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20/09/2018 1 I. Hongos Productores de Micotoxinas y Principales Micotoxinas II. Modo de acción de las micotoxinas: efectos sobre animales III. Micotoxinas como Factores de Virulencia en Fusarium spp. IV. Fusarium graminearum y deoxinivalenol Micotoxinas • Son metabolitos secundarios producidos por hongos que tienen un efecto deletéreo en otro organismo. • Efectos citotóxicos: Afectan estructuras celulares como las membranas e interfieren con la síntesis de DNA, RNA, proteínas y lípidos. • Aunque el moho no sea visible, las micotoxinas pueden estar presentes. Son secretadas por el hongo, así que permanecen aun cuando el microorganismo no esté presente. • Su toxicidad no es selectiva pero algunas especies son más susceptibles que otras. • Alta estabilidad a procesos térmicos. Infección del hongo • Puede ocurrir en cualquier etapa de la producción del cultivo. • En el campo • Durante la cosecha. • Durante el almacenamiento. • Las esporas pueden permanecer viables y dormantes por meses hasta que las condiciones ambientales sean propicias para su germinación. Condiciones que favorecen el crecimiento de los hongos • Humedad relativa mayor al 70%. • Temperaturas sobre 30°C por un periodo de días. • Estrés en la planta hospedera, como sequía, inundación o infestación por insectos. • Alto contenido de humedad en el tejido (mayor al 20%).
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I. Hongos Productores de Micotoxinas y Principales Micotoxinas
II. Modo de acción de las micotoxinas: efectos sobre animalesIII. Micotoxinas como Factores de Virulencia en Fusarium spp.
IV. Fusarium graminearum y deoxinivalenol
Micotoxinas
• Son metabolitos secundarios producidos por hongos que tienen un efecto deletéreo en otro organismo.
• Efectos citotóxicos: Afectan estructuras celulares como las membranas e interfieren con la síntesis de DNA, RNA, proteínas y lípidos.
• Aunque el moho no sea visible, las micotoxinas pueden estarpresentes. Son secretadas por el hongo, así que permanecenaun cuando el microorganismo no esté presente.
• Su toxicidad no es selectiva pero algunas especies son mássusceptibles que otras.
• Alta estabilidad a procesos térmicos.
Infección del hongo
• Puede ocurrir en cualquier etapa de la producción del cultivo.
• En el campo
• Durante la cosecha.
• Durante el almacenamiento.
• Las esporas pueden permanecer viablesy dormantes por meses hasta que lascondiciones ambientales sean propiciaspara su germinación.
Condiciones que favorecen el crecimiento de los hongos
• Humedad relativa mayor al 70%.
• Temperaturas sobre 30°C por un periodo de días.
• Estrés en la planta hospedera, como sequía, inundación o infestación por insectos.
• Alto contenido de humedad en el tejido (mayor al 20%).
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Factores que afectan la incidencia de micotoxinas
Factores Biológicos
Planta hospedera susceptiblePresencia de cepas toxigénicas
Factores Ambientales
TemperaturaHumedadDaño mecánico (insectos, aves)
Cosecha
Madurez del cultivo TemperaturaHumedadDaño mecánico
Almacenamiento
TemperaturaHumedad
Distribución y Procesamiento
UsosProcesos térmicos, mecánicos, químicos
Consumo AnimalConsumo Humano
Ergotismo: Causado por el hongo Claviceps purpurea
Cornezuelo del centeno
Infección en las espigas de trigo.
Los esclerocios contienen alcaloides (ácido lisérgico y ergotamina).
Estables y activos aún en el pan horneado.
Alucinaciones, convulsiones, hemorragias.
Fuego de San Antonio
Aspergillus y Aflatoxinas
• 1961, Inglaterra. Enfermedad X de los pavos. Más de 100,000 muertas.
• La toxina responsible se rastreó a alimento elaborado con pasta de cacahuate.
• Descubrimiento de las aflatoxinas.
• Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus.
• También se encuentran en maíz, pistaches, nueces y semillas oleaginosas.
Aspergillus sp.
• Mas de 100 especies de las cuales, se conoce que 50 de ellas producenmicotoxinas.
• Aflatoxina, ocratoxina A, esterignmatocistina, ácido ciclopiazónico, citrinina, patulina
• Hay especies de Aspergillus que se emplean en la industria alimentaria: Aspergillus niger para la producción de ácido cítrico. A. oryzae en la producciónde salsa de soya y miso.
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Ciclo de Aspergillus Diversidad estructural de las aflatoxinas
Las AFLATOXINAS son potentes mutágenos. Formación de aductos covalentes con el DNA
Producto Límite máximo(µg/kg)
MasaTortillas de maíz nixtamalizadoTostadas de maíz nixtamalizadoHarinas de maíz nixtamalizadopara preparar tortillas y tostadas
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Tortillas de trigoTortillas integralesHarinas para preparar tortillas de trigoHarinas integrales para preparar tortillas
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6.3.4.1 AflatoxinasTabla 6. Especificaciones de Aflatoxinas
Niveles regulatorios para aflatoxinas. Norma Oficial Mexicana
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Toxinas dePenicillium sp.
