Mutaciones en el circuito regulador de lacResumiremos primero los componentes del sistema regulador que son esenciales para que la regulacin pueda funcionar:1. El represor se debe sintetizar correctamente y activo2. El operador debe estar presente en el DNA y con la Secuencia correcta que se puede reconocer por el represor3. El represor debe ser capaz de unirse al operador4. El Inductor debe ser capaz de unirse al represor.Cualquier fallo en uno de estos supuestos conducir a un mutante que presentara distintos fenotipos respecto a la induccin del operon lac. Es importante aqu tener en cuenta que lasmutaciones en transproducirn un producto difusible que est defectuoso. Ellos tienen la habilidad de complementar a un gen que se encuentre cercano. Por otra parte lasmutaciones en cisson caractersticas de cualquier sitio que se encuentre fsicamente contiguo con la secuencias que controla. Cuando dos sitios actan en cis, se encuentran cerca, por ejemplo un promotor y un operador.Mutaciones:1.Mutante con unoperador disfuncional. El operador est mutado (Oc). Pueden existir diferentes cambios en el operador, algunos pueden ser severos y tener grandes efectos. En estos casos el represor no se une al operador o su unin no es tan fuerte como en el tipo salvaje. La RNA polimerasa ser capaz de expresar los genes del operon, por lo tanto se observara sntesis constitutiva de la-galactosidasa. La cantidad de sntesis depender de la severidad de la mutacin. Como estas mutaciones ocurren en el operador, se designan como Ocla c significa constitutivo (ver Fig.10.7Genes VII).Consideremos lo que ocurre en un diploide parcial:

Si el inductor no est presente, entonces el represor se unir normalmente al O+, pero slo parcialmente a Oc. La-galactosidasa se expresar desde el operon #1, pero no desde el operon #2. Si el inductor est presente entonces el represor no se unir al operador y la-galactosidasa se expresar desde ambos operones. Este mutante tiene un fenotipolac+constitutivo.Oces dominante a O+, pero solamente en cis.2.Mutante con unpromotor disfuncional. En este caso el promotor no reconoce la RNA polimerasa y el opern no puede ser transcrito. Estas mutaciones actuarn encisy el fenotipo serlac-constitutivo.3.Mutaciones en el represor. El represor lac es codificado por el gen reguladoridel opern, mutaciones en diferentes partes de este gen i se traducen en diferentes funciones afectadas del represor y por tanto en diferentes fenotipos resultantes. La figura 10.9 Genes VII evidencia como mutantes conocidos del represor ayudan a mapear las regiones del gen implicadas en una u otra funcin de la protena:

Algunos mutantes del represor:Represor mutado con unsitio de unin al DNA disfuncional(I- lacId). En este caso el represor es incapaz de unirse al operador, por eso se observar expresin constitutiva de la-galactosidasa. Si se construye un diploide parcial con el gen lacI+, el salvaje, se observar un fenotipoinducible. Por lo que se dice que lacI+, domina entranssobre lacId. De aqu se deriva que lainducibilidad salvaje domina sobre la constitutividad mutante. Es interesante analizar que la dominancia en trans se origina porque el represor lac es un tetrmero y que las 4 subunidades deben estar completamente activas para unirse al operador. Cuando se transcriben y traducen ambos genes en un diploide parcial tendremos unpoolde subunidades monomricas, que se asociarn al azar, para dar un tetrmero funcional:

De los 5 posibles tetrmeros que se forman 4 son incapaces de unirse al DNA. Como los mutante I-son dominantes al salvaje los designan muchas veces como lacId, d = dominante.Represor mutado queno puede unirse al inductor(Is). En este caso si el inductor no puede unirse al represor, este se encontrar permanentemente enlazado al operador, ya que el represor tiene un afinidad muy alta por el operador KA= 1013M-1. Estos mutantes se comportan comosuper-represores, se nombran como Is. Si se aade el inductor ellos no respondern. En un diploide parcial, aunque al aadir el inductor el represor tipo salvaje se disociar del operador, este sitio sera inmediatamente ocupado por un represor Is. Es decir el represor Isdomina sobre el tipo salvaje. Por lo que se puede decir que laconstitutividad mutante domina sobre la inducibilidad salvaje.

Sistemas reprimibles, el opern del triptfanoEn la siguiente figura se resumen todos los casos posibles de induccin y represin:

El opern lac es unsistema inducible, al estar implicado en la degradacin de un azcar, slo se induce en presencia de ese azcar. El sentido biolgico de esto es que los genes implicados en el metabolismo de azcares estn normalmente reprimidos y en presencia del inductor se induce la transcripcin de su opern. Hay operones en los que el problema biolgico es al contrario, como por ejemplo los operones de biosntesis de aminocidos, que slo se expresan en ausencia del aminocido. Cuando est el aminocido en el medio, el opern est reprimido.Este es el caso delopern del triptfano(que es un aminocido esencial), cuando hay triptfano en el medio, la clula lo coge y no necesita sintetizarlo, por lo tanto el opern del triptfano est bloqueado cuando hay triptfano en el medio, cuando no hay triptfano en el medio, la clula ha de sintetizarlo, con lo que deja de estar reprimida la expresin de las enzimas implicadas en el metabolismo (sntesis) del triptfano. La estructura de este opern se representa a continuacin:

El represor del triptfano reprime tres operones. Uno de ellos,trp, es el de los genes que codifican por las enzimas de sntesis del triptfano. Los otros dos son: el del gen del propio represortrpRy el de genes implicados en la biosntesis de aminocidos aromticosaroH. Cuando hay triptfano en el medio, ste se une con el represor interaccionando con el operador, por lo que no hay expresin de genes de sntesis de triptfano; cuando no hay triptfano presente en el medio el represor no puede unirse al operador y se expresan los genes del opern.El represor se une a una secuencia repetida e invertida del operador, acta por tanto como dmero; se conoce la estructura terciaria del represor del triptfano cada monmero interacciona con el DNA mediante un motivo HTH, en el dmero la distancia entre los dos motivos es de 34 (aproximadamente 1 vuelta de hlice) lo que indica que el dmero de represor se une al DNA por dos surcos mayores consecutivos. Es un fenmeno general para la mayor parte de los factores de transcripcin procariticos el tener estructuras terciarias con 2 hlices lectoras de surcos mayores consecutivos separadas a una distancia de 34 , que reconocen las secuencias del operador localizadas en surcos adyacentes.En el caso del represor del triptfano, se une a DNA cuando est presente el aminocido pero no en su ausencia; sto es as por un cambio alostrico producido por la interaccin del triptfano. El sitio de unin del triptfano con el represor est prximo a las cabezas lectoras de DNA (motivos HTH). Cuando el triptfano est unido al represor, las cabezas lectoras se encuentran a la distancia y orientacin adecuada para interaccionar con surcos mayores consecutivos, cosa que no ocurre en ausencia de triptfano.

Control de la terminacin de la transcripcinAs como la iniciacin de la transcripcin est sometida a control, la regulacin de la transcripcin tambin puede efectuarse a nivel de la terminacin. Hay dos casos bien conocidos: atenuacin y antiterminacin.AtenuacinLaatenuacinse da sobre todo en operones de biosntesis de aminocidos, por ejemplo, el opern del triptfano, que est formado por una serie de genes estructurales que codifican por enzimas implicados en la ruta de biosntesis del triptfano. En el opern lac, la expresin de-galactosidasa en el nivel inducido con respecto al basal era de 103veces. En el opern del triptfano, cuando hay triptfano en el medio la expresin del opern se reprime 700 veces. Cmo se explica esto si se tiene en cuenta que el represor solo reprime 70 veces? Ha de haber algn mecanismo adicional que multiplica por 10 los niveles de represin. La explicacin est en que la transcripcin de estos genes est sujeta a dos controles: represin y atenuacin. La atenuacin es un mecanismo que controla la habilidad de la RNA polimersa para leer, a travs de unatenuador. El atenuador es un terminador intrnseco (ver figura anterior), localizado al comienzo de la unidad de transcripcin. La caracterstica que tiene es que algunos eventos externos (presencia de un metabolito, como Trp para operon trp; o un evento como la traduccin) controlan la formacin de la horquilla necesaria para la terminacin intrnseca (Figura10.39Genes VII). En la atenuacin al aumentar los niveles de triptfano, la transcripcin se para antes: mRNA atenuado; al disminuir los niveles de triptfano, la transcripcin no se para sino que contina.La reginleader(trpL), regin anterior a los genes estructurales (ver Figura10.40Genes VII) juega un papel fundamental en la atenuacin:

