Métodos para el estudio de microorganismos· 30-300 UFCs (≈ 50 UFCs) Conteo de colonias 10-3 4.5...
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Técnicas microscópicas • Campo claro • Campo obscuro • Contraste de fases • I . D . de Nomarski • Fluorescencia • Confocal • Electrónica de barrido • Estereoscópica (magnificación) Métodos para el cultivo bacteriano • Medios de cultivo • Técnicas de sembrado • Aislamiento de cepas Pruebas de susceptibilidad • Conc . mínimas inhibitorias (MIC) • Conc . mínimas bactericidas (MBC) • Antibiogramas ( Kirby - Bauer) Métodos para el estudio de microorganismos Identificación fenotípica • Tinción de Gram • Morfología celular • Motilidad • Tolerancia al oxígeno • Morfología de colonia • Tipificación bioquímica • Perfiles de proteínas celulares Identificación genética • Hibridaciones DNA - DNA • PCR • Secuenciación 16 S rRNA
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Técnicas microscópicas•Campo claro•Campo obscuro•Contraste de fases•I.D. de Nomarski•Fluorescencia•Confocal•Electrónica de barrido•Estereoscópica (magnificación)
Métodos para el cultivo bacteriano•Medios de cultivo•Técnicas de sembrado•Aislamiento de cepas
Pruebas de susceptibilidad•Conc. mínimas inhibitorias (MIC)•Conc. mínimas bactericidas (MBC)•Antibiogramas (Kirby-Bauer)
Métodos para el estudio de microorganismos
Identificación fenotípica•Tinción de Gram•Morfología celular•Motilidad•Tolerancia al oxígeno•Morfología de colonia•Tipificación bioquímica•Perfiles de proteínas celulares
Identificación genética•Hibridaciones DNA-DNA•PCR•Secuenciación 16S rRNA
Métodos para el cultivo bacteriano•Medios de cultivo•Técnicas de sembrado•Aislamiento de cepas
Métodos para el estudio de microorganismos
Curva de crecimiento bacteriano (in vitro)10
9
8
7
6
5
4
Cuen
tas v
iabl
es/m
l (10
log )
Tiempo (hrs)
Fase exponencial
Fase estacionaria Fase dedeclinación
Fase delatencia
Perio
do d
e ac
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ació
n
Métodos para el cultivo bacteriano
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48
Perio
do
de re
tard
o
Medios de cultivo
Medios generales y enriquecidos•Nutricionalmente complejos favoreciendo el crecimiento de un gran número de especies•Pueden ser semi-selectivos variando su composición, pH y condiciones de cultivo (O2, C°, etc.)•USO: aislamiento primario para recuperación amplia de microorganismos y mantenimiento de cepas•EJEMPLOS: agar nutritivo, infusión cerebro-corazón, soya-tripticasa, agar sangre, agar chocolate, NHK, etc.
Medios selectivo•Nutricionalmente pobres con componentes que estimulan e inhiben el crecimiento de cepas específicas•Inhiben el crecimiento de la mayoría de especies y favorecen el de un número reducido de microorganismos•USO: aislamiento primario de microorganismos específicos•EJEMPLOS: agar mitis-salivarius, agar Salmonella-Shigella, medio Thayer-Martin, etc.
Medios diferenciales•Por definición son también selectivos•Permiten la identificación de actividades metabólicas específicas•USO: aislamiento primario de microorganismos específicos•EJEMPLOS: agar MacConkey, agar manitol salado, agar eosina-azul de metileno, etc.