• Más de 150 especies en este género.
• Producción de metabolitos secundarios con actividad bactericida: Penicilina.
• Unas 100 especies producen micotoxinas.
• Las micotoxinas más importantes son: citreoviridina, citrinina, ác. ciclopiazonico, ocratoxina A, patulina, toxina PR, roquefortina C, y ác. secalonico.
Ocratoxina A y Citrinina
• Afectan la función renal en humanos: Nefropatía y Fiebre del arroz amarillo.
• Las aves (pollos, pavo, patos) son susceptibles a ocratoxicosis pues se reduce el peso, producciónde huevos, y la calidad de éstos.
• La ocratoxina se encuentra en cacahuates, nueces, café, y otras semillas oleaginosas.
• La citrinina se encuentra en trigo, arroz, maíz y harinas.
Ocratoxina A Citrinina
Fusarium sp. y sus toxinas• Fusarium spp. incluye más de 100 especies. Muchas son
agentes fitopatógenos de muchos cultivos, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas.
• Relevancia clínica por infecciones en pacientes inmunosuprimidos.
• Ascomycetos: Algunas especies tienen reproducción sexual
Peritecio conascoesporas
Esporas asexuales: macroconidias
Fusarium graminearum
F. graminearum infecta las espigas de trigo
La infección inicia en antésis y se dispersa a otras espigas.
Necrósis y decoloración de las espigas.
F. graminearum sintetiza variasmicotoxinas que son los tricotecenos:
• Deoxinivalenol• Nivalenol• Toxina T-2
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El deoxynivalenol se une a los ribosomas e induce estrés ribotóxico
que conduce a la activación de varias cascadas de señalización; MAP
cinasas, arresto del ciclo cellular y apoptosis.
Tanto células de mamíferos como de plantas son susceptibles a esta
acción del DON.
La producción de toxinas es muy variable entre distintas cepas de una especie de Fusarium.
Su síntesis está influenciada por muchos factores ambientales y por la interacción con la planta hospedera.
La descripción del genoma de F. graminearum ha permitido estudiar factores que regulan la producción de deoxinivalenol.
Fusarium gramineraum causa tizón de la espiga del trigo (Fusarium Head Blight /FHB).
Produce deoxinivalenol (DON), que es una micotoxina, tipo tricoteceno, que es un factor de virulencia del hongo.
DON
La biosíntesis de DON comienza a partir de farnesil pirofosfato y depende de locus TRI
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La síntesis de DON es afectada por varios factores ambientales.
El ácido ferúlico inhibe la síntesis de tricotecenos y reprime la expresión de los genes TRI.
Por otro lado, especies reactivas de oxígeno (EROs), inducen la producción de DON.
Peróxido de hidrógeno
Los EROs se producen endógenamente en la célula y es la mitocondria la principal fuente de estos compuestos (95%).
En mamíferos, la proteína LETM1 (Leucine-Zipper-EF-hand-containingtransmembrane 1) reside en la mitocondria.
Su función exacta no está claramente descrita pero se sabe que se asocia a los ribosomas mitocondriales, se requiere para el metabolismo del DNA mitocondrial y regula la actividad de la piruvato deshidrogenasa.
La deficiencia del gen en humanos causa el síndrome de Wolf-Hirschhorn, caracterizado por afectar el crecimiento y el desarrollo muscular, entre otros síntomas.
El gen LETM1 está conservado filogenéticamente y también se encuentra en hongos.
Estudios en S. cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster sugieren que esta proteína participa en la homeostasis de K+ y en la producción de EROs.
La piruvato deshidrogenasa es una enzima mitocondrial que participa en la conversión del piruvato (glucólisis) a Acetil-CoA, que participa
en el ciclo de Krebs.
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El genoma de F. graminearum contiene un gene (FgLETM1) que codifica una proteína de 550 aminoácidos con 47% de identidad con la proteína de S. cerevisiae.
Un segundo gen (FgLETM2) codifica una proteína con una identidad mucho menor (10%) y además es más corta en el C-terminal.
El gen LETM1 se encuentra en el genoma de 32 hongos. En 25 de las 32 especies,
también hay un gen LETM2.
Las proteínas LETM de hongos se pueden clasificar en dos grupos. FgLETM1 se expresa en niveles más elevados que FgLETM2 en todas las etapas de crecimiento y condiciones probadas.
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Evaluación de la expresión génica: Determinación de los niveles de RNAm específicos por RT-PCR cuantitativa qRT-PCR
RNAm poliadenilado
Síntesis de cDNAOligo-dT hibrida al poli-A
Reacción de PCR en presencia de un fluoróforo.
Captura de la fluorescencia y cuantificación de la señal
Para estudiar la función del gen, se construyeron mutantes sencillas para FgLetm1, FgLetm2 y una doble mutante.
