Microscopía y Técnica Histológica (1)

Microscopía y Técnica Histológica

Dr. C. Guillermo Moreno Fernández

Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de medicina

Departamento de Biología Celular y Tisular

Reflexión inicial

“La verdadera sabiduría está en reconocer la propia ignorancia.”

Sócrates

“Tropezar no es malo, encariñarse con la misma piedra si”.

L U Z • Issac Newton introduce el término

“ fotón”,

• LUZ.- Es la energía en forma de ondas, que se propaga en todas direcciones y siempre en línea recta, a través de agua o aire

La luz es una forma de energía radiante electromagnética que percibimos con el sentido de la visión. La luz es la porción visible de la energía radiante

• Longitud de Onda: Es la distancia que existe entre dos crestas o dos valles sucesivos de la onda luminosa. Determina la visibilidad y color de la luz. La longitud de una onda luminosa se expresa por la letra griega lambda l

• Amplitud de Onda: Es la distancia que existe entre la parte superior e inferior de la onda. Determina la

intensidad de la luz

• Luz visible 400 nm violeta

700 nm roja

FENÓMENOS DE LA LUZ

REFLEXIÓN

• El rayo de luz incide en un

ángulo de 45° sobre una

superficie, devolviéndolo al

medio, de esta manera se hace

visible (espejo)

REFRACCIÓN

• Es el cambio de velocidad

que experimenta una onda

que pasa de un medio con

un índice de refracción

dado a otro diferente.

• Ejemplo: cuando la luz

pasa a través del aire sobre

una superficie caliente,

produciendo un

“espejismo”

http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Refraction.jpg

ÍNDICE DE REFRACCIÓN

• Es la modificación en la velocidad de

la luz al incidir un rayo

perpendicularmente a través de un

cuerpo transparente

Velocidad de la luz en el aire IR= Velocidad de la luz en el medio

Índices de refracción de una serie de sustancias transparentes. • Agua = 1.3300 • Aceite de inmersión = 1.5150 • Fluorita = 1.4340 • Vidrio (crown) = 1.5200 • Flint = 1.6600

MESCLA DE COLORES

COLORES TRANSPARENTES: SUSTRACCIÓN DE COLORES

COLORES OPACOS: SUMA O ADICIÓN DE COLORES

Microscopía

Fotografía de una réplica mostrando los componentes del

microscopio compuesto fabricado por los Jansen.

MICROSCOPÍA

Microscopía

• Es uno de los métodos de estudio de la Biología Celular y Tisular

• Es un instrumento óptico que sirve para obtener imágenes aumentadas de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos.

• La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía.

MICROSCOPIO FOTÓNICO

• Microscopio de luz

• Fotónico

• De Luz Blanca

• De Campo Claro

Esta constituido por: Componentes ópticos. : Condensador. : Objetivos. : ocular(es) Componentes mecánicos. : Base o pie. : Brazo o columna. : Platina. : Revolver. : Tubo óptico. : Carrito o pinzas. Componentes de iluminación. : Bombilla de luz

Microscopía

• Definición etimológica

– Mikrós = pequeño

– Skopéoo = Observar

• ¿Es lo mismo VER que OBSERVAR?

Observar es ir más allá….

Microscopía

Microscopía

• Bichat (20 tejidos)

• 4 Tejidos Básicos:

– Epitelial

– Conectivo

– Muscular

– Nervioso

Microscopio

INSTRUMENTO DE PRECISIÓN QUE PROPORCIONA IMÁGENES AMPLIFICADAS DE

LOS OBJETOS Y MAS DETALLES QUE LOS OBSERVADOS A SIMPLE VISTA.

Variedades de Microscopía

• Microscopio fotónico: Simple o Compuesto

• Microscopio electrónico

• Microscopio de rayos x

• Microscopio de fuerza atómica

Microscopio fotónico

• Instrumento de precisión por medio del cual se modifican las propiedades de la luz por sistemas ópticos para ver propiedades físicas y químicas de la materia.

• Simple: Lupa

• Compuesto: Más de dos lentes

Componentes del microscopio fotónico compuesto

Ópticos Mecánicos Iluminación

• Condensador • Oculares • Objetivos

• Base o pie • Brazo o columna • Platina • Revolver • Tubo óptico • Platina • Tornillos

macrométrico y micrométrico

• Fuente luminosa

Sistema óptico: Lentes

• Cuerpos transparentes limitados por 2 caras esféricas, una puede ser plana.

• Convergentes (+)

• Divergentes (-)

Lentes

Convergentes Positivas

Biconvexo Cóncavo-Convexo Plano-Convexo

Divergentes Negativas

Bicóncava Convexo-Cóncavo Plano-Cóncavo

F

EP

R

F

R

LC: LENTE CONVERGENTE

EP: EJE PRINCIPAL O EJE OPTICO

F: FOCO PRINCIPAL

R: RAYOS DE LUZ

F

EP

LD

R

F

R

LD: LENTE DIVERGENTE

EP: EJE PRINCIPAL O EJE OPTICO

F: FOCO PRINCIPAL

R: RAYOS DE LUZ

Características de las imágenes obtenidas

• De acuerdo a su tamaño

– Aumentadas (mayor tamaño)

– Disminuidas (menor tamaño)

– Mismo tamaño


• De acuerdo a su posición que adopta en el espacio:

• Derecha

• Invertida


• De acuerdo a su orientación que toma con respecto a la lente:

• Real (Del otro lado, se recoge con una pantalla)

• Virtual (Mismo lado)

Imágenes obtenidas en sistemas ópticos

Sistemas Imagen Final Esquema

Lupa Ocular

Mayor, Derecha, Virtual

Proyector Objetivo

Mayor, Invertida, Real

Condensador Ojo humano Cámara digital

Menor, Invertida, Real

Microscopio Mayor, Invertida, Virtual

Sistema Óptico

• Son tres las lentes que lo componen:

– Condensador

– Objetivo

– Ocular

• Solo el objetivo y el ocular amplían las imágenes

Condensador

• Lentes convergentes (1 a 2)

• Reúnen los rayos luminosos y los orienta hacia la muestra

• Diafragma

Objetivos

• Son los elementos mas importantes en la formación de la imagen.

• Formado por lentes convergentes y divergentes

• Forman la imagen primaria del microscopio

Objetivos

Aumentos de los Objetivos

• Capacidad de ampliar la imagen del objeto observado

Aumentos de los Objetivos

• Tipos:

– 5x : Lupa

– 10x : Objetivo seco de poca amplificación (aumento)

– 40x : Objetivo seco de gran amplificación (aumento)

– 100x : Objetivo de inmersión de gran amplificación

Seco de poco aumento

Seco de gran aumento

De inmersión de gran aumento

Poder de resolución

• Capacidad que posee el objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos para que se vean visualizados como separados

Límite de resolución

• Distancia mínima requerida para distinguir dos puntos como separados

• Entonces, ¿PODER = LÍMITE?

– A mayor poder de resolución (mas potente) menor será el límite de resolución.

PODER DE RESOLUCIÓN

• Es la capacidad del ojo o de un sistema óptico para individualizar DOS puntos cercanos entre sí

LR = K x lambda

AN

• Lambda = Longitud de onda (luz blanca 550nm (0.55 micras)

LÍMITE DE RESOLUCIÓN

• Es la distancia mínima de separación que puede existir entre dos puntos o estructuras, para se reconocidos por un sistema óptico

• A mayor AN, mayor resolución • PR (d) ojo= 0.2 mm • PR (d) ML= .2 micras • PR (d) MET = 0.5-1 nm • PR (d) MEB = 5-20 nm

Apertura Numérica

• Capacidad de un objetivo de captar los rayos luminosos refractados

• Tamaño del cono de luz que entra en la lente del microscopio después de pasar por la muestra

Apertura Numérica

APERTURA NUMÉRICA (AN)

• Cifra que corresponde a la capacidad de la lente frontal, para captar la mayor cantidad de rayos de luz.

AN= SEN ½ alfa x IR

• Alfa= ángulo de admisión de la lente

• IR = Del medio presente entre la muestra y la lente frontal

• AN= sen ½ alfa x IR (aceite de

inmersión)

• AN= sen 58° x 1.56

• AN= 0.85 X 1.56

• AN = 1.33

AUMENTO AN

• SECO DÉBIL 10 .25

• SECO FUERTE 40 .65

• INMERSIÓN 100 1.25 – 1.40

OBJETIVOS EJEMPLO

Relación Objetivo-Aumento-Límite de resolución

Con un aumento de 100x y una apertura numérica, el máximo poder de resolución del microscopio fotónico es de 0.2 μm

Oculares

• Forman la segunda imagen ampliada a partir de la imagen primaria de los objetivos

• Amplían a ciertos niveles:

– 5x

– 8x

– 10x

– 12x

Aumento Total

Aumento Objetivo

Aumento Ocular Aumento Total

Lupa 5x 10x 50x

Bajo aumento seco

10x 10x 100x

Gran aumento seco

40x 10x 400x

De Inmersión 100x 10x 1000x

Variedades de Microscopía Fotónica

Microscopio de campo claro

• Fundamento

• Equipo:

– Común

• Material a observar:

– Muestras procesadas mediante la técnica histológica ordinaria

Microscopio de campo oscuro

• Fundamento – Fenómeno de Tyndall

• Equipo: – Condensador

• Material a observar: – Muestras vivas sin fijar ni

teñir.

– Cultivos

– Cristales

Microscopio de contraste de fases

• Fundamento

• Equipo:

– Anillo condensador PH

– Filtro de color (verde)

• Material a observar:

– Muestras vivas sin fijar ni teñir.

– Estructura interna

– Análisis CUALITATIVO

Microscopio Interferencial Diferencial según Normansky

• Fundamento

• Equipo

• Material a observar: – Muestras vivas sin

fijar ni teñir.

– Estructura externa (superficie)

– Análisis CUANTITATIVO

Microscopio de Polarización

• Fundamento – Luz Polarizada

• Equipo: – Polarizador

– Analizador

• Material a observar: – Muestras vivas sin fijar ni

teñir.

– Estructuras con anisotropía (Hueso, Músculo)

Microscopio de Fluorescencia

• Fundamento – Rayos UV

• Equipo: – Anticuerpos marcados con

fluorocromo

• Material a observar: – Muestras procesadas

mediante técnica histológica especial

Microscopio Confocal (Scanning)

Microscopio Confocal

Microscopía Electrónica

Fundamento de la microscopía electrónica

• El ser humano siempre quiere saber más… SIEMPRE!

• ¿Cómo mejorar lo que se ha hecho?

• ¿Cómo hacerle para ver MÁS?


• El microscopio electrónico es un instrumento que: – Permite conocer la ultraestructura biológica.

– Tiene un poder de resolución mayor que el del microscopio fotonico, porque utiliza electrones que tienen una longitud de onda de 0.005 nm.

– Utiliza la propiedad que tienen los haces de electrones de ser desviados por un campo electrostático o electromagnético, igual que un rayo de luz es refractado al atravesar una lente.

Tipos de Microscopía Electrónica

• Microscopia electrónica de transmisión (MET):

a. De bajo voltaje: 50-100 KV.

b. De alto voltaje: 500-3000 KV. Permite estudiar cortes de 5 mm y células vivas en cámaras especiales.

• Microscopia electrónica de barrido (MEB).

Aumentos

• Aumentos que proporciona el MET: 20,000 x

1,000,000 x ( lentes intermedias ).

10,000,000 x ( negativos de fotografías ).

• El microscopio electrónico tiene mayor profundidad de foco.

Técnica Histológica Especial

TECNICA DE PREPARACION DE ESPECIMENES 1. FIJACION EN GLUTARALDEHIDO AL 3% EN AMOTIGUADOR

DE FOSFATO 2. LAVADO EN AMORTIGUADOR. 3. POSTFIJACION EN Os04 al 1%. 4. LAVADO EN AMORTIGUADOR. 5. DESHIDRATACION EN ALCOHOLES A 4° C: R-OH 50% R-OH 70% R-OH 80% R-OH 96% R-OH 100% A TEMPERATURA AMBIENTE: R-OH 100% 6. DIAFANIZACION: OXIDO DE PROPILENO.

