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Nuevos ensayos sobre contaminación seminal
IV JORNADA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL: “ESTÁNDARES DE CALIDAD EN INSEMINACIÓN” 18 OCTUBRE 2017
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La pesadilla de la contaminación bacteriana
-Disminución del periodo de conservación de las dosis espermáticas (<48 h) -Presencia de aglutinaciones espermáticas
Motilidad -Acrosomas dañados -Aumento de la incidencia de cerdas con retorno regular a celo. -Presencia de descargas vaginales a partir de los 5-17 días de la inseminación.
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Herramientas de diagnóstico
Método Detección Identificación Antibiograma
Cultivo en placa 24-48h - 72 horas
Laminocultivos 24-48 h - -
PCR 4 h*** 4h*** -
Citometría 10 min - 1 hora
Kits rápidos 24 h 24h 18 h
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Citometría
Coste pocillo Coste mano de
obra
Coste total
análisis
3€ 2-3 € 5-6 €
Inversión:
Citómetro:25000-80000 €
Ventajas:
-Rapidez: contaminación en 20 minutos, antibiograma en 90
minutos
-Fácil de utilizar
-Preparación rápida
-Precio por muestra bajo
-Permite otros muchos análisis en el semen
Desventajas:
-Inversión inicial alta
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Preparación de la muestra
• Mezcla de fluorocromos en cada pocillo
• Incubación 10 minutos a 37ºC
• Lectura : recuento del número de bacterias por mL.
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Preparación de la muestra
• Tomamos 24 microlitros de semen y lo diluimos en 2,4 ml de tampón.
• Repartimos 200 microlitros en cada pocillo (200 x12=2400 microlitros)
• Cargamos cada fila con un eyaculado diferente
• Cada columna contiene un antibiótico diferente
• La primera columna es el control (sin antibiótico)
Control
Sin ATB
Dosis o eyaculado 1
ATB1 ATB2 ATB3 ATB4 ATB5 ATB6 ATB7 ATB8 ATB9 ATB10 ATB11
Dosis o eyaculado 2
Dosis o eyaculado 3
Dosis o eyaculado 4
Dosis o eyaculado 5
Dosis o eyaculado 6
Dosis o eyaculado 7
Dosis o eyaculado 8
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Menor concentración de bacterias en pocillos con ATB no eficaz
Pocillos control (sin ATB)
Pocillos con ATB no eficaz la población de
bacterias activas se mantiene intacta
(Bacteria antibio-resistente)
Pocillos con ATB eficaz
(Bacteria sensible)
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Pocillo Concentración
bacteriana
20 min
(x108UFC/ml)
Incremento
Concentración
bacteriana
50 min
Incremento
Concentración
bacteriana
150 min
Control sin ATB
(n=6)
0,27a +0,5% +21,8%
ATB no eficaz
(n=15)
0,25a +10,5% +2,2%
ATB eficaz (n=6) 0,34a -35,7% -55,3%
Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05)
• 6 muestras seminales sembradas con diferentes cepas
antibióticas (108UFC/ml)
• Control sin ATB y 5 ATBs diferentes (Apramicina 90
µg/ml , Neomicina 50 µg/ml , Cefalexina 150 µg/ml,
Estreptomicina 50 µg/ml, Ceftiofur 150 µg/ml)
• Incubaciones de 20 min, 50 min y 150 min
• Comparativa con antibiograma tradicional y kit rápido
Menor concentración de bacterias en pocillos con ATB no eficaz
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Interacciones antibiótico-bacteria
Pocillos control (sin ATB)
Pocillos con ATB no eficaz la población de
bacterias activas se mantiene intacta
(Bacteria antibio-resistente)
Pocillos con ATB eficaz
(Bacteria sensible)
Activas
Las bacterias vivas se pueden
dividir en bacterias activas e
inactivas
Inactivas Muertas
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Pocillo Ïndice de
actividad
bacteriana
20 min
Ïndice de
actividad
bacteriana
50 min
Ïndice de
actividad
bacteriana
150 min
Control sin ATB
(n=15)
7,4% a 7,5%a 8,0%a
ATB no eficaz
(n=15)
5,7%a 3,5%a 3,0%b
ATB eficaz (n=6) 3,1%b 2,9%a 2,8%b
Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05)
• 6 muestras seminales sembradas con diferentes cepas
antibióticas (108UFC/ml)
• Control sin ATB y 5 ATBs diferentes (Apramicina 90
µg/ml , Neomicina 50 µg/ml , Cefalexina 150 µg/ml,
