibidores de proteasas, fitohemaglutininas, saponinas, compuestos de selenio y taninos.Diversos estudios se han realizado para determinar los trastornos fisiológicos que causan estos compuestos al ser ingeridos, éstos trastornos van desde un envenenamiento hasta la muerte y el grado de toxicidad dependera de las relaciones que se presenten entre dosis, absorción, destoxificación y excre-

2

si6n ( Smolenski et al., 1981 ) .

En el cuadro 1 se presentan algunos resultados obtenidos de estudios realizados sobre la i.ngesti6n de 10s compuestos mencionados por el ganado, y el trastorno fisiol6gico que se manifiesta.

cuadro 1 S Efectos fisiolbgicos causados en el ganado por el consumo de

metabolitos secundarios.

Nombre Compuesto Efectos fisiolhicos que

manifiestan.

Alcaloides Quinolizidina, anagi rina y pirrolizidina

dispnea. ataxia, convulsiones deformacibn de las extremidades inferiores. dano hepdtiico, coma y muerte.

N-met i 1 -p fenetilamina. mimosina e indospicina

Acacipetalin y linamarina

Aminoácidos tóxicos

ataxia locomotora de los cuartos traseros, alopecia, inanicibn. disminucibn del peso, aborto y muerte.

Glucósidos cianogénicos

dispnea. jadeo, tamboleo,pos- traci6n. convulsiones.. y- muerre-

Isoflavonas Genisteína. formononetina y benzofuranocou- marinas.

infertilidad, disminucibn del crecimiento, efectos hiperestro- gknicos, hipoestrogénicos y antigonadotrópicos.

Nitrocompuestos Mjserotoxina. cibarina, kara- kina e hiptagina

anorexia. diarrea, aspecto demacratorio, salivacibn, incoordinacibn de las extre- midades inferiores.

Fitohemaglutininas Concavalina A infl'amacibn de las cblulas del hepitelio intestinal. hemorra- gia de tejidos linfáticos y daño hepatocelular.

Inhibidores de 1 nhi bidores de proteasas tripsina

hipertrofia pancreatica, retar- do en el crecimiento, inhibicibn de la respiracibn.

Saponinas retardo en el crecimiento y lisis de eritrocitos.

Compuestos de Se encuentra selenio unido a amino-

ác idos

Taninos

alDpecia. anemia hemolftica, leucopenia. fibrosis de brganos e infertilidad.

disminución del peso y efec- carcinogenicos.

------------"---""""""""""~"""""""""""""""""~ Smolenski et al., 1981 .

3

Desde el punto de vista ecol6gico. se han reportado trabajos en los que se ha relacionado la presencia de metabolitos secundarios en las plantas como un mecanismo de defensa ante la depredación ( Swain, 1977: Rosenthal, 1986 ) . En el cuadro 2 se muestran algunos resultados de estos trabajos de tipo ecoldgico. En el caso de las semillas al presentar un alto contenido nutritivo por unidad de volumen y poseer mínimas posibilidades de autoreparacidn una vez que han sido danadas, se ha encontrado que tienen altas concentraciones demetabolitos secundarios, cuya presencia posiblemente les confiere protección ante la depredacidn ( Janzen, 1971 1.

comwesto

Alcaloides

Aminoácidos tóxicos

Coumarinas

Flavonoides

Lignanos

Acidos fenólicos

Terpenos

Esteroides

Número de estructuras conocidas

4 500

250

150

1 200

50

100

1 100

600

confiere protecci6n contra

mamíferos

insectos

hongos

insectos

insectos

plantas

insectos

insectos

Tomado de swain. ( Swain, 1977 1.

Los patrones que se observan en la depredación de semillas estan altamente estructurados y coevolucionan tanto a nivel químico, espacial y temporal ( Janzen, 1971 ) , por lo que no se puede generalizar,el hecho de que las semillas siempre se protegan

4

de los ataques de los depredadores, ya que existen semillas que necesitan para su germinaci6n pasar a . t r a v e s del tracto gastrointestinal de algún animal, fen6meno que desde el punto de vista ecol6gico se ha considerado como una forma de dispersión de las semillas ( Janzen, 1971 ) .

Para fines de este trabajo se considerará la presencia de metabolitos secundarios en las semillas a estudiar como un posible mecanismo de defensa anta los depredadores, y la presencia o no de éstos compuestos se correlacionará con el valor nutricional de las semillas, de tal forma que sólo se podrán considerar potencialmente útiles como alimento áquellas que no posean compuestos tóxicos y

contengan un nivel nutricional adecuado.

S

I t

OBJETIVOS

Objetivos generales

2) Demostrar que las semillas de zonas semiáridas que presenten metabolites secundarios no serán consumidas por insectos y/o roedores.

3 ) Establecer como criterios de utilizaci6n alimenticia la relación calidad nutritiva ( basada en la cantidad de carbohidratos y

proteínas ) y presencia de metabolitos secundarios.

Ob jet ivos específicos

1.1) Establecer la calidad nutricional de las semillas a estudiar.

1.2) Extracción e identificación de los posibles metabolitos secundarios contenidos en las semillas a estudiar.

6

- " . " - - - , "" "". ...

I ' I

METODOLOGIA UTILIZADA

I

"

Recolección de semillas Las semillas de las plantas estudiadas fueron recolectadas en

la Barranca de Metztitlán en el Estado de Hidalgo, la cual tiene un clima semiárido con lluvias en verano del tipo BSW"- según la clasificación de Kopen modificada por Garcia ( 1964 ) -, también presenta una precipitación anual promedio de 369 mm con una máxima en Septiembre de 80 mm y la media mínima en febrero de 1 mm y la temperatura promedio anual que predomina en la zona es de 17.5 C con una mínima de 1 2 . 3 C en Enero y una máxima en Junio de 22.9 C - ( En Armella, 1990 ) . Por las características mencionadas se consideró esta región como representativa de zonas semiáridas.

La selección de las plantas se realizó utilizando los siguientes criterios: Abundancizl Se eligieron las especies de plantas que fueran más representativas y abundantes de la comunidad en su conjunto. TamaAo las semillas Se prefi.ri6 usar semillas entre 2 y 5 mm de diámetro para facilitar su manipulacihn.

Las semillas de las plantas que se eligieron en base a los criterios mencionados fueron:*

Acuc iu &idÚn.ekii McBride. Leguminosae, Mimosoideae Pz05oph 4ueuigatta Swartz. D .C. Leguminosae, Mimosoideae Acacicr w n Wills. Leguminosae, Mimosoideae Sena wi5likmi.i A . Gray. I y B. Leguminosae, Cesalpinoideae E c h i n o w h e n s Zucc. Cactaceae Agave %&tu Zucc. Agavaceae M i m a h.ce%u&z Rose. Leguminosae.. Mimosoideae BuMetu 5 c h k c h M ~ i Eng. Burseraceae Leguminosa sp. NO. de colecta MAAV - 365. Mimosoi.deae

10 Pm&nmodingium r n u 4 t i ~ Rose. Anacardiaceae 11 C a d d W % u &&?.mu ( Kunth ) McBride. Leguminosae.Mimosoide;3e 12 Pa%kinbonia acudeda L. Leguminosae. Mimosoideae 13 MozCziUb m- ( Motch et Sess ) Rose. Zygophyllacae 14 Kaw&kia d l & Schldl. Rhamnaceae 15 Eymdwuftia pdy-ga ( Ortega ) Sarch. Leguminosae

I !

I

Determinación de la calidad nutritiva Para determinar la calidad nutritiva de las semillas se

utilizó como criterio nutricional el contenido de carbohidratos no estructurales y el contenido de proteínas. La cuantificación de proteínas y carbohidratos no estructurales se llev6 a cabo como se indica a continuación.

Determinación de carbohidratos no estructurales. (almidón, carbohidratos solubles totales 1.

- Se pesan 100 mg de tejido seco y se extraen 3 veces con etanol al 80 % caliente, dejando el precipitado para la- determinación de. almidón. - Los extractos etanólicos se concentran hasta un 3 3 % de su volumen inicial. - La determinaci6n de carbohidratos solubles totales se hace por el método de la antrona ( Yemm and Willis, 1954 ) en éstos extractos etanólicos. - Tomando otra porci6n de los extractos etan6licos se 'determina el

contenido de disacdridos utilizando el método de Van Handel ( Van Handel, 1968 1. ' - El precipitado obtenido en el primer paso fué digerido con Scido perclórico al 52 % por 30 min., posteriormente se filtr6 y se aforó a 50 ml, para la determinación de almidón según el método de McReady ( McReady et al., 1950 ) .

- Los resultados se reportan como mg de sacarosa por g de tejido seco.

.Determinaci6n del contenido de proteínas.

- Se hornogenizan 100 mg de tejido seco con una soluci6n de dodecilsulfato de sodio ( SDS ) al 10 %. - Se filtra el homogenado y se procede a la determinación proteica utilizando la modificaci6n de Peterson al método de Lowry ( Peterson, 1977 ) .

