Autores: Quijano Vargas Mónica Juliana,Quijano Parra Alfonso, Meléndez Gélvez IvánTítulo de la ponencia: MUTAGENICIDAD Y GENOTOXICIDAD EN EL AIRE DE PAMPLONA-COLOMBIAPOR LOS HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS Y LOS METALES, Escuela o facultad :Departamento de Química. Facultad de Ciencias Básicas. Universidad de PamplonaÁrea temática: Química AtmosféricaPalabras claves: Benzo(a)pyrene, PM2.5, Test de Ames, ensayo cometa, actividad mutagénica y genotóxica.

ResumenLas exposiciones prolongadas a la contaminación del aire por el material particulado-fracción respirable PM 2.5, se han asociado con la mortalidad atribuible a enfermedad isquémica del corazón, arritmias, insuficiencia cardíaca, y paro cardiaco. Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) son uno de los contaminantes prioritarios del aire debido a sus propiedades extremadamente peligrosas para la salud humana. Muchos de los HAPs son citotóxicos y mutagénicos. Para determinar la actividad mutagénica de las muestras del aire de Pamplona se siguió el test de Ames, usando las cepas TA 100 y TA-98 de Salmonella typhimurium. Se utilizó el ensayo Cometa para determinar el daño genotóxico.La extracción de la materia orgánica presente en las muestras del aire de Pamplona (PM2.5)se realizó por ultrasonido, utilizando como solvente el Diclorometano. En este trabajo nosotros reportamos la identificación de un grupo de HAPs determinados por Cromatografía de Gases/FID en el aire de Pamplona, Colombia; los HAPs encontrados fueron los siguientes: Benzo(a)pireno, Benzo(c) fluoreno, Benzo(b)fluoranteno, Criseno, Benzo(k)fluoranteno, clasificados como carcinogénicos y probablemente carcinogénicos para humanos. Es necesario señalar que el Benzo(a)pireno es considerado carcinógeno en humanos según la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer (IARC). La actividad mutagenica y genotoxica inducida por el material particulado (PM2.5) de Pamplona la podemos

atribuir a las emisiones de los motores diésel, debido a que esta ciudad es recorrida por una vía nacional, la cual presenta un alto flujo de vehículos de carga que funcionan a base de este combustible.Palabras clave: Benzo(a)pyrene, PM2.5, Test de Ames, ensayo cometa, actividad mutagénica y genotóxica.

Mutagenic and genotoxic on air Pamplona-Colombia by polycyclic aromatic hydrocarbons and metals

AbstractProlonged exposure to air pollution by particulate matter (respirable fraction PM 2.5), have been associated with mortality attributable to ischemic heart disease, arrhythmias, heart failure, and cardiac arrest. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are among the priority pollutants in the air, due to the properties extremely dangerous for human health. Many PAHs are cytotoxic and mutagenic. Mutagenic and genotoxic activity from Pamplona air samples was determined by the Ames test and the comet assay. To determine the mutagenic activity from Pamplona air samples we use the Ames test with Salmonella typhimurium strains TA 100 and TA-98. Comet assay was used to determine the genotoxic damage.In this paper we report the identification of a group of PAHs determined by gas chromatography / FID from Pamplona-Colombia air; PAHs found are: Benzo (a) pyrene, Benzo (c) fluorene, Benzo (b) fluoranthene, Chrysene, Benzo (k) fluoranthene, classified as carcinogenic and probably carcinogenic to humans. Mutagenic and genotoxic activity induced by particulate matter (PM) in Pamplona can be attributed to emissions from diesel engines, because this city is crossed by a national route, which has a high flow of freight vehicles operating based on this fuel.Keywords: Benzo (a) pyrene, PM2.5, Ames test, comet assay, mutagenic and genotoxic activity Introducción. La contaminación del aire por material particulado (PM) se considera un serio problema ambiental debido a la presencia en la atmósfera de materiales peligrosos tales como