La RNA polimerasa comienza la transcripcin, el represor reprime poco y la RNA polimerasa transcribe un RNA correspondiente a la secuencia leader. Dependiendo de la estructura secundaria adoptada por este RNA se forma o no una seal de terminacin. La secuencia leader tiene un AUG iniciador de traduccin con una fase de lectura abierta hasta un UGA, seal de terminacin de traduccin, que da lugar a un pptido de 14 aminocidos que no sirve para nada. A mediada que se va sintetizando el RNA leader, va adoptando una determinada estructura secundaria.La regin del RNA inmediatamente antes del sitio de terminacin de la traduccin (regin 1), es complementaria a la regin contigua (regin 2) y al aparear se forma la horquilla 1-2; contina la transcripcin y se transcriben las regiones 3 y 4, que tambin son complementarias y forman la horquilla 3-4. Como la regin 4 va seguida de una serie de Us, esto constituye una seal de terminacin por lo que la transcripcin cesa. Adems, la regin 2 puede tambin hibridar con la regin 3. Curiosamente, en el pptido leader, de los 14 aminocidos dos son triptfano, siendo el triptfano el aminocido menos frecuente en las protenas. Otra cosa a tener en cuenta es que en bacterias, a diferencia de eucariticos, la transcripcin est acoplada a traduccin. Los ribosomas estn traduciendo el RNA que se est transcribiendo.Teniendo esto en cuenta:En ausencia de triptfano en el medio: la RNA polimerasa va transcribiendo. Los ribosomas reconocen el AUG y comienzan a sintetizar el pptido hasta que llegan a lostripletes del triptfano en los que se detienen, debido a que no hay triptofanil tRNA en el medio.Como los ribosomas quedan detenidos en el codon del triptfano, la regin 1 del RNA leader queda "bloqueada"y no puede hibridar con la regin 2 y se impide la formacin del hbrido 1-2. Al sintetizarse la regin 3, la 2 hibrida con la 3, con lo que no puede formarse el hbrido 3-4 y no se da la seal de terminacin. La RNA polimerasa contina la transcripcin del opern.Cuando hay triptfano en el medio, los ribosomas continuamente traducen la regin correspondiente al pptido leader de 14 aminocidos. En este caso los ribosomas quedan parados en la seal de terminacin de traduccin (UGA) impidiendo la hibridacin de la regin 2 con la 3, con lo que al transcribirse la regin 4 se forma el hbrido 3-4. Aparece la seal de terminacin de transcripcin y no se transcribe el opern.Generalidad del mecanismo de atenuacin. Es un mecanismo general de control de transcripcin? Es slo una peculiaridad del opern del triptfano? Si observamos diferentes pptidos leader de distintos operones de biosntesis de aminocidos: Thr: 8 tripletes de Thr.

His: 7 tripletes de His seguidos (MTRVQFKHHHHHHHPD)

Ile, Val, Leu (opern Ilv): 14 tripletes de Leu, Val, Ile, (MTALLRVISLVVISVVVIIIPPCGAALGRGLA)

Opern Leu: MSHIVRFTGLLLLNAFIVRGRPVGGIQH.La caracterstica comn en los distintos operones, es laabundancia de tripletes para ese aminocido en su regin leader. El control de atenuacin no se lleva a cabo slo por el aminocido, sino por la biosntesis de protenas, ya que en ausencia de sta la atenuacin impide la sntesis del aminocido.AntiterminacinLos genes de los fagos no se transcriben todos a la vez. Generalmente hay un programa temporal de transcripcin. As, vimos que en SPO1 este programa se efectuaba a nivel de iniciacin mediante una cascada de factores. A nivel de terminacin ocurre algo anlogo. Supongamos un grupo de genes A tempranos seguido de una seal de terminacin TA, si un producto de uno de estos genes A es unantiterminadorque hace que la RNA polimerasa se salte el terminador A, la RNA polimerasa transcribir lo que viene a continuacin (genes B) pudiendo reconocer el terminador siguiente (TB). Si el producto de un gen B es un antiterminador, la RNA polimerasa transcribe los genes siguientes a TB (genes C). Un ejemplo de este tipo de control se da el fago lambda.ntroduccinLos eucariontes, en su mayora, son organismos complejos. Los organismos eucariotas superiores estn constituidos por numerosos rganos diferenciados, estando cada rgano constituido por diferentes tipos de clula. Sin embargo, los miles de millares de clulas que constituyen estos organismos provienen de una sola clula diploide y para llegar a este resultado, se ponen en juego dos procesos: lamultiplicacin celulary ladiferenciacin. La diferenciacin debera ser el resultado de "encender" y "apagar" diferentes genes. Pero para obtener un organismo "funcional" no es suficiente que sus clulas se diferencien. Tambin hace falta que stas respondan de manera adecuada al ambiente. Para esto es necesario que la expresin de cada uno de los genes autorizados a expresarse para la diferenciacin est perfectamente regulado.En las bacterias, los sistemas de regulacin de expresin de los genes son relativamente sencillos, porque la regulacin se limita casi exclusivamente a un control de la transcripcin, traducindose todo mensaje transcrito inmediatamente en protenas. El objetivo de la regulacin de genes se convierte en el ajuste de la maquinaria enzimtica de la clula al ambiente nutricional y fsico inmediato con el fin de permitir el crecimiento y la divisin de la clula bacteriana. En eucariontes, la cosa no es tan sencilla. En estos organismos, el objetivo de la regulacin de la expresin gnica es garantizar la ejecucin de las decisiones precisas del desarrollo que llevan a la diferenciacin celular. En otras palabras,garantizar que el gen correcto se active en la clula correcta en el momento correcto.Los organismos eucariotas tienen determinadas caractersticas que hacen que sus mecanismos de regulacin gnica sean diferentes de los procariotas. As, vemos que del genoma eucariota, slo el 7% del DNA es codificador. El resto del genoma est constituido por secuencias, muchas de ellas repetidas de 103a 106veces, a veces en tndem, cuyo rol an se desconoce en su gran mayora. Por ejemplo, el DNA satlite representa el 15% del genoma. El gen y la protena eucariotas no son colineales ya que el transcrito primario del mRNA posee intrones que se pierden durante la maduracin de esta molcula. Los mRNA eucariotas son monocistrnicos a diferencia de los procariotas y no poseen operones. El hecho de poseer un nmero diploide de cromosomas, hace que se establezcan relaciones entre los alelos.En eucariontes, los sistemas de regulacin y seleccin son multietapa y a menudo son arborescentes. Esto disminuye considerablemente el esfuerzo de la seleccin estando ya preseleccionados determinados genes en una clula dada (diferenciacin). Esta preseleccin y la multiplicidad de niveles sucesivos de regulacin permiten un ajuste de la velocidad y de la intensidad de la reaccin a los estmulos. La arborescencia permite la obtencin de respuestas pleiotrpicas cuando los estmulos se dirigen a un nivel elevado, es decir a las primeras etapas de la regulacin y de una respuesta fina, muy selectiva y muy rpida cuando se dirigen a un nivel bajo, es decir, a las ltimas etapas de la regulacin. No existe, pues, un modelo general de regulacin como es el caso de los procariontes sino toda una serie de posibilidades que se encadenan, desde una estructura especial de la cromatina (nivel alto de regulacin) hasta una regulacin postraduccional (ltima etapa posible de regulacin).

