KeydeeeE. Coli en microbiología molecularMucho de lo que sabemos de estos tiempos ancestrales y la diversificación sucesiva de los organismos, viene de la paleontología y la biología molecular. Biología experimental que surge a mediados del siglo pasado con el estudio del fago lambda y de la bacteria Escherichia coli K-12, aislada del excremento de André Lwoff, experimentalista de la época. Las bacterias al microscopio ofrecen un mundo bastante monótono, si bien con algunas diferencias morfológicas (cocos, bastones, espiroquetas), poco atractivo en comparación con un zoológico razonable. Pero se reproducen rápido y por miles y se pueden mutar fácilmente. Estas son ventajas importantes para el estudio experimental de la genética, de sus leyes y mecanismos. De los años 40 a mediados de los 70s los descubrimientos en E. coli nos dejaron los fundamentos de la biología molecular, el código genético, el papel en la replicación y regulación del ADN, el modelo del operón de lactosa, las definiciones de enzima alostérica, promotor, operador, gen estructural y gen regulador. Conceptos que son la base en principio para entender la diferenciación y reproducción celular. Fue un período de surgimiento de la microbiología a las fronteras de la ciencia que más contribuciones generan en su momentoEscherichia coli es un tipo de bacteria que ha sido utilizada durante décadas como organismo modelo y, con el surgimiento de la ingeniería genética, pasó a ser el “organismo estrella” de la disciplina del ADN recombinante. Esto se debe a que las técnicas de transformación bacteriana son sencillas y fueron las primeras en desarrollarse rutinariamente en laboratorios de todo el mundo dado que no requieren de equipamiento sofisticado. E. coli se utiliza, entre otras aplicaciones, para obtener muchas copias de un fragmento de ADN de interés (amplificación), y para la fabricación de proteínas recombinantes a gran escala, por ejemplo la insulina humana. Además, los plásmidos de este tipo de bacteria son importantes ya que contienen genes de interés biológico, como aquellos que determinan ventajas adaptativas (por ejemplo, resistencia a antibióticos) y son utilizados como vectores de clonado y de expresión en ingeniería genética.

E. coli en la producción de insulina El suministro de insulina es necesario para regular los niveles de glucosa en pacientes con Diabetes tipo 1 en todos los casos y en ocasiones en pacientes con Diabetes tipo 2, hasta la década de los 80’s era obtenida de páncreas de vacas o cerdos, pero fue en 1982 que entro al mercado la insulina producida por ingeniería genética, que hoy ocupa el 93% del mercado.La producción se realiza a través de un ADN recombinante, esto consiste en la creación de una molécula de ADN artificial que al producir una modificación genética permite la adición de nuevos rasgos a ese organismo, es decir, se produce una proteína recombinante que no estaba presente en ese organismo. En la actualidad, a través de este método, se clonan ciertas proteínas humanas en organismos adecuados para su fabricación comercial, entre ellos, la insulina.El proceso inicia con la identificación y selección del gen responsable de la producción de insulina, después este es insertado en otro organismo que puede ser una bacteria, levadura o célula animal, en la que se clona el gen; para la fabricación de insulina se ha utilizado la bacteria Escherichia coli o la levadura Sacharomces cerevisae. Después se guardan copias idénticas de las células modificadas y aquellas que producen la insulina en mayor cantidad son subcultivadas. La insulina obtenida se mezcla con otros componentes para hacer la absorción más efectiva.La insulina humana, llamada así por ser químicamente idéntica a la que produce naturalmente nuestro cuerpo, fue la primera proteína recombinante que apareció en el mercado. fue desarrollada por Genentech y distribuida por Ely Lilly and company en 1982 y se convirtió en el primer tratamiento de ingeniería genética en ser aprobado.

El mecanismo molecular de los sistemas secreción tipo V (T5SS) y su aplicación en la presentación de anticuerpos monodominio en la superficie de E. coli (bacterial display).