Técnica Histológica Especial

7. IMPREGNACION

RESINA-OXIDO DE PROPILENO

RESINA

8. INCLUSION

EN RESINA EN CAPSULAS DE GELATINA

POLIMERIZACION A 60 °C.

9. CORTE EN ULTRAMICROTOMO

CORTES DE 60 A 100 NM

10. TECNICA DE SOMBREADO

SE UTILIZAN SALES DE METALES PESADOS COMO URANIO, PLOMO, ETC., PARA AUMENTAR LA ELECTRODENSIDAD DE LOS COMPONENTES TISULARES.

¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN!

¿Dudas ?

EQUIVALENCIAS

• 1 picómetro

• 1 angstrom °A

• 10 °A

• 1 nm

• 1000 nm

• 1000 micrómetros

• 0.01 °A

• 0.1 nm

• 1.0 nm

• 1000 picómetros

• 1.0 micrómetros

• 1.0 mm

Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.

• Todo curso de Histología tiene cuatro partes o secciones.

• La primera sección que corresponde a los métodos de estudio, se

divide a su vez en dos nuevas porciones:

a) Técnicas histológicas

b) Microscopio

Histología

Métodos de estudio

Biología celular

Biología tisular

Organografía


LAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS


TÉCNICA HISTOLÓGICA:

• Conjunto de procedimientos por los que una muestra de tejido es sometida a cambios físicos y químicos con el fin de obtener una preparación que puede observarse con un microscopio.

Técnica

Histológica

Esencialmente se trata de tomar una muestra de una estructura en estudio y someterla a diversos

procedimientos que tienen como resultado final la obtención de una preparación histológica que

podemos ver en un microscopio.


a) Técnica histológica ordinaria

b) Técnicas histológicas especiales

• La técnica histológica ordinaria se define por tres características fundamentales:

a) Fijación en formol al 10%

b) Inclusión en parafina

c) Tinción con hematoxilina y eosina


LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA


1. Estado vital del individuo.

El individuo del que obtenemos la muestra, ¿está vivo o no?

2. Método de obtención.

¿Qué método empleamos para obtener la muestra?

3. Momento del diagnóstico.

¿Se realiza el diagnóstico después de o durante el acto quirúrgico?



1. Estado vital del individuo:

1.1. Vivo = Biopsia

1.2. Muerto = Necropsia




Biopsia de piel.

Muestra pequeña

Pieza quirúrgica.

Segmento de intestino


• Los términos necropsia y autopsia se usan indistintamente en la práctica médica para referirse al ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO DEL CADÁVER.



• EL ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO DEL CADÁVER.


La autopsia puede ser:

Médica: Es la que ocurre normalmente en los hospitales. La idea es identificar específicamente las causas del fallecimiento con mayor certeza que lo expresado en el historial médico.

Médico-Legal: Ocurre generalmente en los servicios forenses. Intenta detectar las condiciones legales relacionadas con el fallecimiento.


2. Método de obtención:

De acuerdo con este criterio, distinguimos al menos cuatro variantes:

2.1. Corte

2.2. Punción

2.3. Impronta

2.4. Raspado



El corte.

• Es el método más común de obtención de la muestra, con este fin el médico puede emplear muy variados instrumentos:

a) Bisturí clásico

b) Variantes de bisturí: de diamante, eléctrico, de rayos gamma, laser, etcétera.




Aquí se muestran distintos tipos de instrumentos que se emplean en la práctica médica

para obtener muestras por corte.


• El corte que realizamos en nuestro paciente, puede incidir sobre nuestro sujeto de estudio (corte por incisión: en azul en la foto), o bien, puede extraer completamente nuestro sujeto de estudio (corte por escisión: en rojo en la foto).


Nuestro sujeto de estudio es la lesión pigmentada.

El corte en azul, incide sobre la lesión, mientras que el corte en

rojo no lo hace.


Punción venosa.

• Es el procedimiento más común para la obtención de sangre que permite el estudio de biometría hemática, química sanguínea y tiempos de coagulación.

• Es sin duda el primer tipo de obtención de la muestra que los médicos realizan en su práctica hospitalaria.



Punción arterial.


La sangre arterial se usa para el estudio del pH y de las concentraciones de

gases en sangre (gasometría). En general es un procedimiento más

complicado que la punción venosa porque las arterias son profundas.


Punción de médula ósea.

• La médula ósea es el sitio donde se producen las células de la sangre.

• Se pueden obtener muestras para estudio citológico e histológico.

• Se analizan las características anormales en casos de anemias y leucemias (cáncer de células de la sangre).



Punción con aguja fina (BAAF = Biopsia por aspiración con aguja fina).


Permite obtener muestras de estructuras superficiales como la tiroides y las

glándulas mamaria y parótida con un procedimiento que no requiere del quirófano,

que se puede realizar en el consultorio.


Punción renal.


Los riñones son órganos cuya localización anatómica hace muy difícil el

abordaje por cirugía. Resulta mucho más sencillo localizar las lesiones a

analizar por medio de estudios de imagen y con esta guía puncionarlas

obteniendo una muestra para estudio histológico.


Punción cerebral guiada por estereotaxia:


El aparato de estereotaxia es un dispositivo que permite guiar al cirujano

ayudado por estudios de imagen de modo que se pueda puncionar

exactamente en el lugar en que se encuentra la lesión. Se emplea

frecuentemente en neurocirugía.


La impronta.

• La obtención de la muestra por impronta (Huella) consiste en la aplicación directa del portaobjetos sobre la muestra que se pretende estudiar.

• En la actualidad su uso se circunscribe casi de manera exclusiva a los estudios transoperatorios.

• En el estudio de los ganglios linfáticos en que se sospecha linfoma resulta una maniobra imprescindible.



• La obtención de la muestra por raspado consiste en emplear un instrumento romo con el que raspamos la superficie del tejido que deseamos estudiar, dejando numerosas células en el mismo.

• El ejemplo más frecuente e importante es el caso del raspado del cérvix uterino para la detección oportuna del cáncer.



• La muestra cervical se obtiene por raspado (actualmente se recomienda el cepillo citológico).

• Se extiende sobre la lámina portaobjetos

• Se fija con una solución de base alcohólica

• Se tiñe con el colorante de Papanicolaou.



3. Momento del diagnóstico:

3.1. Diagnóstico post-operatorio (rutina)

La mayor parte de las veces el diagnóstico histológico se realiza después de que ha concluído el acto quirúrgico que permite la obtención de la muestra.

3.2. Diagnóstico transoperatorio.

En otros casos, es importante contar con un diagnóstico histológico antes de que termine el proceso quirúrgico ya que de hecho, el propio diagnóstico histológico permite elegir una u otra posibilidad de tratamiento.



LA FIJACIÓN TISULAR


• La disminución resultante en las concentraciones de oxígeno en el tejido, condiciona una serie de cambios metabólicos que eventualmente alteran las características morfológicas y funcionales del mismo.

• Evitar estos cambios secundarios a hipoxia (déficit de oxígeno en un organismo).



• En condiciones normales, las células de un tejido se encuentran en un estado que conocemos como de equilibrio u homeostasis.

• Para que se de el “equilibrio vital tisular” es necesario que se cumplan varias condiciones.

a) Condiciones intrínsecas:

a.1. Integridad del genoma. El mensaje genético no debe tener alteraciones.

a.2. Integridad del metabolismo. Todas las reacciones químicas que ocurren en el citoplasma deben estar normales.

b) Condiciones extrínsecas:

b.1. Interacción con el entorno. Las relaciones de la célula con otras células vecinas y con la matriz extracelular.

b.2. Factores tróficos. Incluye la sangre, así como estímulos nerviosos y hormonales.



• Equilibrio vital tisular


O2

Aminoácidos

Glúcidos

Lípidos

Vitaminas

Hormona

H

H

Hormona

1

2

3a

3b

4

5

6

Las células no se encuentran aisladas del entorno. Su estabilidad depende de factores

intrínsecos como el genoma (1) y el metabolismo (2). Además es necesaria una adecuada

interacción con otras células vecinas (3-a) y con moléculas de la matriz extracelular (3-b), a lo

que debemos agregar el estímulo trófico de los nutrientes que llegan por la sangre (4) y los

efectos del sistema endocrino (5) y nervioso (6).




O2

Aminoácidos

Glúcidos

Lípidos

Vitamina

H

H

H

H

1 2 3a

3b

4

5

6

En condiciones patológicas cada uno de los elementos aquí señalados puede fallar y como regla

termina afectando a todos los demás. Por ejemplo, un defecto en el genoma puede traducir un

tipo anómalo de proteína que afecta el metabolismo celular. La célula así dañada puede alterar

las condiciones de las células vecinas y su interacción con la matriz extracelular.

X




O2

Aminoácidos

Glúcidos

Lípidos

Vitamina

H

H

H

H

1 2 3a

3b

4

5

6

El aporte adecuado de oxígeno a los tejidos es resultado de muy diversas condiciones. Aquí hay

que considerar todos los elementos involucrados en que este proceso ocurra. Por ejemplo,

puede ser que los pulmones estén dañados y no capten suficiente cantidad de oxígeno. Puede

ser que los eritrocitos tengan algún problema y aunque se capte por los pulmones, no lo puedan

transportar, etcétera. A la condición en que falta oxígeno en los tejidos se le llama hipoxia.

X


• En condiciones en que falte el aporte de oxígeno a los tejidos, el metabolismo intermediario se cambia a la ruta anaeróbica.

• De este modo, ocurren dos consecuencias fundamentales:

a) Disminuye la cantidad de ATP intracitoplásmico

b) Aumenta la cantidad de ácido láctico y por lo tanto el pH citoplásmico disminuye.

La disminución en la cantidad de ATP intracitoplásmico tiene como consecuencia el que todas las funciones celulares que dependan de energía irán disminuyendo gradualmente.



Pieza I. Metabolismo intermediario.

LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.

Lactato

Piruvato

Glucosa

Glucosa-P

[O2] [O2]

Acetil CoA

Ciclo de

Krebs

e

e

e

ATP

ATP

ATP

Cuando el tejido se ve sometido a hipoxia (disminución de los niveles normales de oxígeno)

entonces la vía metabólica es la anaeróbica y ya no pasamos a piruvato sino a lactato. Al

bloquear la vía del piruvato, bloqueamos el paso al ciclo de Krebs y a la cadena respiratoria, por

lo que las concentraciones de ATP disminuyen importantemente.


Pieza II. El transporte transmembrana.


Las reglas de la difusión establecen:

a) Las partículas en solución se

desplazarán desde un sitio de

mayor concentración hacia un sitio

de menor concentración.

b) Si tienen carga, las partículas

serán atraídas por la carga

contraria y rechazadas por cargas

iguales.

En condiciones normales, la cantidad o

concentración de sodio (Na+) fuera

de la célula es mucho mayor que la

que se encuentra en el interior.

Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+ Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Si dejamos así como está representada en nuestro esquema a la célula, la diferencia de

concentraciones de sodio entre el medio interno y el externo impulsará al sodio hacia el

interior. Si agregamos el hecho de que el interior es menos positivo, por lo que se

considera negativo, entonces las cargas positivas del sodio, también lo impulsarán hacia

el interior.




Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+ Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

De acuerdo con lo que acabamos de mencionar, existen dos fuerzas que impulsan al

sodio hacia el interior de la célula:

a) Gradiente (o diferencia) de concentraciones

b) Gradiente (o diferencia) de cargas.

Estas dos fuerzas se mantienen mientras que existan las diferencias o gradientes, por lo

que cesarán hasta que dichos gradientes lleguen a desaparecer.

Gradiente de carga

Gradiente de concentración




Una vez que se ha alcanzado el equilibrio de concentraciones y de cargas entre el medio

interno y el externo, los gradientes ya no existen, por lo que el movimiento neto de

partículas se suspende.

Resulta interesante el hecho de que este “estado de equilibrio” es incompatible con la

vida.

Para que el proceso vida ocurra es indispensable que se mantenga el desequilibrio.

TERMODINÁMICAMENTE POCO PROBABLE Y MANTENIDO GRACIAS A LA

INVERSIÓN CONSTANTE DE ENERGÍA.

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+




Si queremos mantener la diferencia de concentraciones para el sodio, será necesario

contar con un sistema que tenga la capacidad de sacar el sodio que entre. Semejante

sistema deberá transportar sodio en contra de las fuerzas establecidas por los gradientes

de carga y de concentración. Para realizar esto, será necesario gastar energía.

