PARTE II REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDTAR DE PROTEÍNA.
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Ya hemos visto cómo podemos averiguar la fórmula empírica y molecular de un
compuesto. En este tema conoceremos varias técnicas analíticas que combinadas nos
podrán ayudar a identificar la fórmula estructural de las sustancias.
Antes de adentrarnos en el estudio de estas técnicas vamos a ver cómo se puede calcular
de un modo sencillo el número de insaturaciones que tiene una molécula. Esto se
denomina:
CALCULO DEL INDICE DE DEFICIENCIA DE HIDRÓGENOS IDH.
En química orgánica, el índice de deficiencia de hidrógeno (IDH) es utilizado para
ayudar a dibujar estructuras químicas. La fórmula permite determinar cuántos anillos,
enlaces dobles y enlaces triples están presentes en el compuesto a ser dibujado.
No conseguimos saber el número de anillos, doble y triples enlaces por separado sino el
conjunto de insaturaciones, después es necesario aplicar algunas técnicas
espectroscópicas para poder saber la estructura de la molécula.
La fórmula para el grado de insaturación es
IDH= (0,5) (2C +2-H-X+N)
donde C = número de átomos de carbono, H = número de átomos de hidrógeno, X =
número de átomos de halógenos, y N = número de átomos de nitrógeno. El oxígeno y
otros átomos divalentes no contribuyen al grado de insaturación.
Cada ciclo cuenta como un grado de insaturación.
Cada enlace doble cuenta como un grado de insaturación.
Cada enlace triple cuenta como dos grados de insaturación.
Cada benceno cuenta como cuatro grados de insaturación.
Ejemplos:
C17 H21 NO4 IDH 8
C27 H46 O IDH 5
C6 H7 N IDH 4
C15 H10 Cl N3 O3 IDH 12
TECNICAS ANALÍTICAS
Son procedimientos destinados a la determinación estructural, análisis de la
composición de sustancias, y determinación de purezas.
Podemos establecer dos categorías de técnicas:
Espectrometría de masas.
Métodos ópticos espectroscópicos, así se denominan genéricamente a un
amplísimo número de métodos instrumentales que utilizan técnicas
instrumentales en las que se genera una señal de tipo óptico cuyo fundamento
está basado en la interacción de la radiación electromagnética con la materia a
analizar llamada el analito.
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Cristalografía de Rayos X
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Un flujo de electrones hace que las moléculas gaseosas se ionicen y se fragmenten. La
mezcla de iones es acelerada y pasa a través de un campo magnético, donde las
trayectorias de los iones más ligeros se desvían más que las trayectorias de los iones
más pesados. Variando el campo magnético, el espectrómetro permite registrar la
abundancia de iones de cada masa.
El radio de curvatura exacto de la trayectoria de un ión depende de la relación masa-
carga, simbolizada por m/z. En esta expresión, m es la masa del ión (en uma: unidades
de masa atómica) y z es su carga. La mayoría de los iones tiene una carga de +1, por lo
que su desviación tendrá un radio de curvatura que dependerá sólo de la masa.
En el espectro, al pico más alto se le denomina pico base y se le asigna una abundancia
del 100%. La abundancia de los demás picos se da como porcentaje con relación al pico
base. El ión molecular (M+) corresponde a la masa de la primera molécula.
Cuando se evapora una molécula se pueden formar iones M+ , que darán el valor de su
masa molecular, pero también se pueden fragmentar en iones más pequeños. Viendo la
diferencia de masa de los picos de los diferentes fragmentos pueden ser identificados.
Por ejemplo, en el caso de C2H5COOH podemos encontrar los siguientes fragmentos:
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C2H5COOH+ , a 74 es M+
C2H5CO+ , a 57 es M-OH
COOH+ a 45 es M- C2H5
C2H5+ a 29 es M – COOH
Hay que ser cuidadoso en el análisis porque no todos los fragmentos se forman.
Algunos no duran suficientemente para ser analizados porque son muy inestables y
otros no esperados se pueden formar.
Espectro del 2,4-dimetilpentano.