Los T5SS incluyen proteínas con capacidad de "auto-transportarse" a través de la membrana externa, como la familia de intiminas e invasinas y los autotransportadores clásicos (ATs), que son la familia de proteínas secretadas más abundante en las bacterias Gram-negativas. Los ATs tienen distintas funciones biológicas durante la patogenia del microorganismo productor (por ejemplo, la proteólisis de anticuerpos y otras proteínas del huésped, inducir citotoxicidad a las células del huésped, la adhesión a los tejidos, etc.) Además de la investigación del mecanismo de secreción de los ATs, se esta explotando los dominios de transporte de los T5SSs para presentar nanobodies en la superficie de E. coli para la selección de anticuerpos contra antígenos específicos desde genotecas de anticuerpos (bacterial display).

El ensamblaje de las fimbrias tipo 1 en E. coli.Las fimbrias tipo 1 son delgados filamentos proteicos presentes en la superficie de las células de E. coli formados por la polimerización ordenada de una subunidad mayoritaria (FimA) y varias subunidades minoritarias (FimF, FimG, FimH) mediante la ruta de secreción chaperone-usher. Las fimbrias tipo 1 y la adhesina FimH son esenciales para la colonización efectiva y la invasión de las células epiteliales de la vejiga urinaria por cepas UPEC. Se a encontrado que el dominio lectina N-terminal de FimH es reconocido por el usher fimbrial FimD para iniciar el ensamblaje de la adhesina y la polimerización de los filamentos de las fimbrias. El mecanismo de activación de FimD por el dominio lectina N-terminal de FimH está siendo investigado.

Inyección de nanobodies a células humanas con E. coli.Se esta empleando el sistema de secreción de proteínas tipo III (T3SS) de cepas de E. coli EPEC y EHEC cepas de E. coli, para inyectar directamente los anticuerpos de monodominio desde E. coli al citoplasma de las células humanas. Durante la infección, los T3SS actuan como jeringas moleculares para la translocación de las proteínas desde la bacteria a la célula eucariota. La inyección de nanobodies por E. coli no requiere la invasión bacteriana de la célula eucariota o la transferencia de material genético.

Replicación de ADN en E. coliEl ADN de E. coli está organizado en un solo cromosoma en forma de un círculo cerrado de ADN de doble cadena asociado con proteínas parecidas a histonas que le dan su forma característica. En experimentos donde las proteínas se eliminan del cromosoma, se observó con medios autorradiográficos y de microscopia electrónica, que la replicación de ADN genera unas estructuras denominadas horquillas o burbujas replicativas, que son los sitios donde se lleva a cabo la síntesis de ADN activamente.Se han identificado al menos 30 proteínas que participan directamente en la replicación.El proceso de replicación puede dividirse en tres fases: iniciación, elongación y terminación. La iniciación de la replicación está fuertemente regulada e implica la creación de complejos proteicos llamados primosomas en un sitio específico denominado origen de replicación. La coordinación de la frecuencia de inicio de la replicación cromosomal con la síntesis de otras macromoléculas y con el ciclo de división celular es una función compleja resultando de la integración de varios circuitos reguladores. La elongación, o síntesis de las cadenas nacientes usando como templado las cadenas originales, procede de forma bidireccional a una velocidad constante y se observa el movimiento de las burbujas replicativas a lo largo del cromosoma. Esta es llevada a cabo por complejos proteicos y enzimáticos conocidos como replisomas. La terminación, es el evento de separación de los dos cromosomas completos que lleva a la formación del septum y a la bipartición en dos células hijas. La velocidad de replicación del ADN en E. coli es de aproximadamente 800 bases por segundo.En E. coli, la síntesis bidireccional del ADN cromosomal comienza siempre en el mismo sitio del cromosoma, oriC, que es una región de 245 pares de bases, de las cuales sólo algunas son esenciales para iniciar la replicación. El ADN en la región de origen oriC es desenrollado para que las polimerasas, junto con sus proteínas auxiliares, inicien la síntesis de las cadenas

