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I D I M

Métodos de diagnóstico. Colección, preservación y análisis de sangre y orina en la evaluación del metabolismo mineral, enfermedades óseas y nefrolitiasis. Ensayos de vitamina D.

ERICH FRADINGER

Maestría 2013

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CalcioCalcio iónicoMagnesioFósforoPTHI25 Vit D1,25 D

Marcadores F y R

CalcioFósforoMagnesioSodio

UricoCitratoOxálicoCistina

Marcadores R

SANGRE ORINA

LITIASIS

3

Calcio H+FósforoMagnesio H+SodioUricoCitrato H+Oxálico H+CistinaMarcadores RClearenceReabs tub fosforo

ORINA 2 HSrelación ca/crReabs tubular fosforoClearence creatMarcadores R

2ª orina espontaneaRelación ca/crMarcadores R

ORINA 24 HS

4

Cl creat 24 hs: cr orina x diu24 x 100c suero x 1440

Reabs tub PO4: 100 - fosf orina x crea suero x 100fosf suero x crea orina

Cl creat 2 hs: cr orina x diu2 x 100cr suero x 120

Cl corregido: cl creat x 1.73 sup corp

I D I M

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I D I M

1) Medición de calcio total e iónico.

2) Suero o plasma con heparina. Nunca EDTA, citrato, oxalato.

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Calcio iónico:

1) Factores que afecten el pH de la muestra (contacto con el aire). Al aumentar protones (dism pH) disminuye el calcio unido a albumina y aumenta el iónico.

2) Anticoagulante inadecuado3) Anticoagulante en exceso (dilución de la

muestra)

I D I M

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I D I M

CALCIO

Efecto de albumina sobre calcio total:

Calcio correg : calcio total + 0.8 ( 4 – alb)

8Buena concordancia, pero VI… ademas de 2 mediciones: ca y alb

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I D I M

FOSFORO Y MAGNESIO:

1) Suero 2) Evitar hemólisis

PTH Y MARCADORES:1) FREEZER2) Evitar hemolisis

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I D I M

MARCADORES. EN AYUNAS Y ALA MAÑANA

TODO EL METAB FOSFOCALCICO EN AYUNAS!

Dosaje de 25D

•Estado Nutricional

•1,25 DI HIDROXI Vit D NO !!!!!!

I D I M

•1,25 DI HIDROXI Vit D NO !!!!!!

ETAPA PREANALITICA

Clinical Chemistry 2005:51

ESTABILIDAD DE 25 D

** DEQAS: SIN CAMBIOS GUARDANDO 2 SEMANAS A 30 º C

ETAPA ANALITICA

DEQAS 2000

12 16 24 27

(ng/ml)

DEQAS 2004

-2SD -1SD ALTM +1SD +2SD

11 16 23 27

(ng/ml)

DEQAS 2011

-2SD -1SD ALTM +1SD +2SD

11 16 23 27

(ng/ml)

Binkley et al, JCEM 2004:89 (7)

Problemas

• Método

• Especificidad

• Sensibilidad

• Estandarización: necesidad de un st. • Estandarización: necesidad de un st.

Internacional y un metodo de referencia

• Experiencia propia con el ensayo

Métodos para 25(OH)D

• DIRECTOS : Competición proteica sin

cromatografía (in-house ó comercial)

• Chapuy MC, Dawson Hughes B, Heaney

RP, Rosen C, Holick MF, etc!!!!

Métodos para 25(OH)D

• Competición proteica con cromatografía

(baja presión)

• HPLC, GC-MS • HPLC, GC-MS

• RIA

• ELISA

• AUTOMATICOS

JCEM, 2005:90 (6)

Método automatico

Media = 30.4 ng ; 25% = 22 ng 75% = 37 ng

JCEM, 2005:90 (6)

Método automatico

JCEM 2005: 90 (11)

autor ref. publicado

ng/ml

método

Chapuy NEJM 1992 42 DIRECTO

D.Hughes NEJM 1989 38 DIRECTO

D.Hughes NEJM 1997 44 DIRECTO

Holick AJM 2002 35 DIRECTO

Vieth R JCEM 2003 24 RIA

autor ref. publicado

ng/ml

“corregido”

ng/ml

método

Chapuy NEJM 1992 42 29 DIRECTO

D.Hughes NEJM 1989 38 26 DIRECTO

D.Hughes NEJM 1997 44 31 DIRECTO

Holick AJM 2002 35 25 DIRECTO

Vieth R JCEM 2003 24 24 RIA

Según Lips, et al. Ost Int 1999

ESPECIFICIDAD

25(OH) D3/ 25(OH)D2

• Vit.D3 25(OH)D3 1,25D3

COLECALIFEROL

• Vit.D2 25(OH)D2 1,25D2

ERGOCALCIFEROL

Hollis B. Clin Chem 2000:46

Sin medicación Con D2

Steroid Biochem 2007

INFORMAR VALORES DE 25D2?

ESPECIFICIDAD

24,25(OH)2D24,25(OH)2D

“ Are assays that miss target values by 200-500% meaningful?

GUESSING, would be more accurate and additionally could provide

Clinical Chemistry, 2003:49:8:1250-1

cheaper and faster test results for females-without even having to

draw the patient’s blood”.

40

Métodos para 25(OH)D

• AUTOMATICOS

• ROCHE Electroquimioluminiscencia• ROCHE Electroquimioluminiscencia

• SIEMENS Quimioluminiscencia

• ABBOTT Quimioluminiscencia

• LIAISON Quimioluminiscencia

5 20

ESPECIFICIDAD

C3 EPI 25DC3 EPI 25D

JCEM 2006

CONCLUSIONES

• Necesidad de un St. de Referencia Internacional.