Efecto isotópico del cloro Los espectros de masas del 2-cloropropano. Los elementos más pesados no están
formados por un solo isótopo, sino que contienen isótopos más pesados en cantidades
variables. Los isótopos más pesados dan lugar a picos pequeños a números de masa
superiores a los del pico del ión molecular M+.
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La altura de los picos M+, M + 1 y M + 2 dependerá de la composición isotópica del
elemento en cuestión. El cloro es una mezcla del 35Cl con un 75,5 por ciento y del 37Cl
con un 24,5 por ciento. El pico del ión molecular M+ tiene 35Cl siendo tres veces más
elevado que el pico M + 2, el cual tiene 37Cl.
Efecto isotópico del bromo.
Observe que los picos M+ y M + 2 tienen aproximadamente la mima altura.
El bromo es una mezcla del 79Br con un 50,5 por ciento y del 81Br con un 49,5 por
ciento . El pico del ión molecular M+ tiene 79Br siendo tan alto como el pico M + 2, el
cual tiene 81Br.
Espectro de masas del 2-metilpentano
El pico base corresponde a la pérdida de un radical propilo para dar lugar a un catión
isopropilo.
La fragmentación de un alcano ramificado se produce frecuentemente en la rama del
átomo de carbono que da lugar al catión y al radical más sustituidos
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PRINCIPIOS DE ESPECTROSCOPÍA
Al interaccionar la radiación electromagnética con la muestra que contiene el analito, se
pueden originar distintos fenómenos, de entre los cuales la absorción y emisión de
radiación, son los más relevantes y dan lugar a los métodos espectrofotométricos de
absorción y (o) emisión.
El espectrómetro analiza la energía transmitida relativa a la incidente. Como los niveles
de energía están cuantizados solo la radiación con una frecuencia correspondiente a la
diferencia en los niveles de energía será absorbida.
La relación entre energía y frecuencia es dada por: E = h f
Siendo h la constante de Planck, 6,626 x 10 -34
Js
Cuanto mayor sea la diferencia de energía de los niveles mayor será la frecuencia, y
menor la longitud de onda de la luz absorbida, puesto que la longitud de onda y la
frecuencia se relacionan por la fórmula c= h.f siendo c la velocidad de la luz.
La inversa de la longitud de onda se llama número de onda y se mide en cm-1
.
Algunas de las técnicas espectroscópicas son:
Espectroscopía de infrarrojo:
Espectroscopía de resonancia magnética nuclear de hidrógeno: Determinación
estructural de moléculas orgánicas, escaneo del cuerpo humano.
ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO
Los enlaces covalentes vibran a una frecuencia determinada que depende de la
naturaleza del enlace y del tipo de vibración La energía de estas vibraciones
corresponden a la región infrarroja del espectro electromagnético. Como primera aproximación, un espectro IR se obtiene al pasar radiación a través de una
muestra y determinar que fracción de esta radiación incidente ha sido absorbida. La energía
particular a la que aparece cada pico en un espectro guarda relación con la frecuencia de
vibración de una parte (enlace) de la molécula.
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Cuando la frecuencia de la radiación es igual que la de la vibración la molécula lo
absorbe.
Las vibraciones moleculares dependen de las masas de los átomos. Los átomos pesados
vibran lentamente, por lo que tendrán una frecuencia más baja que los átomos más
ligeros. La frecuencia de una vibración disminuye al aumentar la masa atómica. La
frecuencia también aumenta con la energía de enlace, por lo que un doble enlace C=C
tendrá una frecuencia más elevada que un enlace sencillo C-C
Para que una molécula covalente absorba radiación infrarroja, tiene que haber un
cambio en el momento dipolar de la molécula a la vez que se produce la vibración. De
este modo las moléculas gaseosas diatómica formadas por átomos del mismo elemento
como H2, O2, Cl2 son no polares y no absorben radiación infrarroja.
Para moléculas más complejas solo aquellas vibraciones que provocan un cambio en el
momento dipolar serán activas ante la radiación infrarroja.
Una molécula no lineal con n átomos tiene 3n - 6 modos de vibración fundamental. El
agua tiene 3(3) - 6 = 3 modos. Dos modos son de tensión y uno de flexión.
La tensión puede ser simétrica cuando los dos enlaces O-H se alargan al mismo tiempo.
