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Universidad Politécnica Salesiana

Biotecnología - Tercer Nivel

Paul Villagrán

3.11.16

Microbiología (Grupo I)

Informe de laboratorio # 2

MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE SIEMBRA

Un cultivo es un método para la multiplicación de

microorganismos, tales como lo son bacterias en el que se

prepara un medio óptimo para favorecer el proceso deseado.

Un medio de cultivo es una solución de varios nutrientes

requeridos por los microorganismos. Tales como: agua, carbono,

energía, nitrógeno, minerales, factores de crecimiento y

concentración de ion hidrógeno H+

OBJETIVOS:

1. Aplicar el método aséptico de siembra y comprender la

importancia del mismo.

2. Observar las diferencias morfológicas que existen entre las

colonias bacterianas de la misma especie, de diferentes

especies y sembradas en diferentes medios de cultivo.

3. Conocer las diferentes condiciones en las que se cultivan las

bacterias, dentro de esto, conocer los diferentes tipos de

medios de cultivos que se utilizarán en el transcurso del

curso y entender su aplicabilidad.

4. Obtener un cultivo puro de diferentes microorganismos para

el proceso de identificación de los mismos.1

PROCEDIMIENTO

1. Observe el diagrama en el que se describe el método aséptico

de transferencia de microorganismos.

1 Cultivo mixto: cultivo microbiano que contiene uno o más especies de microorganismos.

Cultivo puro: cultivo microbiano con una sola especie microbiana.

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2. Utilizando este método realice la siembra desde los cultivos

de Pseudomona y E.coli como se describe a continuación.

3. Observe detalladamente los cultivos bacterianos que se les

proporcionaran, así como los medios estériles con los que va

a trabajar (MKL, Cetrimida).

4. Tomar la caja con el cultivo bacteriano que va a utilizar.

5. Marcar e identificar las cajas/tubos a los que va a

transferir, poner número de grupo, fecha y microorganismo

utilizado.

6. Tomar un hisopo estéril y realizar el inóculo primario, luego

con el asa de metal estéril realizar el inóculo secundario,

terciario y cuaternario.

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7. Esterilizar el asa luego de casa inóculo y proceder a

realizar la siembra según lo indicado en los diagramas

utilizando el método aséptico

E.coli en MKL

Pseudomona aureginosa en cetrimida

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8. Una vez finalizada la transferencia, esterilizar el asa y

colocarla en un lugar seguro.

9. Incubar a 37°C por 18-24 horas.

10. Asegúrate que las tapas de las cajas petri estén

hacia abajo.

11. Observar los resultados al día siguiente y graficar

en la tabla de resultados.

Patrones de crecimiento en los medios de cultivo:

Reconocer diferentes morfologías de crecimiento de las

bacterias en medios de cultivo es un paso usualmente crucial

en los procesos de identificación de microorganismos. Las

bacterias muestran a menudo distintas morfologías, color y

textura en medios de cultivo.

Las categorías básicas de crecimiento incluyen, forma de la

colonia, forma del margen, elevación, color y textura.

Las formas de las colonias pueden ser descritas como

circulares, irregulares o puntiformes.

El margen puede ser entera (liso, sin irregularidades),

ondular (ondulado), lobulada (lóbulos), filamentosa, o

rizoide (ramificado como raíces).

De acuerdo a la elevación de las colonias, se incluyen plana

y elevada, convexa, pulvinado (muy convexa), y umbonate

(elevada en el centro). La textura de la colonia puede ser

húmedo, mucoso, o seco. La producción de pigmentos es otra

característica útil y se puede combinar con propiedades

ópticas tales como opaco, translúcido, brillante o mate.

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Resultados:

Medios de

cultivo

E. coli Pseudomona

AGAR NUTRITIVO

Medio

preparado;

ámbar claro a

medio

ligeramente

opalescente.

Forma: Puntiforme- Irregular

Borde: Externo

Elevación: Convexa

Color: Blanquecino, brillante

Textura: Lisa

Forma: Puntiforme- Irregular

Borde: Externo

Elevación: Convexa

Color: Translúcido

Textura: Continua

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MacConkey

Lactosa (MKL)

Medio

preparado: rojo

púrpura

Forma: Irregular

Color: Rojas con halo turbio

Textura:

Borde: Externo

Elevación: Convexa

Forma: Irregular

Aspecto húmedo.