Técnicas de sembrado
Estría simple
Estría triple
Estría cuádruple
Aislamiento de cepas
10-1
4.5 ml
500 µl
4.5 ml
10-2
500 µl
4.5 ml
10-3
500 µl
4.5 ml
10-4
500 µl
4.5 ml
10-5
500 µl
100 µl
5 ml
Obtención de la muestra
Dispersión y dilución
Sembrado
Cultivo
100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
Conteo Confluyente Confluyente >300 UFCs ÷ 30-300 UFCs(≈150 UFCs)
÷ 30-300 UFCs(≈ 50 UFCs)
<30 UFCs
XXX X
÷ 30-300 UFCs(≈ 50 UFCs)
Conteo de colonias
10-3
4.5 ml
10-4
500 µl
100 µl
��𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂𝐂 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐂𝐂𝐔𝐔×𝐯𝐯𝐂𝐂𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐂𝐂𝐂𝐂 𝐝𝐝𝐂𝐂 𝐝𝐝𝐝𝐝𝐔𝐔𝐬𝐬𝐂𝐂𝐬𝐬𝐔𝐔𝐝𝐝ó𝐂𝐂 (𝛍𝛍𝐯𝐯)
𝐯𝐯𝐂𝐂𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐂𝐂𝐂𝐂 𝐔𝐔𝐂𝐂𝐯𝐯𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐬𝐝𝐝𝐂𝐂 (𝛍𝛍𝐯𝐯) �×𝐟𝐟𝐬𝐬𝐟𝐟𝐂𝐂𝐂𝐂𝐬𝐬 𝐝𝐝𝐂𝐂 𝐝𝐝𝐝𝐝𝐯𝐯𝐯𝐯𝐟𝐟𝐝𝐝ó𝐂𝐂
𝐯𝐯𝐂𝐂𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐯𝐂𝐂𝐂𝐂 𝐝𝐝𝐂𝐂 𝐝𝐝𝐝𝐝𝐔𝐔𝐬𝐬𝐂𝐂𝐬𝐬𝐔𝐔𝐝𝐝ó𝐂𝐂 (𝐯𝐯𝐯𝐯)� = 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐂𝐂𝐔𝐔/𝐯𝐯𝐯𝐯
��𝟓𝟓𝟓𝟓 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐂𝐂𝐔𝐔× 𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓 𝛍𝛍𝐯𝐯
𝟏𝟏𝟓𝟓𝟓𝟓 𝛍𝛍𝐯𝐯 � × 𝟏𝟏𝟓𝟓,𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓
𝟓𝟓 𝐯𝐯𝐯𝐯 � =
��𝟐𝟐𝟓𝟓𝟓𝟓,𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐂𝐂𝐔𝐔
𝟏𝟏𝟓𝟓𝟓𝟓 𝛍𝛍𝐯𝐯 � × 𝟏𝟏𝟓𝟓,𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓
𝟓𝟓 𝐯𝐯𝐯𝐯 � =
�𝟐𝟐,𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐂𝐂𝐔𝐔× 𝟏𝟏𝟓𝟓,𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓
𝟓𝟓 𝐯𝐯𝐯𝐯 � =
�𝟐𝟐𝟓𝟓,𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓,𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐂𝐂𝐔𝐔
𝟓𝟓 𝐯𝐯𝐯𝐯 � = 𝟓𝟓,𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓,𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓𝟓 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐂𝐂𝐔𝐔/ml = 𝟓𝟓 × 𝟏𝟏𝟓𝟓𝟔𝟔 𝐔𝐔𝐔𝐔𝐂𝐂𝐔𝐔/𝐯𝐯𝐯𝐯
Medio Enriquecido
Medio Selectivo
Propagación de cepas
Aislamiento
Propagación
Métodos para el estudio de microorganismos
Identificación fenotípica•Tinción de Gram•Morfología celular•Motilidad•Tolerancia al oxígeno•Morfología de colonia•Tipificación bioquímica•Perfiles de proteínas celulares
Identificación fenotípica
Definición
Secuencia consecutiva de métodos de “microbiología tradicional” que en conjunto llevan a la identificación de especies bacterianas en cultivo; mediante la determinación y posterior seguimiento de sus características fenotípicas y metabólicas a través de diagramas de flujo de identificación aceptados
Aplicación • Identificación y cuantificación de especie cultivable previamente caracterizadas o de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas• Permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o
en paralelo a la identificación• Es posible realizar la cuantificación de las especies evaluadas
Desventajas
En comparación a la identificación genética:• Más laborioso• Mayor tiempo y costo• Difícil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Subestimación de especies fastidiosas• No permite la identificación de especies no-cultivables
Identificación fenotípica- Diagrama de flujo
Tinción de Gram
Morfología celular
Motilidad
Tolerancia al O2
Morfología de colonia
Tipificación bioquímica
Perfiles de proteínas celulares
Gram positivo
Gram negativo
Identificación fenotípica- Tinción de Gram