8

- Los resultados se reportan como mg de proteína por g de tejido seco.

Criterios de toxicidad. Depredación por insectos y / o animales en el campo.

Los indicios de la depredación en las semillas recolectadas se llevó a cabo observando si las semillas mostraban perforaciones de salida de insectos, mordidas o raspaduras. La presencia de estos dafios puede evidenciar que habían sido atacadas las semillas en el campo, ya sea por insectos o animales, sin embargo, esto no excluye la posibilidad de que la semilla haya sido consumida integramente, en cuyo caso no contamos con la evidencia de la depredación en el campo, por lo que se realizaron los siguientes experimentos.

Depredación por insectos en el laboratorio. Para identificar si algunas larvas de insectos venían en

estado de desarrollo dentro de las semillas, se procedió de acuerdo con el método propuesto PO Armella ( Armella, 1990 ) , el cual consistió de los siguientes pasos: - .Se colocó cada grupo de semillas en recipientes de : vidrio transparente con tapas perforadas para permitir el paso del aire. Estos frascos se mantuvieron a temperatura ambiente. - Se revisaron los recipientes de vidrio cada semana para detectar cualquier indicio de salida de insectos. - Se destaparon los frascos después de 3 meses y se revisaron cuidadosamente cada grupo de semillas para encontrar cuerpos de insectos.

Depredación por roedores en el laboratorio. Debido a que no se pueden obtener datos directos del campo de

la depredación por animales, así como tampoco se pueden obtener datos acerca de sí éstos sufren intoxicación o no, se procedió a ' 8

alimentar ratas Wistar con las semillas recolectadas por un período

9

de 4 semanas. Después de transcurrido Qste per5odo se determin6 si se presentaron pérdidas de peso, o algim otro síntoma de intoxicación en las ratas.

Identificación de metabolitos secundarios, Los metabolitos secundarios forman un grupo de compuestos muy

diverso tanto en cantidad como en diversidad de estructuras, por lo lo que fué necesario dividir el análisis fitoquímico de las semillas en dos fases. En 1.a primera fase que constituye la totalidad de este trabajo se identificaron áquellos metabolitos secundarios más comunmente estudiados en análisis de fitoquimicos, como son: alcaloides, gluc6sidos cardiotbnicos, flavonoides, saponinas y compuestos fenólicos. En la segunda fase se terminarán de identificar los restantes metabolitos secundarios, pero esta segunda fase no forma parte de este proyecto.

La técnica de extracción utilizada para obtener los metabolitos secundarios de interés a excepción de 1.0s alcaloides, fué el método de Wall y colaboradores ( en Dominguéz, 1979 ) , por medio del cual se extraen compuestos polares y metabolitos secundarios en forma de glucósidos. Este método se describe en el esquema 1.

Mientras que la técnica de extracción utilizada para obtener los alcaloides se muestra en el esquema 2. la cual se lleva a cabo utilizando como solvente el cloroformo.

A continuación se describen las pruebas de identificación que se utilizaron en cada grupo de metabolitos secundarios.

10

!

Es.quem. 1 . Metodo de Wall y colaboradores.

Colocar a r e f l u j o 15 g de muestra

en etanol al 96 %

por una hora 3.

Se fi.ltra y se lava 3 veces con etanol al 96 %

3. El filtrado y las

soluciones lavadoras se evaporan hasta un volulnen de 50 m1

3. Se afora hasta un volumen de 100 m1 con agua destilada

3. Obtención de flavonoides

. compuest:os fenólicos glucósidos cardiotónicos

Y saponinas

11

Esquema 2. Método de extracción de los alcaloides.

Colocar 2 g de muestra en un cartucho de

de papel filtro

J Extraer con cloroformo por 2 hr. en Soxhleth

5. Evaporar hasta 1/3 del

volumen inicial

J Extraer 3 veces con

HC1 al 1 %

J Obtención de sales cuaternarias de los

alcaloides

12

I .

Identificacibn de alcaloides. Los alcaloides conforman el grupo mas diverso de 10s

metabolitos secundarios tanto en número de estructuras como en cantidad de las mismas. Son compuestos que se caracterizan por tener un sistema heterociclico conteniendo un &tomo de nitrógeno, el cual les conf'ere sus propiedades basicas ( Dominguez, 1979; Babor y Aznarez, r 953 ) . La biosíntesis de estos compuestos en las plantas se relaciona con reacciones bioquímicas que parten de - a-aminoácidos. tales como ornitina, lisina, fenilalanina, tirosina, dihidroxifenilalanina y triptófano ( Hendrickson, 1973 ) .

La propiedad quimica característica de los alcaloides es su basicidad ( excluyendo casos particulares como son la ricina y la '

colchicina entre otros ) , propiedad que ha sido aprovechada para. aislarlos, purificarlos e identificarlos ( Dominguéz, 1979 ) . Una reacción común para aislarlos es áquella en la que reacciona el nitrógeno básico del alcaloide con soluciones de ácidos diluidos, formandose una sal cuaternaria de alcaloide que es soluble en agua ( Streitwieser y Heathcock, 1985 ) , como se muestra en la siguientg reacción:

R - NH2 + HC1 + R - NH;Cl- . . . ecuación 1

Cuando los alcaloides estan enkforma de sales cuaternarias de

alcaloide ( Ver ecuación 1 ) , determinadas soluciones de dcidos de metales peados tienen la propiedad de precipitarlos, los reactivos m6s comunmente utilizados se muestran en la tabla 1. Los cationes presentes en estos reactivos son agentes precipitantes selectivos por que son capaces de interaccionar con la sal cuaternaria de alcaloide precipitandola. Esta reacción de precipitación se lleva a cabo debido a que la fuerza de atracción entre los iones de carga opuesta, es mayor a la fuerza de atracción entre moléculas de agua 4 I

y los iones, produciendose un desplazamiento de la capa de ! !

hidratación de los iones sacandolos de disolución ( Ramette, 1983; I

Masterton et al., 1990; Bell, 1967 ) . La ecuación iónica neta de esta reacción es la siguiente: I

I

I

f

13 : !

. i vo Cat i6n Caracteristuaz d.le prueba positiva

MF?rC\Jr i yoduro de precipitado Potasio

Pot as i o color marr6n Wagner Yodo-yoduro de precipitado floculento

Acido silicotúnystjco Silicotúnystato precipitado

Sonnenschein Fosfomolibdato precipitado amarillo

R" NH4 (ac) + C- + R - NH4A ( S ) + . + - ... ecuación 2

Por otro lado, el valor de la constante de solubilidad Ks es .determinante en este tipo de reacciones por que proporciona un criterio para predecir el comportamiento de solublilidad, ya que se debe cumplir la siguiente condici6n para que se lleve a cabo una reacción de precipitación: [ Catión ] i [ Anión ] i Ks [ Catión ] i = concentración inicial del catión [ Anión ]i = concentración inicial del anión

Por consiguiente es necesario que se cumpla que el producto .de

las concentraciones iniciales tanto de la sal cuaternaria del alcaloide como del metal pesado sea mayor que el valor númerico de la constante de solubilidad para este precipitado ( Masterton et al, 1990, Ramette, 1983 ) .

Para la identificación de los alcaloides se aplicaron Tos reactivos presentados en la Tabla 1 a las sales cuaternarias de alcaloide ( Ver .Esquema 21 ) .

14

Identificaci6n de compuestos fen6licos. Los compuestos fenblicos se caracterizan por poseer un anillo

arómatico sustituido en diferentes posiciones por uno o más grupos hidroxilo ( Streitwieser y Heathcock, 1985 ) . Estos compuestos se han encontrado en las plantas en estructuras tales como: flavonoides, compuestos fenólicos monocíclicos. fenilpropanoides, quinonas fenólicas y polifenoles ( por ejemplo, taninos, melaninas y lignanos ) , de acuerdo con la clasificacibn propuesta por Harbone ( Harbone, 1984 ) para este grupo de metabolitos secundarios.

En este trabajo se identificaron únicamente flavonoides y taninos, y debido a que pertenecen al mismo grupo de compuestos se tuvieron que determinar en varias etapas sucesivas. En la primera etapa se hi26 la búsqueda de compuestos fenólicos, haciendo uso de reacciones de oxido-reducción. En la segunda etapa se identificaron posibles estructuras de flavonoide mediante reacciones en las que se forma un quelato y adición de ácido sulfúrico. En la tercera etapa se corrieron espectros de absorción en la región y la región ultravioleta para confirmar las posibles estructuras de flavonoide identificadas en la seggunda etapa. En la cuarta etapa se determinó la cantidad total de compuestos fenólicos por el método de Folin- Dennis, y en la última etapa se hizó la prueba de la vainillina para la identificacibn de taninos condensados.

A continuaci6n se describen los fundamentos de las reacciones que se utilizaron para la identifi.caci6n de flavonoides y taninos.