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+




El sistema encargado de mantener la diferencia de concentraciones para el sodio es una

molécula protéica de membrana que tiene la capacidad de transportar sodio contra

gradiente, para lo cual debe obtener energía al romper una molécula de ATP. Dado que

esta misma proteína hace lo propio con el potasio (K+), se conoce como bomba de

Na+/K+ ATPasa. Al mecanismo de transporte contra gradiente con gasto de energía se le

conoce como transporte activo.

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+

ADP + Pi

ATP




El trabajo constante de la bomba de Na+/K+ ATPasa, por medio del consumo de ATP y

por el mecanismo de trasporte activo, mantiene las diferencias de concentración para

sodio y para potasio entre el medio interno y el externo de la célula.

“TERMODINÁMICAMENTE POCO PROBABLE Y MANTENIDO GRACIAS A LA

INVERSIÓN CONSTANTE DE ENERGÍA”.

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+ Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

ADP + Pi

ATP




Aquí tenemos una tina con agua y sodio. En el compartimiento A, encontramos menos sodio

que en el compartimiento B. Dado que el nivel de agua se encuentra igual, pareciera que hay

la misma cantidad de agua en A que en B. Pero si consideramos que el sodio ocupa un lugar

en el espacio, entonces resulta que hay más agua en A que en B. De este modo, existe un

gradiente de concentraciones para sodio de B hacia A y simultáneamente un gradiente de

concentraciones de agua de A hacia B. El caso es que la membrana que separa los

compartimientos sólo deja pasar el agua (Membrana semipermeable).

A Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+

B




Como resultado de este experimento, se aprecia un flujo neto de agua desde A hacia B

debido a un proceso de difusión simple a través de una membrana semipermeable. A

este fenómeno se le conoce como ÓSMOSIS. Pareciera que el “SODIO JALAGUA” pero en

realidad no ocurre así.

Este fenómeno de ÓSMOSIS se puede presentar con otros solutos, podríamos cambiar el

sodio por proteínas y tendríamos el mismo efecto.

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

B

Na+ Na+

A




SODIO JALAGUA, SODIO JALAGUA, SODIO JALAGUA, SODIO JALAGUA


Pieza III. El destructor de todo.


Uno de los organelos que se encuentran

flotando en el citoplasma, está limitado por

membrana y en su interior contiene

numerosas enzimas que tienen la

capacidad de destruir casi todo lo que

tocan.

Dado que la destrucción que condicionan

estas enzimas ocurre en un medio acuoso,

se conocen como enzimas hidrolíticas.

Dado que el pH óptimo de estas enzimas es

de alrededor de 5.0, se conocen como

enzimas hidrolíticas ácidas o hidrolasas

ácidas.

Este organelo, originalmente descubierto

por el Dr. Christian de Duve, se conoce

como lisosoma. Si aceptamos que cuando decimos todo, nos referimos a las macromoléculas, entonces

al decir que las enzimas lisosomales destruyen todo, decimos que destruyen:

a) Proteínas: Proteasas (colagenasas, elastasas)

b) Lípidos: Lipasas

c) Carbohidratos: Glucosidasas

d) Nucleasas: (ADNasa y ARNasa)


Pieza III. El destructor de todo.


El hecho de que el pH en el interior de un

lisosoma sea de 4.8, mientras que el pH en

el citoplasma que le rodea sea de 7.2.,

implica que la concentración de

hidrogeniones dentro del lisosoma es muy

alta.

Para mantener este gradiente de protones

es indispensable que la membrana del

lisosoma cuente con un sistema de

proteínas con capacidad de ATPasa que

constantemente bombeen protones hacia el

interior del lisosoma.

Así, la membrana de este organelo tiene

bombas de protones en abundancia, que

requieren para su funcionamiento, de

adecuadas concentraciones de ATP

citoplásmico.

En condiciones normales, si las enzimas lisosomales salieran del organelo, no tendrían

actividad destructora debido a que se encontrarían en el citoplasma con un pH muy

alejado de su nivel óptimo.

Pero si por alguna razón ocurriera que el pH del citoplasma descendiera, entonces sí

estaríamos en problemas ya que estas grandes destructoras sí podrían ejercer su efecto

lítico.

pH = 4.8

pH = 7.2

Bombas

de

protones


• El tejido que deseamos estudiar con fines diagnósticos en nuestro paciente, se encuentra en las condiciones del equilibrio vital tisular.

• En el momento en que obtenemos la biopsia, separamos al tejido de su fuente nutricia vascular, por lo que obligadamente, las concentraciones de oxígeno en el mismo descienden gradualmente, de modo que entra en condiciones de hipoxia.


Lactato

Piruvato

Glucosa

Acetil CoA

Ciclo de

Krebs

ATP

pH


• Esto conlleva la desviación hacia la glucólisis anaeróbica, por lo que se bloquea el paso al ciclo de Krebs y a la obtencion de ATP en la cadena respiratoria.

• Esto tiene como resultado la disminución de las concentraciones de ATP en el citoplasma y la acumulación de ácido láctico con la consecuente disminución del pH citoplásmico.


Lactato

Piruvato

Glucosa

Acetil CoA

Ciclo de

Krebs

ATP

pH


• La disminución en la cantidad de ATP disponible en el citoplasma tiene como consecuencia que las funciones que dependan de esta molécula irán disminuyendo gradualmente.

• Si empieza a fallar la bomba de Na+/K+ el resultado será la entrada de Na+ al citoplasma y como dice mi amigo el fisiólogo, SODIO JALAGUA. Por lo que la célula literalmente se hinchará (Edema celular).


Lactato

Piruvato

Glucosa

Acetil CoA

Ciclo de

Krebs

ATP

Na+

Na+

H2O

H2O

EDEMA

CELULAR


• Las bombas de protones de los lisosomas, tanbién irán disminuyendo gradualmente su función, con lo que la cantidad de protones citoplásmicos aumentará llevando a una disminución gradual del pH citoplásmico.

• El edema celular favorece la salida de enzimas lisosomales, que ahora entrarán en contacto con un pH ácido por lo que sí funcionarán, destruyendo todo lo que encuentren a su paso: AUTÓLISIS.


Lactato

Piruvato

Glucosa

Acetil CoA

Ciclo de

Krebs

ATP

Na+

Na+

H2O

H2O

EDEMA

CELULAR

pH = 4.8

PROTEASAS

LIPASAS

GLUCOSIDASAS

NUCLEASAS

ACTIVAS

AUTÓLISIS


• La fijación química se logra por la aplicación de diversas sustancias disponibles para el histólogo:

a) Formaldehído e) Glutaraldehído

b) Formol f) Osmio

c) Alcohol g) Ácido pícrico

d) Acetona

• La más sencilla y barata – aunque no ideal – es la inmersión de una muestra en alcohol etílico al 96%. Este método se puede emplear en caso en que no tengamos otro fijador a la mano y resulte urgente mantener la preservación del tejido.



• El fijador más comunmente empleado en la investigación y en la práctica médica es el FORMOL AL 10%

• El formol, también conocido como formalina, es una solución que contiene aproximadamente 60% de agua y 40% de un gas conocido como formaldehído.

• FORMOL Y FORMALDEHÍDO NO SON LO MISMO.


+ =

Gas formaldehído

40%

Agua

60% Formol al 100%


• Para hacer una mezcla de formol al 10%, en un recipiente ponemos una parte de formol y nueve partes de agua.

• En la mezcla resultante, el formaldehído queda a una proporción de 4%

• El agente activo fijador de el formol es el gas formaldehído.

• Con el fin de obtener una fijación óptima del tejido a estudiar, es muy importante tomar en cuenta que el formaldehído tiene una velocidad de penetración tisular de aproximadamente 1 mm/hr.


Agua

Formol


• En general, mi amigo el histólogo recomienda que por cada unidad de volumen de tejido, agreguemos de 20 a 40 unidades de volumen de fijador.

• Si la biopsia que obtenemos es de 1cm3, entonces necesitaremos de 20 a 40 cm3 de fijador. Si igualamos 1 cm3 con 1 ml; entonces bastarán entre 20 y 40 ml de fijador.

• De este modo, nos queda claro que la fijación de biopsias pequeñas no representa problema alguno.

• Pero, ¿qué ocurre en el caso de la fijación de las piezas quirúrgicas que suelen ser mucho más grandes?



• Pensemos en el caso de que queremos estudiar un útero en el que el ultrasonido detectó varios tumores y queremos el estudio debido a que nos interesa saber si son benignos o malignos.

• La pieza que se recibe en el servicio de Anatomía patológica es muy grande. Si aceptamos que la pieza midió: 15 x 10 x 5 cm, entonces su volumen aproximado es de 15 x 10 = 150 x 5 = 750 cc = 750 ml.

• Siguiendo las recomendaciones del histólogo, deberemos sumergir la pieza en un volumen de fijador igual a:

750 x 20 = 15,000 ml = ¡15 LITROS!

• Semejante circunstancia es inaceptable en un hospital.



• ¿Cómo solucionar este problema?

• Es imperativo que las piezas quirúrgicas que lleguen al servicio de Anatomía patológica sean estudiadas a la brevedad.

• De las zonas seleccionadas – por ejemplo en el caso del utero con miomas – los tumores, se deben cortar rebanadas de tejido que tengan un espesor máximo de 0.5 cm. De este modo, la rebanada resultante podría medir 3 x 2 x 0.5 cm. Dimensiones que permiten una rápida y adecuada entrada del fijador.

• .




Aquí vemos un segmento de intestino delgado que una vez cortado muestra la

superficie interna o mucosa. Note que se ha seleccionado un pequeño fragmento

para estudio histológico.



Los cortes seleccionados

se introducen en las

cápsulas de inclusión.

Aquí se muestran unas de

metal y una de plástico.

Note que estos

dispositivos cuentan con

numerosos agujeritos que

permiten el contacto del

tejido con distintas

soluciones que se

emplean en el

procesamiento histológico.


• Los fijadores, como es el caso del formol al 10% tienen varios efectos importantes sobre el tejido, incluyendo:

A) Detienen la mayor parte de los procesos metabólicos tisulares. Esto tiene como consecuencia que DETIENEN EL PROCESO DE AUTÓLISIS, pero además, matan a todo elemento viviente, lo que incluye a bacterias que podrían causar putrefacción y a las propias células que queremos estudiar.

B) Endurecen los tejidos. Esta circunstancia favorece el corte de los mismos.

C) Favorecen la tinción (efecto mordente). Los tejidos bien fijados se colorean mucho mejor, mientras que un tejido mal fijado, se colorea mucho menos.

D) Causan pérdida de sustancias intracelulares. En general, se pierde agua y elementos grasos.



• En la práctica médica, los primeros dos pasos de las técnicas histológicas: LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Y LA FIJACIÓN, las lleva a cabo el médico tratante.

• Si el médico tratante pasa por alto este detalle, puede arruinar el estudio diagnóstico de un paciente.



EL PROCESAMIENTO


• Una vez que las muestras de tejido se encuentran adecuadamente fijadas y en las cápsulas de inclusión, están listas para la parte de la técnica histológica que conocemos como el procesamiento histológico.

• En términos básicos podemos plantear a partir de este momento 3 metas fundamentales:

A) Realización de cortes translúcidos

B) Tinción de los cortes

C) Protección del preparado final

EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO



• La observación con el tipo de microscopio que tenemos en los laboratorios requiere de cortes o rebanadas de tejido lo suficientemente delgadas como para que pase la luz a través de ellas. Es decir, se requiere de cortes translúcidos.




• Una manera para solucionar este problema es congelar el tejido y realizar los cortes en un medio con muy bajas temperaturas. Es el caso de los cortes por congelación.

• No hace daño recordar que el instrumento para realizar estos cortes es el criostato y que en la práctica médica tiene aplicaciones en los siguientes casos:

a) Estudios transoperatorios

b) Estudios de inmunofluorescencia en biopsias renales y de piel.

c) Estudios de histoquímica enzimática en casos de patología muscular.

d) Estudio de grasas neutras en tejido adiposo




a) Parafina

b) OCT (Mezcla comercial de alcohol polivinílico, polietilenglicol y excipientes) empleada para los cortes por congelación. Es un compuesto hidrofílico.

c) Resinas acrílicas, poliéster y epóxicas (empleadas para estudios de microscopía electrónica)

* Como ya hemos comentado, la técnica histológica ordinaria requiere de inclusión en parafina, por lo que partiremos de esta.