antiparalelas del ADN. Dado que la síntesis de ADN por las ADN polimerasas procede siempre en dirección 5' a 3', sólo la hebra de ADN que va en dirección 3' a 5' es copiada de manera continúa. La cadena de ADN así sintetizada se conoce como la cadena líder o guía (en inglés leading). La ptra hebra que va de 5' a 3', es copiada de manera discontinua y se conoce con el nombre de cadena rezagada (en inglés lagging). La síntesis de ambas cadenas procede simultáneamenten gracias a la formación temporal de una estructura de asa de la cadena de ADN que va de 5' a 3' sobre el complejo replicativo. Este doblamiento permite que ambas cadenas nacientes estén orientadas en la misma dirección y que tengan acceso simultáneamente a la ADN polimerasa.La síntesis discontinua de la cadena rezagada produce pequeños fragmentos de ADN de aproximadamente 1000 a 2000 bases llamados fragmentos de Okazaki, los cuales son sintetizados a partir de una secuencia iniciadora de ARN con un extremo 3'-OH libre. Estos iniciadores de ARN son sintetizados por unas ARN polimerasas especificas denominadas primasas, que actúan en conjunto con otras seis proteínas y forman el primosoma. De éstas proteínas que integran el primosoma, las proteínas N, son particularmente importantes, ya que son éstas las que reconocen secuencias específicas de 5 a 10 bases donde las primasas comienzan a sintetizar el ARN requerido por la ADN polimerasa I para la síntesis de los fragmentos de Okazaki. Una vez sintetizados los fragmentos de Okazaki, las regiones de ARN son hidrolizadas por la ADN polimerasa I, que luego rellena los espacios con los dNTPs adecuados. Los fragmentos de ADN son finalmente unidos por la acción de la enzima ligasa del ADN. La ligasa también está involucrada en la reparación de ADN dañado. El mecanismo de formación de las uniones fosfodiéster difieren del utilizado por la ADN polimerasa en que la ligasa utiliza una unión entre el grupo pirofosfato y el cofactor NAD. En procariotas sólo existe una ligasa, a diferencia de dos distintas que se encuentran en el núcleo de organismos eucariotas. Ligasas de varios bacteriófagos y virus han sido aisladas y se utilizan preferentemente en el laboratorio dada su elevada eficiencia para ligar moléculas distintas de ADN y la construcción de ADN heterólogos.Las helicasas son enzimas auxiliares cuya función es desenrollar la estructura de doble hélice del ADN que va a ser replicado, ya que los puentes de hidrógeno no se separan espontáneamente. Estas enzimas requieren ATP como cofactor, ya que usan la energía libre de la hidrólisis del ATP para moverse a través del ADN. Dos tipos de helicasas están involucradas, la proteína Rep, que se une a la hebra original que va a copiarse y que dirige la síntesis de la cadena líder, moviéndose en dirección 3' a 5' del templado, para así sintetizar la cadena en dirección 5' a 3'. La segunda helicasa, DnaB, pertenece al primosoma de la cadena rezagada para producir lo iniciadores de ARN que se emplearán para la formación de los fragmentos de Okazaki.Las proteínas de unión a cadena sencilla o proteínas SSB carecen de actividad catalítica, se unen a sitios donde la doble hélice del ADN ha sido desenrollada pero todavía no se replica y ahí mantienen las cadenas del ADN separadas, ya que en su presencia el ADN está rígido y extendido, lo que es la forma ideal para el copiado. Si las proteínas SSB se remueven, se pueden formar puentes de hidrógeno entre bases complementarias dentro de la misma cadena, estructuras conocidas como el tallo y asa, lo cual inhibe el copiado. Además, las proteínas SSB protegen al ADN de cadena sencilla de la acción de las enzimas nucleasas de cadena sencilla, como son la exonucleasa I y la enzima RecBCD, cuya función es cortar el esqueleto fosfodiéster entre nucleótidos del ADN. En E. coli, la replicación bidireccional de ADN circular produce las llamadas estructuras tetha, formadas por dos burbujas de replicación presentes en el origen. Para exponer cadenas sencillas de ADN y permitir la síntesis de las cadenas complementarias, el ADN debe rotar: por cada 10 bases copiadas, el ADN debe dar una vuelta completa. Se ha calculado que la burbuja replicativa avanza a una velocidad de 800 bases por segundo, lo cual implica que el ADN debe dar 80 vueltas en un segundo.