Identificación de flavonoides Los flavonoides son compuestos que tienen como caracteristica

estructural común tener el anillo de flavona, o bien se les ha considerado compuestos derivados de ésta estructura ( Harbone, 1984: Domingu6z. 1979 ) . El anillo de flavona está formado por dos anillos arómaticos unidos por una cadena alifática de 3 atomos de carbono. Las diferentes estructuras de flavonoide se forman a Partir de los grupos hidroxilo o metilo que se encuentren unidos a 10s anillos aromáticos, además del grado de oxidación que presente la cadena alfática, utilizando estructural para la clasificaci6n de

éSta úl tima característica estructuras de flavonoide -

I

15

( Hendrickson, 1965, Ranganna, 1978 ) , estructuras que se muestran en la figura 1. Estos compuestas se encuentran generalmente como gluc6sidos en las plantas, y la aglucona de flavonoide puede estar

Figura 1. Estructuras de flavonoide.

* . A 4

Estructura

5

flavononol

4

flavonol

o * chalcona antocianidina

o . f lavonona f lavona

16

de f lavonoide

f lavari-3,4-diol

catequina

isoflavona

unida a diferentes combinaciones de carbohidratos - por ejemplo, glucosa-glucosa, glucosa-ramnosa, arabinosa-ramnosa, entre otras combinaciones - , pudiendo generar diferentes glucósidos una misma aglucona ( Harbone, 1984 ) .

Por ser compuestos fenólicos los flavonoides presentan determinadas caracteristicas qulmicas, que han sido utilizadas para su identificación. A conrinuación se muestran las pruebas de identificación que se emplean para este tipo de compuestos y su fundamento. a) Debido a que tienen pares de electrones no compartidos en el átomo de oxigeno del grupo hidroxilo, son capaces de formar enlaces covalentes coordinados con determinados cation& metálicos, produciendo quelatos de muy variados colores ( Hendrickson, 1965; Masterton et al., 1990 ) . Estos iones metálicos pueden ser Mg, Zn Y Fe, y dependiendo de la coloración que se presente puede ser útil como criterio diagnostico para identificar determinadas estructuras ( Dominguéz, 1979; Harbone,, 1984 ) .

Asi mismo gracias a la presencia de éstos electrones libres los compuestos fendlicos pueden llevar a cabo reacciones de oxido- reducción, como es el caso de la reducción de Ag+ a Ag , como se - muestra en la ecuacidn 3 ( Streitwieser y Heathcock, 1985 ) ; o como en el método de Folin-Dennis ( Price et al., 1978; Ranganna, - - 1978 ) .

O

b) Debido a la presencia de anillos aromáticos en los compuestos fenólicos presentan absorción en la región ultravioleta del espectro electromagnetico, mostrando una intensa banda de absorción a 304 nm, en la que se detecta el grupo cromóforo de la figura 2 - ( Harbone, 1 9 8 4 ; Ranganna, 1978; Kenso, 1967 ) . Los diferentes grupos hidroxilo y metilo que sustituyen a este grupo cromóforo causan corrimientos en la banda de absorción mencionada y/o

aparición de otras bandas secundarias que permiten identificar el

I

17 ' I

I '

Figura 2'. Grupo crorn6foro de los flavonoides.

tipo de estructura de que se trata ( Dorninguéz, 1979; Harbone, - 1984 1. En la tabla 2 se muestran las características espectrales de los flavonoides.

?@la 2. Características espectrales de los flavonoides.

Estructui

Antocianina

Auronas

Chalconas

Flavonoles

Banda maxima &, &sorción ( nm )

475 - 560

390 - 430

365 - 390

350 .. 390 250 - 270

Flavonas y 330 - 350 biflavonilos 250 - 270 Flavononas y flavononoles

Isoflavonas

275 - 290 ca 225

255 - 265

Bandas secundarias ( nm 1

ca 275 ( 55% )

240 - 270 ( 32% )

240 - 260 ( 30% )

ca 300 ( 40% 1

310 - 330 ( 30% )

310 - 330 ( 25% )

Tomado de Harbone ( Harbone, 1984 1.

18

Identificación de taninos condensados. Los taninos se definen como compuestos fendlicos, solubles en

agua, que poseen pesos moleculares entre 500 y 3000 y que tienen la propiedad de precipitar proteínas, según la definici6n propuesta por Swain y Bate-Smith ( en Sarkar and Howarth, 1976 ) . Por su estructura química se clasifican en dos tipos : taninos condensados y taninos hidrolizables, 1.0s que a su vez se dividen en los siguientes grupos ( Harbone, 1984 ) : a) Taninos condensados.

Existen dos tipos de taninos condensados dependiendo de la naturaleza del polimero; cuando estan constituidos de oligorneros de catequina se denominan proantocianidinas y cuando estan formados por unidades de flavan-3.4-diol ( o leucoantocianianidinas ) se conocen como flavolanos. Sus pesos moleculares varfan entre 1000 a 3000. b) Taninos hidrolizables.

También existen dos tipos de taninos hidrolizables, s í estan constituidos de polimeros de ésteres de acid0 gálico y glucosa se trata de galotaninos, o cuando estan formados por ésteres de ácido hexahidroxidifenoico y glucosa se trata de eligataninos. Los pesos molecufares de los galotaninos varian entre 1000 a 1500 y los pesos de los eligataninos estan entre 1000 y 3000.

Las reacciones químicas para la identificaci6n de taninos son las siguientes:. la reacción de la vainillina para taninos condensados y la reacci6n con iodato o con Bcido nitric0 para los taninos hidrolizables ( Foo and Porter, 1980; Price et al., 1978: Seigler et al., . 1986 ) . El método de la vainillina ha sido utililizado tanto para la determinfición cuantitativa como

I

1 9

* Reaccj ones comunmente uti l.¡ zadas para la identif icaci6n dg compuestos fen61 icos.

React ivo " .

Mg / HCI

Zinc f

Feci

FeNHq ( 2* 12 H20

FeqFe(CN6I3

Folin-Dennis

Nitrato de plata amon i aca 1

H2S04

formacibn de quel.ato: c m 1 i ta1.j va

formación de quelato; cualitativa

formacihn de qualato: cualitativa

redox: cualitativa

redox: cualitativa

redox: cuantitativa

redox: cualitativa

~ t ~ s t i t l ~ c t b n electro- fllica: cualitativa

- Coloraci6n g ~ l e "_ se presenta

anaranjada ro fa roja azulosa violeta

anaranjada

verde azul

verde azul

azul prusia

verde

negro cafe

amari 1 la guinda o anaranjada roja azulosa

- Estructura gue " identifica

f lavona f lavonona flavonoles flavononoies o xantonas

flavononol

derivados del catecol derivados del pirogalol

grupo catecol y pirogalol mono- y meta- hidroxifenoles

compues tos f en61 icos

compuestos fen62icos

orto-dihidroxi fenoles orto-trihidroxifenoles

f 1.avonas y f lavonoles flavononas chalconas y auronas

Referencia

DaminguQr. 1979 Harbone.1984

DominguBz. 1979

Dczmlng?lSz. 1979 Bate- Smith. 1948

Ranganna. 1978

Ranganna, 1978 Price et al.. 1978

Ranganna, 1978: Price et al 1978: naxson. 1972 Bate-Smith, 1948 Streitwieser y Heathcock.19t

DominguBz. 1979 Streitwieser y Heathcock. 19E

""""""""_""""""""~"""""""""""""""""" """"""""""""~""""""""""""""""---------~

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I , , .l-

cualitativa de los taninos condensados ( Butler et al., 1982 ) , por que identifica específicamente las antocianinas O

leucoantocianidinas producidas por hidr6lisis &ida del polimero - ( Watterson and Butler, 1983; Acheson, 1981 ) . La especificidad de 6sta prueba se debe a que la vainillina es capaz de reconocer estructuras de compuestos fendlicos que posean un s610 enlace en la posici6n 2 . 3 y que carezcan de grupos hidroxilo en la posici6n meta del anillo B ( Sarkar and Howarth, 1976 ) , por lo que estructuras como : chalconas, flavonas, flavonoles y cromonas dan prueba negativa a 6sta prueba ; mientras las antocianinas, dihidroxichalconas, flavononas y flavononoles dan prueba positiva a esta reacci6n. La reacci6n que se lleva a cabo se muestra en la ecuación- 4 , en la que se tomó como ejemplo un polímero de I

procianidina ( Watterson and Larry, 1983; Sarkar and Howarth, . 1976 >.

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H O d V I

O M O H - H+

\ calor W O H . OH /n

oligomer0 de procianidina

HO

OH + OH

cianidina

COOH

OH

HO n

OH cianidina

C=O

I

1

I

I

OH . . . ecuación 4 ' ' t I

vainillina compuesto protonada colorido

En este trabajo se identificaron únicamente taninOS condensados, por ,que se ha reportado en la literatura que tienen una relaci6n directa con mecanismos de defensa en las plantas, mientras que a los taninos hidrolizables no se les ha asociado con este tipo de funci6n en las plantas ( Roux et al., 1980: Bate- Smith, 1973; Hagerman and Butler, 1981 ) . La identificaci6n de 10s taninos condensados se hi26 según el método de la vainillina propuesto por Dominguez ( Dominguez, 1979 ) , este método se aplicó únicamente a las semillas que presentaron alto cQntenido de compuestos fenólicos ( determinado previamente por el método de Folin-Dennis ) , por que al tener alto contenido de este tipo de compuestos pudiesen contener algún tipo de polimero, como - taninos condensados,entre otros. p .