Identificación fenotípica- Morfología celular
Coco
Bacilo
PleomórficoEspirilo
•Sin motilidad•De nado (Swimming)•De deslizamiento (Glidding)•En espasmos (Twitching)
En Agar
Tubo de Punción
Identificación fenotípica- Motilidad
Contraste de Fases
Campo Obscuro
•Anaerobio estricto(en ausencia de O2)
•Microaerofílico(en conc. bajas de O2)
•Capnofílico(en presencia de CO2)
•Anaerobio facultativo(en presencia/ausencia de O2)
•Aerobio estricto(en presencia de O2)
Identificación fenotípica (Tolerancia al oxígeno)
•Color•Tamaño•Forma•Textura•Consistencia
•Periferia•Adherencia al agar•Formación de fosas•Propiedades hemolíticas•Fluorescencia con luz UV
Identificación fenotípica- Morfología de colonia
Identificación fenotípica- Tipificación bioquímica
•Fermentación de carbohidratos•Productos terminales•Catalasa•Oxidasa•Coagulasa•Reacciones de aglutinación
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)
Identificación fenotípica- Perfiles de proteínas celulares
Pruebas de susceptibilidad•Conc. mínimas inhibitorias (MIC)•Conc. mínimas bactericidas (MBC)•Antibiogramas (Kirby-Bauer)
Métodos para el estudio de microorganismos
Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana
CONSIDERACIONES GENERALES
• Todas las pruebas que se discutirán, dependendel cultivo bacteriano in vitro
•Requieren de un tiempo relativamente largopara la obtención de resultados (3-7 días)
•No infieren sobre la susceptibilidad bacterianaen biopelículas
•Sólo permiten la evaluación de especiescultivables
•Son aplicables únicamente para cultivos puros
Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC)
Definición Concentración más baja de un fármaco que inhibe el crecimiento visible de microorganismos después de su cultivo en presencia del agente
Aplicación
• “Estándar de oro” en pruebas de susceptibilidad para diagnóstico e investigación• Uso obligado en casos de endocarditis, meningitis, septicemia, osteomielitis,
pacientes inmunosuprimidos, infecciones de prótesis y cuando no ha habido una buena respuesta a pesar de haber tenido resultado de “S” con antibiogramas
• En pacientes críticos para quienes se requiere una MIC exacta (≥10 diluciones)
Ventajas• Proporciona concentraciones útiles clínicamente• Permite establecer puntos de corte de sensibilidad y resistencia
Desventajas
En comparación a los antibiogramas:• Técnicamente más laborioso• Requiere mayor tiempo para la obtención de resultados• Es más costoso
Ajustar D.O.de 104 a 106
Suspender en caldo
Transferir a pozos
Incubar
*Sin antibiótico
Determinar MIC a cada antibiótico
Met
roni
dazo
l
Clin
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a
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na
Ampi
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Nor
floxa
cina
Control*
0.5 µg/ml
1 µg/ml
2 µg/ml
4 µg/ml
8 µg/ml
16 µg/ml
32 µg/ml
MÉTODO DE DILUCIÓN EN CALDO
Aplicación: Bajo número de cepas contra número elevado de antibióticos
Estándares: CLSI (antes NCCLS)
Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC)
Conc. sugeridas
…512 µg/ml16 µg/ml8 µg/ml4 µg/ml2 µg/ml1 µg/ml0.5 µg/ml0.25 µg/ml0.12 µg/ml0.06 µg/ml…0.001 µg/ml
Caldo con diferentes conc. de 12 antibióticos
Ajustar D.O.de 104 a 106
Suspender en caldo
Transferir a pozos (S/A)
Replicar en placas de agar
Control* 0.5 µg/ml
1 µg/ml 2 µg/ml
4 µg/ml 8 µg/ml
16 µg/ml 32 µg/ml