En una tensión asimétrica un enlace O-H se alarga, mientras que el otro enlace O-H se
comprime. La flexión, también conocida como movimiento en tijereta, se produce
cuando el ángulo H-O-H disminuye y aumenta pareciendo unas tijeras.
Por ejemplo la tensión simétrica del CO2 será inactivo mientras que la tensión
asimétrica y la flexión son ambas activas porque producen cambio en el dipolo.
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Puesto que los átomos involucrados en la tensión y flexión determinarán la frecuencia,
IR se utiliza en su mayor parte para identificar la presencia de grupos funcionales en
una molécula.
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Un alcano mostrará frecuencias de tensión y flexión solamente para C-H y C-C. La
tensión C-H es una banda ancha entre 2800 y 3000 cm-1, una banda presente en
prácticamente todos los compuestos orgánicos. En este ejemplo, la importancia recae en
lo que no se ve, es decir, la ausencia de bandas indica la presencia de ningún otro grupo
funcional.
Comparación del espectro de IR de n-hexano y 1-hexeno y cis-2octeno. Las
absorciones más importantes del espectro del 1-hexeno son la tensión C=C a 1642 cm-1
y la tensión =C-H a 3080 cm-1. El doble enlace, casi simétricamente sustituido del cis-
2-octeno, da lugar a una absorción C=C débil a 1660 cm-1; sin embargo, la tensión de
enlace =C-H a 3023 cm-1 es clara.
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El espectro de IR del 1-octino muestra absorciones características a 3313 cm-1 y 2119
cm-1
El espectro de IR del 1-butanol muestra una absorción de tensión O-H ancha e intensa
centrada alrededor de 3300 cm-1. La forma ancha se debe a la naturaleza diversa de las
interacciones de los enlaces de hidrógeno de las moléculas de alcohol.
El alcohol O-H absorbe alrededor de 3300 cm-1 y normalmente tiene una banda ancha y
fuerte. Esta banda se debe a los distintos reordenamientos del enlace de hidrógeno que
tienen lugar. Existe una banda de tensión C-O centrada próxima a 1050 cm-1. Aunque
una banda de tensión alrededor de esta región se puede deber a las mismas tensiones C-
O, la ausencia de esta banda alrededor de 1000 - 1200 cm-1 sugiere encarecidamente la
ausencia de un enlace C-O.
El espectro de IR de la dipropilamina muestra una banda ancha, correspondiente a una
absorción de tensión N-H, centrada alrededor de 3300 cm-1. Observe el pico agudo de
esta banda ancha de absorción.
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Los enlaces de hidrógeno que se forman entre el nitrógeno y el hidrógeno son más
débiles que aquellos que se forman con el oxígeno y el hidrógeno. Las aminas, como los
alcoholes, tendrán una banda ancha centrada alrededor de 3300 cm-1, pero no tan fuerte.
Podrían existir picos agudos superpuestos en la zona de absorción de tensión
dependiendo del número de hidrógenos que el nitrógeno tenga; una amina secundaria
tendrá un pico agudo, mientras que una amina primaria tendrá dos picos agudos. Las
aminas terciarias no mostrarán picos agudos porque no hay un enlace N-H.
Las vibraciones de tensión C=O de las cetonas, aldehídos y ácidos carboxílicos
sencillos se producen a frecuencias de aproximadamente 1710 cm-1. Estas frecuencias
son más altas que las de los dobles enlaces C=C, debido a que el doble enlace C=O es
más fuerte y más rígido.
La tensión C=O es fuerte e inconfundible. Dependiendo de qué más esté unido al
carbonilo, existen otras bandas que se pueden buscar para diferenciar entre aldehídos,
cetonas y ácidos.
(a) 2-heptanona y (b) butanal. Las dos presentan absorciones, debidas al grupo
carbonilo, intensas en torno a 1710 cm-1
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El espectro de la 2-heptanona muestra una absorción fuerte a 1718 cm-1. El aldehído
tiene la tensión C=O a 1720 cm-1, pero también tiene dos bandas de tensión distintas
para el enlace C-H del aldehído a 2720 y 2820 cm-
Los ácidos carboxílicos presentan una absorción O-H ancha entre 2500 y 3500 cm-1.