Identificación de esteroides saponinas """"" y """"""-"""" cardenólidos. Los esteroides son compuestos que han sido aislados tanto en

tejidos animales como en tejidos vegetales, encontrándose en estos últimos tejidos en forma de glucósidos, esterificados, o como moléculas libres ( Romo de Vivar, 1989; Harbone, 1984 ) . Por su biosíntesis en los vegetales estan estrechamente relacionados con los terpenos, ya que se forma la unidad tetracíclica del esteroide a partir de unidades de isopreno ( Streitwieser y Heathcock, - 1985 ) . Esta unidad tetraciclica de esteroide, por su estructura química se le considera derivada del 1,2-~iclopentenofenantreno parcialmente hidrogenado ( Ver :figura 3 y figura 4 ) , y esta unidad es característica estructural común en 3 grupos de metabolites secundarios: fitoesteroles, carden6lidos y saponinas esteroidales. En la figura 5 se muestra un ejemplo de cada uno de los grupos mencionados.

22

rue un

tura anular esteroide

1.2 ciclopentenofenantreno H

Figura S . Tipos de esteroides que se presentan en las plantas.

Fi toesterol Estigmasterol

Carden6lido oleandrina

Saponina esteroidal Diosgenina

En este trabajo se determinarán únicamente carden6lidos y

saponinas, por ser compuestos que se les asociado una función de defensa en las plantas, mientras que los fitoesteroles cumplen una diversidad de funciones no asociadas directamente con mecanismos - de defensa en las plantas a excepción de las fitoecdisonas (Heftmann, 1975). La identificación de cardenólidos y saponinas se

23

llev6 a cabo en dos etapas. En la primera etapa b se busc6 la presencia de esteroles en las semillas utilizando las pruebas de Liebermann-Burchard, Rosenheim. Salkowski y Tortelli-Jaffe: en la segunda etapa se hicieron pruebas especificas para la identificacidn de los dos grupos de compuestos: para las saponinas la prueba de producci6n de espuma y 3 isis de eritrocitos, y para los cardenólidos la prueba de Legal.

I -1dentificación de esteroides. Las reacciones coloridas que se utilizan para la determinación

de esteroides son capaces de identificarlos en estructuras tales como glucósidos cardiotónicos, saponinas esteroidales, esteroles y

metilesteroles, pero también pueden reaccionar con diterpenos, triterpenos, esteroalcaloides y saponinas amirinicas ( Chandel - and Rastogi, 1980 : DominguQz, 1979 ) . Estas reacciones que se han utilizado comunmente en la identificación de esteroides son las siguientes. a) Prueba de Liebermann-Burchard. Una solución cloroformica de esteroide se pone en contacto con una solución de anhidrido acético y áciQ sulfúrico, la prueba es positiva cuando aparecen colores azul, verde, rojo y anaranjado, los que cambian a travkz del tiempo. Esta prueba colorida se fundamenta en el arreglo dienona- fenol que puede sufrir el anillo A de un esteroide. En la ecuacidn 5 se muestra el arreglo que se produce en el anillo A de un esteroide ( Djerassi, 1963 ) .

AcaO. H2SOq + cloroformo

20 c

23

17

... ecuación 5

I

b) Prueba de Rosenheim. A una soluci6n de esteroide en cloroformo se le adicionan unas gotas de una solución al 90% de acid0 tricloro6cetico en agua, la prueba es positiva si se presenta una coloración roja, la cual cambia gradualmente a azul. Esta prueba identifica dienos nucleares reales o potenciales ( Fieser and Fieser, 1959 ) .

c) Prueba de Salkowsky. Una solución cloroforrnica de esteroide tratada con ácido sulfúrico produce la formación de colores amarillo y rojo, debido a la interacción esntre moléculas de esteroide generandose arreglos como los que se presentan en la figura 6 ( Fieser and Fieser, 1959 1.

F'igura Arreglos estructurales en La prueba de Salkewsky.

bicolestatotraeno A 3 ' ' ' ' - 3 , 3' bicolestatotreno

d) Prueba de Tortelli-Jaffe. Lamuestrade esteroide se disuelve en una solución de cloroformo y ácido acético, después se pone en contacto con una solución de bromo en cloroformo. La. formación de coloración en la interfase se lleva a cabo cuando la prueba es positiva. Esta prueba es específica para identificar un doble enlace terciario efectivo o potencial ( Fieser and Fieser, 1959 ) .

La reacción que se lleva a cabo se muestra a continuación +

( Djerassi, 1963 ) .

I

i

I

!

25

cl

AcOH

orof ormo *

Br2 O

... ecuación 6

1 1 - Identificación de cardenólidos y saponinas. a) Identificación de cardenólidos.

Los carderlólidos o glucósidos cardiotónicos son compuestos que se caracterizan por tener una genina conformada por un anillo esteroidal, en el cual los anillos C y D se encuentran en posición cis,además de contener unido al C-3 un grupo OH y una y-lactona a , B insaturada unida al carbono 17 con orientación beta ( Drill, 1974 )

Se ha demostrado que es necesario que se cumplan las características estructurales mencionadas para que estos compuestos tengan una acción sobre el músculo cardiac0 ( Drill,. 1974; Chen, 1942 ) .

La reaccih colorida que se utilizó para la identificación de los carden6lidos fué la prueba de Legal, por que reacciona selectivamente con plactonas a,B insaturadas de 5 miembros ( Romo de Vivar, 1989; Domingugz, 1979 ) .

b) Identificaci6n de saponinas. Las saponinas son metabol-itos secundarios que tienen como

caracteristica particular ser agentes tensoactivos, por lo que disminuyen la tensión superficial del agua produciendo espuma cuando se agitan soluciones acuosas de saponinas.

Las saponinas por su estructura química se dividen en dos grupos: saponinas del grupo colano o esteroidales, ya que por hidrogenación de sus geninas se produce 3'-metil-1,2- ciclopentenofenantreno, y las saponinas del grupo terpenoide o amirinicas, ya que por hidrogenación de sus geninas producen una mezcla de naftaleno y fenantreno ( Basu and Rastogi, 1967 ) . La estructura química de una saponina del grupo terpenoide se muestra en la figura 7.

26

La identificación de saponinas se llevó a cabo aplicando dos pruebas: una prueba cualitativa mediante la producción de espuma y

una segunda prueba cuantitativa mediante la determinación de la capacidad lítica de las saponinas usando eritrocitos humanos.

Para la determinación de la capacidad lftica de las saponinas se procedió a obtener'un extracto vegetal con una concentración de 25 mg/ml, de este extracto original se hicieron las siguientes diluciones: 1:2, 1:4, 1 : 8 , 1::16, 1 : 3 2 , 1:64 y 1:100, las cualek fueron probadas en una suspensión de eritrocitos humanos que fué preparada según el metodo de Wall ( Wall et al., 1952 ) . Finalmente el contenido de hemoglobina se determinó por el método de la

cianometahemoglobína [ Facultad de Química, Manual de Prácticas,- UNAM ) .

27

ACTIVIDADES REALIZADAS

. . .

El uso de plantas control fue una ayuda importante en la interpretacibn de los resultados, ya que fueron utilizadas para evitar considerar pruebas positivas como negativas, o tambih negativas como positivas. Para cada grupo de metabolitos secundarios buscado las plantas control que se utilizaron se muestran en la tabla 4 .

Tabla 4 . Plantas control utilizadas en l a interpretacibn de resultados.

Planta Compuesto que contiene Referencia

Nicoliatur Labacum alcaloides Streitwieser y Ilea thcock, 1985

Agtimonia s p . compuestos fenólicos Pah low, Bate-Smith.1973

D i g i t a l i b pU4pulca cardenólidos Pahlow. Drill,. 1974

Agave l e c h u g w i L c 4 Saponinas Domingude , 1979 ,

"""""""""""""~"""""~""""""""""""""""

"""""""""""""""""""""""""""""""""""

A continuaci6n se presentan los resultados obtenidos en cada una de las actividades realizadas.

28

Determinación de la calidad nutritiva

Determinacibn de carbohidratos no estructurales. ( almidbn. carbohidratos solubles totales 1.

La cantidad de carbohidratos no estructurales en las semillas se muestra en la tabla 5, como mg de sacarosa por gramo de tejido seco. En primer término aparecen las semillas con mayor cantidad de carbohidratos fácilmente asimilables, y después aparecen aquellas semillas que tienen mayor cantidad de polisacáridos.

Determinación del contenido de proteinas.

El contenido de proteinas en las semillas se muestra en la tabla 6 , en la cual aparecen las semillas ordenadas de mayor cantidad de proteínas a menor cantidad de proteínas.

Criterios de toxicidad. Depredacih por insectos y/o roedores en el campo.