Se generó una cepa complementada sobre el fondo mutante en la que se introdujo el gen LETM fusionado a GFP.
Estudio de la función de un gen por mutagénesis. Se interrumpe el gen que se pretende estudiar.
Se introduce una secuencia quimérica que contiene un gen marcador de resistencia a algún antibiótico (higromicina) flanqueado por las secuencias del gen que se quiere interrumpir. Esto facilita la recombinación y el gen de resistencia a
higromicina se inserta en el genoma e interrumpe (muta) el gen de interés.
FgLetm1 participa en el crecimiento de las hifas.
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Las macroconidias de la mutante FgLetm1 son más chicas y tienen menos septos
Las conidias mutantes FgLetm1 germinan más lentamente.
La mutante FgLetm1 es más sensible a estrés por NaCl y KCl que la cepa silvestre y la mutante FgLetm2
La mutante FgLetm1 es más sensible a estrés por calor y se reprime la transcripción de genes de choque térmico (HSP).
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La mutante FgLetm1 es más sensible a fungicidas y a estrés por iones.
La mutante FgLetm1 fue incapaz de crecer en presencia de Fe2+ , lo que sugiere que LETM1 participa en la homeostasis de este metal.
Tanto FgLETM1 como FgLETM2 tienen localización mitocondrial
Cepas que expresan la fusión LETM-GFP
La proteína verde fluorescente (GFP) proviene de medusas. Permite hacer una secuencia quimérica en la que se une el gen de GFP al gen de la proteína de interés y esta proteína de fusión se expresa. Permite visualizar la localización celular de la proteína.
La carencia del gen FgLETM1 causó incremento en el volumen mitocondrial y pérdida de la estructura tubular de las crestas
mitocondriales
Las mitocondrias en la mutante FgLETM2 son normales.
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En levadura, Mdm38, el homólogo de FgLETM1 es esencial para la biosíntesis de componentes de la cadena respiratoria.
Para evaluar si en F. graminearum, LETM1 tiene la misma función, determinaron los niveles de citocromo b en las mutantes por Western blot.
En la mutante Letm1, hay menores niveles de Cyt b.
Letm1 se requiere para la integridad de la estructura mitocondrial y la producción de componentes de la cadena respiratoria.
El Western blot permite la detección específica de una proteína en un extracto de proteínas. A) Separación por electroforesis en geles de poliacrilamidaB) Transferencia a una membrana para inmovilizar a la proteínaC) Reacción antígeno – anticuerpo. Anticuerpo marcado o uso de un
segundo anticuerpoD) Detección del complejo antígeno – anticuerpo
Tinción con
La mitocondria es la principal generadora de EROs.
La mutante Letm1 tiene una muy baja capacidad de producir EROs.
La mitocondria es la principal generadora de EROs.
La mutante Letm1 tiene una muy baja capacidad de producir EROs (H2O2)
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Los niveles de transcrito de los genes de catalasas (CAT) y súperóxidodismutasas (SOD) son muy bajos en la mutante Letm1 y en la doble
mutante.La mutante FgLETM1 muestra tolerancia a estrés oxidativo.
En la mutante Letm1 y doble mutante hay una reducción (≈30%) en la producción de ATP
La mutante FgLetm1 y la doble mutante causaron síntomas muy tenues en las espigas de trigo (15 dpi).
Las semillas de trigo de espigas inoculadas con la mutante FgLetm1 y la doble mutante no mostraron los síntomas de “blanqueamiento” de las otras semillas.
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La incapacidad de inducir síntomas por parte de los mutantes no se debe
a deficiencia del crecimiento pues éstos son capaces de crecer en “wheat
head tissue media”
La mutante FgLetm1 y la doble mutante son incapaces de producir estructuras de infección en la espiga del trigo.
En la mutante FgLETM1 está reprimida la expresión de los genes TRI y no se forman los “toxisomas”…
La mutante produce muy bajos niveles de deoxinivalenol (DON)
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La hipoxia (1% oxígeno) puede inducir varios fenotipos en la cepa silvestre similares a la mutante FgLETM1
(Fenocopiar)
No hay diferencias en el crecimiento pero se reprime la formación de toxisomas.
La hipoxia (1% oxígeno) puede inducir varios fenotipos en la cepa silvestre similares a la mutante FgLETM1
(Fenocopiar)
La hipoxia causa represión de los genes TRI y de la producción de DON.Bajo condiciones de hipoxia, la cepa silvestre es incapaz de infectar y colonizar las espigas de trigo.
En resumen…
La proteína LETM1 es una proteína integral de la mitocondria.
Interactúa con múltiples proteínas ribosomales.
Regulador de la traducción en mitocondrias.
Afecta el metabolismo mitocondrial, incluyendo la generación de EROs
Los EROs son moléculas de señalización que participan en la regulación de la biosíntesis de la micotoxina DON.