Esta absorción ancha ocupa por completo la región de tensión C-H, con más amplitud.
La tensión del doble enlace C=O será aguda e intensa a 1711 cm-1. Los dos picos tienen
que estar presentes para identificar al compuesto como un ácido carboxílico
Un espectrofotómetro infrarrojo mide la frecuencia de la luz infrarroja que son
absorbidas por un compuesto
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Aplicaciones de la espectroscopia de infrarrojo.
Es muy útil en el análisis de compuestos orgánicos porque los diferentes enlaces en los
grupos funcionales absorben a diferentes frecuencias. También el pico de absorción
preciso depende de los átomos vecinos.
Es útil en la determinación de estructura de moléculas orgánicas, información de la
fortaleza de enlace, información sobre la estructura secundaria de proteínas, medida del
grado de instauración de aceites y grasas y determinación del nivel de alcohol en la
respiración.
ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE
HIDRÓGENO.
La Resonancia Magnética Nuclear es una espectroscopia cuyo fundamento es la absorción de
energía (radiofrecuencias) por un núcleo magnéticamente activo, que está orientado en el seno
de un campo magnético, y que por efecto de esa energía cambia su orientación. Las partes
fundamentales de un espectrómetro de RMN son un imán, actualmente una bobina
superconductora, que suministra el campo magnético principal, un oscilador de radiofrecuencias
que suministra la energía necesaria para cambiar la orientación de los núcleos, una bobina
detectora que recibe las señales y un sistema informatizado que gobierna todo el aparato y que
incluye un sistema de amplificación y registro.
Entre los núcleos más frecuentes en los compuestos orgánicos son magnéticamente activos el
protón (1H), carbono (
13C), nitrógeno (
15N), fósforo (
31P) y flúor (
19F).
Los espectros más comunes son representaciones de la intensidad de absorción frente a la
frecuencia de resonancia (generalmente a través del parámetro δ) y presentan señales cuya
posición, forma y tamaño están íntimamente relacionadas con la estructura molecular.
Los protones en distintos entornos químicos están apantallados en distintas cantidades.
El protón hidroxilo no está tan apantallado como los protones metilo, por lo que el
protón hidroxilo absorbe a un campo más bajo que los protones metilo. Decimos que el
protón está algo desapantallado por la presencia de átomos de oxígeno electronegativos.
Cuando los protones se encuentran en distintos entornos de la molécula y la molécula
está expuesta a una frecuencia constante, los protones absorberán la radiación a distintas
intensidades del campo magnético. La RMN variará el campo magnético y representará
un gráfico de la absorción de energía como función de la intensidad del campo
magnético.
Los protones de metilo más apantallados aparecen hacia la derecha del espectro (campo
más alto); el protón hidroxilo menos apantallado aparece hacia la izquierda (campo más
bajo).
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En un espectro RMN el campo magnético aumenta desde la izquierda hacia la derecha.
Las señales del lado de la derecha están en la parte más alta del espectro y las de la
izquierda están en la parte más baja. Los protones apantallados aparecen en la parte alta.
Utilización de la escala δ ,el desplazamiento del TMS se define como 0. Como muestra
de referencia se usa el tetrametilsilano porque sus 12 protones tienen el mismo entorno
así que dan un solo pico muy marcado, no es tóxico y es poco reactivo. Absorbe a una
longitud de de onda separada y muy característica, además es volátil y puede ser
separado de la muestra fácilmente.
La escala aumenta de derecha a izquierda (hacia el campo más bajo). Cada unidad δ se
diferencia 1 ppm del TMS
El desplazamiento químico de los protones se mide en partes por millón (ppm),
independientemente del campo y la frecuencia del instrumento utilizado. Cuanto más
altas son las frecuencias des espectrómetro, más detallado es el espectro
Los protones metilo absorben a δ = 3.4 ppm y los protones hidroxilo absorben a δ = 4.8
ppm.
Los tres protones metilo son equivalentes, por lo que producirán sólo una señal.
Valores de algunos desplazamientos químicos .
