INGENIERIA DE SISTEMASSEMINARIO DE INVESTIGACION

STEVEN BEDOYA- MARIHELENA AYALA

MONOGRAFÍA BIOINFORMÁTICA Y APLICACIÓN EN LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

Marielena Ayala Segura – 160002706Martín Steven Bedoya Rodríguez – 160002703

Msc. Diana Franco Mora

Seminario de investigaciónIngeniería de sistemas

Facultad de ciencias básicas e ingenieríaUniversidad de los llanos

Villavicencio – Meta2014

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Bioinformática

La estructura básica de un ser vivo parte esencialmente de la célula, cuyo sistema biológico se constituye de miles de ella. La composición química de este sistema incluyen en si los elementos químicos (Como el carbono, nitrógeno, sodio…) y las macromoléculas. Estas se encuentran en cuatro grupos reconocidos, los cuales son los ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, y glúcidos¹. Los primeros son de carácter esencial para el estudio del ser vivo. Existen dos tipos básicos: el ADN y el ARN, líderes en tema de estudio de la bioinformática.

La bioinformática surge cuando se logra comprender la secuencia de ADN y la primera proteína.² (Beltrá ,2004) A partir de este punto el ser humano emprende una búsqueda avanzada y profunda acerca del estudio del ser vivo con todos sus componentes. Debido a la gran cantidad de datos originados durante tantos años y la excesiva demanda de la investigación biológica se exige la creación de nuevas herramientas que permiten entender la información contenida y llegar a un punto de conocimiento ³, para tomar las decisiones más adecuadas como por ejemplo conocer el estado actual de una enfermedad.

La bioinformática se define como un campo interdisciplinar que se encuentra en la intersección de la biotecnología y las ciencias de la computación 4 (Voe,2006).Esta abarca disciplinas como estadística, matemática aplicada, ciencias de la computación, inteligencia artificial, química y bioquímica. 5

Se utilizan herramientas y tecnologías altamente sofisticadas para procesar, almacenar, organizar y visualizar la información adquirida en el proceso de investigación, capaces de simular sistemas o mecanismos en tiempo real.

La bioinformática principalmente se da por la necesidad de despejar las distintas incógnitas en las ciencias de la vida, mediante los diferentes sistemas que proporcionan los avances tecnológicos tras pasar los años, está impulsada por el genoma humano y la obligación de mejorar las condiciones y la calidad de vida de los seres vivos, 6 partiendo inicialmente de cómo funciona una célula y su desempeño a nivel molecular.

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La bioinformática da sus primeros pasos gracias a biólogos y bioquímicos quienes se acercan a la tecnología computacional para realizar su trabajo, por lo que es complicado mencionar la historia sin depender de acontecimientos importantes en la biología y la computación.

En la década de los 50 se secuencia la primera proteína por F. Sanger, 7 y se propone una estructura tridimensional del ADN, molécula responsable de transmitir la herencia genética.Se resumen los acontecimientos más importantes en la historia de la bioinformática:

En 1965, Margaret Dayhoff creó la primera base de datos de secuencias biológicas, en la cual almacenó y puso a disposición de la comunidad científica todas las secuencias de ADN y proteínas descritas hasta la fecha.

1953 Watson y Crick los padres del ADN propusieron el modelo de la doble hélice para explicar su estructura.

1973, se anunció y creó la base de datos más antigua que se conoce y la cual sigue vigente, el Protein Data Bank.

En 1978 Margaret Dayhoff fue la encargada de generar la primera matriz de substitución de aminoácidos, denominada PAM, lo que conllevo al estudio de evolución molecular.

Varios grupos de investigación de prestigio, dieron origen a la base de datos más conocida en el mundo, el GenBank34. Dicho proyecto fue financiado por los National Institutes of Health, United States Departament of Energy y el United States Department of Defense.

En 1985 se reportó el algoritmo FASTA o FAST-All de comparación de secuencias, el cual directamente operaba como motor de búsqueda de secuencias similares dentro de la base de datos GenBank.

En 1990, se originó otro de los hitos más importantes de la bioinformática: la implementación del algoritmo BLAST.