La detecciól, de signos de depredación en las semillas se llevó a cabo observando cuidadosamente cada grupo, y los resultados obtenidos se.muestran en la tabla 7 ,

Depredacih por insectos en el laboratorio.

La detección del desarrollo de insectos en las semillas se muestra en la tabla 8 , en la cual aparecen en primer término aquellas semillas que presentaron mayor desarrollo de insectos, y

despues aparecen aquellas semillas que no tuvieron desarrollo de insectos.

I

29

CARBOHIDRATOS

SOlU8LES TOTALES

07.52* 2.02 91.81 t 2.36

37.14 k 3.78

55.39 t 5.03

32.47 5 I. 46

14.1 3 ,C 3.57

12.70 LO. 39

5 7 2 0 5 1.35

51.96 k3.41

51.87 L 2.52

41.48 5 2.99

31.59 k I .78

rm 20.23 50.54

11.33 50.85

0.63 f 4.72

OLIGUSACARIDOS ALMIDON

25.50% 0.91 19.01 3.28 79.54 2 3.46 2 6 . 5 0 ~ 2 7 1

27.88 2 3.97 29.77 23.34

46.95 2 4.04 37.74 2 1.20

24.68 2 1.56 30.622 3.26

8.62 $- 1.7 36..91 2 2.33

11.20 2 0.49

64.44 2 5.00

55.20 2 3.24

57.28 ,f ¡.O0

42..18 2 I .35

29.60 t I .66

20.30 2 1.43

10.75 2 0.22

35.11 2 1.57

21.71 ,t 3.11

233.62 2 4.39

33.16 ,t 4.84

194.27 t 12.3

50.99 ? 7.88

20.48 5 2.58

58.34 2 4.66

6.00 2 1 .O0 116.27 2 3.00 i

,

LOS valores estan reportados c o m o

Mg d e sacarosa / g de tejido seco

. . ..- " .

.MONOSACARIDOS

62.02 12.32

9.31

0.4 4

8.00

5.51

1.5

I

1 2 5 4 2 9

35. I3 ,t 4.59

34.60 2 0.74

29.87 " 0 . 3 6

29.54 k 2.27

25.09 24.00

19.43 -1; 0.50

17.50 3- 1.00

17.21 -k 2.31

17.10 5 1.97

15.91 5 2.31

I5GU -k 1.15

15.30 2 I .76

14.63 -2 2.85

14.42 -1- 1.39

.14.20 2 1.93

Los valores estan reportados como

Mg de protezna / g de tejido seco

31

M D M D R D R D R D -R D R D R D PD PD PD SD SD SD SD

M D Mayormente daiiadas RD Regularmente daiiadas PD Poco dañadas SD Sin daño

32

Semilla Resultados

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + O O

O O O O

+ + + + + -4-

O

Mayor desarrollo de insectos Resular desarrollo de insectos Míñimo desarrollo de insectos No hubo desarrollo de insectos

33

Depredaci6n por roedores en el laboratorio.

Los resultados obtenidos en la depredaci6n por roedores se muestran en la tabla 9, presentandose en primer termino aquellas semillas que al consumirlas murieron los ratones, posteriormente las semillas con las que perdieron peso lot; ratones y por último las semillas que fueron consumidas por los ratones.

Identificación de metabolitos secundarios Identificación de alcaloides.

Todas las semillas presentaron resultados negativos a las pruebas de Mayer, Wagner, Sonnenschein y ácidosilicotúngstico, por lo que se concluye que no contienen alcaloides.

Identificación de compuestos fenólicos

La identificación de flavonoides y taninos se llevó a cabo en varias etapas y los resultados obtenidos en cada una de ellas se muestran a continuación.

I- Identificación de compuestos fenólicos.

Las pruebas que se utilizaron para la identificación de compuestos fen6licos fueron áquellas en las que ocurren reacciones de oxido-reducción, como son Azul de Prusia, sulfato amoniacal de Fe I11 y nitrato de plata amoniacal . Estas pruebas se aplicaron a todas las semillas.

En la tabla 10 se muestran los resultados obtenidos en esta primera etapa.

34

Semilla Resultados

M M M M M PP PP PP PP C

C

C

C

C

C

M PP C

Mueren l o s ratones Pierden peso l o s ratones Son consumidas por los ratones

35

I ..

Tabl;a:.:.LX:,::.,:Reacciones que se utilizaron en la identificacibn de flavonoides.

Muestra Mg/HC1 Zn/HCl FeC13

rojo f lavonona

verde DC

E y n b e W ~ p d y m y a CF anaranjado anaranjado verde E1 f lavona flavononol DC

Burlbe- b-fi

E1 CF anaranjado anaranjado -

f lavona flavononol

anaranjado flavononol

""~""""""""""""""""""""""""--"---"----- CF color formado E1 Estructura identificada - prueba negativa DC derivados del catecol

que se corrieron graficando longitud de onda contra unidades de absorbancia, indicando las bandas de.absorci6n que se utilizaron para identificar de que estructura de flavonoide se trataba.

En la tabla 12 se muestran los resultados obtenidos en esta tercera etapa.

A partir de los resultados obtenidos con los espectros de absorci6n se confirmó la presencia de flavonones y flavononoles en las semillas de iwm, E y n b e W * pdybtuchya, Bumvua - y P m p i h &430ig&.

36

Tabla. $Q. Reacciones de oxido-reduccih que se utilizaron para la identificacibn de compuestos fent5licos.

Muestra AP SA NA

---""""""""""""""""""""""""""""""""-

AP Azul de Prusia SA Suifato amoniacal de Fe I I 1 NA Nitrato de plata amoniacal

--""""""""""""""""""""~""""""""""""-

+ Prueba positiva - Prueba negativa .

11- Estructuras de flavonoide. Para la identificación de flavonoides se aplicaron a todas las

semillas, pruebas en las que se forma un quelato con los flavonoides y con cationes metálicos como: Mg, Zn y Fe.

En la tabla 11 se muestran los resultados obtenidos en esta segunda etapa.

Una vez identificadas las semillas que contenian flavonoides se les aplicó la reacción de sulfonación. en esta prueba - las semillas de Echim- hem, Eymt.hmdt.&~ &3.tCLchyal 8" xh.CechteWi y Pmo& 4ueoiguta presentaron coloración guinda lo que indica la presencia de flavonones.

Para confirmar las estructuras de flavonoide identificadas en la etapa I1 se corrieron espectros de 200 nm a 600 nm, para buscar las bandas de absorción caracteristicas de cada estructura de flavonoide, las cuales se mostraron en la tabla 2. En la figura 7, 8 , 9 , 10 y 11 se presentan los espectros de absorción que se

37

O 250 300 350 400 450 500 550

38

@:$gW&:$:.! Espectro de absorción de E W - 5 ingen5, indicando las . bandas de absorci6n características de flavonones y flavononoles.

10 250 300 350 400 450 500 550

39

c L

I

1 1 I

O 250 300 350 400 450 500 550

~ & ~ ~ & ~ ; ~ : ~ , ~ : ~ : ' Espectro de absorción de Ey5e&,a,&gu & m a . indicando las bandas de absorción caracteristicas de flavonones y flavononoles.

4 0

2

.

200 250 300 350 400 450 500

- - " "oUarr"-; "" - "-

2

I

.- W o U c

O cn O

'o Q)

cn Q) U O U c =I

-e n

.-

2

I

42

Tl:b,l&t:.:b2.. Bandas , . . . . . . . de absorcihn jdentificadas que indican la

presencia de f lavonones y f 1 avononoles. """""""""_"""""""""""""""""""""""" "~""""""""""""""""""""""""""""""""

Muestra BAB . BAF ( nm ) PM ( nm ) BS ( nm )

insews -210 280 315-330

EY6-w pd!44-Ya 210 272 315-320

R U M e z a 5- 210 272 310-325

PW5Opi4 4ue+a,tu 210 267 320-325

..

""""""""""~"""""""""""""""""""""""

"""""""".~"~"""""""""~""""""""""""""

BAB banda de absorción del benceno E3.9 F bandas .de absorción .de. f lavonones- y f lavononoles. PM banda máxima de absorción BS banda secundaria de absorción.

IV- Determinación de compuestos fenólicos por el método de Folin- Dennis.

La determinación de compuestos fenólicos en todas las Semillas se hizd para elegir áquellas que. presentasen mayor cantidad de estos compuestos como posibles candidatas a contener polifenoles como taninos.

En la tabla 1 3 se muestra la cantidad de compuestos fenólicos como mg de ácido tánico por g de tejido seco.

Las semillas que presentaron mayor contenido de compuestos f enólicos fueron : L e g d a sp, Bmem wMechWü, E y m h m t t g a

p d y w a , P ~ e u d ~ & ~ ~ & i n g i w n muM&iXm, Pmopi6 huiga.ta, Acacia 6a&whnu y A& 6i-i.

43

V- Identificacibn de taninos.

La prueba de la vainillina se aplic6 a las semillas que presentaron mayor cantidad de compuestos . fenblicos, para identificar la posible presencia de taninos condensados.