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Aunque en ocasiones el desplazamiento al cuál aparece un pico puede pertenecer a
diferentes tipos de hidrógenos, sin embargo el área debajo de cada pico corresponde al
número de átomos de hidrógeno de un determinado tipo (con un determinado entorno),
y esto puede ser extremadamente útil en la determinación de la estructura de una
molécula.
El área de cada pico suele venir dada por la altura en la traza de la integral (integration
trace).
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Espectro del dimetiletileter
Cuando recorre un pico, el trazo del integrador (azul) se eleva una altura que es
proporcional al área del pico.
En el dimetilietiléter hay tres hidrógenos de metilo y nueve hidrógenos del grupo ter-
butil. La integración habrá hecho un trazo para los hidrógenos ter-butil que es tres veces
mayor que el trazo de los hidrógenos de metilo. El área relativa para los metilos y el ter-
butil es 1:3.
Espectro de RMN de protón para un compuesto de fórmula C6H12O2.
El alto valor de H-RMN como herramienta analítica se basa en los espectros de alta
resolución en los cuales se pueden ver desdoblamientos.
Estos desdoblamientos se deben al acoplamiento de los espines.
Si hay un protón en un carbono adyacente al grupo metilo, ese protón podrá alinearse a
favor del campo magnético o en contra. El efecto será que los protones del grupo metilo
estarán sometidos a un campo magnético ligeramente superior o ligeramente inferior de
resultando un desdoblamiento del pico, esto se conoce como doblete.
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Si hay un grupo CH2 adyacente al grupo metilo, entonces hay tres posibles estados
energéticos:
Los dos protones paralelos al campo magnético
Uno a favor y otro en contra
Los dos en contra
Esto da lugar a un triplete cuyos picos están en la proporción 1:2:1
Es posible predecir el desdoblamiento conociendo el número de protones adyacentes. El
número de líneas es siempre uno más que el número de protones adyacentes.
Uno de los desdoblamientos típicos es un cuarteto seguido de un triplete por la
presencia del grupo etilo.
-CH2- tiene tres protones adyacentes y se desdoblan en un cuarteto
No tiene protones adyacentes así que no hay desdoblamiento
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CH3, al lado del CH2 se desdobla en un triplete
El espectro RMN del 1,1-dicloroetano presenta dos señales:
δ = 5,9 ppm ; integración = 1 corresponde a -CHCl2
δ = 2,1 ppm ; integración = 3 corresponde a -CH3
El desdoblamiento de las señales se produce por el efecto del campo magnético vecino
sobre el aplicado externamente, provocando que la frecuencia de resonancia cambie
Efecto de grupo -CH- sobre el grupo -CH3
El espín del grupo metino -CH puede adoptar dos orientaciones con respecto al campo
externo aplicado. Como resultado de ello la señal del grupo -CH3 vecino se desdobla en
dos líneas de igual intensidad, un doblete.
Efecto del grupo -CH3 sobre el grupo -CH
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Los espines de los tres protones del grupo metilo pueden adoptar 8 combinaciones, que
se pueden agrupar en cuatro opciones diferentes (en dos casos hay tres combinaciones
equivalentes). Como resultado de ello la señal del grupo vecino -CH se desdobla en
cuatro líneas con intensidades respectivas 1:3:3:1, un cuartete
Podemos afirmar que la proximidad de n protones equivalentes en un carbono vecino
provoca el desdoblamiento de la señal en n+1 líneas, el número de éstas se conoce como
multiplicidad de la señal. Los protones equivalentes no se acoplan entre sí.
Nº de protones
adyacentes
Nº de picos
(multiplicidad)
Relaciones de área
0 1 (singulete) 1
1 2 (doblete) 1 1
2 3 (triplete) 1 2 1
3 4 (cuadruplete) 1 3 3 1
4 5 (quintuplete) 1 4 6 4 1
5 6 (sextuplete) 1 5 10 10 5 1
6 7 (septuplete) 1 6 15 20 15 6 1
EJEMPLO 1:
Número de picos: Entornos diferentes que rodean a los átomos de hidrógeno
3
Área bajo los picos
Relación de áreas igual a la relación entre hidrógenos en cada entorno
3:2:3
Desplazamiento químico
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EJEMPLO 2:
Ejercicio: ¿A cuál de las tres sustancias corresponde el RMN?