Niveles de la expresin gnica en eucariontesLas diferentes posibilidades de regulacin de la expresin gnica en organismos eucariotas son:I. Nivel de cromatinaII. Nivel transcripcionalIII. Nivel postranscripcionalIV. Nivel traduccionalV. Nivel postraduccional

Regulacin de la expresin gnica a nivel de la cromatinaExisten cuatro subniveles de regulacin al nivel de la cromatina:1. Condensacin de la cromatina: sitios sensibles e hipersensibles a la DNasa I2. Zonas superenrolladas3. Metilacin de las citosinas4. Reordenamiento del genomaCondensacin de la cromatina: sitios sensibles e hipersensibles a la DNasa ILa estructura cromatiniana descondensada representa, al parecer, el primer y ms elevado nivel de regulacin. Es a este nivel que se llevar a cabo la seleccin entre los genes que la clula estautorizada a transcribir y aquellos que ella no debe transcribir. La cromatina est constituida por el DNA enrollado alrededor de una serie de nucleosomas, empaquetada ms relajada en las regiones que contienen genes activos. Adems de los cambios generales que ocurren en las regiones activas o potencialmente activas, ocurren cambios estructurales en sitios especficos asociados con la iniciacin de la transcripcin o con determinadas caractersticas estructurales del DNA. Estos cambios se detectaron por primera vez gracias a los efectos de la digestin con concentraciones muy dbiles de la enzima DNAsa I.Cuando la cromatina se digiere con DNAsa I, el primer efecto es la introduccin de cortes en la doble cadena ensitios hipersensiblesespecficos. Ya que la susceptibilidad a la DNAsa I refleja la disponibilidad del DNA en la cromatina, consideramos que estos sitios representan regiones de la cromatina en las cuales el DNA est especficamente expuesto porque no est organizado en la estructura nucleosmica usual. Un sitio hipersensible tpico en la cromatina es cien veces ms sensible al ataque de las enzimas. Estos sitios tambin son hipersensibles a otras nucleasas y a agentes qumicos. Ellos representan fragmentos de DNAdesprovistos de nucleosomas.Muchos de los sitios hipersensibles estn relacionados con la expresin gnica. Cada gen activo tiene su sitio en la regin del promotor y a veces ms de un sitio. La mayora de los sitios hipersensibles se encuentran solamente en la cromatina de las clulas en las cualesse est expresando el gen asociado; no se encuentran cuando el gen est inactivo. Se asume que un sitio hipersensible es el resultado de la unin de protenas reguladoras especficas que excluyen los nucleosomas. Los factores de transcripcin pueden generar sitios hipersensibles asociados a la transcripcin.Zonas superenrolladasElsuperenrollamiento negativodel DNA hace que las bases estn ms accesibles a las protenas. Algunos resultados experimentales demuestran que la variacin del grado de torsin del DNA se utiliza como medio para modificar el acceso de las protenas al promotor, lo mismo en eucariontes que en procariontes, regulando as la expresin de los genes correspondientes. Las mutaciones en los genes de las topoisomerasas, que son las enzimas que crean o eliminan los supergiros, disminuyen su actividad y tambin disminuyen importantemente la transcripcin de numerosos genes. Este efecto tambin se obtiene por los inhibidores de las topoisomerasas. Sin embargo, este resultado no es general, y slo algunos genes estn afectados. Lastopoisomerasasimplicadas en esta regulacin parecen fijarse a determinadas secuencias especficas del DNA situadas antes de los promotores.La expresin gnica est asociada a la no-metilacinLa metilacin del DNA tiene lugar en sitios especficos. En bacterias est asociado a la identificacin de una determinada cepa bacteriana y tambin con la diferencia entre el DNA replicado y el no replicado. En eucariontes, su funcin primordial conocida est asociada al control de la transcripcin. Entre el 2 y el 7% de las citosinas en el DNA de las clulas animales est metilado (el valor vara con las especies). La mayora de los grupos metilo se encuentran en los "dupletes" CG, y, de hecho, la mayora de las secuencias CG estn metiladas. Generalmente, los residuos C en ambas cadenas de este tipo de secuencia palindrmica estn metiladas. Cuando un duplete est metilado en una sola de las dos cadenas, se dice que est hemimetilado.Muchos genes tienen un patrn de metilacin que es constante en la mayora de los sitios, pero puede variar en otros. Una minora de sitios est metilado en tejidos en los cuales no se expresa el gen, pero no estn metilados en los tejidos en los cuales el gen se encuentra activo. Por tanto, un gen activo se puede describir como hipometilado.Un gen metilado es inactivo, pero el no metilado es activo. Una regin hipometilada coincide con una regin de mxima sensibilidad a la DNAsa I. La metilacin en el extremo 5 de un gen puede estar directamente relacionada con su expresin. Muchos genes no estn metilados en el extremo 5 cuando se expresan, aunque permanecen metilados en el extremo 3. Al igual que como sucede con otros cambios en la cromatina, parece probable que la ausencia de grupos metilo est asociada con la posibilidad de transcripcin y no con el propio acto de la transcripcin.Reordenamiento del genomaEntre los genes cuya expresin est condicionada por un reordenamiento genmico figuran los genes de determinados antgenos de superficie en el tripanosoma, los genes de las protenas del sistema inmune y los genes que intervienen en la esporulacin de la levadura (mating-typeo fenotipo sexual). Los reordenamientos del DNA generan diversidad, tanto en procariontes como en eucariontes. Las consecuencias generales del reordenamiento pueden ser:a) Crear nuevos genes como es el caso de las inmunoglobulinas, necesarias para la expresin en determinadas circunstancias.

b) El reordenamiento puede ser responsable delcambio de la expresinde un gen ya existente en otro. Esto ofrece un mecanismo para la regulacin gnica. Este es el caso del fenotipo sexual o esporulacin de las levaduras.1INTRODUCCIN2REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN2.1REGULACIN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIN2.1.1REGULACIN POR SUBUNIDADESsALTERNATIVAS2.1.2REGULACIN DEL INICIO DE TRANSCRIPCIN POR PROTENAS REGULADORAS2.1.2.1EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO E INDUCIBLE: REGULACIN DEL OPERNlacDEE. coli2.1.2.2EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO Y REPRIMIBLE: EL CASO DEL OPERNtrpDEE. coli2.1.2.3CONTROLES POSITIVOS2.2REGULACIN POR ATENUACIN DE LA TRANSCRIPCIN3SISTEMAS DE REGULACIN DE DOS COMPONENTES: SENSORES Y REGULADORES DE RESPUESTA4MECANISMOS REGULADORES GLOBALES4.1RESPUESTA SOS ANTE GRANDES DAOS EN EL ADN4.2RESPUESTA AL CHOQUE TRMICO4.3QUORUM SENSING"ENLACES

1INTRODUCCINCon este tema comenzamos el estudio de la gentica bacteriana, que va a estar centrado alrededor de las variaciones bacterianas. Entendemos por tales los cambios moleculares y eventualmente fenotpicos que se producen en las bacterias por causas genticas. Dentro de ellos podemos distinguir dos categoras principales:Variaciones bacterianas por adaptacin al medio: son cambios moleculares y fenotpicos que ocurren sin modificacin del material hereditario (sin variacin del genotipo), siendo debidos a diversos mecanismos de regulacin de la expresin de los genes. (Las trataremos en el presente tema)

Variaciones bacterianas asociadas a cambios genotpicos. Dentro de esta categora podemos incluir:Variaciones hereditarias no asociadas con transferencia de material gentico: principalmente se trata de los diversos tipos de mutaciones. (Tema 16)

Variaciones hereditarias asociadas con transferencia de material gentico entre una bacteria donante y otra receptora. Entre ellas se encuentran:Variaciones debidas a transformacin (Tema 17)

Variaciones debidas a conjugacin (Tema 18)

Variaciones debidas a transduccin (Tema 19)

Comenzamos, pues, con el estudio de la regulacin gnica en procariotas. Desde el punto de vista de la expresin gentica, los operones bacterianos se pueden dividir en dos grandes tipos:operones de expresin constitutiva(es decir, aquellos que se transcriben permanentemente, independientemente de las condiciones ambientales). Por ejemplo, operones para las ADN- y ARN-polimerasas; operones para las protenas de las cadenas transportadoras de electrones; operones para las protenas ribosmicas, etc.

operones cuya expresin est reguladaen funcin de las condiciones ambientales. Dentro de esta categora, se distinguen a su vez: operones de expresin inducible y operones de expresin reprimible.

En principio, por su modo la regulacin puede ser de dos tipos :Induccin: sntesis de ciertos enzimas (o aumento de su sntesis) debida a la presencia en el medio de sustratos metabolizables adecuados, o en trminos ms generales, por la existencia de determinados estmulos ambientales (no necesariamente de tipo nutricional). Ejemplo tpico: la produccin de-galactosidasa es inducible en determinadas bacterias cuando en el medio aparece un azcar de tipo-galactsido (como la lactosa)

Represin: desconexin rpida de la ruta biosinttica de un determinado compuesto, cuando ste aparece aportado en el medio de la bacteria. Ejemplo tpico: siE. colicrece en ausencia de triptfano (Trp), la ruta para su biosntesis est funcionando hasta que ese aa. aparezca en el medio. La represin no siempre tiene que ver con estmulos nutricionales: se pueden desconectar genes para evitar que su expresin interfiera con otros procesos que ya estn en curso en la clula.

En resumen, y en relacin con el modo de expresin gentica que subyace a sustancias relacionadas con el metabolismo, la norma general es que:la induccin permite el ajuste rpido para el uso de sustratos metabolizables;

la represin permite el ajuste para la sntesis de una sustancia que interviene como intermediario metablico.