• Si queremos sustituir el agua que se encuentra en el interior de la célula por parafina, lo primero que debemos hacer es eliminar el agua.

• Una manera muy conocida por algunos caballeros, es la deshidratación con alcohol.

• Con el fin de evitar el efecto de encogimiento del tejido como resultado de la deshidratación brusca, los tejidos pasan a varios baños con etanol en grados crecientes. Al final del proceso, donde había agua en la célula, ahora hay etanol.


ETANOL

AL 60%

ETANOL

AL 70%

ETANOL

AL 80%

ETANOL

AL 96%

ETANOL

AL 100%



• Con la DESHIDATACIÓN EN ETANOL EN GRADOS CRECIENTES hemos logrado eliminar el agua del tejido. Ahora donde había agua, hay etanol.

• Pero resulta que el etanol no se mezcla con la parafina, por lo que también deberemos eliminarlo. Obviamente debemos emplear una sustancia que se mezcle tanto con el etanol como con la parafina.

• Para lograr este fin la mayor parte de las veces empleamos XILOL también conocido como XILENO. Podemos emplear también TOLUENO o BENCENO.


ETANOL

AL 100%

XILOL

• Aquí no usamos grados crecientes de XILOL.

• Este proceso se conoce como ACLARAMIENTO.

• Al final, donde había etanol, ahora hay xilol.

• Estamos listos para pasar nuestro tejido a parafina.



• Terminada la etapa de ACLARAMIENTO, donde primero había agua y después había alcohol, ahora hay XILOL.

• Enseguida la muestra pasa a un recipiente con parafina caliente de modo que se encuentra líquida y podemos sumergir la muestra.

• La parafina entra ahora reemplazando al xilol. A este paso se le llama INFILTRACIÓN.


PARAFINA

LÍQUIDA

XILOL TEJIDO

INFILTRADO

• Hasta aquí hemos logrado nuestra meta fundamental que era sustituir el agua por un material más duro que facilitara la realización de cortes delgados, tan delgados que sean translúcidos.



• A la secuencia de pasos que incluye la deshidratación en alcoholes de grados crecientes, el aclaramiento y la infiltración del tejido, el histotecnólogo le conoce como EL PROCESO – no el de Kafka – o en ocasiones le llama más adecuadamente, EL PROCESAMIENTO.


TEJIDO

BIEN

FIJADO

ETANOL

60%

ETANOL

70%

ETANOL

80%

ETANOL

96%

ETANOL

100%

XILOL

PARAFINA

LÍQUIDA TEJIDO

BIEN

INFILTRADO DESHIDRATACIÓN

EN ALCOHOL

EN GRADOS CRECIENTES

ACLARAMIENTO

INFILTRACIÓN



• Es importante considerar que cada uno de estos pasos, requiere un tiempo que varía entre una y dos horas. Los tiempos y soluciones pueden variar levemente entre uno y otro laboratorio, pero esencialmente siguen los principios aquí marcados.

• Si aceptamos un procesamiento como el aquí señalado, entonces el tiempo desde el primer paso a etanol hasta tener un tejido bien infiltrado, consume un total de ¡7 a 14 horas!


TEJIDO

BIEN

FIJADO

ETANOL

60%

ETANOL

70%

ETANOL

80%

ETANOL

96%

ETANOL

100%

XILOL

PARAFINA

LÍQUIDA TEJIDO

BIEN

INFILTRADO



• En los viejos tiempos, el procesamiento histológico se hacia a mano. ¡Uf!

• Por suerte, ahora los laboratorios cuentan con aparatos que hacen automáticamente el procesamiento. Su nombre, muy imaginativo, es el de PROCESADOR AUTOMÁTICO DE TEJIDOS.




• La muestra completamente infiltrada, pasa ahora a un recipiente cuadrilongo en el que se vierte parafina líquida y posteriormente se deja enfriar. De este modo, la parafina se solidifica y queda un bloque de parafina con tejido incluido en su interior. A este paso se le conoce como INCLUSIÓN.


C B A

PARAFINA

LÍQUIDA TEJIDO

INFILTRADO

BLOQUE

DE

PARAFINA



• El resultado final es un bloque de parafina que en su interior contiene el tejido – que se puede ver a través de la parafina – y que está listo para realizar un corte lo suficientemente delgado como para que pase la luz a través de él.




• Para la realización de un corte muy delgado se emplea un instrumento especial que se conoce como microtomo.

• En realidad existen varios tipos de microtomos, el que se usa para las técnicas ordinarias se conoce como microtomo rotativo.


• El microtomo contiene un soporte para el bloque de parafina (flecha roja) y otro para un cuchilla muy afilada que debe manejarse con mucho cuidado (flecha azul)

• Cuenta con un sistema que permite un avance muy gradual del bloque de modo que al acercarse a la cuchilla, salen los cortes.



• En esta imagen vemos el detalle de la cara frontal del microtomo rotativo. Se puede idenfificar el bloque de parafina con una muestra de tejido incluida en su interior. Se aprecia además la cuchilla y sobre ella, una tira de cortes.

• Conforme sale cada una de las rebanadas o cortes de tejido, una se va quedando pegada a la que sigue y se forma una tira de cortes delgadísimos que se conocen como cortes de parafina.

• El técnico puede tomar con mucho cuidado la tira de cortes de parafina para continuar con el procedimiento.




• El técnico pone con mucho cuidado un fragmento de la tira de cortes de parafina sobre una lámina portaobjeto y le agrega unas gotitas de alcohol, con el fin de que los cortes se estiren.

• Enseguida, los pasa a una tina con agua que tiene un sistema que permite regular la temperatura. Con cuidado pone los cortes sobre la superficie del agua que se encuentra en el baño de flotación, donde se siguen estirando un poco más.




• Para terminar, el técnico selecciona los cortes que tienen mejor aspecto y los captura con una lámina portaobjetos, de modo que quedan adosados a la superficie de la misma.

• Al final, se cuenta con numerosos cortes de parafina ya en las láminas portaobjetos y se ponen en rejillas especiales que permiten manipular hasta cincuenta laminillas.




• Con estos pasos hemos cumplido la meta primaria: obtener cortes tan delgados que sean translúcidos, de modo que ahora podemos estudiarlos con nuestro microscopio.

• Los cortes obtenidos con el microtomo rotativo tienen espesores que varían entre 4 y 8 micrómetros o micras.

• Frecuentemente estaremos mencionando medidas microscópicas por lo que conviene recordar algunas de ellas.




• Ahora sí, estamos listos para observar con nuestro microscopio. Tomamos nuestra laminilla que tiene un corte de parafina con un espesor de sólo 6 micrómetros por lo que la luz facilmente puede atravesarla y nos asomamos a ver cómo se ve.

• ¡Mmmmh! Pues sí se ve algo, pero como que no muy bien ¿no crees?

• ¿Cómo se vería coloreado?

• ¡Mmmmh! Se ve mucho mejor. Tal vez sí debemos colorearlo.




• El problema con el que topamos ahora es que los colorantes son generalmente soluciones acuosas y nuestro corte es de parafina – lo que implica un medio graso – por lo que así no es posible colorearlo.

• Nos estorba ahora la parafina. Debemos eliminarla.

• Para esto necesitamos ahora repetir los pasos que realizamos antes, pero en sentido inverso. Es decir, será necesario quitar la parafina – desparafinar – y sustituirla por xilol – aclaramiento – para finalmente hidratar los cortes – hidratación en alcoholes de grados decrecientes.

• ¡Osh! ¡qué lata!

• Ni modo, manos a la obra.




• Para lograr la tinción de los cortes de parafina por la técnica histológica ordinaria, el técnico tiene una serie de recipientes de vidrio que contienen las soluciones necesarias.

• Las laminillas montadas en una canastilla pueden pasarse manualmente de una a otra solución. Por suerte, en este procedimiento los tiempos son mucho más cortos.

• Ponemos nuestra canastilla en xilol durante unos 15 minutos para que se desparafinen. Algunos técnicos ponen las laminillas en xilol en una estufa de modo que se acelere el proceso. Esto debe hacerse con mucho cuidado ya que el xilol es inflamable.

• Después, las laminillas pasan a dos baños de etanol al 96% seguidos de otros dos en etanol al 100%

• El tiempo entre cada paso es de medio minuto a dos minutos.

• Por lo tanto el tiempo de deshidratación es de 15 + 2 = 17 minutos a 15 + 8 = 23 minutos.




• Una vez hidratados los cortes, pueden pasar a tinción con hematoxilina y eosina en el caso de la técnica histológica ordinaria. Si pasan a otra tinción, entonces se trata de una técnica histológica especial.

• Note Usted que el procedimiento de obtención de cortes de parafina fue el mismo tanto para la técnica histológica ordinaria (hematoxilina y eosina) como para una técnica histológica especial.




• Ahora sí podemos observar muchos detalles histológicos en nuestro corte recién teñido con hematoxilina y eosina.

• Pero, tomando en cuenta que su espesor es de sólo 6 micrómetros, resulta ser muy frágil, por lo que si nos equivocamos y pasamos un dedo por su superficie, podemos dañarlo de manera permanente.

• La idea es que el corte pueda ser estudiado hoy y también dentro de 20 años, por lo que debemos protegerlo.




• Para proteger nuestro corte y lograr una preparación histológica permanente, le vamos a pegar un fragmento laminar de vidrio que llamamos cubreobjetos.

• El problema reside en que nuestro corte está hidratado y el “pegamento” para el cubreobjetos es una resina de naturaleza grasa.

• Por lo que… ¿qué crees? Deberemos de nueva cuenta deshidratar los cortes en alcoholes de grados crecientes, aclararlos en xilol, y finalmente agregar la resina y pegar el cubreobjetos (montaje).



• Con el fin de visualizar desde otra perspectiva los pasos de la técnica histológica, vamos ahora a revisar un esquema que además nos facilitará el recordarlos.

• Vamos a imaginar que sobrevolamos un misterioso país con una geografía muy peculiar. Tenemos dos grandes avenidas que llamamos medio acuoso y medio graso.

• Estas se encuentran separadas por dos ríos peculiares. Uno es maravilloso para algunos caballeros porque ¡es de alcohol! El otro, no es muy amigable porque es de xilol.


MEDIO GRASO

MEDIO ACUOSO

XILOL

ETANOL


• Con más detalle observamos que el río de etanol está separado en canales que implican graduaciones.


MEDIO GRASO

MEDIO ACUOSO

XILOL

100% ETANOL 96%

80%

70%

60%


• La obtención de la muestra y la fijación ocurren en medio acuoso. La primera porque el tejido es rico en agua y la segunda porque la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas.


MEDIO GRASO

MEDIO ACUOSO

XILOL

100% ETANOL 96%

80%

70%

60%

1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

2. FIJACIÓN


• La infiltración, la inclusión y el corte ocurren en medio graso. Por lo que, para llevarlas a cabo, deberemos atravesar los dos ríos, pasando primero por grados crecientes de etanol – deshidratación – y luego por xilol – aclaramiento, como marca la flecha ascendente.


MEDIO GRASO

MEDIO ACUOSO

XILOL

100% ETANOL 96%

80%

70%

60%


2. FIJACIÓN

5. INFILTRACIÓN

6. INCLUSIÓN

7. CORTE

3. DESHIDRATACIÓN EN

ALCOHOLES DE

GRADOS CRECIENTES

4. ACLARAMIENTO



MEDIO GRASO

MEDIO ACUOSO

XILOL

100% ETANOL 96%

80%

70%

60%


2. FIJACIÓN

5. INFILTRACIÓN

6. INCLUSIÓN

7. CORTE


ALCOHOLES DE

GRADOS CRECIENTES

4. ACLARAMIENTO

• Nuestra siguiente meta es la tinción. Pero ésta ocurre en medio acuoso. Por lo que deberemos cruzar de nueva cuenta los dos ríos, pero ahora en sentido inverso. Aclaramiento y la hidratación en etanol en grados decrecientes. Como marca la flecha descendente.