metales traza tóxicos [1]. Se ha demostrado que los metales asociados con PM aumentan las lesiones cardiopulmonares en los seres humanos [2] .Estudios epidemiológicos relacionados con los efectos en la salud de la contaminación ambiental del aire sugieren que esta puede ser la responsable del aumento de la tasa de cáncer de pulmón [3]-[5]Los estudios epidemiológicos han informado las asociaciones entre los problemas de salud, especialmente enfermedades respiratorias y la exposición a partículas finas y ultrafinas (PM10 y PM2.5). Las partículas de la fracción respirable (PM10 y PM2.5) tienen la capacidad de penetrar y depositarse en las regiones traqueo-bronquial y alveolar del tracto respiratorio [6].En cuanto a los efectos sobre la salud humana, el material particulado (PM) fracción respirable es el de mayor preocupación, ya que a largo plazo la exposición al PM se ha asociado con una mayor incidencia de enfermedades pulmonares, cardiovasculares y cáncer [7],[8].En las áreas urbanas los metales pesados provienen de las emisiones vehiculares y actividades industriales[9]. Diferentes Hidrocarburos aromáticos y metales son considerados como probables o posibles carcinógenos humanos por la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer [10]. Los metales pesados manifiestan los efectos citotóxicos en las células de varios tejidos, y la regulación estricta de los metales es esencial para la salud de los organismos [11].La identificación y cuantificación de la exposición humana a estos compuestos mutagénicos y genotoxicos es imprescindible en la evaluación de los riesgos de la salud pública. Las partículas PM10 y PM2.5 muestran mutagenicidad directa e indirecta y los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) son considerados como las principales causas de acción indirecta de mutagenicidad, mientras que los hidrocarburos aromáticos nitropoliciclicos(NPAHs) son considerados como las causas principales de la acción

directa de la mutagenicidad [12].La mutagenicidad de las partículas emitidas por los tubos del escape de motores diesel (DEP) ha sido ampliamente estudiada [13]-[15] y se ha demostrado su actividad mutagenica directa [16].Partículas del escape de motores diesel (DEP) causan una grave contaminación del aire urbano [12] y pertenecen a la clase de partículas del tamaño de las vías respiratorias, lo cual ha sido implicado como responsable de aumento de la mortalidad diaria y las tasas de morbilidad en condiciones ambientales de la exposición [6].Los estudios de mutágenos en el aire proporcionan algunas evidencias sobre el origen de estos. Debido a que un número de los estudios se produjo en sitios urbanos, varios investigadores indican que las fuentes móviles (automóviles, camiones, etc), contribuyen significativamente al nivel de mutágenos en el aire[13],[17]. Aparte de su carcinogenicidad, los HAPs pueden ejercer sus efectos negativos sobre el organismo humano por la inducción de estrés oxidativo.Estos compuestos tienen la capacidad para entrar en ciclos redox, aumentar la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y por lo tanto, causar estrés oxidativo. El efecto del PM en los organismos depende de su composición química: un mayor contenido de HAPs aumenta la genotoxicidad del PM, resultando en la formación preferencial de aductos HAP-ADN [18] En el aire de Colombia, no existe información en general sobre los niveles de mutagenicidad /genotoxicidad y su relación con los metales pesados e hidrocarburos Aromáticos Poli cíclicos (HAPs).En el presente estudio las partículas en suspensión (PM2.5) y los compuestos volátiles se recogieron en un equipo Partisol 2025 Plus durante el periodo comprendido entre Enero- Julio 2011 cerca de una vía muy transitada en Pamplona-Norte de Santander por vehículos que funcionan con diesel y gasolina. Estas muestras se analizaron para la detección de Hidrocarburos Aromáticos

Poli cíclicos (HAPs) por Cromatografía de gases/FID, los metales pesados se determinaron por Absorción Atómica y se realizaron bioensayos para determinar su actividad gen tóxica y muta génica; las actividades muta génicas y gen tóxicas asociadas con el aire ambiente de Pamplona-Colombia, se evaluaron utilizando dos bioensayos: el tes de Ames usando cepas de Salmonella typhimurium TA 98 y TA100 y el ensayo cometa. Metodología.

