Montaje de Cariograma
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MONTAJE DE CARIOGRAMA BLGA. MARIELA VINCES
ESTUDIO DE CARIOTIPO: Cultivo de linfocitos de sangre periférica Se colecta la muestra de manera
aséptica con la ayuda de una jeringa con un anticoagulante: heparina (3 mL)
Algunas gotas de sangre pueden ser inoculadas en medio de cultivo o pueden ser sedimentadas.
Se siembre el plasma que contienen los leucocitos.
MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: Presenta los compuestos y elementos
necesarios para la sobrevivencia y multiplicación de las células.
Contiene antibióticos: impiden el crecimientos de bacterias
FITOHEMAGLUTININA: AGENTE MITOGÉNICO
PROPIEDADES DE LA FITOHEMAGLUTININA
Tiene como función promover la desdiferenciación de los linfocitos que retornan a la condición blástica, adquiriendo la capacidad de dividirse.
En un tubo falcon previamente esterilizado colocar 4 mL de Medio Mínimo Escencia (MEM) o RPMI – 1640, adicional 1 mL de Suero Fetal Bovino (SFB), 0,35 mL de fitohemaglutinina (PHA) P, y aproximadamente 0,5 mL de sangre heparinizada (12 gotas).
Se incuban las células a 37 oC por aproximadamente 69 horas
La siembra debe hacerse en cámara de aire de fluno laminar para evitar la contaminación.
La recolección de la muestra es el proceso que se obtienen células en metafase, de las cuales se obtendrán cromosomas.
La calidad de las metafases se debe a principalmente de la solución hipotónica que se utilice, lo que garantiza una buena dispersión de los cromosomas dentro de la célula, como el uso de una solución fijadora encargada de remover los restos de organelos y membranas celulares, permitiendo obtener preparaciones limpias y analizables.
La colchicina, un inhibidor del huso mitótico es esencial dentro del proceso que permite manipular las células para llegar al producto final de interes: los cromosomas.
LA RECOLECCIÓN se incia con la adición de 0,1 mL de Colchicina durante los 25 minutos finales de cultivo.
Las células se centrifugan por 10 minutos a 1200 RPM; se descarga el sobrenadante y el botón celular se resuspende con una pipeta Parteur; luego se adicionan 8 mL de solución hipotónica (Cloruro de potasio al 0,075 M), la cual debe estar a 37oC; se vuelve a resuspender con pipeta Pasteur evitando la formación de burbujas, y se incuba por 10 minutos a 37oC.
Adicionar 1 mL de solución fijadora fría (Metano – ácido acético glacial) y centrifugar (10 min a 1200 RPM),
Descargar el sobrenadante, desprender el botón celular por medio de golpes suaves al tubo, adicionar 5 mL de solución fijadora (siempre fría) lentamente por las paredes del tubo; resuspender, tapar e icubar por 20 minutos en la nevera.
Adicionar 5 mL de solución fijadora, resuspender, tapar e incubar por 10 min en nevera. Centrifugar y descartar el sobrenadante
Por cada cultivo deben prepararse de tres a cuatro láminas portaobjetos, las cuales tienen que ser de óptima calidad . Deben sumergirse con anterioridad en un recipiente de etanol puro, por mínimo 24 horas (en congelación) y se limpian energéticamente con una toalla que no deje motas.
Al botón celular se le agrega 5 gotas de fijador, se resuspende y se extiende de 2 a 3 gotas de preparación en láminas portaobjetos previamente desengrasadas a una distancia de 1 mt sobre un plano inclinado a 45°.
Luego se procede a realizar la coloración Giemsa
HIBRIDACIÓN IN SITU CON SONDAS FLUORESCENTES (FISH) Se aplica esta técnica de genética molecular para la preparación
de cromosomas de núcleos en metafase o interfase. El objetivo es dectar reordenamientos cromosómicos pequeños
que no puden ser detectados en microscopia. Durante FISH una sonde de ADN marcada es hibridada in situ con
ADN cromosómico de cadena simple sobre un portaobjetos. La hibridadción sito-específica resulta en una señal visualizada
sobre el cromosoma. En la marcación directa, la marca fluorescente, un nucleótido
modificado (con frecuencia 2´deoxiuridina 5´trifosfato) que contiene un fluoróforo, es incorporado directamente al ADN; la marcación indirecta requiere de una sonda de ADN con un fluoróforo para hacer visible la señal
Tinción sólida
Tinción con Giemsa Bandeo G
Tinción con Mostaza de quinacrina Bandeo Q
Bandeo C tiñe específicamente regiones centroméricas
Bandeo 550 bandas Bandeo 650 bandas
Bandeo de alta resolución
CARIOTIPO Conjunto de cromosomas
característico de una especie determinada.