8. TINCIÓN (H Y E)

8. ACLARAMIENTO

9. HIDRATACIÓN EN

ALCOHOLES DE

GRADOS DECRECIENTES



MEDIO GRASO

MEDIO ACUOSO

XILOL

100% ETANOL 96%

80%

70%

60%


2. FIJACIÓN

5. INFILTRACIÓN

6. INCLUSIÓN

7. CORTE


ALCOHOLES DE

GRADOS CRECIENTES

4. ACLARAMIENTO

• Por último, para el montaje que ocurre en medio graso, deberemos de nueva cuenta pasar al medio acuoso. Deshidratación en etanol en grados crecientes y aclaramiento, como marca la segunda flecha ascendente.

10. TINCIÓN (H Y E)

8. ACLARAMIENTO

9. HIDRATACIÓN EN

ALCOHOLES DE

GRADOS DECRECIENTES

11. DESHIDRATACIÓN

EN ALCOHOLES DE

GRADOS CRECIENTES

12. ACLARAMIENTO

13. MONTAJE



MEDIO GRASO

MEDIO ACUOSO

XILOL

100% ETANOL 96%

80%

70%

60%


2. FIJACIÓN

5. INFILTRACIÓN

6. INCLUSIÓN

7. CORTE

3. DESHIDRATACIÓN

4. ACLARAMIENTO

• Le recomendamos repasar los pasos de la técnica histológica relacionados con el esquema, de modo que trate de memorizar un gráfico, más que un texto.

• Note que las tres flechas – ascendente, descendente y ascendente – marcan la secuencia de procedimientos.

10. TINCIÓN (H Y E)

8. ACLARAMIENTO

9. HIDRATACIÓN 11. DESHIDRATACIÓN

12. ACLARAMIENTO

13. MONTAJE


• El resumen mínimo de este procedimiento se constituye por 3 flechas

• La primera flecha ya fue revisada. Incluye los pasos que van desde la obtención de la muestra, fijación, deshidratación, aclaramiento, infiltración e inclusión y corte.

• Nos habíamos quedado en la etapa en que poníamos numerosas laminillas con cortes de parafina en una canastilla.



• En el laboratorio de histología, los técnicos han dispuesto una serie de frascos de vidrio que contienen las soluciones necesarias para llevar a cabo las flechas 2 y 3 del esquema – descendente y ascendente.

• A esta disposición en fila, también se le conoce como “en batería”. Por eso, el técnico llama a este arreglo: batería de tinciones.

• Vamos ahora a identificar las soluciones.




El técnico va pasando la rejilla con

laminillas por las distintas soluciones. El técnico sumerge las laminillas en el

colorante hematoxilina.

Aquí vemos dos rejillas con

numerosos cortes que ya están

teñidos.

El técnico pone resina sobre el corte

para terminar el paso del montaje.


• El resultado final de todo este proceso es una preparación histológica de acuerdo con los principios de la técnica histológica ordinaria.

• Esta laminilla puede ser estudiada con un microscopio fotónico compuesto de iluminación común, como el que tenemos en nuestros laboratorios que equivale al o los que se encuentran en la mayoría de los laboratorios del mundo.

• En su interior se encuentra un corte o rebanada de tejido muy delgada – en el caso de la imagen mostrada, de 5 micrómetros – que puede ser estudiada al momento o muchos años después.



LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA


• Ya hemos mencionado que la técnica histológica ordinaria se define al cumplir tres requisitos esenciales:

A) Fijación en formol al 10%

B) Inclusión en parafina

C) Tinción con hematoxilina y eosina

• La gran mayoría de las muestras obtenidas a partir de nuestros pacientes en los hospitales, se fijan originalmente en formol al 10% y pasan a procesamiento histológico hasta inclusión en parafina y obtención de cortes de 4 a 8 micrómetros; los que finalmente se tiñen con hematoxilina y eosina (H y E).

LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)


• La tinción con hematoxilina y eosina emplea dos colorantes por lo que constituye una técnica bicrómica.

• La hematoxilina es un compuesto que se obtiene a partir de la planta leguminosa Haematoxilum campechianum conocida como palo de Campeche.

• Es nativo de México, particularmente del estado de Yucatán, aunque se encuentra también en Guatemala y Belice.



• La hematoxilina es un producto natural que al oxidarse produce una sustancia de color morado obscuro conocida como hemateína.

• Para aumentar la eficacia de la coloración, la hematoxilina debe combinarse con iones metálicos como hierro o aluminio que funcionan como mordentes, o sea, favorecedores de la tinción.

• En los textos de histotecnología se relata una gran variedad de mezclas de hematoxilina, algunas con hierro y otras con aluminio.

• La más comunmente empleada es la llamada hematoxilina de Harris que incluye aluminio en sus componentes.

• NOTA: Fue en 1880 que Wilhelm Waldeyer introdujo el empleo de la hematoxilina en las tinciones histológicas.

• La hematoxilina de Harris, al igual que la mayoría de las otras mezclas de hematoxilina, se comporta como una sustancia básica.



• La eosina es una sustancia que resulta de la acción del bromo sobre la fluoresceína. El resultado es un polvo rojo que se usa ampliamente como colorante en la industria textil y en las técnicas histológicas.

• Existen al menos dos variantes de eosina, la eosina Y amarilla y la eosina B azul.

• La más empleada en las técnicas histológicas es la eosina Y amarilla. En general la eosina es un compuesto ácido.

• En conclusión, la hematoxilina es morada y básica; mientras que la eosina es rosa a rojo y ácida.

• Estas características son fundamentales para comprender los resultados tintoriales de la técnica de H y E.



• Como recordamos, un tejido está constituido por dos elementos fundamentales: células y sustancias intercelulares.

• Aceptando que la sustancia intercelular más común y fácilmente identificable es la colágena, podríamos plantear un dibujo muy esquemático de un tejido de la siguiente manera.

• En el dibujo podemos identificar una célula más o menos cuadrada con su núcleo redondo en el centro. Junto a la célula tenemos una fibra de colágena representada por una barra rectangular.



• Si bien las proteínas en general pueden comportarse como bases o como ácidos, la mayor parte de ellas cuando son sometidas al procesamiento histológico se comportan como bases.

• Dado que la colágena – sustancia intercelular – es una proteína, se comporta generalmente como base.

• El citoplasma celular contiene grandes cantidades de proteínas, por lo que también se comporta como base.

• El núcleo celular, por otro lado, tiene grandes cantidades de ácidos nucléicos, por lo que su comportamiento general es ácido.


ÁCIDO

BASE


• Debemos recordar que de acuerdo con el Dr. Johannes Nicolaus Brønsted (1879-1947), los ácidos son donadores de protones y las bases o alcális, son aceptores de protones.

• Cuando una molécula dona un protón – comportamiento ácido – pierde una carga positiva, por lo que queda con carga negativa.

• De este modo, un ácido tiene carga negativa y una base, carga positiva.


- -

- -

- ÁCIDO BASE

CARGA NEGATIVA CARGA POSITIVA


• Como sabemos bien: cargas del mismo signo se repelen, mientras que cargas de signos contrarios se atraen.

• De este modo, las estructuras tisulares que tienen comportamiento ácido, como es el caso de los ácidos nucléicos que fundamentalmente se encuentran en el núcleo, mostrarán afinidad o apetencia por sustancias básicas. A esta afinidad se le conoce como basofilia.

• Así, el núcleo celular resulta ser basófilo por lo que “atrae” al colorante básico que es la hematoxilina. Dado que la hematoxilina es morada, entonces los núcleos se verán morados.



• Hemos dicho que las proteínas generalmente se comportan como bases. Por lo tanto tendrán afinidad por las sustancias ácidas, propiedad que conocemos como acidofilia.

• Dado que la eosina es un colorante ácido, entonces todos los componentes tisulares ricos en proteínas como es el caso de la mayor parte de los citoplasmas y el caso de la colágena, serán acidófilos por lo que se teñirán con la eosina que les imparte un tinte rosado.

• De este modo, tenemos el contraste fundamental de la tinción con H y E; los núcleos se ven morados y el citoplasma rosa al igual que la colágena.



• Un caso particular de la tinción con H y E lo constituyen los eritrocitos.

• Los eritrocitos humanos son células que normalmente no tienen núcleo. Su citoplasma tiene grandes cantidades de una proteína muy importante que conocemos como hemoglobina. Es tan notable la cantidad de esta proteína en los eritrocitos que en vez de verse rosa, se ven con tinte rojo escarlata.

• En los cortes histológicos teñidos con H y E se identifican como estructuras redondeadas – sin núcleo – de color rojo brillante y con una zona central más pálida.



• La gran mayoría de los campos microscópicos teñidos con H y E que revisemos, siguen las reglas de tinción aquí señaladas.

• Sin embargo, también es posible encontrarnos células que muestren basofilia en el citoplasma.

• Esto se debe a la presencia de ribosomas. Como ya mencionamos, los ribosomas son organelos constituidos por ARN y proteínas que se encargan de la síntesis de proteínas.

• Por lo tanto, la presencia de basofilia citoplásmica nos representa que esa célula está sintetizando grandes cantidades de proteínas.


CÉLULA SIN BASOFILIA CITOPLÁSMICA CÉLULA CON BASOFILIA CITOPLÁSMICA


• De este modo podemos apreciar que la tinción con H y E no sólo nos da un buen contraste del detalle celular, sino que además nos permite establecer inferencias funcionales.

• Las células con basofilia citoplásmica tienen una mayor actividad de síntesis (anabólica) que las células sin basofilia citoplásmica.

• Ahora sí estamos listos para estudiar algunos campos microscópicos teñidos con H y E.


CÉLULA SIN BASOFILIA CITOPLÁSMICA

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS MODERADA

CÉLULA CON BASOFILIA CITOPLÁSMICA

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS INTENSA


Observe detenidamente la imagen. Note el detalle de los núcleos celulares teñidos de morado con la hematoxilina. Observe el contraste de los núcleos con el citoplasma rosado. Este es un corte de hígado. En el centro de la imagen tenemos a un hepatocito – célula del hígado – que le está haciendo “ojitos”.



Aquí tenemos otra preciosa imagen de hígado teñida con H y E. De nuevo, note el contraste entre los núcleos y los citoplasmas. En el núcleo del centro se identifica claramente un gran nucléolo.



En este corte, de nuevo notamos el contraste entre los núcleos y los citoplasmas. Las zonas más pálidas corresponden a tejido conjuntivo de la dermis. Las zonas más obscuras, corresponden a tejido epitelial de la epidermis.



En este corte de páncreas, usted puede identificar claramente los núcleos. Pero ahora es posible notar que los citoplasmas tienen una zona basófila (presencia de abundantes ribosomas. flechas amarillas) y otra zona acidófila (presencia de abundantes proteínas. Flechas rojas).



En algunas células como estas (células plasmáticas) el citoplasma, además de mostrar basofilia intensa, permite identificar una zona clara perinuclear que corresponde al aparato de Golgi. Por eso a esta imagen clara sobre fondo basófilo, se le conoce como imagen negativa de Golgi.



• La técnica histológica ordinaria tiene muchas ventajas en términos de costo y de identificacion de detalles de estructuras celulares y tisulares.

• Sin embargo, como todo, tiene sus limitantes. Es importante conocerlas entre otras razones, porque en algunos casos tiene relevancia en el estudio de pacientes.

• Las limitantes de la técnica histológica ordinaria se basan esencialmente en la naturaleza del propio proceso.

• El paso de la deshidratación elimina el contenido de agua del tejido y el paso del aclaramiento, elimina en gran medida las grasas neutras.

• También es posible que el procesamiento elimine del tejido grandes cantidades de carbohidratos complejos, entre los que sobresale el moco producido por las glándulas.

• Esto condiciona que en las zonas del citoplasma donde se encuentren estas sustancias – agua, grasa o moco – se identifiquen espacios vacíos, que dado que usamos luz blanca para ver con el microscopio, se ven blancos.



• La traducción práctica de esta circunstancia es que, cuando veamos huecos claros en el citoplasma, es posible que hayan estado ocupados in vivo por grasa, moco o agua.

• En general, el principal reservorio de grasas neutras en los tejidos se constituye por el tejido adiposo.

• Las células del tejido adiposo pueden tener una gran gota de grasa en el citoplasma, tan grande que desplaza a todos los órganos hacia la periferia, dándole a la célula una forma que “mi amigo el histólogo” ha comparado con un anillo de sello.