En esta última etapa las semillas que dieron la prueba positiva fueron Ey$enhm#ya PdyMadtga y Summa .sch.cech.cendrrlC, por lo que se concluye que contienen polimeros de proantocianidina.

E s posible que las otras semillas que presentaron alto contenido de compuestos fenblicos contengan otro tipo de polifenoles como: lignanos, taninos hidrolizables, o melaninas.

Identificación de esteroides, saponinas Y cardenólidos.

La identificación de saponinas y carden6lidos se llev6 a cabo en dos fases, las cuales se describen a continuaci6n.

I- Identificacih de esteroides.

Los resultados obtenidos de aplicar las pruebas de identificación de esteroides a todas las semillas se muestran en la tabla 14.

Los resultados negativos obtenidos de las pruebas de Rosenheim y Tortelli-Jaffe indican que 1.0s esteroides contenidos en AcAtcia

h h r n e h ü , Agave %t%iaia, Ey.se.nha&ga ptA@a&a, Kaw&t&iu mdch y PaWmoniu ucukAu, no poseen dobles enlaces reales o potenciales en el anillo de esteroide.

. .

4 5

Tabh 14,. Resultados obtenidos con las pruebas de identificacibn de esteroides.

""_"""~"""""""""""""""""""""""""""" "__"""""""""""""""""""""""""""""""" Muestra LB R S TJ

K m i n / e i a nwU& + +

LB prueba de Liebermann-Burchard R prueba de Rosenheirn S prueba de Salkowski TLJ prueba de Tortelli-Jaffe + prueba positiva - prueba negativa

I I - Identificacibn de cardenólidos y saponinas.

Una vez identificadas las semillas que contienen esteroides se procedí6 a aplicarles la prueba de Legal y la prueba de producción de espuma.

En la tabla 15 se muestran los resultados obtenidos en estas dos pruebas.

Las semillas que presentaron cardenólidos flieron € y l ~ a & a pdyMuchya y K w W m o U i ~ , por que dieron resultados positivos a la prueba de Legal. Mientras que las semillas de A& 6duneh 'i, Agaue

M&iiztu y Pahhonicr czadedu dieron la prueba positiva a la producción de espuma, por lo que probablemente contengan saponinas.

. .

Para confirmar la presencia de saponinas en las semillas que dieron positiva la prueba de producción de espuma, se procedió a aplicarles la prueba de lisis de eritrocitos humanos.

En la gr6fica 1 se muestran los resultados obtenidos en esta prueba cuantitativa, observandose que las saponinas de Agwe +t%iu-tu

46

Tabla- Resultados obtenidos con las pKuebas de identificacibn utilizadas para saponinas y cardenblidos.

Muestra

b i W i i

Prueba de Produccidn de Lecpal . espuma " +

Agave " + +-

-e

tienen la mayor capacidad litica ( mayor con respecto a la planta control, Agave .cechugu.i&a 1 , y las saponinas de Pa&honia aadea&t

unicamente tienen capacidad litica a la concentraci6n. original de 25 mgl ml.

4 8

OBJETIVOS Y

METAS ALCANZADAS

LOS objetivos generales y especlficos que se plantearon al inicio de este trabajo se llevaron a cabo en su totalidad.

Con respecto a los objetivos específicos, se establecid la calidad nutricional de las semillas determinando el contenido de carbohidratos no estructurales y el contenido de proteínas. Tambih se extrajeron e identificaron rnetabolitos secundarios, tales como: alcaloides, flavonoides, gluc6sidos cardiot6nicos, saponinas y taninos, presentes en las semillas.

En el caso de los objetivos generales se observ6 que las semillas m& ricas nutricionalmente ! semillas con alto contenido de carbohidratos solubles y alto contenido proteínico ) , fueron las que presentaron mayor diversidad de metabolitos secundarios, cumpliendose así la primera parte de estos objetivos. Así mismo se observó que las semillas que contenian alguno de los metabolitos secundarios buscados inhibian el crecimiento de insectos y / o perdían peso o morían los roedores. Finalmente, se correlacionaron estos últimos datos para proponer las posibles semillas que podían ser utilizadas como alimento.

4 9

, . ,."+̂ .. ~

RESULTADOS Y

CONCLUSIONES

RESULTADOS

1

I

Las semillas estudiadas presentaron diferentes niveles nutricionales, por lo que se reunieron en 4 grupos dependiendo de la cantidad de monosacáridos ( carbohidratos facilmente asimilables) y proteinas que presentaron.

En el primer grupo se reunieron las semillas con alto contenido en momosacAridos y proteinas denominandose grupo A ,

cnformandose por las semillas de €y5enh#d&ia pdY5tuchga y C u m

w. En el segundo grupo se agruparon las semillas con alto

contenido en proteínas y bajo contenido en monosactkidos denominandose grupo B. conformandose por las semillas de Leguminosa sp., EchiwmntM ingencs y P 5 W r n & * ~ ú L r n t.rw%&lb.

En el tercer grupo se encuentran las semillas con alto contenido en carbohidratos solubles ( diferentes de monosacáridos )

y bajo contenido en proteínas denominandose grupo C, el cual se conformó por las semillas de ?3t“ mhkhkm”, P ~ o p t h Caeoigu4u. A& &m&imu, Sena w W m & i y Ka.44u~ieia d h .

Finalmente, en el cuarto grupo se reunieron las semillas con bajo contenido tanto en carbohidratos solubles como en proteínas denominandose grupo D, el cual se conformó con las semillas de A& di.dimekii, Agave M,%í&a, M&4iu meticum, P&hhoda aadea$a y

*. En el cuadro ‘ 3 se muestran las semillas- de las plantas

estudiadas reunidas bajo la clasificación propuesta. Las semillas que se consideraron potencialmente utilizables

como alimento fueron aquéllas que se encontraron en 10s tres primeros grupos, por ser las más ricas nutricionalmente, de acuerdo Con el criterio nutricional que se considera en la determinación de la calidad nutritiva de las semillas ( Ver Metodología ) . Pero este criterio de alta calidad nutritiva no es suficiente para que las semillas puedan ser consumidas por el ganado o por el hombre, también debe de cumplirse que no sean tóxicas. Las pruebas que se utilizaron para determinar la toxicidad de las semillas fueron: depredación en el campo, depredación por insectos en el laboratorio Y depredación por roedores en el laboratorio. De esta forma fue

I

50

I ..-

""""""""""""""."".""""""""""""""""" _""""""""""""""""."""""""""""""""""

G r u p o A. Alto contenido en eonosa&idos y proteínas.

Grupo B. Alto contenido proteínico.

Grupo C. Alto contenido en carbohidratos solubles.

Grupo D. Bajo contenido en proteínas y carbohidratos solubles.

indispensable que se cumpliera que las semillas presentasen signos de de ser consumidas en el campo, además de mostrar desarrollo de insectos en las pruebas de laboratorio y los roedores no mostrasen ningún signo de intoxicación.

A continuación se muestran los resultados obtenidos en los criterios de intoxicación considerados.

51

I i

Grupo A 8 Las semillas de E y 5 e W k pdy-ya no presentaron signos de

depredaci6n en el campo, .y en las pruebas de laboratorio no mostraron desarrollo de insectos y los roedores murieron al consumirlas.

Las semillas de CuWnctza &&t.u presentaron signos de depredación en el campo, y en las pruebas de laboratorio - mostraron desarrollo de insectos y los roedores consumieron las semillas sin presentar ningún signo de intoxicación.

Grupo B. Las semillas de Echinocm&b ingm y P~seudomocting.ium nwh%&Ai.um

no presentaron signos de d.epredación en el campo, y en las pruebas del laboratorio no mostraron desarrol.10 de insectos'y los roedores perdieron peso al consumirlas.

Las semillas de Leguminosa sp. presentaron signos de depredación en el campo, y en las pruebas de laboratorio mostraron desarrollo de insectos y fueron consumidas por los roedores sin presentar ningún signo de intoxicación.

Grupo c 8

Las semillas de Wezcz wh-4 no presentaron signos de depredación en el. campo, y en las pruebas de laboratorio no mostraron desarrollo de insectos y los roedores murieron al consumirlas.

Las semillas de Acacia &ammiurn presentaron signos de depredación en el campo, y en las pruebas de laboratorio mostraron desarrollo de insectos, pero los roedores murieron al consumirlas.

Las semillas de Kuwhbhia m044h presentaron signos de depredación en el campo, y en las pruebas de laboratorio no mostraron desarrollo de insectos y los roedores murieron al consu- mirlas. Es importante destacar que aunque las pruebas de laboratorio no confirmaron la depredación en el campo, se debe posiblemente a que éstas semillas son atacadas por insectos exdgenos .

52

Las semillas de Pmopíh ,Caevigatu y Sena wiWend presentaron signos de depredación en el campo, y en las pruebas de laboratorio mostraron desarrollo de insectos y los ratones las consumieron sin presentar ningún signo de intoxicación.