Ácido propanoico
EJEMPLO 3:
Ejercicio: ¿Qué información puede obtener del siguiente espectro sabiendo que la
fórmula molecular del compuesto es C4H8O2 ?
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3 entornos diferentes para los átomos de hidrógeno
Los átomos de hidrógeno en estos tres ambientes están en una relación 2:3:3
Como son 8 hidrógenos, hay un grupo CH2 y dos grupos CH3
El grupo CH2 de 4.1 ppm tiene junto a él un grupo CH3
El grupo CH3 de 1.3 ppm tiene junto a él un grupo CH2
El grupo CH3 de 2.0 ppm tiene junto a él un carbono sin hidrógeno
EJEMPLO 4:
Ejercicio: Interpretación del espectro RMN-H:
Están presentes 5 tipos de H en la proporción 5 : 2 : 2 : 2 : 3.
Hay un singlete de 5 H, dos tripletes de 2 H cada uno, un cuartete de 2 H y un triplete de
3 H.
Cada triplete indica que hay 2H en la posición adyacente, y un cuartete 3H en la misma
posición.
Por ello los picos a 4,4 y 2,8 ppm deben estar conectados como unidad CH2CH2.
Los picos a 2,1 y 0,9 ppm deben formar CH2CH3 .
Usando la tabla de desplazamiento químico los H pueden ser asignados de la siguiente
manera:
7.2ppm (5H) = ArH
4.4ppm (2H) = CH2O
2.8ppm (2H) = Ar-CH2
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2.1ppm (2H) = O=CCH2CH3
0.9ppm (3H) = CH2CH3
Una de las aplicaciones más importantes es la obtención de imágenes por resonancia
magnética.
En 2003 dos científicos Paul C Lauterbur ( 1929-2007) USA y Meter Mansfield (1993-)
United Kingdom ganaron el premio Nobel de Medicina por su trabajo en desarrollo del
uso del RMN en diagnóstico médico.
Los protones en agua, lípidos, carbohidratos etc. Dan diferentes señales dependiendo de
su entorno. Se puede obtener una imagen del cuerpo completo construida situando al
paciente dentro de una máquina de RMN.
Estas imágenes sirven para diagnosticar cáncer, esclerosis múltiple, osteomielitis y
hidrocefalia. Como esta técnica utiliza solo ondas de baja energía, ondas radio, es no
invasiva y no causa ningún daño al paciente. Además de la resonancia magnética de los
núcleos de hidrógeno hay otras resonancias de otros núcleos que también poseen espín
como por ejemplo el C-13 o el P-31 y pueden ser utilizados para obtener imágenes por
resonancia magnética RMI
CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X
La cristalografía de rayos X se usa para identificar las longitudes de enlace y los ángulos de
enlace de compuestos cristalinos.
La cristalografía de rayos X es una técnica consistente en hacer pasar un
haz de rayos X a través de un cristal de la sustancia sujeta a estudio. El haz
se escinde en varias direcciones debido a la simetría de la agrupación de
átomos y, por difracción, da lugar a un patrón de intensidades que puede
interpretarse según la ubicación de los átomos en el cristal, aplicando la ley
de Bragg.
Es una de las técnicas que goza de mayor prestigio entre la comunidad
científica para dilucidar estructuras cristalinas, debido a su precisión y a la
experiencia acumulada durante décadas, elementos que la hacen muy
fiable. Sus mayores limitaciones se deben a la necesidad de trabajar con
sistemas cristalinos, por lo que no es aplicable a disoluciones, a sistemas
biológicos in vivo, a sistemas amorfos o a gases.
Es posible trabajar con monocristales o con polvo microcristalino,
consiguiéndose diferentes datos en ambos casos. Para la resolución de los
parámetros de la celda unidad puede ser suficiente la difracción de rayos X
en polvo, mientras que para una dilucidación precisa de las posiciones
atómicas es conveniente la difracción de rayos X en monocristal.
La cristalografía de rayos X desempeñó un papel esencial en la descripción
de la doble hélice de la molécula de ADN.