EL monitoreo del PM2.5 se realizó con un equipo Partisol- Plus Model 2025-Air sampler. U.S.EPA. Reference designated PM2.5 Method RFPS 0498-118 in accordance with 40CFR Part 53 de la Ruprecht-Patashnick. Se realizó el monitoreo de la fracción respirable PM2.5 en Pamplona-Norte de Santander. Las muestras ambientales obtenidas en muestreos de 24 horas, con una frecuencia de tres días se realizaron durante el período comprendido entre Enero-Julio del 2011.El monitoreo de PM 2.5 se realizó en una vía que presenta un alto flujo vehicular, particularmente de tráfico pesado que utiliza como combustible el Diesel ya que éste sector es paso obligado del transporte vehicular que une a Colombia con Venezuela, generando un mayor riesgo en la salud humana por la exposición a contaminantes, en especial en la población más vulnerable. Otra particularidad que tiene Pamplona es que no tiene industrias contaminantes y la única fuente de contaminación atmosférica son los vehículos que circulan por esta ciudad. Por consiguiente el análisis fisicoquímico de los filtros nos dará una idea de la magnitud de la contaminación ambiental producida únicamente por la combustión vehicular.Análisis de metales.Para la detección de los metales presentes en el PM2.5 se utilizó un equipo de Espectrofotometría de Absorción Atómica (EAA) Perkim Elmer Analyst 300. Para realizar

la curva de calibración se usaron patrones Analíticos de Merck.Para la extracción y el análisis de los elementos metálicos recolectados en la localidad de Pamplona (Norte de Santander), se utilizó el método (EPA IO-3.2, 1999), que establece una digestión del 10% del área del filtro. Extracción de la Materia Orgánica de los filtros de PM2.5

La materia orgánica de los filtros de PM 2.5

(HAPs) se extrae por ultrasonido [19], en un baño ultrasónico (Branson 1510, modelo 1510R-MT); se utiliza diclorometano como solvente de extracción. Una vez obtenido el extracto orgánico, se lo concentra en un evaporador rotatorio de vacío , marca Heidolph modelo Laborota 400-1, a una temperatura de 30ºC a 150 rpm; hasta aproximadamente 10 ml. Posteriormente el extracto se transfirió a dos viales cada uno de 5ml. El extracto global se utiliza para la determinación de Hidrocarburos Aromáticos Poli cíclicos (HAPs) por Cromatografía de Gases y el otro para los ensayos muta génicos.Las muestras de HAPs se secaron con Na2SO4, con el fin de eliminar el agua residual y preparar la muestra para el análisis cromatográfico. Se guardaron en frasco ámbar, manteniéndolas refrigeradas a 4 °C.Detección de Hidrocarburos Aromáticos Poli cíclicos (HAPs)Para identificar los Hidrocarburos Aromáticos Poli cíclicos (HAPs) presentes en el PM2.5 de Pamplona se utilizó un equipo de Cromatografía de Gases marca Agilent Technologies 6890A Plus Series II Hewlet-Packard Plus con detector FID (Flame Ionization Detector). La columna utilizada es Agilent DB-EUPAH 20m de longitud, 0.18mm de diámetro, 0.25μm de diámetro interno(5% phenyl methylpolysiloxane). Para la identificación de los HAPs se utilizó el patrón de 16 hidrocarburos de Restek (catalogo # 31841 EPA Method 8310 PAH Mixture). La identificación cualitativa de los HAPs presentes

en el extracto global se realizó de acuerdo a las siguientes condiciones: detector FID a 320ºC Mezcla (mL/min): Aire 400 – H2 30 –N2

45. Se inyectó 1 µl, modo splitless a 320oC. Temperatura inicial 45ºC por 0.8 min y se incrementa de la siguiente manera: 45°C/min hasta 200ºC, 2,50°C/min hasta 225ºC, 3°C/min hasta 266ºC, 5°C/min hasta 300ºC, 10°C/min hasta 320ºC durante 4,50min.Tiempo de análisis por muestra 41.21 min. Gas de arrastre Helio, flujo 20 mL/min. Temperatura del inyector 250 ºC.Test de AmesUno de los métodos para determinar la actividad mutagénica de la materia orgánica proveniente del PM 2.5 es el test bacteriano desarrollado por Ames [20] que utiliza cepas mutadas de Salmonella tuphimurium, las cuales no sintetizan la histidina, por lo tanto, son incapaces de formar colonias en agar sin este aminoácido. Las mutantes se reconocen, porque revierten esta característica cuando se les pone en contacto con un mutágeno. Las variedades más populares utilizadas en las investigaciones mutagenicas son las cepas TA 98 y TA 100 Ensayo Cometa. El ensayo cometa es una técnica altamente sensible para evaluar el daño y la reparación del ADN en cualquier tipo de célula eucariota. Este, en su versión alcalina, permite detectar roturas de simple cadena y sitios sensibles al álcali que se originan durante la reparación dando lugar a la formación de la cola del cometa[21].Resultados y DiscusionLos metales hallados en el aire de Pamplona son: Fe ,Pb, Zn,K,Ni, Mn y Cr. Es de anotar que en el municipio de Pamplona la principal fuente de contaminación atmosférica es el tráfico vehicular, porque en este municipio no existe ningún tipo de industria, lo que nos permite inferir que los metales pesados encontrados en el aire de Pamplona son emitidos básicamente por la combustión vehicular, estos resultados concuerdan con estudios realizados por otros