Agar con diferentes conc. de 1 antibiótico*Sin antibiótico
Determinar MIC de cada cepa
Incubar
MÉTODO DE DILUCIÓN EN AGAR
Aplicación: Elevado número de cepas contra bajo número de antibióticos
Estándares: CLSI (antes NCCLS)
Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC)
Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC)
Ajustar D.O.de 104 a 106
Suspender en caldo
Transferir en césped Incubar
Determinar MICs
MÉTODO DE TIRAS DE GRADIENTE
Aplicación: Elevado número de cepas contra elevado número de antibióticos
Colocar tira con antibiótico
Interpretación de MICs- “La relatividad de la susceptibilidad”
Resultado de la prueba MIC (µg/ml)
Valores de los puntosde corte+=Interpretación clínica de la
susceptibilidad
• No tienen utilidad per se
• Se interpreta considerando las concentraciones que el fármaco puede alcanzar en el sitio de la infección después de administrar una dosis terapéutica
• Estándares del CLSI
• Basados en las concentraciones que el fármaco puede alcanzar en el sitio de la infección después de administrar una dosis terapéutica
FARMACOCINÉTICA• Dosis, distribución y vida media del fármaco: factores que
determinan la concentración alcanzable en el sitio de infección
• Difiere de fármaco a fármaco, de sitio a sitio y de paciente a paciente
• Por lo tanto, los puntos de cortes son diferentes para cada agente:
• Una MIC baja puede representar “R” a un fármaco y una MIC elevada “S” a otro por diferencias en sus puntos de corte
Interpretación de MICs- Puntos de corte e índices PD
ÍNDICES FARMACODINÁMICOS (PDI)
• Consideran la cinética y dinamia del fármaco junto con la MIC para determinar su efectividad
• Se compara el “coeficiente del punto de corte” (MBQ) con el valor de la MIC
• MBQ = Punto de corte(1) ÷ MIC
• <MIC y >MBQ: >eficacia del fármaco
PUNTOS DE CORTE (PC)
• MIC < PC(1) = “S”
• MIC > PC(3) = “R”
• PC(2): Puede ser efectivo si la infección se localiza en sitios que concentran al fármaco ó cuando se pueden administrar dosis altas con seguridad
PUNTOS DE CORTE EJEMPLOS
Antibiótico Susceptible (1)
Intermedio (2)
Resistente (3) MIC MBQ Interpretación
A. Imipenem ≤8 16 ≥32 48 0.17 RB. Ampicilina ≤2 4 ≥8 4 0.5 IC. Cefotaxima ≤2 4 ≥8 1 2 SD. Clindamicina ≤16 32 ≥64 2 8 SE. Metronidazol ≤12 24 ≥48 4 3 S
(Concentraciones en µg/ml)
R
I
S
R
I
S
R
I
SR
I
S
R
I
S
Interpretación de MICs
PUNTOS DE CORTE EJEMPLOS
Antibiótico Susceptible (1)
Intermedio (2)
Resistente (3) MIC MBQ Interpretación
A. Imipenem ≤8 16 ≥32 48 0.17 RB. Ampicilina ≤2 4 ≥8 4 0.5 IC. Cefotaxima ≤2 4 ≥8 1 2 SD. Clindamicina ≤16 32 ≥64 2 8 SE. Metronidazol ≤12 24 ≥48 4 3 S
(Concentraciones en µg/ml)
Fármaco EFármaco DFármaco CFármaco BFármaco A
Concentraciones mínimas bactericidas (MBC)
DefiniciónConcentración más baja de un fármaco capaz de matar microorganismos, se determina después de subcultivar en agar sin el agente, muestras de caldo sin crecimiento visible en una serie de diluciones para la determinación de MIC
Aplicación• Se utiliza con menor frecuencia que las MICs• Uso obligado en casos de endocarditis, meningitis y en pacientes críticos
Ventajas• Proporciona concentraciones útiles clínicamente• Permite identificar el efecto “bactericida” y “bacteriostático” del fármaco
Desventajas
En comparación a MICs y antibiogramas:• Técnicamente más laborioso• Requiere mayor tiempo para la obtención de resultados• Es más costoso