Grupo De Las semillas de A& &tXinlettii y Agave &tiatu presentaron signos

de depredación en el campo, y en las pruebas de laboratorio mostraron desarrollo de insectos y los roedores perdieron peso al consumirlas.

Las semillas de Mo&LUiu mmicuna presentaron signos de depredación en el campo, y en los resultados del laboratorio no mostraron desarrollo de insectos, y los roedores las consumieron sin presentar ningún signo de intoxicación.

Las semillas de M W u 4ucaatu presentaron signos de depredación en el campo, y en las pruebas del laboratorio no mostraron desarrollo de insectos y los roedores murieron al consumirlas. Es problable que éstas semillas sean atacadas por insectos exógenos, por lo que 110 se confirmó la depredación en el campo en las pruebas de laboratorio ( como en el caso de K w h &

r? luuih 1. Las semillas de Pakhonicr aadeutu presentaron signos de

depredación en el .campo, y en los resultados del laboratorio mostraron desarrollo de insectos y los roedores las consumieron sin presentar ningún signo de intoxicación.

Una vez concluidos los experimentos para determinar la toxicidad de las semillas, se pudo observar que las semillas de los grupos de más alta calidad nutritiva ( Grupos A , B y C ) ,

fueron las más tóxicas también, lo cual se puede apreciar en el cuadro 4 .

Las semillas que presentaron toxicidad puede deberse a la presencia de metabolitos secundarios, de acuerdo con los objetivos planteados, por lo que se buscaron compuestos tales como: alcaloides, flavonoides, gluc6sidos cardiotónicos, saponinas y

taninos condensados. Los compuestos que se identificaron se presentan a

continuación.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . Toxicidad de las s e m i . l l a s ,

CAMPO LABORATORIO I R

Grupo A.

Grupo B.

Grupo C.

Grupo D.

ND D

D . ND ND

NI3 D D D D

D D D D D

ND M D. c

D c ND PP ND PP

ND D D D ND

M C M C M

D PP D PI? ND C D . c ND M

N D Las semillas no presentaron signos de depredación en el campo, o en el ca'so de las pruebas del laboratorio no mostraron desarrollo de insectos.

campo, o en el caso de las pruebas del laboratorio mostraron desarrollo de insectos.

D Las semillas presenta.ron signos de depredación en el

PP Los roedores perdieron peso al consumir las semillas. M Los roedores murieron al consumir las semillas. C Los roedores consumieron las semillas sin presentar

ningún signo de intoxicación. t

5 4

I - , , .-

Grupo A. En las semillas de E y w z W p d y e t d y a se identificaron

flavonoides, gluc6sidos cardiotbnicos y En las semillas de C d M m &&m

los metabolitos secundarios buscados.

taninos. no se identific6 ninguno de

Grupo B, En las semillas de EchimcucU ingenl, .se identificaron flavonoi-

des, y en las semillas de P~eudo?lmodingium W W h no se identificó ninguno de los metabolitos secundarios buscados.

En las semillas de Leguminosa sp. se encontró una alta cantidad de compuestos fenólicos.

Grupo Cm En las semillas de Bwm khkchtend&Ui se identificaron

flavonoides y taninos. En las semillas de A& &mna-iuna se encontró un alto

contenido de compuestos fenólicos. En las semillas de K u w M i a m&fh se identificaron glucósidos

cardiotónicos. En las semillas de PwopCs buigutu se identificaron

flavonoides, y por último en .las semillas de Sena w W d no se identificaron ninguno de los metabolitos buscados.

Grupo D m En las semillasdeAcacia &dm&u *., Agave 6t&ia.&z y Pahkinn0n.h acu4eutu

se identificaron saponinas. Mientras que en las semillas de Mc%kiUiu me%im.nu y Mi#no&z h#&u no se identificó ninguno de 10s metabolites secundarios buscados.

. .

Los resultados obtenidos en la identificación de metabolitos secundarios se presentan en el c:uadro 5.

En la literatura se ha reportado que la presencia. de metabolitos secundarios en las plantas posiblemente cumpla una función de defensa ante la depredación por insectos o animales ( Fraenkel, 1959 1. A cada uno de los compuestos identificados en las semillas se les ha atribuido una función de defensa, en

55

. . . . . . . . . . . . . . . . ci;ta&o';'.li:" . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . : . ' . : ! : i . . : i ; . . . . . . . . Metabolites secundarios 3 de=

tificados en las semillas,

Grupo A 8

Grupo 8. Leguminosa sp. E W - 6 ihgen4 Pwd€mw&ingium rnuh&hm . .

Grupo C.

Grupo D.

A F

+

+

Gc

+

A- +

+

S

+-I-

+

+

T

+

+

""""""""""""""""""""""""""""""""-" ."""""""""""""""""""""""""""""""""

A F Gc

Alcaloides T Taninos

Flavonoides + Compuesto identifi- cado en la semilla.

Glucósidos cardiotónicos

Saponinas

56

especial a los taninos conde:nsados se les ha relacionado con mecanismos de defensa en las plantas, por que se ha reportado en algunos trabajos que actuan de la siguiente forma: cuando se encuentran en las vacuolas vegetales ( Harbone, 1984 ) , y las células son dafiadas Qstos compuestos se liberan hacia el citoplasma: o bien, cuando se trata de semillas los taninos que se encuentran en la testa migran hacia el endospermo ( Bate-Smith, 1973 ) , una vez liberados estos polifenoles interaccionan con las proteinas del citoplasma o del endospermo disminuyendo su grado de digestibilidad ( Watterson and Larry, 1983 ) . Otra forma de defensa que se ha observado en los tan.inos condensados es su afinidad por las enzimas contenidas en la saliva de mamiferos, al interaccionar con estas proteinas desactiva sus funciones y se torna muy dificil la digestión del alimento ( Hagerman and Butler, 1981 ) . En los insectos se ha reportado que los taninos condensados ejercen un efecto inhibitorio en el crecimiento de larvas ( Bock and Waiss, 1978 ) .

La presencia de glucósidos cardiotónicos en las plantas, confiere un mecanismo de defensa ante la depredación de insectos y animales, por que se ha comprobado que actuan a nivel de las membranas celulares por inhibici6n de la ATPasa, causando una acumulación celular de Na' y pérdida de iones K+ ( Heftman, 1975 ) ,

este desequilibrio en el transporte de iones se ha reportado que tiene una relación directa con €51 músculo cardiac0 en los mamíferos ( Drill, 1974 } .

La presencia de flavonoides en tejidos vegetales, no sólo Cumple funciones tales como: atrayentes de insectos, pigmentos que dan color a las plantas, entre otras. Estos compuestos también actuan COmO agentes de proteccih cuando se encuentran en forma de isoflavonas, actuando como principios estrogénicos causando infertilidad, disminución del crecimiento , entre otros sintomas en el ganado ( Smolenski et al., 1.981 ) .

Las saponinas son un grupo farmacodin6mico de productos naturales Con un amplio espectro de actividades biológicas; entre estos diversos efectos destaca su poder hemolitico, el cual se debe a que son sustancias que tienen propiedades emulsificantes, por lo

57

que causan alteraciones estructurales en los lipidos de la membrana celular ( Basu and Rastogi, 1967 ) . Asi mismo se ha observado que las saponinas son los compuestos responsables de la resistencia que presentan algunas maderas ante el ataque de termitas ( Basu and Rastogi, 1967 ) , tambikn se ha reportado que ciertas saponinas son capaces de ejercer actividad antifúngica ( Chandel and Rastogi, 1980 ) .

Como conclusión preliminar es posible que las semillas de zonas semiAridas utilizen como mecanismo de defensa la acumulaci6n de metabolites secundarios,en especial se destaca que las semillas mAs ricas nutricionalmente son las que presentaron mayor diversidad de los compuestos buscados.

Asi mismo se estableció como criterio de Utilización alimenticia la relación ca'lidad nutritiva Y Presencia de metabolites secundarios, lo cual esta estrechamente relacionado con la toxicidad de las semillas, por lo que se descartaron varias semillas como posible fuente de alimento.

58

i

CONCLUSIONES

I

. . . . . . . . . . . . . . . . . . cM&o:::.6::.: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,:::I ',.:h. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Toxicidad las semillas -

Grupo A,

Grupo B.

Grupo C.

Grupo Da

TOX I CA NO TOXICA

MODERADAMENTE TOXICA NO TOXICA MODERADAMENTE TOXICA

TOXICA NO TOXICA TOXICA NO TOXICA TOX I CA

MODERADAMENTE TOXICA MODERADAMENTE TOXICA NO TOXICA MODERADAMENTE TOXICA TOX I CA

NO TOXICA No se presentaron signos de toxicidad en los roedores y hay crecimiento de insectos.

MODERADAMENTE TOXICA

TOX I CA

Los roedores pierden peso y no hay crecimiento de insectos, o hay cre- cimiento de insectos.

Mueren los roedores y no hay crecjmiento de insec- tos. O hay crecimiento de insectos.