autores [22]-[25]. Como se puede observar en la Tabla 1, se detectó actividad mutagénica directa en las cepas TA-98 y TA-100, esta actividad supera más de dos veces el control negativo, lo que nos indica la presencia de compuestos mutagénicos. Esta mutagenicidad la podemos atribuir al Pb, dado que ha sido asociado con varios efectos, incluyendo carcinogenicidad, mutagenicidad y teratogenicidad [26]. De igual manera compuestos de Pb han sido enumerados como posibles carcinógenos humanos sobre la base de datos de roedores [27]. Como se observa en la tabla 2, las muestras de aire analizadas muestran un alto potencial genotóxico, cuando se evaluó en el ensayo Cometa. Este resultado nos indica que existe un riesgo en la población expuesta, teniendo en cuenta que existe una correlación entre el incremento del daño en el ADN y cáncer en humanos [28].Parte de la actividad mutagénica también la podemos atribuir al Cr y el Ni, los cuales son conocidos metales cancerígenos [21],[22],[26]. Los metales pesados causan estres oxidativo y pueden asociarse con formación de tumores en células mamarias [13]. El perfil cromatográfico del extracto global de los compuestos orgánicos presentes en el PM2.5 de la ciudad de Pamplona muestra la existencia de los siguientes hidrocarburos aromáticos poli cíclicos (HAPs) : Benzo( c) fluoreno, Criseno (2B), Benzo(b)fluoranteno (2B), Benzo(k)fluoranteno (2B),Benzo(a)Pireno(1). Es de anotar que estos HPAs provienen exclusivamente de la combustión de las fuentes móviles que circulan con diesel y gasolina.Estos hallazgos nos indican que parte de la mutagenicidad y genotoxicidad mostrada por el aire de Pamplona, es ocasionada por los HAPS encontrados, dado que existe suficiente evidencia que correlaciona la presencia de estos compuestos y el riesgo para la salud humana. Por ejemplo, el Benzo (a) pireno está clasificado según la EPA [29] en el grupo 1 como carcinógeno para humanos; ,el Criseno,el

Benzo (b) fluoranteno y el Benzo (k) fluoranteno se clasifican en el grupo (2B ) como posiblemente carcinogénicos para humanos.

ConclusiónEl aire de Pamplona muestra genotoxicidad y mutagenicidad, la cual probablemente se debe a los HAPs Benzo (a) Pireno,Criseno, Benzo(b) fluoranteno,Criseno, Benzo(k)fluoranteno así como a los metales Cr, Ni, Pb,esta genotoxicidad está relacionada con las emisiones de los motores Diesel que circulan por la ciudad.

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Tabla 1. Actividad mutagénica en cepa TA-98 y TA-100 de Salmonella tiphymurium , de muestras de aire provenientes del municipio de Pamplona Norte de Santander Colombia .

Dosis (µg) Número de revertantesTA-98 TA-100

50 191 ± 10 299 ± 17

100 222 ± 12 322 ± 20150 237 ± 21 385 ± 13Control negativo

22 ± 4 90 ± 5

Control positivo

437 ± 14 567 ± 24

Cada valor corresponde al promedio de tres experimentos independientes. Como control negativo se uso DMSO 12% y como control positivo se usó 4-NQO. Se considera respuesta positiva si las revertantes del tratamiento superan mas de dos veces las revertantes del control negativo.

Tabla 2. Daño del ADN en linfocitos de sangre periférica humana inducida por material particulado fracción respirable PM2.5 de Pamplona Norte de Santander Colombia.Dosis (µm)

Promedio de la longitud de cola en µm ± DS

50 108 ± 17100 154 ± 20150 162 ± 22Control positivo

164 ± 21

Control negativo

41 ± 11

Se analizaron un total de 200 células en cada uno de los ensayos. Como control positivo se usó el peróxido de hidrogeno y como control negativo se utilizó dimetil sulfoxido que fue el solvente usado para disolver las muestras.