El desenrollamiento del ADN induce superenrollamiento, mientras que un enrollamiento positivo (hacia la derecha, en dirección al enrollamiento del ADN sobre su eje) induce un superenrollamiento negativo, o sea en dirección hacia la izquierda. La replicación semiconservativa del ADN requiere de cortes en uno o los dos esqueletos fosfodiéster para liberar la tensión que se acumula en la molécula. Las topoisomerasas son el grupo de enzimas encargadas de regular la tensión generada en el ADN durante la replicación. Las topoisomerasas tipo I cortan una de las dos cadenas del ADN, lo que permite que la hélice gire liberando una vuelta y relajando al ADN; mientras que las topoisomerasas II (dentro de las cuales sobresale la girasa) aumentan una vuelta al ADN lo que incrementa la tensión. Estas enzimas están involucradas en el movimiento de la burbuja replicativa en bacterias y en células eucariotas.Dos moléculas cerradas entrelazadas entre sí son generadas frecuentemente durante la replicación de ADNs circulares, como plásmidos y cromosomas procariotas. A esta estructura se le conoce como concatenación del ADN. Las topoisomerasas tipo II resuelven estas estructuras, cortando una de las moléculas de doble hélice del ADN, para permitir que se libere y finalmente resellan la molécula. Las topoisomerasas requieren de la presencia de ATP para su función; en E. coli estas enzimas consisten en dos subunidades, una de las cuales posee la actividad de ATPasa mientras que la otra lleva a cabo la unión con el ADN. Las topoisomerasas también poseen la capacidad de formar los enlaces fosfodiéster entre dos desoxirribonucleótidos.Cuando la bacteria se duplica, el nuevo DNA también se duplica. De esta forma se puede por ejemplo introducir el gen de la insulina en un plásmido bacteriano para que la bacteria sintetice la proteína insulina.

Extracción y purificación de ADN plasmídico. El procedimiento más comúnmente usado en biología molecular es la purificación de ácidos nulceicos, en particular de plasmidios. Se han desarrollado muchos métodos para purificar plasmidios a partir de bacterias. Estos métodos invariablemente cuentan con tres etapas básicas. Primero, el crecimiento del cultivo bacteriano; segundo, la cosecha y lisis de las bacterias; y finalmente, la purificación del material plasmídico. Muchos de los plasmidios que se usan actualmente (ejemplo, serie pUC, serie pET) que se replican en alto número de copias en Escherichia coli pueden ser purificados en grandes cantidades a partir de cultivos que simplemente se dejan crecer hasta la fase logarítmica en medio de cultivo selectivos estándares (medio LB). Después del cultivo las bacterias son cosechadas por centrifugación y lisada por uno de los métodos que se han reportado para este fin. La elección del método adecuado para la lisis depende de la talla del plasmídio, la cepa de E. coli empleada como hospedero, y la técnica elegida para la subsiguiente etapa de purificación del plasmidio. Un método ampliamente utilizado es la lisis alcalina, un método que permite la purificación de plasmidios en un amplio rango de tallas (< 15 kb). En la lisis alcalina después de la adición de EDTA y, en algunos casos, lisosima, las células se exponen a un detergente (dodecil sulfato de sodio, SDS) y son lisadas por calentamiento o por un tratamiento con álcalis. Este tratamiento, el cual distorsiona el apareamiento de bases del ADN, causa que el ADN cromosomal del hospedero se desnaturalice. Sin embargo, las dos hebras del ADN de los plasmidios, que son moléculas pequeñas circulares y cerradas, permanecen inseparables (a pesar de estar desnaturalizadas) por la propia topología del ADN plasmídico. Cuando las condiciones vuelven a la normalidad (se neutraliza el medio alcalino), las dos hebras del plasmídio se complementan y se reconstruye una molécula completamente superenrollada como en su estado nativo. Finalmente los plasmidios son purificados de esta mezcla mediante cromatografía de intercambio iónico o de filtración en gel, o por precipitación diferencial con polietilenglicol. Estos métodos rinden plasmidios con gran pureza pero son métodos que consumen mucho tiempo. Sin embargo, para el trabajo rutinario del laboratorio de biología molecular, la purificación mediante extracción con una mezcla de fenol