• Necesidad de definir un Método de Referencia.

• Control del método con CCI y CCE

I D I M

I D I M

METODOS 1,25D

• Ria (cromatografia)

• Sin Standard Internacional de Referencia.• Sin Standard Internacional de Referencia.

• Sin Método de Referencia.

Métodos para 25(OH)D

• RIA

• HPLC

• ELISA

• LC-MS del NIST y Univ de GHENT: METODO DE

REFERENCIA!

• AUTOMATICOS

• DIASORIN Quimioluminiscencia (2004)

• SIEMENS Quimioluminiscencia

• ABBOTT Quimioluminiscencia

• ROCHE Electroquimioluminiscencia

Listado de trabajos con los nuevos ensayos 2012

• Heijboer et al. Clin Chem 58:3

• Ong et al Clin Chim Acta 413

• Barake et al, JCEM 97(3).

• Tahsin et al, Clin Nutr

• Won Moon et al Clinical Biochem 45.• Won Moon et al Clinical Biochem 45.

• Farrell et al Clin Chem 58:3

• Van den Ouweland JM et al, J Chrom 878

• Chen Y et al, Clin Biochem

• Emmen JM et al, Clin Chem Lab Med

• Jenssen M et al, Steroids

• 1) Gran variabilidad entre ensayos

• 2) Gran variabilidad con respecto a LC/MS

• 3) Gran variabilidad en respuesta a standard

internacional SRM 972 (1): en general, bias positivo

para Roche y bias negativo para Centauro, Architect

Liaison.

• 4) Linealidad.• 4) Linealidad.

• El corte debería ser ensayo-especifico.

• Seguimiento en el mismo laboratorio

• Urgencia en la estandarización.

Janssen M, et al, Steroids 2012

25 OH VITAMIN D TESTING BY THREE METHODS: DO THEY IDENTIFY THE SAME LEVEL OF DEFICIENCY? Sequera Ana M, Ruibal GR, Núñez Chavarría E, Farelo H, Odriozola A, Fossati P, Pelletier D, Esteban P, Corti S, Aguet M, Aguirre M, Aseguinolaza M, Benítez G, Coniglio S, Fradinger E, Fiorenzano R, Fontanazza A, González ME, Gutiérrez N, Justo C, Lescurat M, Miro M, Montero S, Molinas H, Paredes C, Pittau A, Reverendo A, Tarifa C, Barcudi S, Canteli A, Calderón C, Di Pietro G, Galassi A, García V, Gimenez J, Guerrero L, Kogovsek N, Muñoz M, Niro M, Ramos G, Rocca M, Rossi N, Fenili C, Gurfinkiel M, Kozak A. II Course of Specialization in Endocrine Biochemistry, Argentine Society for Endocrinology and II Course of Specialization in Endocrine Biochemistry, Argentine Society for Endocrinology and Metabolism, Buenos Aires, Argentina.

RIA ADVIA ROCHE

NORTE 20.9% 45.5% 16.7%

CENTRO 35.2% 33.3% 37.9%

SUR 51.4% 67% 42.2%

< 20 ng/ml

15

20

25

30%

Distribución de pacientes con 25D

menor a 10 ng/ml

ADVIA MODULAR LIAISON RIA

% 26 11 14 12

0

5

10

Lab. Medicina, Lab. Stamboulian, IDIM. Calilab 2012

Problemas

• Molécula extremadamente hidrofóbica.

• Unión muy importante a DBP

• Dos moléculas en circulación (en tto con D2)• Dos moléculas en circulación (en tto con D2)

• Dudas con la disociación de la 25D de su proteína

ligadora para ser ensayada

• Dependencia entre-ensayo de la cc de DBP del

paciente.

Problemas

• Especificidad:

• 24,25 (OH)2: 25D < 60 ng/ml: 3.5 ng/ml

• 25D > 60 ng/ml: 12 ng/ml

• C3- epi 25D (los IE no los reconocen, salvo Roche)

• Isobaros como el 7 α C4 (¿?)

ENSAYO EMPRESA % 25D3 %25D2 %24,25 % C3-EPI

RIA DIASORIN 100 100 100 -

LIAISON DIASORIN 100 100 - 1.3

CENTAURO SIEMENS 97.4 106 - 1.0

COBAS/

MODULAR

ROCHE 98 81 121 93

MODULAR

ARCHITECT ABBOTT 105 82 112 2.7

RIA ct DIASOURCE 100 100 95 -

ELISA DIASOURCE 100 83 100 0.2

ELISA INMUNODI

AGNOSTIK

100 23.4 - -

CONTROL EXTERNO DEQAS 2012 n 1000

-2SD -1SD ALTM +1SD +2SD

13 23

(ng/ml)

Las buenas noticias

• Procesos de mejora contínua

Re-standarización de curvas

Las muestras del DEQAS van a estar medidas

por el metodo de referencia del NIST!!

I D I M

SRM 972a

I D I M

Reparten 50 sueros con valores certificados por método de referencia

(calibrado con SRM 2972 y validado con SRM 972)

Trazar el método a LC/MS y a SRM

I D I M

CONCLUSIONES

• Necesidad de un St. de Referencia Internacional.

• Necesidad de definir un Método de Referencia.

• Control del método con CCI y CCE