TIPOS DE MECANISMOS DE REGULACIN GENTICACasi cada uno de los niveles de los que depende la expresin de informacin gentica puede estar sometido en principio a algn tipo de regulacin, aunque el ms frecuente es sobre la transcripcin.1)Nivel transcripcional y sobre el ARNma)A nivel del inicio de la transcripcini)sustitucin del factorde la ARN-polimerasaii)por interaccin de protenas regulatorias sobre secuencias de ADN cercanas al promotor:(1)fenmenos de induccin gnica(2)fenmenos de represin gnicaA su vez, estos fenmenos pueden realizarse por:mecanismos de control positivo

mecanismos de control negativo

b)Terminacin prematura de la transcripcin: fenmenos de atenuacin de la transcripcin.c)Procesamiento de ARN (casos muy raros en procariotas)2)Nivel traduccional. Ejemplos:a)regulacin de la sntesis de las protenas ribosmicas.b)regulacin por ARN antisentido, que interfiere con la traduccin del ARNm3)Nivel postraduccional. Aqu ya no estamos ante mecanismos puramente de regulacin gentica. Algunos ejemplos: degradacin de protenas y modificacin covalente de protenas (p. ej., fosforilacin). Regulacin alostrica por retroalimentacin (feed-back) de la actividad de las protenas enzimticas.4)Sistemas globales de regulacinCuando varios operones estn regulados coordinadamente por un mismo tipo de estmulos, constituyen una red de regulacin que se suele denominar con el nombre dereguln(p. ej., el reguln de los operonesspode la esporulacin en las especies del gneroBacillus).Casi todos los productos de genes bacterianos estn regulados en al menos uno de estos niveles, y a menudo lo estn en varios niveles al mismo tiempo.Como veremos enseguida, muchos de estos mecanismos se disparan en el interior celular debido a pequeas molculas que informan a la bacteria de un determinado cambio ambiental.2REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN2.1REGULACIN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIN2.1.1REGULACIN POR SUBUNIDADESALTERNATIVASSe trata de una estrategia muy directa y sencilla, en la que la subunidadestndar de la clula vegetativa normal se ve desplazada y sustituida por otro(s) tipo(s) dediferentes (codificadas por genes distintos). La holoenzima de la ARN polimerasa con la nuevareconoce ahora e inicia la transcripcin a partir de un tipo distinto de promotor. Esto hace que se transcriban operones que hasta entonces permanecan silenciosos (sin expresin).Veamos algunos ejemplos:Uno de los casos mejor estudiados se da en las especies del gn.Bacillus, durante el proceso de la esporulacin: Durante el crecimiento vegetativo,B. subtilisposee una holoenzima tpica2'+43(=A), que reconoce los promotores estndar de los operones vegetativos. Al iniciarse la esporulacin, se sintetiza en la preespora una nueva, llamadaF, que desplaza parcialmente a laA(vegetativa). Ahora, la holoenzima reconoce los promotores de algunos operonesspo(que estaban inactivos durante el crecimiento vegetativo), que codifican funciones requeridas durante las primeras fases de la esporulacin. Uno de los genes que ahora se expresa corresponden a otra subunidades(G) distinta de las dos citadas, y que permite a la polimerasa transcribir en la preespora una nueva oleada de operonesspo, ms tardos. En una fase ms avanzada de la esporulacin, se expresan en la clula madre otros genesspodebido a la activacin de una nueva(K). Cada nueva holoenzima reconoce un tipo distinto y caracterstico de promotor (con secuencias de nucletidos peculiares), que no puede ser reconocido por las otras versiones de la ARN polimerasa dotadas de subunidadesdiferentes.

EnEscherichia coliexiste una subunidadestndar, que es la70, implicada en el inicio de la transcripcin de la mayora de los genes relacionados con el crecimiento en condiciones normales. Sin embargo, para ciertas condiciones y procesos especiales, la expresin de ciertos genes requiere el uso de subunidadesespeciales:La respuesta al choque por calor (heat-shock): siE. colise somete a una agresin de altas temperaturas, se produce la induccin de ms de 30 genes (genes de la respuesta al calor, o de respuesta al estrs), cuyos productos tienden a evitar ciertos daos ocasionados por este agente. Esta respuesta est mediada por una nueva subunidad(llamadaHo32) que desplaza a la70de la clula normal. La nueva holoenzima reconoce los genes de la respuesta al calor, todos los cuales poseen un promotor con una regin -10 totalmente diferente a la estndar.

Cuando las enterobacterias sufren hambre de N (por ejemplo, no existe amonio), una nueva subunidad(llamada54oN) desplaza a la70, y entonces la holoenzima reconoce promotores distintos, correspondientes a operones cuyos productos permiten utilizar otras fuentes de N ms raras.

El factor38se usa cuando la bacteria est en la fase estacionaria, as como cuando tiene que hacer frente a estrs oxidativo u osmtico.

Muchos genes implicados en la sntesis del flagelo bacteriano y de la quimiotaxis (ver tema 8) se transcriben con un ARN-polimerasa que emplea una subunidadespecial (Fo28).

2.1.2REGULACIN DEL INICIO DE TRANSCRIPCIN POR PROTENAS REGULADORASComo ya apuntamos, podemos encontrar dos tipos de fenmenos:induccin: el desencadenante del ajuste se denomina inductor;

represin: el desencadenante del ajuste se denomina correpresor.

En general, los desencadenantes de la respuesta se llamanefectores, y suelen ser molculas de pequeo tamao. Si estamos tratando con respuestas adaptativas metablicas, podemos hacer la siguiente generalizacin:Elinductorsuele ser el sustrato de una ruta catablica, o una molcula muy semejante al sustrato natural.

Elcorrepresorsuele ser el producto de una ruta biosinttica, o una molcula parecida.

El funcionamiento de estas molculas en su papel de efectores no depende de su interaccin metablica en la ruta correspondiente. Lo que hacen los efectores es interactuar conprotenas reguladoras especficaspara cada sistema (de cada opern o de cada grupo de operones). Y, a su vez, las protenas reguladoras interactan con una zona del opern cercana al promotor. Es frecuente que muchas protenas reguladoras bacterianas compartan un dominio tridimensional caracterstico denominado hlice-giro-hlice, que las capacita para reconocer determinadas secuencias del ADN al comienzo del opern, cerca del promotor (o incluso superspuesto al promotor).Tanto la induccin como la represin gnicas de funciones pueden deberse a su vez a:controles positivos;

controles negativos.

As pues, en la regulacin del sistema tenemos varios tipos de elementos:a)efectores: pequeas molculas que informan del ambiente exterior;b)un elemento regulatorio que acta entrans(a distancia): ungen reguladorque codifica una protena cuya nica funcin consiste en controlar la expresin (a nivel de inicio de transcripcin) de un opern de genes estructurales.c)genes estructurales(normalmente agrupados en operones, donde los genes se co-transcriben en forma de ARNm policistrnico). Estos genes pueden codificar protenas estructurales, o protenas enzimticas o simplemente transcribirse a ARNr o ARNt.La funcin controladora de la protena reguladora se ejerce por su interaccin con secuencias especficas al comienzo del opern, cerca del promotor. Estas secuencias son, pues, elementos que actan encisdentro del circuito regulatorio: esto significa que su efecto depende de que estn ligadas genticamente con los genes estructurales que van a ser sometidos a control gentico. Son secuencias que no codifican productos difusibles que pudieran actuar a distancia.Cmo se puede distinguir y discriminar entre las funciones de un regulador que acta entrans(a distancia) de una secuencia encis? Esto se puede lograr a partir de la observacin de los efectos fenotpicos de sus respectivas mutaciones y de los tests de complementacin (aunque las bacterias son haploides, se pueden realizar ensayos de complementacin gnica en diploides parciales por medio de algn sistema de transferencia gentica, como por ejemplo el uso de conjugacin con factores F-primas (F'):vase tema 18):1)La mutacin inactivante de un gen regulador tiene efectos recesivos entransy pleiotrpicos, que varan segn que el control sea de tipo positivo o negativo:a)en el caso de control negativo, la mutacin tiene efectos constitutivos;b)en el caso de control positivo, la mutacin tiene efectos ininducibles.2)La mutacin de un operador tiene efectos dominantes encis.3)Por otro lado, la inactivacin mutacional de un gen estructural simplemente priva a la clula de la funcin correspondiente.Comparemos ahora las regulaciones genticas de tipo positivo y negativo:1)Control negativo: el sistema se expresa a menos que sea desconectado por la accin de una protena reguladora, a la que se denomina represor. Dentro de este control podemos distinguir, a su vez:a)Control negativo con efectos inductores(ej: en el opernlac): el represor,per sees activo, pero se inactiva en presencia del inductor.b)Control negativo con efectos represores(ej: en el operntrp): el represor,per sees inactivo (aporrepresor), pero en presencia del correpresor se activa (adquiere su capacidad funcional), y es entonces cuando reprime al opern estructural.2)Control positivo: los genes estructurales no se transcriben (o en todo caso lo hacen a un nivel basal bajo) a no ser que exista una protena reguladora activa llamada apoinductor o activador. Tambin aqu puede haber dos categoras:a)Control positivo por induccin: la protena activadora, por s misma es inactiva, pero queda activada cuando se le une el inductor.b)Control positivo por represin: la protena activadora,per se, es activa, pero se inactiva cuando se le une el correpresor.