59

A partir de los datos del cuadro 6 se puede concluir que las semillas de las plantas que posiblemente se pudieran utilizar como fuente de alimento, por no Ser tóxicas y por tener un alto valor nutricional ( semillas de los grupos A , B y C ) , fueron las siguientes: C a w W o a , Leguminosa sp., Prl030prh 4uev.iSa4a y Senu U?~~#tü.

Las semillas que mostraron ser moderadamente thxicas, si bien no pueden utilizarse como alimento, en el caso de las semillas de Ech.inoca&ub %m, A& &&?h.&ü, Agave $ & i o t a y P W 0 n i . a acuu, éstas podrian ser utilizadas como materias primas en la industria farmackutica debido a que presentaron flavonoides ( en las semillas de ) y saponin4as ( en' las semillas de las plantas restantes ) . Con respecto a las semillas de P3eudcrsmoctingium

rnu&i&Aium y M W rrwmkmu, que también mostraron una toxicidad moderada es necesario que se realice un análisis fitoquímico más extenso para identificar la presencia de otros metabolitos secundarios no buscados en este trabajo.

Por último, las semillas de Ey&x#m&iu pdy+fac&a, Bwella Is-, Acacia &w-t&anu, KallwiwJ(eia dih y M i m a al ser altamente tóxicas su posible uso queda limitado a su aplicaci6n como insecticidas o venenos.

60

RECOMENDACIONES

I

1) Debido a la diversidad de metabolitos secundarios seria importante terminar de identificar compuestos tales como : aminoAcidos t6xicos, gluc6Sidos cianog&nicos, nitrocompuestos, fitohemaglutininas, compuestos de Selenio e inhibidores de proteasas. Para poder contar con un estudio fitoquimico completo de las semillas estudiadas en este trabajo.

2) Las semillas que no se pudieron considerar como posible fuente de alimento, puden ser consideradas para otro tipo de estudios a nivel del aprovechamiento del compuesto que se haya presentado. De esta manera es posible que se utilizaran como materias primas para la industria farmacéutica los gluc6sidos cardiotónicos, flavonoides y saponinas.

En el caso de los taninos:, éstos se podrian utilizar en las industrias que producen pieles, aumentando el valor comercial de las planta que los produce.

3 ) Debido a que el 25% del gru:po de semillas estudiadas resultaron ser posiblemente utilizables como alimento, seria conveniente seguir impulsando investigaciones enfocadas al estudio de especies vegetales que no han sido consideradas hasta la fecha como alimento, ya sea para el ganado o para el hombre.

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BIBLIOGRAFIA

,.. . . .. . . .~ ... .~ ._"""."""-I-_

Acheson R.M. 1981. Quimica Heterociclica. Ed. Publicaciones Culturales. Mexico.

Armella M.A. Depredaci6n predispersi6n de semillas en la barranca de Metztitlan. Tesis de maestri.a. UNAM. 1990.

Babor J .A. y Aznarez J. I . 1.953. Quimica General Moderna. 4ta edici6n. Ed. Nacional.

Basu N. and Rastogi R.P. 1967. Triterpenoid saponins and sapogenins. Phytochemistry, 6: 1249-1270.

Bates D.M. 1985. Plant utilization: patterns and prospects. Economic Botany, 39(3): 241-265.

Bate-Smith E.C. 1948. Anthocyanins and flavones. Biochemical Journal (43) d-2.

Bate-Smith E.C. 1973. Tannins of herbaceos leguminosae. Phytochemistry, 12: 1809-1812.

Bate-Smith E.C. 1973. Haemanalysis of tannins: the concept of relative astringency. Phytochemistry, 12: 907-912.

Bell J.A. 1967. Chemical principles in practice. Ed. Addison- Wesley. New York.

Butler L.G. , Price M.L. and Brotherton E.F. 1982. Vanillin assay for proanthocyanidins (condensed tannins): modification of the solvent for estimation of the degree polymerization. Journal of Agriculture Food Chemistry, 30: 1087-1089.

1 i

62

Chandel. R.S. and Rastogi R.P. 1980. Triterpenoid saponins and sapogenins: 1973-1978. Phytochemistry. 19: 1889-1908.

Chen K.K., Henderson F.G. and Anderson R.C. 1951. Comparison of forty-two cardiac glycosides and aglicones. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 103: 420-430.

CHen K.K., Steldt F.A., Fried J. and Elderfield R.C. 1942. The action of simple lactones related to cardiac aglycones. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 74: 381-391.

Dominguéz X.A. 1979. Métodos de investigación fitoquímica, Ed. Limusa

Djerassi C. 1963. Steriod reactions. An outline for organic chemists. Ed. Holden-Day.

Drill A.V . 1974. Farmacologia médica. Ed. La Prensa Médica Mexicana. México.

Facultad de Quimica. U N A " Practicas del curso Análisis Quimico- Clinicos. Determinación de hemoglobina.

Felker P. And Bandurski R . S . 1979. Uses and potential uses of leguminous trees for minimal energy input agriculture. Economic Botany, 33(2): 172-184.

Foo L.Y. and Porter L. J.. 1980. The phytochemistry of proanthocyanidin polymers. Phytochemistry, 19: 1747-1754,

Fraenkel S . G . 1959. The raison d'6tre of secondary plant substances. Science, 129: 1466-1470.

63

Franke W. 1983. Las plantas del desierto una riqueza insospechada. Mundo CientLfico, 23 ( 3 ) : 323 - 326.

Hagerman A.E. and Butler L.G. 1981. The especificity of proanthocyanidin-protein interactions. The Journal of Biological Chemistry, 256 (9): 4494-4497.

Harbone J.B. 1984. Phytochemical methods. 2da ed. Ed. Chapman and Hall. New York.

Heftman E. 1975. Functions of steroids in plants. Phytochemistry, 14: 891-901.

Janzen D.H. 1971. Seed predation by animals. Ann. Rev. Ecol. Syst., 2: 465-492.

Kenzo H. 1961. Handbook of UV and visible absorption spectra of organic compounds. Ed. Plenum Press.

Masterton W.L., Slowinki J.E. y Stanitski C.L. 1990. Quimica General Superior. 6ta ed. Ed McGraw Hill.

Maxson E .D. and Rooney L.W. 1972. Evaluation of Methods for Tannin Analysis in Sorghum Grain. Cereal Chemistry, 49 (6) : 719- 729.

McReady R.M., Guggolz J., Vernon S. and Owens H.S. 1950.

Determination of starch and amilose in vegetables. Analytical Chemistry, 22: 1156-1160.

Neckers D. C. y Doyle M.P. 1985. Biblioteca de Química Orgánica. Ed. Continental.

Pahlow M. 1987. El gran libro de l a s plantas medicinales. Ed. Everest. Espafia.

64

Petrucci H.R. 1977. Quimica General. Ed. Fondo Educativo Interamericano. MBxico.

Price M.L., Van Scoyoc S . and Butler L.G. 1978. A critical evaluation of the vanillin reaction as an assay f o r tannin in sorghum grain. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 26 ( 5 ) :

1214-1218.

Rangana S. 1978. Manual of analysis of fruit and vegetable products. Ed. McGraw Hill.

Ramette R.W. 1983. Equilibrio y análisis químico. Ed. Fondo Educativo Interamericano.

Romo de Vivar A. 1989. Steroids, more than 100 years of research. Revista Latinoamericana de Quirnica. Suplemento 1. 288-317.

Rosenthal G.A 1986. Defensa química de las plantas superiores. Imvestigación y Ciencia, 114: '70-76.

Roux D.G., Ferreira D. and Botha J.J. 1980. Structural considerations in predicting the utilization of tannins. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 28: 216-222.

Sarkar K . S . and Howarth R . E . 1976. Specificity of the vanillin test for flavanols. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 24(2): 317-320.

Seigler D. S. , Seilheimer S., Keesy J. and Huang H. F. 1986.

Tannins from four common A c d u especies of Texas and northeastern Mexico. Economic Botany, 40(2): 220-232.

65

1 2 8 4 2 9 Smolenski J.S., Kinghorn D.A. and Balandrin M . F . 1981. Toxic constituents of legume forage plants. Ecomomic Botany, 3 5 ( 3 ) : 321-355.

Streitwieser A . y Heathcock C. 1985. Quimica OrgAnica. Ed. Interamericana.

Swain T. 1977. Secondary compounds as protective agents. Ann. Rev. Plant. Physiol., 28: 479-501.

Van Handel E. 1968. Direct Determination of Sucrose. Analytical Biochemistry, 22: 280- 283.

Watterson J. J. and Butler L.G. 1983. Ocurrence of an unusual leucoanthocyanidin and absence of proanthocyanidin in sorghum leaves. Journal of Agriculrure and Food Chemistry, 31: 41-45.

Wall M.E., Eddy R., McClennan M.L. and Klump M.E. 3952. Detection and estimation of steroidal sapogenins in plant. tissue. Analytical Chemistry, 2 8 : 1337-1341.

Yemm E.W. and Willis A . J . 1954. The estimation of carbohydrat-es in plant extracts by. antrone. Biochemistry, 57: SO8-514.

66