y cloroformo y la posterior precipitación con Etanol, son suficientes para lograr plasmidios de la calidad necesaria. La extracción con fenol:cloroformo es el método estándar para eliminar proteínas de soluciones de ácidos nucleicos. El proceso de eliminar las proteínas es más eficiente cuando dos solventes orgánicos son empleados en lugar de uno. La técnica más ampliamente usada para concentrar el ADN es la precipitación con Etanol o Isopropanol. Los precipitados de ADN, los cuales se forman en presencia de cationes monovalentes, se colectan por centrifugación y se disuelven nuevamente en el tampón y la concentración deseada. Las sales más comúnmente empleadas para precipitar ácidos nucleicos son el Cloruro de Sodio (0.2 M) o el Acetato de Sodio (0.3 M; pH 5.2). Electroforesis del ADN en gel de Agarosa. Electroforesis a través de geles de agarosa es el método estándar para separar e identificar fragmentos de ADN. La técnica es simple, rápida y capaz de resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otro procedimiento. La localización del ADN dentro del gel puede ser determinada directamente por tinción con el agente intercalador fluorescente Bromuro de Ethidium; bandas que contienen cantidades tan pequeñas como 10 ng de ADN, pueden ser detectadas a simple vista examinando el gel bajo luz ultravioleta. La corrida electroforética se realiza colocando el gel que contiene el ADN en un campo eléctrico, y las moléculas migran a una velocidad que es inversamente proporcional al log10 de su talla en pares de bases. Esta velocidad de migración está también afectada por la concentración de la agarosa en el gel, la conformación del ADN, el voltaje, la composición de bases, la presencia de agentes intercalantes, la temperatura y la composición del tampón de corrida. Los plasmidios con exacto número de bases pero con diferente conformación, tienen velocidades de migración diferentes. Aplicación de la muestra Corrida de la electroforesis Visualización del gelPreparación y Transformación de células competentes de E. coli Existen métodos basados en principios químicos o físicos para introducir artificialmente material genético en el interior de la célula. Muchos métodos químicos de transformación en bacterias son basados en el hecho que cuando las bacterias son tratadas con una solución fría de CaCl2 y posteriormente calentadas (shock térmico), estas pueden ser transfectadas con ADN del Bacteriófago Lambda. El mismo método ha sido subsecuentemente utilizado para transformar bacterias con ADN plasmídico. Aparentemente, este tratamiento induce un estado de “competencia” en la bacteria receptora, durante el cual ellas son capaces de tomar ADN proveniente de diferentes fuentes. Las bacterias tratadas con este procedimiento original rinden entre 105 y 106 colonias transformantes por cada µg de ADN plasmídico superenrollado. Muchas variaciones de este método básico se han reportado, todas con vistas a mejorar la eficiencia de este proceso en términos de transformantes por µg de ADN. El método de electroporación, un método físico para la transformación de bacterias, tiene una eficiencia de entre 109 y 1010 colonias transformantes por cada µg de ADN plasmídico empleado. En este procedimiento una mezcla del ADN y las células receptoras es sometida a una diferencia de potencial muy alta (2,500 Volts) por un periodo de tiempo muy corto (milisegundos). Esta mezcla debe ser en un pequeño volumen y debe poseer una resistencia muy alta. Este procedimiento se logra con un aparato llamado electroporador. En el momento que ocurre el pulso eléctrico las células se hacen “competentes” para la entrada de los plasmidios con una eficiencia mayor que cualquier método químico utilizado. La eficiencia de esta técnica se ve fuertemente afectada por la cepa de E. coli empleada, la talla y calidad del ADN plasmídico, volumen y fuerza iónica de la mezcla y parámetros físicos empleados durante el pulso eléctrico. La preparación de las células para la electroporación es relativamente fácil en comparación con el método químico de CaCl2. Las bacterias son crecidas hasta la fase logarítmica, cosechadas y lavadas en frío con tampones pobres en sales para reducir la fuerza iónica de la