Control negativo con induccinControl negativo con represin

Obsrvese, pues, que el estado activo del opern vara segn que se trate de un sistema inducible o reprimible:en los sistemas inducibles, el estado activo es el inducido;

en los sistemas reprimibles, el estado activo es el desreprimido.

2.1.2.1EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO E INDUCIBLE: REGULACIN DEL OPERNlacDEE. coliIniciamos ahora el estudio de los controles genticos en un sistema paradigmtico: el opernlac(metabolismo de la lactosa) del colibacilo (Escherichia coli), que histricamente fue el primero en investigarse (por Jacob y Monod, aos 50, y que les hizo ganar el premio Nobel en 1965). En este epgrafe abordaremos el comportamiento de este opern bajo regulacin negativa (incorporando detalles ulteriores al trabajo de Jacob y Monod). Ms adelante (2.1.2.3), veremos que el opernlactambin posee un control positivo.El opernlac, est constituido por:tres genes estructurales:Gen lacZ: codifica la -galactosidasa (tetrmero de un polipptido de 116 kDa), la enzima que hidroliza la lactosa en galactosa y glucosa;

Gen lacY: determina la -galactsido permeasa (46 kDa); protena de membrana que realiza el simporte de H+y lactosa.

GenlacA: determina -galactsido acetilasa, prescindible y de papel desconocido.

un promotor para la unin de la holoenzima de la ARN polimerasa

un elemento regulador encis: el operador, parcialmente superpuesto con el promotor

Este opern est controlado por el producto de un gen situado cerca del opern (pero que no forma parte de l; este es el elemento regulatorio entrans): el genlacI, que codifica un represor que por s mismo es activo como tal. El polipptido de 38 kDa producido por este gen se agrega espontneamente formando tetrmeros, que son la forma funcional del represor.

Veamos el funcionamiento del sistema:Mientras en el medio no exista lactosa, el tetrmero del represor presenta una alta afinidad de unin hacia las secuencias del operador, y as impide que la ARN polimerasa reconozca y se una al promotor; por lo tanto, no existe apenas transcripcin del opern de la lactosa. La actividad de unin al operador reside en el extremo N-terminal, que presenta un diseo caracterstico en hlice-bucle-hlice. El operador al que se une presenta una secuencia palindrmica imperfecta.

Si en el medio existe lactosa(u otro azcar de tipo -galactsido) como nica fuente de C, dicho azcar acta como inductor del opern: se une a una zona de las subunidades del tetrmero del represor (codificado porlacI), con lo que se produce un cambio conformacional alostrico del represor; con ello disminuye la afinidad del tetrmero hacia la secuencia del operador, por lo que ahora la ARN polimerasa puede iniciar la transcripcin. El represor inactivo emigra a zonas inespecficas y aleatorias del ADN, distintas del operador.

Algunas ideas adicionalesEn realidad el inductor natural no es exactamente la lactosa, sino el ismero alolactosa, que se origina nada ms entrar aquella a la clula.

En el laboratorio se suelen emplear los llamadosinductores gratuitos: se trata de molculas artificiales (aunque-galactsidos) que si bien pueden interaccionar con el represor, no pueden ser metabolizadas (a diferencia de la lactosa). Un ejemplo es el llamado IPTG (isopropil--D-tiogalactsido).

Se ha visto que el opernlactiene de hecho tres secuencias de tipo operador. La denominada O1es la clsica, parcialmente superpuesta con el promotor, pero tambin hay que contar con la O2, centrada hacia la coordenada +440 del ARNm, y la O3, bastante aguas arriba respecto del promotor (centrada hacia -82). Se ha propuesto que los tetrmeros del represor reconocen simultneamente dos de estas secuencias, obligando al ADN a curvarse de modo pronunciado, evitando as que pueda actuar la ARN-polimerasa.

En Ingeniera gentica se suele usar a menudo algn componente del opernlac.Por ejemplo, se puede recurrir al promotorlac(bien sea en su versin silvestre o en algn mutante) para lograr la expresin de ciertos genes. Uno de los usos ms extendidos es el del genlacZ, determinante de la-galactosidasa. Cuando las clulas deEscherichia colisilvestres respecto delacZcrecen en presencia del X-gal (un galactsido artificial), las colonias tiene un aspecto azul, debido a que la-galactosidasa transforma dicho X-gal en una sustancia de color azul. Pero si el genlacZest inactivado (p. ej., porque tenga una deleccin o una insercin), las colonias son de color blanco.

Este tipo de dispositivo regulador es propio de rutas catablicas, donde el principio de economa debe garantizar que las enzimas de la ruta slo se induzcan en presencia del sustrato adecuado.2.1.2.2EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO Y REPRIMIBLE: EL CASO DEL OPERNtrpDEE. coliLa regulacin negativa y reprimible es muy apropiada y econmica para desconectar la transcripcin de los genes de rutas biosintticas de intermediarios metablicos (como aminocidos, bases nitrogenadas y vitaminas) cuando los productos finales de estas rutas estn disponibles a la bacteria a partir del medio de crecimiento. En estos sistemas, a diferencia de la regulacin de operones catablicos, la protena reguladora es inactiva en s misma, por lo que recibe el nombre deaporrepresor. El efector que desencadena la represin se denominacorrepresor, y suele ser la sustancia del medio equivalente al producto final de la ruta biosinttica. La unin del correpresor con el aporrepresor genera un complejo denominadorepresor activo.El operntrpdeEscherichia coliest compuesto por:Cinco genes estructurales en la secuenciatrpEDCBA. Codifican cinco polipptidos que a su vez constituyen tres enzimas implicadas en el paso de corsmico a triptfano.

Promotor

Operador (superpuesto al promotor).

A la zona del operador se pueden unir dmeros del elemento regulatorio entrans: un represor codificado por el gentrpR(que est lejos del opern estructural). Entre el promotor y el inicio del primer gen estructural existe una zona regulatoria compleja (lder ms atenuador) que interviene en un tipo de regulacin distinta que estudiaremos ms adelante (atenuacin). (Como ya dijimos, son muy frecuentes los sistemas genticos sometidos a varios niveles de regulacin).As pues, en esta apartado consideraremos slo el funcionamiento del sistematrpen cuanto al mecanismo de represin-desrepresin:En un medio pobre en aminocido triptfano: el gentrpRse expresa: se sintetiza el aporrepresor inactivo, por lo que la ARN polimerasa puede transcribir el opern de genes estructurales (trpEDCBA). Hay sntesis de las enzimas del opern a sus niveles desreprimidos.

En un medio rico en triptfano: el gentrpRse expresa igualmente, es decir, se sintetiza aporrepresor inactivo, pero al unirse a dos molculas de triptfano que la bacteria ha captado del medio se produce un cambio de conformacin que genera el represor activo (aporrepresor + correpresor): ahora reconoce y se une a la secuencia del operador (que est solapado con el promotor). As se impide la transcripcin del opern, aunque no totalmente. Esto da lugar al nivel de expresin basal o reprimido (que en el caso de este opern representa 1/60 del nivel desreprimido).

Adems, en medio rico en triptfano, el gen reguladortrpRse ve reprimido por su propio producto (aporrepresor + triptfano). Estamos ante un ejemplo de regulacin autgena: el nivel de represor est autocontrolado:Si existe demasiado represor, se impide la sntesis de ms represor;

Si existe poco represor se posibilita la transcripcin del gentrpR.