Concentraciones mínimas bactericidas (MBC)
MIC: método de dilución en caldo
Incubar
Determinar MBC
Subcultivo en agar sin antibiótico
Interpretación de MBCs
“Bactericida” vs. “Bacteriostático”
• Bactericida: MBC ≤ 4 veces MIC• Bacteriostático: MBC > 4 veces MIC
Antibiótico Ejemplos Efecto
Penicilinas - Amoxicilina- Ampicilina Bactericida
Cefalosporinas - Cefotaxima- Cefalexina Bactericida
Carbapenems - Imipenem- Meropenem Bactericida
Aminoglucósidos - Amikacina- Gentamicina Bactericida
Quinolonas - Ciprofloxacina- Levofloxacina Bactericida
Lincosaminas - Clindamicina Bacteriostático
Macrólidos - Azitromicina- Claritromicina Bacteriostático
Tetraciclinas - Doxiciclina- Minociclina Bacteriostático
Nitroimidazoles - Metronidazol Bacteriostático
Fenólicos - Chloramfenicol Bacteriostático
Antibiogramas- Prueba de Kirby-Bauer
DefiniciónMétodo para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de bacterias, basado en el tamaño de zonas de inhibición de crecimiento alrededor de discos impregnados con diferentes fármacos en un sembrado en césped
Aplicación
• Determinación rápida (presuntiva) de la susceptibilidad de microorganismos a diferentes antimicrobianos
• En casos donde se requiere un resultado rápido para la selección y administración inicial del antimicrobiano
VentajasEn comparación a MIC y MBC:
• Menos laborioso y costoso• Requiere menos tiempo para la obtención de resultados
Desventajas• No proporciona concentraciones útiles clínicamente• Los resultados son un indicador pobre de la efectividad clínica del agente
Sembrado en césped
Antibiogramas- Prueba de Kirby-Bauer
Ajustar D.O.de 104 a 106
Suspender en caldo
Colocar discos
Medir zonas de inhibiciónIncubar
Interpretación de antibiogramas
Ejemplo para E. coli y otros bacilos entéricos G(-) PUNTOS DE CORTE
Antibiótico Conc. endisco (µg) Resistente Intermedio Susceptible
Amikacina 30 ≤14 15-16 ≥17Ampicilina 10 ≤13 14-16 ≥17Cefazolina 30 ≤14 15-17 ≥18Gentamicina 10 ≤12 13-14 ≥15Tetracyclina 30 ≤14 15-18 ≥19Ticarcilina 75 ≤14 15-19 ≥20Trimetoprim 5 ≤10 11-15 ≥16Tobramicina 10 ≤12 13-14 ≥15
(Diámetro en mm)
INTERPRETACIÓN ESTÁNDAR• Diámetro ≥ 18 mm o radio ≥ 6 mm = “S”• Diámetro < 18 mm o radio < 6 mm = “R”• Lo anterior considera discos de 6 mm• Los puntos de corte varían específicamente para algunos MO y/o antibióticos• La interpretación debe basarse en los estándares vigentes del CLSI• El punto de corte “intermedio” se interpreta igual que en MICs
Métodos para el estudio de microorganismos
Identificación genética•Hibridaciones DNA-DNA•PCR•Secuenciación 16S rRNA
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace a moléculas de DNA complementarias en una muestra (templete)
Aplicación • Identificación y cuantificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Permite la identificación de especies no-cultivables
En comparación a otras pruebas genéticas:• Es posible cuantificación las especies evaluadas
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificaciónEn comparación a otras pruebas genéticas:
• Menor sensibilidad y especificidad
•Sonda: fragmento de DNA marcado con una molécula reportadoraque permite su detección después de la hibridación
•Molécula ReportadoraRadioactiva: Isótopos con emisiones β (generalmente P32)No-Radioactiva: Digoxigenina, Fluorescina, Biotina, etc.