En 1993 se inició la era genómica con la ejecución del proyecto de secuenciación de genoma humano

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) & (PCR) en tiempo real

“La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la célula de duplicar el ADN, se trata de una técnica usada para crear un gran número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización, apareamiento con cebadores (primers), y extensión por una ADN polimerasa termoresistente, desarrollado en 1896 por Kary Mullis”. (Ing. Agr. Carlos A. González).

Pero, ¿cómo funciona una PCR?, según el portal web de la compañía farmacéutica Roche, “es un proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un número específico de veces”, en primera instancia, “se debe separar la doble hebra del ADN en dos filamentos, esto se conoce como “desnaturalización”, después se procede a “alinear” los primers, para dar el punto de partida y el final de la secuencia a replicar, finalmente se “extiende” la cadena de ADN utilizando diferentes nucleótidos libres que replican los filamentos de ADN”, éste proceso se realiza en un termociclador, que es un dispositivo, programable que permite realizar ciclos de temperatura indispensables para que el proceso del PCR funcione correctamente, por supuesto, éste proceso puede hacer artesanalmente, sin embargo, el umbral de errores es muy alto.

Con el tiempo, ésta técnica se ha optimizado utilizando hardware y software avanzado, con la finalidad de reducir el porcentaje de error, hoy en día se utiliza un tipo de PCR, llamado PCR en tiempo real o cuantitativo, el cual tiene la ventaja con respecto al PCR convencional de, “rapidez y automatización, detección de más de un producto específico en una misma reacción, cuantificación precisa del ADN, entre otras.”(Msc. Luis Guzmán Masias, 2009), según Guzman las aplicaciones de ésta metodología, serían el diagnóstico clínico de enfermedades, monitoreo y evaluación de terapias, la detección de mutaciones en genoma humano, la medicina forense (identificación de cadáveres a partir de ADN), parentescos, polimorfismo genético, y gran cantidad de usos en la genética.

Entonces, ¿cómo funciona Una PCR cuantitativa o en tiempo real?, el servicio de apoyo a la investigación en la sección de biología molecular de la universidad de Murcia, tiene una explicación detallada del proceso optimizado; La herramienta principal es un termociclador “Avanzado” un ejemplo es, un 7500 Fast Real Time PCR System, inventado por la compañía Applied Biosystems, y un software 7500 System SDS para la recolección y análisis de datos propiedad de la misma compañía, el cual, es un software de pago; El proceso es prácticamente el mismo sin embargo se debe añadir un reactivo químico, TaqMan o SYBR Green, los cuales sirven para aplicar una electroforesis para visualizar el espectro de fluorescencia del producto del PCR a fin de realizar el respectivo análisis de imágenes y determinar los resultados.

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Software y hardware para el método PCR en tiempo real

El software 7500 System SDS controla todo el proceso de ejecución, los ciclos térmicos en el dispositivo, la configuración para el reactivo seleccionado, los análisis y datos recogidos además de permitir enviar los resultados a través de la red y entre dispositivos semejantes.

El dispositivo se entrega con una laptop dell y el software instalado, además incluye el software Primer Express v3.0, el cual es de pago, su precio oscila entre los $100.000.000 de pesos colombianos.

Otro dispositivo es el, Equipo PCR Tiempo Real MX3000P, Agilent technologies ofrece la plataforma Stratagene MX para PCR tiempo real. Se trata de los modelos MX3000P y MX3005P, de 4 y 5 canales respectivamente, la plataforma Mx incluye un cómodo bloque de 96 pocillos para tubos de 0,2 ml con tapa en domo o bien, strips de 8 tubos o placas de 96 pocillos. Los equipos cuentan con una potente lámpara de luz blanca, como fuente de excitación y un sensible fotomutiplicador de 16 bits para la detección de emisión, logrando un rango dinámico de 10 unidades logarítmicas y capacidad de detección de una sola copia de ADN.