• Si ponemos juntos muchos adipocitos – células del tejido adiposo – el aspecto general es el de una reja conformada por numerosas estructuras redondeadas con huecos claros, apiladas entre sí.



• Existen variantes sobre el tema de grasa en gotas o inclusiones citoplásmicas.

• En primer lugar debemos mencionar a la llamada grasa parda. En este tipo de tejido adiposo, las células tienen muchas gotitas de lípidos, no sólo una. El aspecto que adquiere el adipocito es el de una célula multivacuolar. De hecho, se conoce también como adipocito multilocular en contraposición con los adipocitos uniloculares que ya vimos.


ADIPOCITO

UNILOCULAR ADIPOCITO

MULTILOCULAR


• El aspecto de célula con numerosos huecos claros en el citoplasma, que se observa en los adipocitos multiloculares de la grasa parda, es compartido por otros tipos celulares. Un ejemplo se encuentra en la corteza suprarrenal, que en su capa media tiene células llamadas espongiocitos con numerosas gotitas de lípido citoplásmico. El tercer ejemplo se encuentra en las células de glándulas de la piel llamadas sebáceas.


ADIPOCITO

MULTILOCULAR ESPONGIOCITO

CÉLULA DE

GLÁNDULA

SEBÁCEA


•


CORTEZA SUPRARRENAL. LA CAPA MEDIA TIENE CÉLULAS

CUYO CITOPLASMA SE APRECIA CLARO Y ESTÁN DISTRIBUIDOS

EN CORDONES. SON LOS ESPONGIOCITOS.

GRASA PARDA. NUMEROSOS ADIPOCITOS MULTILOCULARES

QUE SE ENCUENTRAN ALTERNANDO CON OTROS

UNILOCULARES EN ARREGLOS EN CONGLOMERADOS.


•


GLÁNDULA SEBÁCEA EN PIEL HUMANA. NOTE QUE DESDE BAJOS AUMENTOS, LA

GLÁNDULA SE VE PÁLIDA. A GRANDES AUMENTOS – RECUADRO – SE APRECIA EL

ASPECTO CITOPLÁSMICO CON NUMEROSAS GOTITAS DE LÍPIDO.


• La gran mayoría de las glándulas producen secreciones ricas en carbohidratos complejos que conocemos comunmente como moco.

• El procesamiento histológico elimina en gran medida el moco de los tejidos y el que queda, debido a sus características químicas, no se tiñe intensamente con H y E, por lo que las células que contienen moco en su citoplasma muestran también un citoplasma claro.


• Aquí observamos el aspecto de la célula mucoproductora más famosa: la célula caliciforme. Note que la porción superior del citoplasma se encuentra completamente llena por numerosos gránulos de moco que con H y E se ven claros. Note que el resto del citoplasma se encuentra adelgazado hacia la periferia de modo que el núcleo queda rechazado hacia la porción basal de la célula.


• Con bajos aumentos, el aspecto de las células caliciformes es muy característico. Se observan como “bolas blancas” en estrecha relación con otras células, en el caso de la imagen, de intestino.



Aquí observamos otros ejemplos de células productoras de moco cuyo citoplasma muestra un aspecto claro con la tinción con H y E.


LAS CÉLULAS DEL EPITELIO SUPERFICIAL DEL ESTÓMAGO,

MUESTRAN LA PORCIÓN SUPERIOR CON ABUNDANTE MOCO, DE

MODO QUE SE APRECIA CLARA.

LAS CÉLULAS DE CITOPLASMA MÁS CLARO, CORRESPONDEN A

CÉLULAS MUCOPRODUCTORAS DE UNA GLÁNDULA MUCOSA.


• El glucógeno es un polímero de glucosa de alto peso molecular que se almacena principalmente en el hígado y en el músculo.

• Las células de los epitelios escamosos – planos estratificados con o sin estrato córneo – de mucosas, normalmente almacenan grandes cantidades de glucógeno citoplásmico. Por esta razón suelen mostrar un citoplasma claro, como si estuviera vacío.



• En conclusión, cuando identifiquemos huecos claros en el citoplasma de una célula, las posibilidades son:

A) Agua

B) Carbohidratos

C) Grasa

• Los huecos claros citoplásmicos relacionados con presencia de agua, se observan sólo en condiciones patológicas de lesión celular. Recuerde lo comentado sobre el edema celular.

• Los carbohidratos intracitoplásmicos que se manifiestan como huecos blancos pueden ser de dos tipos fundamentales:

a) Glucógeno

b) Moco

• Los lípidos intracitoplásmicos que forman huecos blancos pueden encontrarse en los adipocitos – uni y multiloculares – y en las glándulas sebáceas de la piel.



• De este modo terminamos la revisión básica de los conceptos relacionados con la técnica histológica ordinaria (THO).

• Es necesario que ahora el alumno repase imágenes de campos microscópicos para que aprenda a identificar una tinción de H y E.

• Debe quedarnos claro que la tinción bicrómica de H y E puede realizarse en cortes obtenidos por congelación. En este caso, desde luego, ya no es técnica histológica ordinaria; se trata de una técnica histológica especial.

• Recuerde que para ser THO se deben cumplir los tres criterios.

• Por último, para resolver las limitantes que nos plantea la THO, existen numerosas técnicas histológicas especiales…

• Pero, esa es otra historia y será contada en otra ocasión.


Departamento de Biología Celular y Tisular

Enrique A. Sampedro Carrillo.

Médico especialista en Anatomía Patológica

Técnicas histológicas

especiales

Técnicas histológicas especiales.

• Debemos recordar que la técnica histológica ordinaria se define por tres características esenciales:

a) Fijación en formol al 10%

b) Inclusión en parafina

c) Tinción con hematoxilina y eosina

• De este modo, las técnicas histológicas especiales quedan definidas como todas aquéllas que no cumplan al 100% con estos requisitos.


• Existen muchas maneras de clasificar a las técnicas histológicas especiales, aquí presentamos un esquema simplificado:

Técnicas histológicas especiales

1. THE de primer orden

a) Tinciones b) Histoquímica c) Impregnaciones metálicas

2. THE de segundo orden

a) Microscopia electrónica b) Inmunológicas c) Biología molecular

Técnicas histológicas especiales. Tinciones

• Podemos dividir a las tinciones en dos grandes grupos:

a) Metacromáticas

b) Ortocromáticas

• La gran mayoría de las tinciones son ortocromáticas (color correcto). Esto significa que el color que imparten es el mismo que el color que tienen.

• Un colorante azul, tiñe de azul a varias estructuras.


• En el caso de las tinciones metacromáticas, ocurre que el colorante tiene un color “x”, por ejemplo, azul y las estructuras coloreadas adquieren un color distinto “y”, por ejemplo rojo.

• Esto se debe a que las moléculas de los colorantes metacromáticos, normalmente se encuentran separadas en solución, pero cuando se juntan o polimerizan, adquieren un color distinto.

Moléculas de colorante

en solución (monómeros)

Moléculas de colorante

polimerizadas en el tejido


• Las estructuras tisulares que son metacromáticas tienen en común en formar polímeros regulares, esto es, con moléculas muy similares entre sí.

• En este grupo se incluye a los mucopolisacáridos conocidos también como glucosaminoglucanos.

• Debido a que la matriz del cartílago es muy rica en glucosaminoglucanos, resulta que el cartílago es metacromático.


• En los tejidos conjuntivos se encuentra un tipo de célula que se caracteriza por poseer numerosos gránulos de secreción en el citoplasma.

• Estos gránulos contienen sustancias reguladoras asociadas con los fenómenos alérgicos.

• Entre estas, se encuentra un tipo especial de glucosaminogucano que se denomina heparina.

• Por esta razón, los gránulos de estas células que se conocen como mastocitos o células cebadas, son metacromáticos.


• En la práctica médica existen condiciones diversas en las que el número normal de células cebadas se encuentra aumentado.

• La mayoría de estas condiciones conocidas globalmente como mastocitosis, se manifiestan con lesiones en la piel, por lo que suele ser necesario el estudio de una biopsia.

• Para identificar a las células cebadas se emplean rutinariamente tinciones metacromáticas como el azul de toluidina.


• En la

Biopsia de piel de paciente con

mastocitosis teñida con HE.

Células cebadas indetificadas

por la metacromasia de sus

gránulos. Azul de toluidina.


• Para fines prácticos, podemos afirmar que todas las demás tinciones se basan en el empleo de colorantes ortocromáticos.

• En general las tinciones especiales están diseñadas de modo que permitan la identificación de estructuras que no se ven claramente con hematoxilina y eosina.

• Dado que la THO ordinaria emplea dos colorantes, se dice que hematoxilina y eosina es una técnica bicrómica.

• Así, una manera de aumentar el detalle, consiste en aumentar el número de colorantes empleados.


• Las tinciones que emplean más de dos colorantes se pueden llamar policrómicas, de las que la combinación más común es con tres colorantes, por lo que tenemos el grupo de los tricrómicos.

• El histólogo cuenta con un extenso arsenal de tinciones tricrómicas; aquí sólo revisaremos de manera superficial los más comunes:

a) Tricrómico de Masson

b) Tricrómico de Gallego


Tricrómico de Masson

• Esta técnica tintorial es una de las más frecuentemente usadas en la práctica médica.

• Se debe a uno de los patólogos más famosos y notables que haya existido: el Dr. Pierre Masson.

Dr. Pierre Masson. 1880-

1959

• El azul de anilina que se emplea en esta técnica, tiñe de manera específica a la colágena.

• De esta manera es posible diferenciarla del músculo.


• Con el tricrómico de Masson, la colágena se aprecia en azul, los citoplasmas epiteliales y musculares en rojo escarlata y los núcleos en negro.

Corte de lengua teñido con Masson. En azul se observa la colágena

y en rojo se identifican epitelio y músculo.


• La identificación más o menos específica de la colágena en la práctica médica tiene relevancia en casos de lesión hepática.

• En algunas ocasiones las células del hígado no sobreviven y mueren. Como resultado, el organismo “intenta llenar el hueco” pero desafortunadamente no lo hace con nuevos hepatocitos, sino con tejido conjuntivo rico en colágena.

• A esta fibrosis del hígado asociada con muerte de hepatocitos se le conoce como cirrosis.


• La cirrosis puede ser el resultado de la lesión hepática debida a numerosos factores entre los que sobresalen: por etanol y por virus.

• Si bien la cirrosis es irreversible, en muchos casos el tratamiento antiviral evita la progresión de estos cambios, por lo que el médico debe tener una idea clara de dicha evolución verificando la cantidad de colágena – extensión de la lesión – en el hígado del paciente.

• En estos casos, el tricrómico de Masson resulta particularmente útil.


• Hígado con intensa fibrosis demostrada con Masson.


Tricrómico de Gallego

• Desarrollada originalmente por don Abelardo Gallego, ilustre histólogo español.

• Los tejidos muestran núcleos en color rojo, la colágena en verde y los citoplasmas, como los del músculo en amarillo.

• El resultado es un predominio de tintes verdes en la imagen.

• La técnica fue posteriormente modificada por el Dr. Alfonso Reyes Mota. Dr. Abelardo Gallego

1879-1930



• La técnica original de Gallego permite diferenciar las fibras elásticas en un color magenta obscuro.

• El Dr. Alfonso Reyes-Mota cambió el mordente con lo que resultó que ahora las fibras elásticas se identifican en color rojo brillante, mucho más fácil de diferenciar de otras estructuras.

Dr. Alfonso Reyes-Mota

1912-1974



• La técnica tricrómica de Gallego modificada por Reyes-Mota, además de los contrastes ya mencionados, permite identificar de manera muy clara a las fibras elásticas en un color rojo brillante.

Pared de la aorta Cartílago elástico


Técnicas de Romanowsky • En 1891, Ernst Malachowsky y Dimitry Leonidovich Romanowsky

desarrollaron técnicas tintoriales con una mezcla de eosina y azul de metileno modificado.

• La mezcla resultante daba un tercer color inesperado de tinte púrpura, con lo que el contraste era tricrómico a pesar de sólo emplear dos colorantes.

• Estas técnicas fueron mejoradas por los doctores James Homer Wrigth y Gustav Giemsa.