•Especificidad: determinada por el diseño de la sonda•Sensibilidad: determinada por el tipo y concentración de la sonda
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
•Southern BlotBlanco = DNASonda = DNA
•Northern BlotBlanco = RNASonda = DNA
•Western BlotBlanco = ProteínaSonda = Anticuerpo
“MiniSlot”
Canales abiertos
Membranade nylon
Filtros
Socransky et al. Biotechniques 1994
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
“MiniBlotter”
Canales de hibridación
Membranade nylon
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
Socransky et al. Biotechniques 1994
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
* Serotipos a: 43717 & b: 43718† Subespecies nucleatum: 25586, polymorphum: 10953 & vincentii: 49256
Actinomyces georgiae 49285Actinomyces israelii 12102Actinomyces meyeri 35568Actinomyces naeslundii stp. 1 12104Actinomyces odontolyticus 17929Actinomyces viscosus 43146Aggregatibacter actinomycetemcomitans *Campylobacter gracilis 33236Campylobacter rectus 33238Campylobacter showae 51146Capnocytophaga gingivalis 33624Capnocytophaga ochracea 27872Capnocytophaga sputigena 33612Dialister pneumosintes 33048Eikenella corrodens 23834Eubacterium nodatum 33099Eubacterium saburreum 33271Filifactor alocis 35896Fusobacterium nucleatum †Fusobacterium periodonticum 33693
Especie ATCC
Neisseria mucosa 19696Parvimonas micra 33270Porphyromonas asaccharolytica 25260Porphyromonas gingivalis 33277Prevotella intermedia 25611Prevotella loescheii 15930Prevotella melaninogenica 25845Prevotella nigrescens 33563Propionibacterium acnes 6919Selenomonas noxia 43541Streptococcus anginosus 33397Streptococcus constellatus 27823Streptococcus gordonii 10558Streptococcus intermedius 27335Streptococcus mitis 49456Streptococcus oralis 35037Streptococcus sanguinis 10556Tannerella forsythia 43037Treponema denticola 35405Veillonella parvula 10790
Especie ATCC
Métodos genéticos- PCR
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra (templete)
Aplicación • Identificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor sensibilidad
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Permite la identificación de especies no-cultivables
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificaciónEn comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especies (excepto PCR en tiempo real)En comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas
PCR
Métodos genéticos- PCR
•Ciclos repetitivos de desnaturalización, alineamiento de primers yextensión para producir múltiples copias de una secuenciadeterminada de DNA
•Especificidad: determinada por el diseño de los primers•Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la determinación de la secuencia en el DNA de la fracción 16S rRNA en una muestra (templete) y su posterior comparación con secuencias publicadas
Aplicación • Identificación de cualquier microorganismo a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor especificidad
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Permite la identificación de especies no-cultivables
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificaciónEn comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especiesEn comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas
Secuenciación 16S rRNA
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA
•Comparación con bancos de secuencias conocidas
•Especificidad: hipotéticamente “absoluta”•Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula