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Cetrimida Agar

Medio

preparado:

ámbar claro,

opalescente con

precipitado.

Crecimiento inhibido

Forma: Irregular

Color: pigmentación verde azulada

alrededor de la colonia

Textura: Bacilo Recto

Borde: Externo

Elevación: Convexa

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SIM

Medio

preparado:

ámbar

Color: rojo

Movilidad: +

Indol: +

Producción de ácido sulfúrico: -

Textura: Turbia en el medio

Color: Naranja

Textura: Turbia en el medio

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Observaciones:

En el cultivo de Pseudomona en (Mkl), no se observó crecimiento, este medio nos sirve para ver bacterias

entéricas2 que tienen la habilidad de fermentar lactosa y pueden ser detectadas utilizando el

carbohidrato lactosa y el indicador de pH es rojo neutro.

En el medio de cultivo Cetrimida, no se observaron resultados en los cultivos de E.Coli, ya que este

medio es utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del

mismo género.

En los medios de cultivo SIM, tanto para E.Coli como para Pseudomona, se pueden verificar la movilidad,

producción de indol y de sulfuro de hidrógeno ya que este medio es útil para diferenciar miembros de

la familia Enterobacteriaceae

2 Las bacterias entéricas o Enterobacterias son microorganismos que habitan, generalmente, en el intestino de los animales y las personas

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Resultados II:

MEDIO DE

CULTIVO

S.AUREUS S.EPIDERMIDIS

manitol salado

medio

preparado:

rojo

forma: líneas rectas

color: colonias blanquecinas

forma: lineas rectas

color: blanco, medio de cultivo rosáceo

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Observaciones:

El medio ‘’manitol salado’’ es un medio altamente selectivo debido

a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa

positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias

aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante como es el caso

de S. aureus. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan

colonias rodeadas de una zona roja o púrpura como en el caso de

S. epidermidis.

PREGUNTAS:

1. Los medios de cultivo se clasifican de acuerdo a su

composición, ¿Cuál es la particularidad de cada uno de ellos?

Según su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales

de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o

infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.

b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición

química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para

obtener resultados reproducibles.

c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden

factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico

complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

Según su consistencia

a) LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en

solución acuosa.

b) SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido

(caldo) a razón de 15g/litro. El agar es una sustancia inerte

polisacárida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas.

Como esta sustancia no es digerida por las bacterias no constituye

ningún elemento nutritivo. Este conjunto convenientemente

esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos de

ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar

bacterias, "procesos que antes no eran posibles en medio líquido".

c) SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se

utilizan para determinar la motilidad de las especies en estudio.

Según su composición: A causa de los requerimientos químicos del

mundo microbiano, a veces es necesario agregar o eliminar

componentes químicos del medio.

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a) COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la

mayor parte de los microorganismos poco existentes. Es el medio

más frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas.

Por ejemplo: agar común o caldo común.

b) ENRIQUECIDOS: están compuestos de un medio base como apoyo del

crecimiento al cual se le puede agregar un gran exceso de

nutrientes como suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre,

suero, líquido ascítico, etc. Se utiliza para microorganismos que

tienen grandes exigencias nutricionales.

c) SELECTIVOS: son sólidos en los que la selectividad se consigue

alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo o

suprimiendo componentes químicos específicos con el fin de

inhibir el crecimiento de especies químicas cuyo crecimiento no

interesa. Este tipo de medio sólo permite el crecimiento de un

grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza

para seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones

mixtas. Por ejemplo, Agar salado-manitol o Chapman (permite el

crecimiento de ciertos estafilococos). (2016). Biologia.edu.ar.

2. Escribe las especificaciones de los medios de cultivo

utilizados en esta práctica (composición, indicadores de pH,

si son específicos o no para grupos bacterianos y por qué).

(MacConkey Agar, Agar Nutritivo, Manitol Salado, SIM,

Cetrimida).

Agar MacConkey:

Composición:

Fórmula (g/l)

Peptona 17.0

Pluripeptona 3.0

Lactosa 10.0

Mezcla de sales

biliares

1.5

Cloruro de sodio 5.0

Agar 13.5

Rojo neutro 0.03

Cristal violeta 0.001

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pH final: 7,1 ±0,2

Indicadores de pH: Cristal violeta y rojo neutro

Rojo neutro: decolora en pH sobre 6.8 y se torna rosado a un pH

bajo el 6.8

Cristal violeta: Amarillo e pH por debajo de 1.6 y se torna violeta

azulado por encima de 1.6

Especificidad: Permite diferenciar bacterias que fermentan

lactosa (L+) de las no fermentadoras (L-) en muestras clínicas,

de agua y alimentos. Todas las especies de la familia

Enterobacteriaceae se desarrollan en el mismo. Contiene sales

biliares y cristal violeta, lo que inhibe el crecimiento de

bacterias Grampositivas, lo que convierte en un medio diferencial

poco selectivo.

Agar Nutritivo:

Composición:

Fórmula (g/l)

Pluripeptona 5.0

Extracto de carne 3.0

Cloruro de sodio 8.0

Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.2

Indicadores de pH: Ninguno

Especificidad: Medio de cultivo nutritivo no específico, en el

cual la pluripeptona y el extracto de carne constituyen la fuente

de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes para el desarrollo

bacteriano.

Manitol Salado:

Composición:

Fórmula (g/l)

Extracto de carne 1.0

Pluripeptona 10.0

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d-Manitol 10.0

Cloruro de sodio 75.0

Agar 15.0

Rojo de fenol 0.025

pH final: 7.4 ± 0.2

Indicadores de pH: Rojo fenol: amarillo bajo el pH 6.8 y rojo a

pH 7.4 a 8.4

Especificidad: Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado

para el aislamiento y diferenciación de estafilococos.

Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a

partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y

otros materiales de importancia sanitaria.

También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies

halófilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS

Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no

desarrollar.

SIM:

Composición:

Fórmula (en gramos por

litro)

Tripteína 20.0

Peptona 6.1

Sulfato de hierro y

amonio

0.2

Tiosulfato de sodio 0.2

Agar 3.5

pH final: 7.3 ± 0.2

Indicadores de pH: Las cepas productoras de sulfhídrico se

distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de

hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a

un pH mayor a 7.2.

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Especificidad: Es un medio útil para diferenciar miembros de la

familia Enterobacteriaceae.

Cetrimida Agar:

Composición:

Fórmula (en gramos por litro)

Peptona de gelatina 20.0

Cloruro de magnesio 1.4

Sulfato de potasio 10.0

Agar 13.6

Cetrimida 0.3

pH final: 7.2 ± 0.2

Indicadores de pH: No contiene

Especificidad: Medio utilizado para el aislamiento selectivo de

Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del género.

Madigan, Michael T. (2012)

Conclusiones:

1. De aplicó el método de siembra con la asepsia requerida

2. Se observó las diferencias morfológicas que existen entre las

colonias bacterianas de la misma especie, de diferentes

especies y sembradas en diferentes medios de cultivo.

3. Se reconoció las diferentes condiciones en las que se

cultivan las bacterias y los diferentes tipos de medios de

cultivos que se utilizaremos en el transcurso del curso, se

comprendió que ciertos medios de cultivo tienen especificad

para ciertos microorganismos

4. Se obtuvo un cultivo puro de diferentes microorganismos

(E.coli, Pseudomona para el proceso de identificación de

estos.

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Bibliografía:

­ Madigan, Michael T. (2012). Brock biology of

microorganisms (13th ed.). San Francisco: Benjamin

Cummings.

­ (2016). Biologia.edu.ar. Recogido el 3 de noviembre del

2016, desde

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf

­ Anderson, Cindy (2013). Great Adventures In The Microbiology

Laboratory. Pearson. p. 175-176

­ Leboffe, M and Pierce, B (2011). A Photographic Atlas for

the Microbiology Laboratory. Englewood-Colorado. Morton

Publishing. 4th edition.

­ Merck. (2002). Microbiology Manual. Europa: Merck. 2th

Edition.

­ Miyata, S., M. Casey, D. W. Frank, F. M. Ausubel, and E.

Drenkard.,2003, Use of the Galleria mellonella caterpillar

as a model host to study the role of the type III secretion

system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect.

­ Prescott, Lansing M. Harley, John P. Klein, Donald A. 2013.

Microbiology. Mc Graw Hill Interamericana. Madrid. España