suspensión. Finalmente se resuspenden en glicerol al 10% a una concentración de 3x1010 células/mL y se conservan a -700 hasta su uso. Electroporador Cubetas de electroporación Aquellas células bacterianas que fueron transformadas con un plasmidio son fácilmente detectadas ya que la mezcla de transformación es sembrada en placas de medio sólido que contiene un antibiótico de selección para el cual el plasmidio porta un gen de resistencia. Los antibióticos comúnmente utilizados son Ampicilina o Kanamicina y los genes que confieren resistencia a estos antibióticos betalactamasa y neomicina-phosphotransferasa respectivamente. La Ampicilina inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana mientras que la Kanamicina interfiere con la función del ribosoma. En estos medios selectivos solo se duplicarán aquellas células bacterianas que replican un plasmidio en su interior.Por otro lado durante la construcción de plasmidios recombinantes las células de E. coli son transformadas con mezclas que contienen plasmidios recombinantes (correctos o deseados) como no recombinantes (incorrectos o no deseados). Existen métodos para identificar aquellas colonias bacterianas que contienen plasmidios recombinantes, este procedimiento se denomina pesquisaje o screening de clones recombinantes. Entre estos métodos, los más comunes son: el análisis de restricción de plasmidios purificados de estoas colonias, la inactivación por inserción, la hibridización con sondas marcadas y la alpha-complementación.La selección por alpha complementación o por colonias blancas y azules, se basa en la actividad de la enzima Beta-galactosidasa (lacZ) de E. coli y en la regulación del operón lactosa.Estos dos dominios por separados no presentan actividad enzimática pero al unirse, incluso de manera no covalente, se restablece la actividad enzimática de esta enzima, y este fenómeno se denomina alpha complementación. Se ha tomado ventaja de este fenómeno para construir un sistema de plasmidios que permiten la búsqueda rápida de clones recombinantes. Estos vectores portan ADN que codifica para la subunidad alpha de la Beta-galactosidasa bajo el promotor y el operador del operón lactosa. Cuando células de E. coli que portan la enzima mutada en la subunidad alpha (lacZ-) son transformadas con estos plasmidios se restablece la actividad Beta-galactosidasa. La actividad de la enzima Beta-galactosidasa puede detectarse in vivo usando el sustrato cromogénico 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactosido (X-gal) que toma una coloración azul intenso cuando es procesado por la enzima. Al insertarse un gen de interés, mediante biología molecular, en los plasmidios que portan la subunidad alpha, esta secuencia se interrumpe y este fragmento no se expresa más, por tanto las colonias que portan los plasmidios recombinantes son de coloración blanca cuando se crecen en medio sólido que contiene X-gal e IPTG. Mientras que aquellos clones no recombinates serán azules en este mismo medio.Mientras que aquellos clones no recombinates serán azules en este mismo medio. El isopropylthiogalactosido (IPTG) es una molécula sintética análoga a la alolactosa que se une eficientemente al represor del operón lactosa, convirtiéndola en un inductor del sistema.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR: del inglés Polymerase Chain Reaction) El propósito de este método es la obtención de gran número de copias de un fragmento de ADN de interés. El PCR es un método in vitro para sintetizar de manera enzimática secuencias específicas de ADN. La reacción utiliza dos oligonucleótidos (entre 15 y 40 pb) como cebadores que hibridizan en extremos opuestos de la secuencia que se quiere amplificar. La elongación de estos cebadores es catalizado por una ADN Polimerasa termoestable (Ej. Taq polimerasa). Una serie repetida de ciclos que involucra, la desnaturalización del molde, la hibridización de los cebadores y la elongación de los cebadores por la polimerasa, resulta en la acumulación exponencial del fragmento de ADN a amplificar. La especificidad de la reacción está dada por la secuencia de los oligonucleótidos cebadores y en esto radica el éxito y la gran utilidad de esta técnica.