Los datos adquiridos por tan sensibles sistemas, son analizados por el software MXPro, que cuenta con funciones de cuantificación absoluta y relativa según reglamento MIQE, pero además, incluye una función de discriminación alélica y SNPs por sondas diagnósticas y una función de lectura fluorométrica para cuantificar DNA o RNA total. El software además cuenta con una función de experimentos múltiples, que le permite asociar distintos ciclos dentro de un solo experimento, el costo del mismo oscila alrededor de los $60.000.000 de pesos colombianos. (Agilent technologies, 2004)

Izquierda Mxp3000P Imagen tomada de http://www.genexpress.cl/equipo-pcr-tiempo-real-mx3000p/, derecha 7500 Fast PCRImagen tomada de http://www.lifetechnologies.com/co/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-instruments/7500-fast-real-time-pcr-system.html

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Freeware para PCR en tiempo real

Debido a la naturaleza del software privativo, es complicado conocer características del software, sin embargo, el centro de investigación de insuficiencia cardiaca de la universidad de Ámsterdam, lanzó una versión freeware del mismo, llamada LinRegPCR, capaz de funcionar con cualquier dispositivo PCR del mercado, además, poseen un buzón de sugerencias donde los usuarios pueden reportar fallos en la plataforma, cada mes, se relanza una versión del software corrigiendo los errores reportados.

Aplicaciones principales de la PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigación científica y como herramienta de diagnóstico, vale la pena resaltar, que “se ha avanzado bastante en el estudio de virus que afectan al hombre y los animales” (Stephen Bustin, 2005) así como en la investigación de bacterias y hongos patogénicos, pues ésta prueba ofrece una gran sensibilidad y especificidad en menor tiempo y a un menor costo.

También es ampliamente utilizada para la identificación de mutaciones o polimorfismos genéticos valiéndose de sondas específicas y sus resultados en el análisis de los cambios de la curva de fusión (Mark Valasek & Repa, 2005), asimismo la PCR en tiempo real se utiliza para acceder a datos relevantes a la biodinámica de los organismos que producen enfermedades (Clementi, 1993).

Sin embargo uno de los campos de mayor aplicación de esta técnica es la investigación de cambios en la expresión genética de células a través de la cuantificación de su ARNm, permitiendo asociar dichos cambios a estados fisiológicos celulares, presencia de fármacos, agentes infecciosos, etc. (Stephen Bustin, 2005).

Una ventaja adicional de esta técnica es que para implementarla es suficiente contar con una cantidad pequeña de muestra. Esto la hace ideal cuando se usa conjuntamente con microcirugía láser para hacer biopsias de tejidos o células específicas y estudiar, por ejemplo, el comportamiento de células cancerosas (Edwards, 2004; Johnson, 2005).

La PCR en tiempo real también se está usando en otros campos como la investigación forense y la bioseguridad. En estos casos las investigaciones se basan en la identificación con una alta sensibilidad y especificidad de organismos patógenos o saprófitos difundidos en el medio ambiente. La caracterización de pequeñas cantidades de material genético procedente de tales organismos hace posible conocer su procedencia e identificar su dinámica (Johnson et al., 2005).

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Otro campo en el que se utiliza la PCR en tiempo real es el de la seguridad alimentaria. Aquí, la identificación de organismos genéticamente modificados (OGM) en alimentos o aditivos alimentarios es una necesidad que se puede cubrir utilizando esta tecnología. Bajo los principios revisados anteriormente también se puede acceder a la cuantificación de OGM, recurriendo a genes de referencia para normalizar la cantidad de ADNc ingresado en los ensayos (Stephen Bustin, 2005).

Conceptos destacados

ADN: Ácido desoxirribonucleico, abreviado como ADN, es un ácido nucleico que contiene instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria.

Polimerasa: Es una enzima capaz de transcribir o replicar ácidos nucleicos.

Primer: Los oligonucleótidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN.

Termociclador: También conocido como máquina de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) o reciclador térmico de PCR es un aparato usado en Biología Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reacción en cadena de la polimerasa de amplificación de ADN.

SYBR Green: Es un agente intercalante que se une al ADN de doble cadena dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR.

__________________________________ _____________________________________Los conceptos fueron extraídos del informe PCR de las estudiantes Adriana Cortazar Martínez y Elsa Patricia Silva del curso MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS EN BIOTECNOLOGÍA del instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México.

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Conclusiones

Existe una técnica llamada secuenciación que es más efectiva que la PCR, es propia de la Ingeniería genética, la cual consiste en la determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN, sin embargo, tiene un altísimo costo, teniendo en cuenta, que el costo de un dispositivo para aplicar el proceso PCR es, relativamente alto.