Ernst Malachowsky

(1857-1934)

D.L. Romanowsky

(1861-1921)

Dr. J.H. Wright

(1869-1928) Dr. G. Giemsa

(1867-1948)


Técnicas de Romanowsky

• Las técnicas tintoriales de Wright y de Giemsa se emplean de manera rutinaria para el estudio de extendidos o frotis de sangre y de médula ósea.


Técnicas de Romanowsky


Técnica de Papanicolaou • En 1928, en una conferencia médica en Battle Creek, Michigan, el Dr.

Georgios Nicholas Papanikolaou, patólogo de origen griego, presentó a la comunidad científica un trabajo en el que se describía un procedimiento sencillo, reproducible y de bajo costo para la detección del cáncer del cérvix uterino.

• Para variar “la comunidad científica” restó importancia a este trabajo y no fue hasta el año de 1943, tras la publicación junto con el Dr. Herbert Traut, del libro Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear, que se le empezó a dar importancia.

Dr. George Papanicolaou

(1883-1962)


Técnica de Papanicolaou • La técnica de obtención de la muestra por raspado de la superficie de

transición cervical, permite el estudio de las células epiteliales que normalmente se descaman – citología exfoliativa – que después de ser sometidas a un extendido en un portaobjetos, pueden fijarse y teñirse con el colorante de Papanicolaou.

• Con este procedimiento se pueden estudiar las variaciones hormonales del epitelio genital femenino, los microorganismos que le infectan y se pueden identificar tempranamente los cambios precursores de cáncer.


Técnica de Papanicolaou

Técnicas histológicas especiales. Histoquímica

• Las técnicas de histoquímica se dividen en dos grandes grupos:

a) Histoquímica simple

b) Histoquímica enzimática

• El criterio de división es muy simple, en un caso participan enzimas y en el otro no.

• Las técnicas de histoquímica simple se han dividido de acuerdo con los grupos moleculares que hacen evidentes.

• Así, hay técnicas para lípidos, para carbohidratos y para ácidos nucléicos.


Histoquímica simple para carbohidratos.

• Posiblemente la técnica más famosa en este grupo es la que se conoce como P.A.S.

• El término corresponde a las siglas para: periodic acid Schiff.

• El corte de parafina se somete a la acción del ácido peryódico que rompe de manera específica un enlace en las unidades de monosacáridos de un carbohidrato, liberando así grupos aldehídos.

• Posteriormente se agrega el reactivo de Schiff o leucofucsina, que originalmente es cristalino y al contacto con grupos aldehído adquiere un tono magenta.



• La técnica de P.A.S. nos permite identificar carbohidratos, pero no nos dice específicamente de qué carbohidrato se trata.

• En esta técnica se emplea hematoxilina, por lo que los núcleos se tiñen de morado.

• Debido a que normalmente el citoplasma celular posee cierta cantidad de carbohidratos, los citoplasmas observados con P.A.S. muestran un ligero tinte rosado, por lo que no sería difícil que el principiante confunda un corte teñido con H y E con un teñido con P.A.S.

• Para evitar este problema debemos fijarnos en dos cosas: la presencia de estructuras con muchos carbohidratos que se aprecian magenta intenso y el tinte de los eritrocitos, que con P.A.S. se ven pálidos y con H y E se ven rojo brillante.



Corte de intestino delgado teñido con P.A.S. Note las bolitas rojo-magenta que

corresponden a células productoras de moco (carbohidratos complejos) que se

conocen como células caliciformes.



Corte de intestino delgado teñido con P.A.S. Note las células caliciformes y los

núcleos morados que recuerdan el aspecto del H y E. Observe la presencia de

eritrocitos rosados señalados con la flechas amarillas.



Observe detenidamente las diferencias y semejanzas entre el aspecto del corte

superior teñido con H y E y el corte inferior, teñido con P.A.S.



• En la práctica médica, la técnica de PA.S. resulta útil en las siguientes circunstancias:

a) Identificación de células mucoproductoras en neoplasias malignas poco diferenciadas.

b) Identificación de alteraciones en membranas basales. Este detalle puede apreciarse en particular en el caso de las biopsias de riñón.

Carcinoma mucosecretor identificado

por la reacción positiva con P.A.S.

Glomérulo renal que muestra el detalle

de la membrana basal con P.A.S.



• Una variante de la técnica de P.A.S se emplea frecuentemente en la práctica médica con el fin de identificar de manera específica a un tipo particular de carbohidrato: el glucógeno.

• El glucógeno es una macromolécula polimérica cuyo monómero es la glucosa.

• La prueba se conoce como P.A.S. con diastasa y se basa en la capacidad que tiene esta enzima, también conocida como alfa-amilasa, para despolimerizar y por lo tanto deshacer el glucógeno.



• Si en un corte histológico sospechamos que se encuentra un agregado de glucógeno, lo primero que hacemos es un corte con P.A.S que dará reacción positiva dado que se trata de un carbohidrato.

• Enseguida tomamos otro corte del mismo bloque de parafina y antes de someterlo a la técnica de P.A.S., lo dejamos expuesto a la acción de la diastasa.

• Si la estructura problema SÍ ES glucógeno, entonces se disolverá por efecto de la diastasa y por lo tanto, no habrá reacción positiva para P.A.S, dejando un hueco que representa el sitio donde estaba la macromolécula.

• Si por otro lado, NO ES glucógeno, entonces no sufrirá el efecto de la diastasa, por lo que SÍ habrá reacción positiva para P.A.S.



Corte histológico con

estructura P.A.S. positiva

Nuevo corte histológico

del mismo bloque

Aplicación de

diastasa

Realización de la

técnica de P.A.S.

Si la reacción P.A.S.

positiva se mantiene,

entonces NO ES

GLUCÓGENO

Si la reacción P.A.S.

positiva se pierde,

entonces SÍ ES

GLUCÓGENO



• Un detalle curioso de la técnica de P.A.S. con diastasa reside en el hecho de que la identificación del glucógeno es negativa.

• Esta técnica se emplea de manera rutinaria en el estudio de biopsias de hígado.

Biopsia de hígado contrastada

con el método de P.A.S. con

diastasa. Se identifican células

con citoplasma P.A.S. positivo

resistente a la diastasa, por lo

que su contenido NO ES

GLUCÓGENO. Se trata de los

macrófagos del hígado.



• Existe una técnica especial para la demostración directa y positiva del glucógeno, se trata del carmín de Best.

• Desafortunadamente no es una técnica comúnmente empleada en los hospitales.

Demostración de glucógeno en

hígado de rata por medio de la

técnica de carmín de Best. La

imagen de la izquierda es de

una rata que estaba en ayuno y

la de la derecha, de una rata

bien alimentada. El glucógeno

se aprecia como numerosos

puntos rojos en el citoplasma de

los hepatocitos.



• En algunos casos es importante determinar si los carbohidratos que hacemos evidentes con la técnica de P.A.S. corresponden al grupo de las mucinas.

• Es importante recordar que las mucinas son una familia de glucoproteínas, es decir, moléculas formadas por proteína que contienen grandes cantidades de carbohidratos.

• Las mucinas constituyen elementos secretorios de células epiteliales glandulares.

• Una de las técnicas de histoquímica que permite identificar claramente mucinas es la conocida como mucicarmín de Mayer.



Glándula salival teñida con mucicarmín de Mayer. En amarillo se aprecian los

conductos glandulares, las células serosas en color pardo y en rosa, las

mucoproductoras.



• En el caso de que sea importante diferenciar entre mucinas neutras y mucinas ácidas, podemos emplear la técnica de azul alciano en pH ácido.

En este corte teñido con azul

alciano, el moco alcalino de las

células normales del estómago

se aprecia rosa pálido, mientras

que la mucina ácida de las

células caliciformes que

normalmente se encuentran en

el intestino, se aprecia azul.

Este hallazgo permite confirmar

el diagnóstico de esófago de

Barrett.


Histoquímica simple para ácidos nucléicos.

• La técnica de Feulgen permite la identificación específica del ADN.

• El principio histoquímico de esta técnica es el mismo que el descrito en la técnica de P.A.S. con la diferencia de que en vez de emplear ácido peryódico para liberar aldehídos de los carbohidratos, se emplea ácido clorhídrico.

• El HCl libera aldehídos exclusivamente a partir de un azúcar específico que resulta ser la desoxirribosa.

• Dado que la desoxirribosa solamente se encuentra en el ADN, la aplicación posterior del reactivo de Schiff demuestra la presencia de este tipo de ácido nucléico.



• La técnica de Feulgen nos permite apreciar el detalle de los cromosomas en las distintas etapas de la división celular.

• Debe quedar claro que se trata en este caso sólo de un aspecto académico y no diagnóstico, ya que las figuras de mitosis se pueden apreciar con H y E.

Cortes de raíz de lirio contrastados con la técnica de Feulgen. Note el detalle de

los cromosomas en metafase y en anafase.



• En la práctica médica, también es posible identificar de manera específica a los cromosomas con técnica de procesamiento especial.

• Una vez identificados, se pueden ordenar formando lo que conocemos como cariotipo.

Cromosomas humanos obtenidos a partir de linfocitos y extendidos en una

laminilla que se identifican específicamente con la técnica de Feulgen.



• Uno de los criterios de evaluación de la agresividad de las neoplasias es la cantidad de figuras de mitosis apreciables con H y E.

• Se supone que en la medida en que más figuras de mitosis encontremos, el tumor se reproduce más y por lo tanto el pronóstico del paciente es más reservado, por lo que deberemos contemplar la posibilidad de un tratamiento más agresivo.



• Desafortunadamente ocurre en en muchos casos, el tumor muestra un alto nivel de reproducción, pero los cortes histológicos no muestran figuras de mitosis.

• Debemos saber que normalmente, las células, cuando van a iniciar el proceso de división celular, lo primero que hacen es duplicar su ADN.

• Por lo tanto, si pudiéramos saber cuántas células en el tumor tienen el doble de material genético – han pasado la llamada etapa S del ciclo celular – entonces tendríamos una estimación más exacta que el conteo de mitosis, sobre las células que están reproduciéndose.



• De este modo, se obtiene un corte histológico del tumor problema en estudio y se contrasta con la técnica de Feulgen.

• La laminilla se pasa a un sistema de análisis por computadora que tiene la capacidad de medir exactamente la cantidad de ADN por núcleo celular.

• El resultado se expresa en gráficos de fácil interpretación.

• Este sistema conocido como citometría estática permite además obtener un estimado de la ploidía de las células del tumor, de modo que podemos saber exactamente cuántas son diploides, poliploides o en su caso aneuploides.

• La citometría estática tiene aplicaciones fundamentalmente en el estudio de neoplasias malignas.



Equipo de citometría estática con el

microscopio, el sistema de captura de imágenes

y las computadoras encargadas del análisis.

Gráfico de contenido de ADN que nos da un

estimado de la cantidad de células que se

encuentran en las distintas etapas del ciclo

celular

Corte de un tumor teñido con Feulgen que

resulta ser la base de este estudio.


Histoquímica simple para lípidos.

• Estas técnicas ya casi no se usan con fines diagnósticos, debido a que han sido superadas por las técnicas de inmunohistoquímica.

• Cuando queremos estudiar el contenido de grasas de un tejido, es importante recordar que el procesamiento histológico suele eliminar el contenido lipídico del corte, por lo que cuando vemos una sección de tejido adiposo con H y E, observamos huecos donde estaba la grasa.

• ¡¡¡NO SE TRATA DE QUE LA GRASA SE TIÑE DE BLANCO!!!

• Para mantener la grasa en el tejido será necesario obtener cortes por congelación, los que ahora se pueden contrastar con técnicas que colorean específicamente a los lípidos.


Histoquímica simple para lípidos.

Tejido adiposo con técnica

histológica ordinaria. Se ha

perdido la grasa y sólo se

aprecian los huecos claros.

Tejido adiposo en cortes

congelados con técnicas para

grasa.

En negro, la tinción fue con osmio

y en rojo se empleó la tinción de

rojo oleoso.


Histoquímica enzimática.

• Este es otro grupo de técnicas que va siendo cada vez menos utilizado en el diagnóstico médico.

• Las enzimas son catalizadores biológicos, esto es, que pueden acelerar reacciones.

• Como regla, las enzimas actúan de manera específica sobre moléculas que conocemos como sustrato.

• La interacción enzima – sustrato, tiene como resultado la generación de un producto específico.