2.1.2.3CONTROLES POSITIVOSAlgunos operones bacterianos poseen promotores tales que no pueden ser usados eficientemente por la ARN polimerasa de forma directa para el inicio de la transcripcin, sino que adems, requieren protenas auxiliares activadoras. Es decir, la transcripcin de estos operones no ocurre (o en todo caso ocurre a un nivel basal bajo), a no ser que la protena activadora se una a zonas del ADN cercanas al promotor (normalmente al lado 5' respecto del promotor). Este tipo de promotores carecen de las secuencias tpicas -35 y -10 a las que ya hemos aludido anteriormente.Como ejemplo de regulacin positiva del inicio de transcripcin estudiaremos la que existe en el opernlacdeE. coli:Para comenzar, veamos el comportamiento de una poblacin de esta bacteria cuando en su medio de cultivo existen dos fuentes de carbono: glucosa y lactosa: se da un crecimiento en dos fases llamadocrecimiento diuxico: durante una primera fase, las bacterias aprovechan solamente la fuente ms rica de carbono (la glucosa), creciendo de modo exponencial durante unas cuantas generaciones, hasta que agotan esta glucosa. A continuacin se entra en una corta fase de tipo estacionario, que conduce a una nueva fase de crecimiento exponencial (aunque con un coeficientemenor que el de la fase exponencial anterior) debido a que en sta las bacterias han pasado a metabolizar la lactosa. Mientras exista glucosa en el medio de cultivo, no se degrada la lactosa, debido al fenmeno conocido comorepresin catablica o efecto glucosa:el catabolismo de la glucosa impide de alguna manera que se expresen los genes del opern de la lactosa. Pero una vez que la glucosa se agota, el opernlacse activa y se expresa: se sintetizan las enzimas que permiten metabolizar la lactosa. La corta fase estacionaria representa entre las dos exponenciales representa el tiempo que tardan las bacterias en conectar y expresar los genes del catabolismo de la lactosa una vez agotada la glucosa.

El nombre de represin catablica se puso en un momento en el que se desconoca la base molecular de su funcionamiento. A pesar de que sigamos usando este nombre por motivos histricos, hoy sabemos que este fenmeno es la manifestacin de un proceso de regulacin gentica positiva. A continuacin pasamos a describirlo a nivel molecular:En breves palabras, lo que ocurre es que en presencia de una fuente preferencial de carbono (como es la glucosa) el mecanismo de regulacin positiva del opernlacse inactiva. Por contra, en ausencia de glucosa y en presencia de la lactosa, este mecanismo positivo es funcional, lo que permite la estimulacin del inicio de la transcripcin del opern.Elementos del circuito regulatorio:gencrp: codifica la protena regulatoria, un polipptido que forma espontneamente dmeros, constituyendo la denominada protena relacionada con la represin catablica(CRP), tambin conocida como protena que une AMPc (CAP). Tal como es sintetizada por el gencrp, la protena CAP es inactiva (apoinductor inactivo). Pero cuando la bacteria posee niveles adecuados de AMPc (que acta como inductor endgeno), ste se une a la CAP, lo que conduce a que el dmero cambie de conformacin: en esta nueva configuracin el complejo CAP-AMPc reconoce una secuencia palindrmica cercana al promotor del opernlac(hacia su lado 5'), y acta como activador del inicio de transcripcin de este opern.

gencya: codifica laadenilato-ciclasa, enzima que convierte el ATP en AMPc.

opernlac: a la descripcin que ya dimos, solamente aadir que a la izquierda (o sea, al lado 5' o aguas arriba) del promotor existe unasecuencia palindrmica caracterstica, que como acabamos de ver es el lugar de reconocimiento del complejo activador CAP-AMPc.

Veamos, pues, el funcionamiento del circuito regulatorio:Ante todo, hay que tener presente que el nivel intracelular de AMPc est en relacin inversa con la velocidad de crecimiento de la bacteria. A su vez, la velocidad de crecimiento est en relacin directa con la riqueza de la fuente de C.

En presencia de glucosa (fuente rica de C):como se recordar(tema 6), en Enterobacterias la glucosa es transportada por elsistema de fosfotransferasa (sistema PTSGLC, un ejemplo tpico de transporte activo acoplado a translocacin de grupos). Como es sabido, en este sistema hay dos enzimas especficas del azcar a nivel de membrana, que reciben secuencialmente el fosfato (P), que a su vez ser transferido a la glucosa, que de esta forma entra al citoplasma. Mientras exista glucosa, el sistema PTSGLCestar funcionando, de modo que apenas habr nivel de E-IIAGLCfosforilada, porque rpidamente el fosfato es transferido a la glucosa en su trnsito por la membrana (bajo E-IIGLC~P). Ello supone una seal que inhibe a la enzima adenilato-ciclasa. En resumen, en presencia de glucosa los niveles de AMPc son bajos. Por lo tanto, el apoinductor CAP, aunque se est sintetizando, permanece inactivo, ya que al no haber apenas AMPc no puede cambiar de conformacin. Esta es la base molecular del fenmeno de represin catablica: observa que en realidad no es una autntica represin, sino que se trata de lano activacin de la protena activadora, debida en ltima instancia al catabolismo de la glucosa.

En ausencia de glucosa:el sistema PTSGLCno est transportando glucosa, por lo que ahora s hay altos niveles de E-IIAGLC~P (y bajos de la versin no fosforilada). El sistema ahora no enva la seal inhibidora de la actividad adenil-ciclasa : se sintetizan niveles elevados de AMPc. ste se une a los dmeros de CAP (=CRP); el concomitante cambio de conformacin permite al complejo CAP-AMPc reconocer su secuencia-diana palindrmica cerca del promotor delac. En esta interaccin con su secuencia-diana, la CAP obliga al ADN a curvarse unos 90o. Ahora la CAP interacciona con las subunidadesde la ARN polimerasa, de modo que ahora s puede efectuar el inicio de la transcripcin con gran eficiencia.

As pues, hemos completado el estudio de la regulacin del opernlac. En resumidas cuentas, cabe resaltar que se trata de un opern sometido a dos tipos de controles del inicio de la transcripcin:regulacin negativa, (represin en ausencia de lactosa, pero induccin en presencia de lactosa)

regulacin positiva, por activacin (en ausencia de glucosa y con lactosa presente)

Por lo tanto, el opernlac, para que pueda transcribirse a pleno rendimiento requiere que se cumplandos condiciones simultneamente:1.No debe haber en el medio una fuente ms rica de azcar (como la glucosa), lo que libera la represin catablica por el mecanismo de regulacin positiva a travs de CAP2.Debe existir el inductor exgeno (la lactosa), que inactiva el mecanismo de regulacin negativa.En Enterobacterias, lo que acabamos de describir para el opernlaclo podemos hacer extensivo a otros muchos operones (que comprenden ms de 300 genes) correspondientes al catabolismo de otras fuentes de C ms pobres que la glucosa. Es decir, mientras exista glucosa en el ambiente de la bacteria, sta ser usada en primer lugar, de modo que mientras se metaboliza est operando el fenmeno de represin catablica. Pero una vez agotada, y suponiendo que exista una fuente alternativa de C, sta pasar a ser usada, merced a la activacin gentica mediada por el complejo CAP-AMPc.Ejemplos de otros operones controlados positivamente por CAP-AMPc:opernara(del catabolismo de la arabinosa);

operngal(del catabolismo de la galactosa);

opernmal(del catabolismos de la maltosa).

Este conjunto de operones diferentes que estn regulados por la protena CAP se denominareguln CAP.En otras bacterias el fenmeno de represin catablica no depende de AMPc-CAP, sino que la regulacin positiva de operones catablicos de azcares distintos de la glucosa est mediada por protenas activadoras diferentes.No podemos olvidar aqu un tipo de operones transcribibles por holoenzimas de la ARN-polimerasa con subunidadesalternativas a la estndar70que requieren para su transcripcin eficiente la colaboracin de protenas activadoras especiales que reconocen secuencias de ADN situadas a bastante distancia aguas arriba respecto del respectivo promotor. Por ejemplo, en muchas bacterias Gram-negativas hay operones con un tipo de promotor especial (cuyas secuencias conservadas, centradas en -24 y -12 son diferentes a las citadas hasta ahora) reconocido slo por la versin de la ARN-polimerasa provista de la subunidad54. Pues bien, para la transcripcin de este tipo de operones (llamadosntr) se requiere la concurrencia de la protena reguladora NtrC fosforilada, que reconoce una secuencia palindrmica a unas 100 pb aguas arriba del promotor. Al parecer, la unin de oligmeros de NtrC~P a sus secuencias de reconocimiento hace que el ADN se curve, de modo que esas NtrC~P hacen contacto con la ARN-polimerasa, y tras gastar ATP ayudan en el inicio de la transcripcin.2.2REGULACIN POR ATENUACIN DE LA TRANSCRIPCINLa atenuacin es un mecanismo de control que se da en ciertos operones de rutas biosintticas (sobre todo de aminocidos), por el cual una onda de transcripcin recin iniciada puede terminar prematuramente en una zona denominada atenuador, antes de alcanzar al primer gen estructural de ese opern. A nivel de ADN, el atenuador est situado entre el promotor y el inicio del primer gen estructural, dentro de la porcin que a nivel de ARN representa al lder. A diferencia de los mecanismos de regulacin que hemos visto en la seccin anterior, la atenuacin no depende de protenas reguladoras.La atenuacin se produce por un control ejercido por la traduccin, que a su vez responde al nivel intracelular del ARNt cargado con el aminocido de la ruta biosinttica en cuestin:si existe suficiente nivel de ese aa-ARNt, habr atenuacin de la transcripcin;

si no existe suficiente de ese aa-ARNt, no habr atenuacin, y por lo tanto la transcripcin continuar hasta el final.

La presencia o ausencia del aa-ARNt concreto determina si el ribosoma puede traducir, o no, una zona temprana del ARNm (dentro de la porcin del lder): si el ribosoma puede traducir esa zona (porque existe nivel de ese aa-ARNt), el avance del ribosoma detrs de la ARN polimerasa impide ciertos emparejamientos intracatenarios dentro del ARNm naciente, pero permite otros emparejamientos alternativos de modo que se forma una estructura secundaria de tipo terminador simple (independiente de). Por lo tanto la ARN- polimerasa se atranca en esta horquilla y finalmente se separa, detenindose as la transcripcin antes de que la onda de transcripcin haya alcanzado al primer gen estructural.Mecanismo molecular de la atenuacin: lo estudiaremos con el caso del opern de la biosntesis del triptfano (trp), el primero en investigarse (por Yanofsky).Descripcin del opern trp(consultar figura): observa la zona del promotor-operador (sobre la que ya vimos en un apartado anterior que se ejerce un mecanismo de control negativo por represin); observa lasecuencia lder, al comienzo del ARNm, antes de la porcin codificadora del primer gen (trpE). Este lder consta de 162 bases, y en su interior alberga una corta regin con capacidad potencial de ser traducida por ribosomas (es decir, un marco abierto de lectura u ORF segn sus iniciales inglesas): ntese que el pptido que se sintetizara a partir de esta porcin es rico entrp, es decir, tiene unaalta proporcin del mismo aminocido objeto de la sntesisdependiente del operntrp.Como ya dijimos antes, la clave de la regulacin estriba precisamente en el lder (incluyendo la porcin del pptido rico en triptfano). La porcin de ARNm correspondiente al lder forma parte de una zona que puede adoptarestructuras secundarias distintas y alternativas, debido a la posibilidad de establecer emparejamientos intracatenarios:bien se emparejan la zona 1:2 y la 3:4;

o bien se empareja la 2:3, quedando la 1 y la 4 sin emparejar.

Pues bien, la estructura en horquilla formada por el emparejamiento de 3:4 constituye un tpico terminador de la transcripcin independiente de.Pasemos, pues, al funcionamiento del mecanismo de atenuacin:Si existe suficiente triptfano en el medio: la bacteria capta triptfano, y sintetiza el triptofanil-ARNt (ARNttrp); habr reserva suficiente de este ARNttrpcomo para poder ser usado normalmente en la sntesis de protenas. La ARN polimerasa va transcribiendo el operntrp, y detrs de ella los ribosomas comienzan a cubrir la zona del pptido dentro de lder del ARNm. Tras traducir la porcin 1 del lder, el ribosoma cubre enseguida y traduce la porcin 2. Mientras tanto, la ARN-polimerasa acaba de transcribir las porciones 3 y 4. La porcin 3 se empareja espontneamente con la 4. (Observa que a la porcin 3 no le queda ms remedio, ya que la porcin 2, con la que tericamente tambin puede emparejarse no est disponible, ya que est oculta -cubierta- por el ribosoma). Consecuencia: al formarse la horquilla 3:4, seguida por la ristra de uracilos (U), se constituye un tpico terminador de transcripcin independiente de: se termina prematuramente la transcripcin (antes de que la onda de transcripcin haya alcanzado al primer gen estructural,trpE): este es precisamente el fenmeno de atenuacin.

Si el triptfano es limitante en el medio: la bacteria dispondr de pocos ARNt cargados on el aminocido triptfano (o sea, el pool intracelular de ARNttrpestar a bajos niveles). El ribosoma, al llegar a los codones de triptfano dentro de la porcin codificadora del lder, se quedar atrancado, debido a que no encuentra el ARNttrpque introduzca el triptfano frente a dos codones seguidos para ese aminocido. El ribosoma se queda, pues, detenido en la porcin 1. Mientras tanto, la ARN polimerasa le va sacando ventaja al ribosoma, de modo que transcribe la porcin 2, luego la porcin 3... pero antes de terminar con la porcin 4, la 2 y la 3 se emparejan entre s (de modo que es ahora la 4 la que se queda sin emparejarse). Esto implica que ya no se puede formar la estructura secundaria 3:4 seguida de varios U: por lo tanto, no hay terminacin de la transcripcin, sino que sta contina y abarca a todo el operntrp, y finalmente se sintetizan las enzimas biosintticas que conducirn a la sntesis del aminocido triptfano.

Otros casos de atenuacin:La atenuacin es un sistema de control gentico de una amplia variedad de operones biosintticos, especialmente de aminocidos. Otros ejemplos descubiertos despus del sistematrp:opernhis: sntesis de histidina

opernphe: sntesis de fenilalanina;

opernleu: sntesis de leucina;

opernthr: sntesis de treonina;

opernilv: sntesis de isoleucina y de valina.

Algunos de estos operones (como elhis) slo poseen atenuacin como mecanismo de control, mientras que otros gozan, adems de regulacin por represin.Los ARNm de cada uno de estos operones posee en su inicio una porcin lder ms o menos larga, pero con las caractersticas que ya hemos visto:contiene un marco de lectura abierta (ORF=open reading frame) con capacidad potencial de codificar un pptido rico en el aminocido que la ruta correspondiente debe sintetizar. Por ejemplo: La ORF del lder del opernhiscodifica un pptido de 17 aa., de los cuales 7 son histidina. La ORF del lder del opernleucodifica un pptido de 28 aa., de los cuales 4 son leucinas.

el lder del ARNm puede formar estructuras secundarias alternativas, incluyendo un atenuador (es decir, una estructura en horquilla seguida de ristra de uracilos, que acta como un poderoso terminador prematuro de la transcripcin).

En resumen: La atenuacin es un mecanismo que permite detectar los bajos niveles intracelulares del aminocido en cuestin (bajo la forma de aminoacil-ARNt), los cuales dependen a su vez de bajos niveles del aminocido en el medio, de modo que la bacteria responde a las necesidades inmediatas de ese aminocido (que se requiere para la sntesis proteica). El mecanismo estriba en la capacidad o incapacidad del ribosoma para atravesar la regin lder, lo que a su vez determina la formacin de estructuras secundarias alternativas en el lder. Como se puede constatar, la atenuacin es un mecanismo que depende totalmente del estrecho acoplamiento que existe en bacterias entre transcripcin y traduccin.3SISTEMAS DE REGULACIN DE DOS COMPONENTES: SENSORES Y REGULADORES DE RESPUESTALos sistemas de regulacin que hemos estudiado hasta ahora se ponen en marcha cuando un estmulo ambiental qumico, normalmente una pequea molcula relacionada con el metabolismo (el efector), entra en la clula e interacciona con una protena reguladora, que a su vez se une (o deja de unirse) con una secuencia de ADN al comienzo del opern. Pero hace relativamente pocos aos se descubri que las bacterias poseen tambin numerosos sistemas en los que la seal ambiental no entra a la clula, sino que es detectada por un sensor a nivel de membrana, el cual reemite (transduce) el estmulo hacia una protena citoplsmica, la cual a su vez interacciona con secuencias determinadas al comienzo del opern, para regularlo, generando as la respuesta adaptativa correspondiente a la seal ambiental. Como en la mayor parte de los casos el sistema funciona con dos protenas (la sensora y la reguladora), a este tipo de sistemas se los conoce con el nombre de sistemas de regulacin de dos componentes.Los distintos sensores, a pesar de que cada uno detecta un estmulo diferente, se parecen entre s en al menos parte de su secuencia, y lo mismo ocurre con los reguladores de respuesta, por lo que se habla de dos familias de protenas (cada una con un probable origen evolutivo comn):1.Familia dehistidn-proten-quinasas (HPK): Este tipo de protenas son lassensorasde algn tipo de estmulo ambiental. Muchas de ellas son autofosforilables, pero su funcin esencial es la de fosforilar al correspondiente segundo miembro de la pareja (el regulador). Los distintos sensores suelen tener en comn su porcin carboxiterminal, denominadadominio transmisor(que incluye la histidina fosforilable). Los sensores suelen ser protenas integrales de membrana citoplsmica. Cada sensor tiene un dominio aminoterminal caracterstico, inmerso en el espacio periplsmico, y de este modo detectan algn estmulo procedente del ambiente. Al hacerlo, parece que cambian de conformacin, de modo que el dominio transmisor intracitoplsmico se autofosforila y luego fosforila al correspondiente regulador de respuesta.2.Familia dereguladores de respuesta(RR): cada regulador de respuesta, tras ser fosforilado en cierto asprtico por su correspondiente HPK, ejerce algn efecto regulatorio. Normalmente, los RR fosforilados actan como activadores de la transcripcin de ciertos operones. Los distintos reguladores comparten un mismo tipo de dominio aminoterminal, denominadodominio receptor, que incluye el asprtico que recibe el fosfato del sensor correspondiente. Los reguladores que actan como activadores de transcripcin suelen incluir un dominio carboxiterminal a base del tpico motivo hlice-giro-hlice, capaz de interactuar con ciertas secuencias de ADN.