En cada cromosoma, la cromátida izquierda muestra las bandas que aparecen en la metafase y a la derecha el mayor número de bandas encontradas en la profase tardía.
p: brazo corto q: brazo largo Los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22
tienen satélites que corresponden a los organizadores nucleolares y que no deben confundirse con el llamado ADN satélite de secuencias repetidas.
Los organizadores nucleolares contienen el ADN con los genes de los ARN ribosómicos de 18 S, 28 S y 5,8 S
CARIOGRAMA HUMANO Para la construcción del carigrama
humano, los cromosomas son recortados y depositados de forma ordenada, de acuerdo con la morfología, en orden decreciente de tamaño, a menos que hayan sido sometidos a coloración especial, en ese caso se deberán tomar en cuenta el patrón de bandas
En los laboratorios de citogenética humana, el análisis cromosómico para rutina con fines de diagnóstico se realizan teniendo como base los cromosomas que hayan sido diferenciados en bandas G o alguna otra banda equivalente, que permita la identificación inequívoca de cada para de cromosomas homólogos.
Los 46 cromosomas humanos forman 23 pares 22 pares son autosómicos y un par sexual Los pares de cromosomas autosómicos son
numerados del 1 al 22 de manera decreciente en cuanto a su tamaño
Los cromosomas sexuales son denominados X e Y.
Los pares cromosómicos, incluyendo los sexuales son reunidos en 7 grupos, designadoles las letras del A hasta la G, y clasificándolos por grupos.
Para la distribución de los cromosomas en los diferentes grupos, después de la coloración convencional, se debe obedecer a los siguientes criterios:
GRUPO A Presenta a los 6
cromosomas más grandes El par 1 es metacéntrico El par 2 es
submetacéntrico El par 3 es metacentrico
pero más pequeño que el primero,
GRUPO B Incluye los pares 4 y 5:
submetacéntricos El tamaño de los brazos
cortos equivale a los 1/3 de sus brazos largos.
No existe diferenciación morfológica entre los pares de cromosomas homólogos.
GRUPO C Presenta 15 cromosomas en el hombre 7 16 cromosomas
en la mujer, debido a que el cromosomas X se encuentra incluido en este grupo.
Son metacéntricos y submetacéntricos, siendo difícil su identificación individual.
Los pares 6 y 7 son identificados por ser los de mayor tamaño en el grupo, así como el cromosoma X; su tamaño se encuentra comprendido entre el par 7 y 8.
Los cromosomas del par 9 son identificados en un solo par (raramente ambos) debido a una constricción secundaria intersticial en los brazos largos.
GRUPO D Presenta tres pares de cromosomas acrocéntricos,
de tamaño mediano. Presentan constricción secundaria y satélites en los
brazos cortos (pero no siempre visibles). Los pares 13, 14 y 15 no son morfológicamente
diferenciados entre si
GRUPO E Incluye 3 pares de cromosomas El par 16 es metacéntrico, e identificable
morfológicamente. Los pares 17 y 18 son submetacéntricos; el
par 17 presenta los brazos cortos ligeramente de mayor tamaño a los del par 18.
GRUPO F Presenta dos pares de cromosomas Los pares 19 y 20 Son metacéntricos pequeños Nos diferenciados morfológicamente
entre si
GRUPO G Presenta 4 cromosomas en las mujeres y 5 cromosomas en los
hombres, aquí se encuentra el cromosoma Y Los pares 21, 22 y el cromosoma Y son acrocéntricos, y los
más pequeños. Los cromosomas 21 y 22 presentan constricciones secundarias
y satélites en el brazo corto (no siempre se pueden observar). No existe diferencia morfológica en ambos pares El cromosoma Y se caracteriza por la ausencia de
constricción secundaria y satélite; se reconoce por el tamaño mayor o menor que los autosómicos, y por la posición paralela de los brazos largos
PRÁCTICA CARIOGRAMA OBJETIVOS:
Aprender el protocolo adecuado para el cultivo de linfocitos
Armar un cariograma humano
MATERIALES Fotografía de célula humana en metafase Tijeras Goma
PROCEDIMIENTOS Descartar la hoja que trae la copia fotográfica de
la metafase Contar el número de cromosomas, prestar
atención con la ocurrencia de superposiciones, asociaciones de acrocéntricos, constricciones secundarias, satélites, etc.; que pueden confundir al contar.
Con la identificación preliminar del grupo al cual pertenece, recortar cada cromosoma, manteniendo un pequeño margen alrededor.
Obtener los pares de cada uno de los grupos del A al G
Dejar para el final los cromosomas del grupo C por ser los más numerosos y semenjantes entre sí.
Colocar cara par cromosómico en la tabla anexa.
http://learn.genetics.utah.edu/content/begin/traits/karyotype/
http://learn.genetics.utah.edu/content/disorders/whataregd/klinefelter/