Los componentes de la reacción de PCR son los que siguen, los cuales deben mezclarse adecuadamente en el tubo de reacción. La cantidad y calidad de estos componentes influyen significativamente en la especificidad, calidad y rendimiento de esta reacción; igualmente influye el diseño de los ciclos de temperatura, como se describen más abajo. 1. El ADN molde del cual se quiere amplificar un fragmento 2. Los oligonucleótidos cebadores 3. ADN polimerasa 4. MgCl2 5. Desoxiribonucleótidos libres (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 6. Tampón (pH, fuerza iónica y aditivos adecuados para la enzima empleada) Los ciclos de reacción son: Hay tres etapas fundamentales en un PCR, las cuales son repetidas entre 30 y 40 veces. Esto es realizado en un termociclador automático que realiza estos cambios de temperatura en muy corto tiempo. 1. Desnaturalización (940C): La doble hebra del ADN se separa en dos cadenas independientes. En esta etapa todos los procesos enzimáticos están detenidos. 2. Hibridización o anneling (450C – 600C): Los oligonucleótidos se unen a sus secuencias específicas por complementación de bases, la polimerasa se une al ADN y usando el oligonucleótido como cebador comienza a polimerizar. 3. Extensión (720C): Es la temperatura ideal para que polimerase la enzima. La polimerasa adiciona los desoxiribonucleótidos (dNTPs) complementarios a la cadena molde de 5´ a 3´ (la cadena molde se lee de 3´ a 5´).Las especies modelo en microbiología molecular

Saccharomyces cerevisiae es una especie modelo perteneciente a los hongos unicelulares. Este organismo ha sido parte de la biotecnología desde los comienzos de la historia ya que es la levadura utilizada en la elaboración del pan, el vino y la cerveza, entre otros productos obtenidos por fermentación.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo eucarionte ideal para estudios biológicos y genómicos, y ha resultado una herramienta poderosa para el entendimiento de los genes de organismos eucariontes superiores, como el humano, así como para un análisis sistemático de la función de los productos correspondientes a estos genes. La simplicidad de manipulación genética de la levadura permite que sea utilizada convenientemente para analizar la función de los productos génicos de organismos eucariontes superiores. En cuanto a su utilización biotecnológica como fábrica de moléculas recombinantes, la levadura es de gran utilización para la preparación de proteínas recombinantes de uso comercial. La importancia de esta levadura para la producción de productos proteicos por metodología de ADN recombinante queda ilustrada por el hecho de que la primera vacuna recombinante para humanos aprobada, contra la hepatitis B, y el primer producto alimenticio recombinante aprobado, la renina utilizada en la fabricación de queso, fueron producidos en sistemas de levaduras.

Caenorhabditis elegans es un nematodo (gusano redondo) perteneciente a la categoría de los animales invertebrados. Los Nematodos son muy abundantes e incluyen importantes especies parásitas de plantas y animales. El estudio de esta especie aporta herramientas prácticas aplicables al tratamiento de enfermedades causadas por nematodos. Además, los conocimientos adquiridos acerca de este tipo de gusano permite compararlos con los de especies animales superiores. En particular, de Caenorhabditis elegans se conoce la descripción completa de su anatomía celular y la secuencia de su genoma. Las técnicas de ingeniería genética puestas a punto para esta especie permiten realizar investigaciones sobre diferenciación celular, neurobiología, desarrollo y evolución, mediante la comparación de los genomas de levaduras, gusanos y ratones, entre otros. Se ha identificado que el genoma de C. elegans determina características comunes a todos los animales (e incluso plantas)

superiores. Por ejemplo, posee genes para la mayoría de los componentes moleculares del cerebro de los vertebrados, lo cual sugiere que esta especie provee un modelo válido para el estudio de sistema nervioso en animales.

Drosophila melanogaster es la pequeña mosca de la fruta, y pertenece al grupo de animales más abundante sobre la tierra: los artrópodos. Los estudios realizados en esta mosca durante los últimos cien años, han permitido comprender aspectos fundamentales de la genética eucariótica, entre ellos las bases de la determinación del sexo. La mayor parte del genoma de esta especie está secuenciado desde el año 2000. Los estudios realizados con genes de Drosophila han posibilitado armar modelos que explican muchos procesos celulares y de desarrollo embrionario en animales superiores. Se descubrió, por ejemplo, que los genes de mamíferos con similar secuencia a los de D. melanogaster también cumplen similares funciones. Algunos de ellos están relacionados con procesos complejos como el desarrollo del cuerpo y del sistema nervioso, el comportamiento, el control del sueño (ciclo circadiano), los procesos de neurodegeneración y respuestas fisiológicas a drogas tales como el alcohol. La conservación de genes y procesos biológicos entre mosca y mamíferos amplía el campo de influencia de este insecto a la medicina. El arsenal de técnicas genéticas disponibles en la mosca se aplica para caracterizar y comprender la función de genes humanos. Así se han podido detectar y conocer genes involucrados en la enfermedad de Parkinson, genes supresores de tumores, el homólogo a la insulina en mosca, como así también los algunos receptores de hormonas.