• Frecuentemente las enzimas rompen a su sustrato dejando como producto los fragmentos del mencionado sustrato.

ENZIMA SUSTRATO PRODUCTOS



• Una vez ocurrida la reacción enzimática se agrega una sustancia que al combinarse con el producto de la reacción adquiere color.

• A esta sustancia se le conoce como cromógeno.

ENZIMA SUSTRATO PRODUCTOS

SIN CONTRASTE POR LO TANTO

INVISIBLES

+ PRODUCTO CROMÓGENO

COMPLEJO

CON COLOR

CLARAMENTE

IDENTIFICABLE



• Con este procedimiento, los histólogos identificaron la presencia de numerosas enzimas en numerosas regiones tisulares.

• Sin embargo, la técnica tiene numerosos inconvenientes prácticos, por lo que fue muy difícil aplicarla en los hospitales con fines diagnósticos.

• En la actualidad tiene aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades primarias del músculo esquelético.

• Dado que la actividad enzimática se pierde en gran medida por el procesamiento rutinario, estas muestras requieren de la realización de cortes congelados.



Biopsia de músculo esquelético en corte por congelación que se procesó con la técnica

de histoquímica enzimática para la detección de la enzima ATPasa. Se pueden

distinguir al menos 3 tipos de fibras: las obscuras, las claras y las intermedias. Las

alteraciones en este patrón normal de distribución enzimática permiten realizar

diagnósticos en patología muscular



• La histoquímica enzimática para ATPasa, permite además la identificación – con fines de investigación y de enseñanza – de otras estructuras importantes como es el caso de las células de Langerhans y los canalículos biliares del hígado.

Células de Langerhans con ATPasa. Canalículos biliares con ATPasa

Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones

Impregnaciones metálicas.

• Los tejidos a estudiar se someten al efecto de sales metálicas, que frecuentemente son de oro y/o de plata.

• Las partículas metálicas quedan adheridas a la superficie de las células y/o estructuras tisulares inertes de la muestra en estudio.

• De modo que impregnación, es algo así como “cubrir por fuera”.

• Las impregnaciones clásicas que fueron las primeras en emplearse requieren de muchos y estrictos cuidados para su elaboración, por lo que no suelen usarse en los hospitales.

• Estas técnicas tienen un importante valor histórico y afectivo, en particular para los mexicanos, ya que se considera que provienen de la escuela cajaliana.


• El más grande histólogo que pueda jamás imaginarse, fue un médico de pueblito llamado Santiago Ramón y Cajal.

• Sus estudios sobre la textura (tejidos) del sistema nervioso le valieron el Premio Nobel de Medicina y Fisiología en el año de 1906.



• En la actualidad, las impregnaciones metálicas clásicas tienen nula aplicación en el diagnóstico médico y escasa en el campo de la investigación científica.

Las impregnaciones metálicas clásicas jugaron un papel determinante en la demostración de la

existencia celular de las neuronas. Aquí vemos una técnica que permite identificar el perfil de las

neuronas piramidales de la corteza cerebral humana. La secuencia: Cajal —- del Río Hortega —-

Costero, resultó fundamental en el desarrollo de la anatomía patológica y la histología mexicanas.




Célula de Purkinje en el cerebelo. Astrocito fibroso con prolongaciones

en contacto con vasos sanguíneos.




Numerosos astrocitos fibrososo asociados

con vasos sanguíneos.

Fibras reticulares en hígado

demostradas con la técnica de doble

impregnación de Pío del Río

Hortega.



• A partir de los conocimientos obtenidos por el desarrollo de las técnicas de impregnación metálica clásicas, los histotecnólogos han llegado a desarrollar técnicas más sencillas y fácilmente aplicables a cortes de parafina, por lo que su utilidad diagnóstica se ha mantenido hasta la fecha.

• A estas técnicas las conocemos como impregnaciones metálicas modernas.

• Una de las más empleadas se basa en los principios de la técnica de P.A.S. ya que se emplea ácido peryódico para liberar grupos aldehídos de moléculas de tipo carbohidrato.

• Esta técnica conocida como plata metenamina, con las variantes de Gomori o de Jones, se usa rutinariamente en el estudio de biopsias renales.



Biopsia renal contrastada con la técnica de metenamina de plata de Gomori. Se

aprecian en negro las lineas que corresponden a las membranas basales, tanto de

túbulos renales como de los glomérulos. Las alteraciones en estos arreglos

normales, permiten realizar diagnósticos en la práctica médica.



La técnica de Wilder, conocida comúnmente como “retículo”, se emplea

rutinariamente en el estudio de las biopsias de hígado con fines diagnósticos.

Permite identificar en cortes de parafina, el arreglo de las fibras reticulares.



• Dos conceptos importantes referidos a las impregnaciones metálicas modernas son:

a) ARGENTAFINIDAD

B) ARGIROFILIA

• Argentafinidad es un propiedad histoquímica por la que algunas sustancias tienen la capacidad de capturar la plata y reducirla de manera espontánea.

• Argirofilia es una propiedad histoquímica por la que algunas sustancias tienen la capacidad de capturar la plata, pero no la reducen espontáneamente. Es necesaria la aplicación de un agente reductor.

• La plata reducida se ve negra.



• En el humano existen varias sustancias argentafines y es necesario recordarlas.

SUSTANCIAS ARGENTAFINES

a) Melanina

b) Aminas biogénicas:

b.1. Serotonina

b.2. Catecolaminas (epinefrina y norepinefrina)

• Las técnicas de impregnación metálica modernas del tipo argentafín permiten la identificación de estas sustancias.

• La técnica argentafín más comúnmente empleada en el diagnóstico médico es la de Fontana-Masson.



• Las sustancias argirófilas, son menos e incluyen a:

SUSTANCIAS ARGIRÓFILAS.

a) Fibras reticulares

b) Neuropéptidos. Con este término nos referimos a una familia amplia de glucoproteínas que se comportan como hormonas y que se encuentran en tejido nervioso y en epitelios neuroendocrinos.

• La técnica argirófila más frecuentemente empleada en la práctica médica es la de Grimelius.



Piel humana contrastada con la técnica

de Fontana-Masson. Se identifican

claramente en negro los gránulos de

melanina en la epidermis.

Intestino delgado contrastado con la

técnica de Fontana-Masson. Se

identifican los gránulos negros de

aminas biogénicas (en este caso

corresponden a serotonina) en la base

de las células neuroendocrinas.



Corte de apéndice cecal humano contrastado con la técnica de Grimelius. Se

aprecia el detalle de los gránulos citoplásmicos negros argirófilos de una

célula neuroendocrina.



Conclusiones:

• Hasta aquí hemos revisado de manera superficial algunas de las técnicas histológicas especiales de primer orden.

• Conviene ahora al educando, revisar el material de nueva cuenta con un poco más de detenimiento.

• Es importante que sepamos de cada una de las técnicas revisadas:

a) Que existen

b) Para qué sirven

c) Cómo se identifican

• Recuerde que la mayoría de las técnicas aquí revisadas se emplean frecuentemente en la práctica médica con fines diagnósticos.


Resumen de las técnicas histológicas especiales de primer orden:

• Tinciones

a) Metacromáticas. Azul de toluidina

b) Ortocromáticas.

b.1. Tricrómicos: Masson, Gallego

b.2. Romanowsky: Wright, Giemsa

b.3. Papanicolaou

• Histoquímica

a) Simple

a.1. Para carbohidratos: P.A.S., P.A.S. con diastasa, carmín de Best, azul alciano

a.2. Para lípidos: Osmio, rojo oleoso

a.3. Para ácidos nucléicos: Feulgen

b) Enzimática

• Impregnaciones metálicas

a) Clásicas

b) Modernas: Metenamina de plata, Wilder, Fontana-Masson, Grimelius

Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas

Técnicas inmunológicas.

• Las técnicas inmunológicas se basan en la especificidad que tienen los anticuerpos para unirse a diversos tipos de moléculas.

• Las sustancias a las que se unen los anticuerpos reciben el nombre genérico de antígenos.

• Podemos hacer antigénica a cualquier sustancia si la pasamos a un animal de otra especie.

• Por ejemplo, si aislamos insulina humana, que en una hormona protéica reguladora de la glucemia, y la inyectamos a un ratón; este animal reconoce como extraña a la insulina humana y produce anticuerpos de ratón anti-insulina humana.



• Ahora aislamos estos anticuerpos y les agregamos una marca para poder identificarlos en un tejido.



• Podemos pegarles una sustancia fluorescente (fluorocromo) o una enzima cuya actividad podemos revelar empleando histoquímica enzimática.



• Cuando empleamos un fluorocromo para marcar el anticuerpo estamos haciendo una técnica de inmunofluorescencia.

• El fluorocromo más comúnmente empleado es el isotiocianato de fluoresceína que brilla en color verde.

Inmunofluorescencia con anticuerpos anti-

actina en un fibroblasto en cultivo. Inmunofluorescencia con anticuerpos anti-

IgG en una biopsia renal.



• La inmunofluorescencia tiene aplicaciones en el diagnóstico médico en casos de glomerulopatías y en algunas lesiones de piel en que participa el sistema inmune.

• Se requiere de un microscopio de fluorescencia y de cortes por congelación.


IgG en piel de paciente con lupus

eritematoso sistémico.


IgA con depósitos en vasos sanguíneos en

paciente con vasculitis.



• Cuando empleamos una enzima para marcar el anticuerpo y revelamos su presencia por medio de una técnica de histoquímica enzimática, estamos haciendo una inmunohistoquímica enzimática.

• La enzima más frecuentemente empleada para marcar anticuerpos tiene el curioso nombre de peroxidasa del rábano fuerte, pero se conoce comúnmente como peroxidasa.

• Se pueden usar al menos dos reveladores para la peroxidasa, el carbazol, que produce un color rojo y la más común que es la diaminobencidina, que produce un color pardo.

• No se requiere de un microscopio de fluorescencia y las laminillas pueden revisarse años después.



Inmunohistoquímica enzimática con

anticuerpos primarios anti-insulina en islotes

pancreáticos.


anticuerpos primarios anti-glucagon en

islotes pancreáticos.




anticuerpos primarios anti-proteína ácida

fibrilar glial, que es un filamento intermedio

que se encuentra en astrocitos fibrosos.


anticuerpos primarios anti-actina específica

de músculo liso en un corte de piel. Se

identifican las paredes de vasos sanguíneos

de la dermis.




anticuerpos primarios anti-proteína ácida

fibrilar glial, que es un filamento intermedio

que se encuentra en astrocitos fibrosos.


anticuerpos primarios anti-CD3 en un corte

de piel. Se identifican los linfocitos T en un

linfoma (neoplasia maligna de linfocitos).




anticuerpos primarios anti-proteína S100 en

piel humana. Se hacen evidentes las células

dendríticas de Langerhans.


anticuerpos primarios anti-proteína S100. A

grandes aumentos, el detalle de la célula de

Langerhans y su relación con los

queratinocitos resulta muy claro.



• En la actualidad las aplicaciones de la inmunohistoquímica enzimática en la práctica médica son muy extensas.

• No sólo nos permite resolver importantes problemas de diagnóstico histológico, pero también sus resultados se pueden traducir en el establecimiento del pronóstico y tratamiento de los pacientes con los que trabajamos.


anticuerpos primarios anti-HER2 en un

cáncer de mama. Las pacientes que

muestran abundante expresión

inmunohistoquímica de esta molécula de

tipo factor de crecimiento, pueden ser

tratadas con anticuerpos monoclonales anti-

HER2, y su pronóstico es mucho mejor que

el de aquéllas que no lo expresan.


Conclusión final.

• Aquí hemos presentado una muy breve revisión de algunas de las técnicas histológicas que tienen relevancia en el diagnóstico, pronostico y tratamiento de nuestros pacientes.

• Faltan muchas otras que muy probablemente se irán revisando a lo largo del curso.

• Es importante que no olvides que todo esto se usa diariamente en la práctica como médico general y especialista, ante pacientes reales.

• Sobre las técnicas histológicas especiales de segundo orden que nos faltaron – microscopía electrónica y biología molecular – haremos posteriormente otra presentación específica.

• GRACIAS.

Introducción al estudio de la Medicina Humana

Microscopía y Técnica Histológica (1)

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