El método PCR fue inventado por el científico Karry Mullis en 1986, luego en 1991 la compañía Roche adquiere las patentes del método, para así 2 años más tarde desarrollar la PCR en tiempo real (Adriana Cortazar Martínez, 2004) desde entonces es gracias a la tecnología informática que ha sido posible su optimización para llegar a aplicativos con errores casi nulos.

La informática y la biología están dando grandes pasos, a fin de entender el genoma humano, asimismo, mejorar la calidad de vida del ser, la interdisciplinariedad de las mismas, proporciona un conocimiento base para futuras investigaciones y protagoniza logros en telemedicina, oncogenes, patologías, además la grandiosa posibilidad de entender la procedencia humana, su creación y su finalidad.

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Referencias

Fuentes electrónicas

Acerca de la PCR, Hoffmann-La Roche, consultado el 27 de marzo de 2014http://www.roche.es/portal/roche-spain/acerca_de_la_pcr

Bioinformática, consultado el 27 de marzo en http://es.wikipedia.org/wiki/Bioinform%C3%A1tica

Bioinformática consultado el 27 de marzo de 2014 en http://www.ecured.cu/index.php/Bioinform%C3%A1tica

Bioinformática consultado el 28 de marzo de 2014 enhttp://www.unav.es/genetica/bioinfo/concepto.html

Equipo PCR Tiempo Real MX3000P, consultado el 29 de marzo de 2014 enhttp://www.genexpress.cl/equipo-pcr-tiempo-real-mx3000p/

LinRegPCR Heart Failure Research Center, Academic Medical Center, section K2 Meibergdreef 9, PO Box 22660, 1100 DD Amsterdam, The Netherlands, consultado el 29 de marzo de 2014 en http://www.hartfaalcentrum.nl/index.php?main=files&fileName=LinRegPCR.zip&description=LinRegPCR:%20qPCR%20data%20analysis&sub=LinRegPCR

Reaccion en cadena de la polimerasa, Universidad autónoma de México, 2004. Consultado el 27 de marzo de 2014 enhttp://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf

Reacción en cadena de la polimerasa, Servicio de apoyo a la investigación en la sección de biología molecular de la universidad de Murcia, consultado el 27 de marzo de 2014 enhttp://sbmsaiumu.files.wordpress.com/2012/11/pcrrt311012.pdf

Reacción en cadena de la polimerasa, Gabinete de Botánica del CNBA (colegio nacional de buenos aires) Buenos Aires, Argentina, consultado el 27 de marzo de 2014 enhttp://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/Dibulgeneral/PCR/PCR.htm

Reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real, consultado el 28 de marzo de 2014 enhttp://www.monografias.com/trabajos64/pcr-tiempo-real/pcr-tiempo-real2.shtml#ixzz2xUOCeEIg

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Reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real, Msc. Luis Guzmán Masias, 2009. INSTITUTO PERUANO DE BIOLOGÍA MOLECULAR, consultado el 28 de marzo de 2014 enhttp://www.slideshare.net/dianyu/pcr-en-tiempo-real

Ser vivo, consultado el 27 de marzo de 2014 enhttp://es.wikipedia.org/wiki/Ser_vivo#Macromol.C3.A9culas

TECNOLOGÍAS BIOINFORMÁTICAS PARA EL ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE ADN, Consultado el 30 de marzo de 2014 en http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/2455/1/57280285R893.pdf

Termociclador, consultado el 28 de marzo de 2014 enhttp://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=302

Libros

Aplicaciones PCR TR Bustin,S.A. 2005a. Real-Time PCR. In: Encyclopedia of Diagnostic Genomics and Proteomics M.Podda & J.Fuchs, editors. Marcel Dekker.New York, p. 1131-1135.

Aplicaciones PCR TR Johnson,M., Petrauskene,O., Brzoska.P & Melancon.C. 2005. Using Real-Time PCR for Pathogen Detection. Genetic Engineering News 25.

Bioinformática: Simulación, Vida Artificial E Inteligencia Artificial, Lahoz-Beltrá. (2004).

Bioquímica, pp. 200. Lahoz-Beltrá. (2004).