Mus musculus es un mamífero vertebrado, conocido corrientemente como ratón de

laboratorio. El ratón ha sido elegido desde los comienzos de la investigación científica clínica como especie mamífero modelo dada su cercanía fisiológica y genética con el humano. Las pruebas de toxicidad de alimentos, medicamentos, y otras sustancias se han realizado tradicionalmente en el ratón de laboratorio y las conclusiones obtenidas de todos los ensayos son luego convenientemente extrapolados al hombre. El objetivo de los estudios con ratones es comprender los efectos que causan diferentes mutaciones y utilizar esos datos en la búsqueda de posibles equivalencias en la especie humana. Inicialmente los estudios se realizaron con mutantes naturales, pero luego se desarrollaron las técnicas de transformación, en las cuales el gen de interés del ratón es mutado al insertar intencionalmente en su secuencia algún transgén de modo tal de anular la expresión del gen endógeno. Así se han obtenido, por ejemplo, ratones que expresan los posibles genes de obesidad, y han resultado efectivamente más obesos y al anular su expresión y observar su falta de obesidad se pudo confirmar la función del gen humano, como así también la existencia de una homología para dicho gen entre humanos y ratones. Este ejemplo demuestra el potencial de estos modelos para determinar genes involucrados en enfermedades y las posibles implicancias en el campo de la medicina.

Arabidopsis thaliana es una hierba diminuta y una de las especies modelo, aunque sin valor comercial, ni relevancia ecológica. Dentro del Reino Planta el mayor interés está puesto en comprender la biología de las especies de importancia agronómica y poder mejorarlas para un mayor aprovechamiento. Elegida como especie modelo por su minúsculo tamaño, rapidez de reproducción, gran número de semillas por planta, genoma compacto y la facilidad de realizar cruces y transgénicos, Arabidopsis pasó en menos de 15 años de ser casi desconocida a ser la especie mejor entendida de todo el reino vegetal. Al analizar el genoma de esta planta, se encontró que se trata de un genoma muy pequeño pero con un gran número de genes y que un 8% concuerda con genes animales, sobre todo los vinculados con el metabolismo primario (síntesis de

elementos básicos, como azúcares o lípidos). Arabidopsis comparte genes funcionales (germinación, floración, formación de semillas) con otras plantas como el arroz, la soja, el trigo, el maíz y el algodón. Al igual que la información obtenida de otros proyectos genoma, la información del genoma de Arabidopsis ayudará a comprender los mecanismos de la evolución. Además, el conocimiento de la genética molecular de esta especie ha facilitado el avance hacia el mejoramiento de otras especies vegetales de mayor importancia agronómica, por medio de la obtención de plantas transgénicas con genes de caracteres de interés provenientes de otras especies vegetales (ej: resistencia a estrés ambiental por frío, salinidad, etc). También permitió el avance en el conocimiento relacionado con el metabolismo secundario de las plantas, de gran aplicación industrial, farmacológica y cosmética, como así también en la obtención de tejidos derivados de fibras vegetales y en la producción de energía derivada de vegetales (biodiesel).

Nicotiana tabacum o planta de tabaco es utilizada experimentalmente como planta modelo para la transformación genética y cultivo in vitro por ser fácilmente transformable y tener una morfología y fisiología más semejante a la de cultivos agronómicos como el tomate y otras dicotiledóneas. Muchas proteínas recombinantes que se quieren expresar en plantas superiores, como así también las proteínas recombinantes de interés farmacológico (para obtener las llamadas plantas transgénicas de tercera generación, utilizadas como fábricas de moléculas) son primero ensayadas en tabaco.