Los sistemas de dos componentes son muy abundantes en bacterias. Por ejemplo, enE. colise han descubierto unos 50, entre los cuales podemos citar:Sistema Ntr de utilizacin de fuentes de nitrgeno, que responde ante los niveles de amonio, y que permite el uso de fuentes alternativas de nitrgeno.

Sistema de respuesta ante osmolaridad: el aumento de presin osmtica es detectado por la HPK sensora llamada EnvZ, que fosforila al regulador OmpR. A su vez, este regulador controla las proporciones relativas de dos porinas, OmpC y OmpF, haciendo que predomine la porina de poro ms pequeo (OmpC).

4MECANISMOS REGULADORES GLOBALESPara finalizar este recorrido por los principales tipos de mecanismos de regulacin de la expresin gnica en bacterias, vamos a referirnos brevemente a algunos ejemplos de grandes sistemas de operones que se ven sometidos a una regulacin coordinadada comn, encaminada a la superviviencia de la bacteria en determinadas circunstancias ambientales extremas o a realizar grandes ajustes metablicos para adaptarse a cambios bruscos en las condiciones nutricionales.4.1RESPUESTA SOS ANTE GRANDES DAOS EN EL ADNRepasemos algo que ya vimos en elcaptulo 13(Influencia de los agentes fsicos sobre las bacterias): en determinados procariotas existe un sistema inducible de reparacin a los daos severos al ADN ocasionados por agentes como la luz UV o las sustancias alquilantes. Los genes SOS se desreprimen segn el siguiente esquema:Cuando el ADN de la bacteria est seriamente daado, existen zonas de ADN de cadena sencilla sin reparar. Esto constituye una seal por la que la protena RecA (que est en este momento a una concentracin basal relativamente baja) se modifica y se convierte en una proteasa muy especfica (RecA*): la RecA*rompe a la protena LexA, que estaba reprimiendo una serie de operones, incluyendo arecA, uvrABC, umuDC,etc. Por lo tanto, estos genes se expresan ahora a alto nivel:la expresin deuvrABCinduce una mejora de la reparacin por escisin resntesis;

la expresin derecAmejora la reparacin por recombinacin;

la expresin deumuDCfavorece una sntesis de emergencia de ADN, por la que se introducen frecuentes errores: hay aumento de la mutagnesis;

se altera la regulacin del crecimiento y divisin celular: las clulas se hacen filamentosas, muy largas, con formas anmalas.

Todos estos cambios, a pesar de las alteraciones que provocan en las clulas, suponen la salvaguardia, en ltima instancia de su viabilidad. Cuando las circunstancias agresivas (UV) desaparezcan, el mismo circuito regulador se encarga de que las clulas vuelvan rpidamente a su metabolismo normal.4.2RESPUESTA AL CHOQUE TRMICOLa llamada respuesta al choque trmico es un mecanismo adaptativo compartido por prcticamente todos los seres vivos, consistente en el aumento rpido de la sntesis de una serie de protenas (denonimadas protenas Hsp, iniciales del inglsheat shock proteins) ante la elevacin brusca de la temperatura por encima de la ptima, con un ulterior descenso lento a sus niveles basales. A pesar de que esta respuesta se descubri precisamente ante aumentos de temperatura, se sabe ahora que en realidad se induce ante otros tipos de agresiones o estrs ambientales (como por ejemplo, presencia de etanol u otros solventes orgnicos en el medio, o dao al ADN). Las protenas Hsp protegen a las clulas del dao que les causara una posterior elevacin adicional de la temperatura. Obviamente, este sistema parece que constituye un mecanismo adaptativo de proteccin que, una vez que detecta incrementos anmalos de temperatura, prepara a la bacteria para soportar perodos relativamente largos a temperaturas por encima de la ptima de crecimiento.EnEscherichia colila mayor parte de los 36 genes codificadores de protenas Hsp forman un reguln, y los correspondientes operones son transcritos por la versin de la ARN-polimerasa provista de la subunidad32.La mayor parte de las protenas Hsp se expresan a niveles basales durante el crecimiento normal, pero tras la agresin ambiental, aumentan abruptamente y luego vuelven lentamente al nivel normal (aun cuando p. ej., la temperatura siga alta). Algunas de las Hsp sonprotenas celadoras (chaperonas; vase tema 7) que intervienen en el plegamiento adecuado de otras protenas. Entre estas celadoras se encuentran GroE, DnaK, DnaJ y GrpE. Otras Hsp son proteasas (como la Lon) que degradan protenas demasiado anmalas. Estos papeles de las protenas Hsp explican por qu la respuesta al choque por calor es transitoria:Inmediatamente despus de la agresin ambiental, las protenas, al no tener las concentraciones de sales y otros componentes adecuados a su estabilidad, tienden a desnaturalizarse. La respuesta adaptativa viene enseguida, aumentando los niveles de protenas celadoras (que ayudan a replegarse a las protenas defectuosas, parcialmente desnaturalizadas) y de proteasas (que eliminan protenas intiles desnaturalizadas).

Pero una vez que ha pasado un tiempo, el medio interno de la clula ya se ha adaptado a las nuevas condiciones, por lo que ya no hace falta un nivel tan alto de Hsp, por lo que la respuesta va remitiendo.

Los operones del reguln del choque por calor se transcriben a partir de promotores especiales (con su propia secuencia consenso) cuando son reconocidos por la holoenzima de la ARN-polimerasa con la subunidad32. Durante el crecimiento en condiciones normales, hay muy pocas molculas de32en la clula, debido a que se degrada rpidamente (en uno o dos minutos), pero cuando sube la temperatura de 30 a 42 C, los niveles suben 15 veces, de modo que aumenta la transcripcin de los genes del choque trmico. Al parecer, esos niveles de32vienen regulados postraduccionalmente por alguna de las propias chaperonas.El modelo actual dice lo siguiente:en condiciones normales las protenas celadoras (chaperonas) DnaK, DnaJ y GrpE se unen a polipptidos nacientes ayudndoles a plegarse adecuadamente. Pero por otro lado, la DnaK se une tambin a la poca32, de modo que sta no slo no puede ayudar al inicio de transcripcin de los operones Hsp, sino que adems queda inestabilizada y es ms susceptible de ataque por proteasas.

Cuando hay un choque por calor, al cambiar bruscamente las condiciones del medio celular, las protenas en general tienden a desnaturalizarse, por lo que en un primer momento las chaperonas se dedican a intentar replegar correctamente el mayor nmero de protenas. Esto significa que ahora la DnaK tiende preferentemente a unirse a protenas diferentes del factor32. Por lo tanto, la32intacta se va acumulando en la clula e incrementa su actividad, y se puede producir el aumento de expresin de los operones Hsp, incluyendo el mismodnaK. Esto explica igualmente el fenmeno ya comentado de que la expresin de las Hsp va volviendo poco a poco a su nivel basal: cuando se ha acumulado una buena cantidad de DnaK suficiente para ayudar a replegarse a las protenas celulares, y cuando ha dado tiempo a que las condiciones internas se ajusten a las condiciones del estrs ambiental, vuelve a haber DnaK libre como para volver a unirse a la32, de modo que lentamente se vuelve al nivel normal de transcripcin de los genes de las protenas del choque trmico.