Estreptomicina 50 µg/ml, Ceftiofur 150 µg/ml)
• Incubaciones de 20 min, 50 min y 150 min
• Comparativa con antibiograma tradicional
Interacciones antibiótico-bacteria
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Kits rápidos de pruebas bioquímicas
Coste Kit Coste mano de
obra
Coste total
10-30 € 2-3 € 12-33 €
Inversión:
Estufa:400-800 €
Autoclave: 4000-6000 €
Ventajas:
-Rapidez: identificación 24-48 horas, antibiograma 14 horas
-Fáciles de utilizar
-Bacterias responsables de contaminación seminal
-Preparación rápida
-Inversión baja
Desventajas:
-Límite mínimo de detección alto (103 a 105 UFC/ml)
-Antibióticos utilizados en otros ámbitos clínicos
-Coste fungible puede ser elevado
-Inexactitud
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Identificación bacteriana
>105 UFC/ml
• E Coli
• Grupo PPM (Proteus, Providencia)
• Grupo KES (Klebsiella, Enterobacter,
Serratia)
• Pseudomona
• Enterococos
• Estafilococos
• Candida
>5 x103 UFC/ml
• E Coli
• Enterobacterias
• Pseudomona
• Estreptococos
• Estafilococos
• Enterococos
• Micoplasma
H) V)
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Antibiograma
Antibiograma
• Cloxacilina,
• Amoxicilina + ac. Clavulánico,
• Ampicilina + Colistina,
• Cefalexina,
• Cefoperazona,
• Ceftiofur,
• Cefquinoma,
• Gentamicina,
• Espiromicina,
• Tilosina,
• Marbofloxacino,
• Penicilina + Estreptomicina,
• Sulfonamidas + Trimetroprim,
• Tetraciclina + Neomicina + Bacitracina
Antibiograma
• Amikacina - 32 μg / mL
• Gentamicina - 8 μg / mL
• Tobramicina - 8 μg / mL
• Piperacilina-Tazobactam - 128/4 μg / mL
• Fosfomicina - 200 μg / mL
• Cefoperazona - 64 μg / mL
• Cefotaxima - 64 μg / mL
• Ceftazidima - 32 μg / mL
• Ampicilina / Sulbactam - 32/16 μg / mL
• Ácido nalidíxico - 32 μg / mL
• Ciprofloxacina - 4 μg / mL
• Levofloxacina - 8 μg / mL
• Amoxicilina / Ácido clavulánico - 32/16 μg / mL
• Co-trimoxazol - 8 μg / mL
H) V)
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verraco UFC/ml E Coli H Proteus Providencia HPseudomona HGrupo KES H Enterococos HEstafilococos HE Coli V Pseudomona VEnterobacterias V Estreptococos VEstafilococos VEnterococos V
86 6,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 0 0 0
1443 25,00 0 PP 0 KES 0 0 0 0 0 0 0 Enterococo
1613 25,00 0 0 Ps 0 Enterococo 0 0 0 Enterobact 0 Estafilococo 0
1613 30,00 0 0 Ps 0 Enterococo 0 0 0 Enterobact 0 Estafilococo 0
1443 100,00 0 PP 0 KES 0 0 0 0 0 0 0 Enterococo
1603 100,00 Coli PP 0 KES 0 0 0 0 Enterobact 0 0 0
1726 100,00 Coli 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1603 100,00 0 0 0 0 0 0 0 0 Enterobact 0 0 0
1726 100,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1442 150,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 0 0 0
1712 150,00 0 PP Ps 0 0 0 0 Ps 0 0 0 0
1609 150,00 Coli 0 Ps KES 0 Estafilococo 0 Ps 0 Estreptoc Estafilococo 0
1442 150,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 0 0 0
1712 150,00 0 PP Ps 0 0 0 0 Ps 0 0 0 0
1609 150,00 Coli 0 Ps KES 0 Estafilococo 0 Ps 0 Estreptoc Estafilococo 0
86 156,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 0 0 0
1612 250,00 Coli PP 0 KES Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0
1510 250,00 Coli PP Ps 0 Enterococo 0 0 Ps 0 0 0 0
1612 250,00 0 0 0 0 Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0
1510 250,00 Coli PP Ps 0 Enterococo 0 0 Ps 0 0 0 0
1610 250,00 0 PP 0 KES Enterococo 0 0 Ps 0 0 Estafilococo Enterococo
1610 300,00 0 PP 0 KES Enterococo 0 0 Ps 0 0 Estafilococo Enterococo
1713 300,00 Coli PP Ps 0 0 Estafilococo 0 0 0 0 Estafilococo Enterococo
1506 300,00 0 0 0 0 0 Estafilococo 0 0 0 0 0 0
1616 300,00 0 0 0 0 Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0
1617 300,00 0 0 0 0 Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0
1713 300,00 0 0 0 0 0 Estafilococo 0 0 0 0 Estafilococo Enterococo
1456 350,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 Estreptoc Estafilococo Enterococo
1606 350,00 0 PP 0 KES 0 Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 Enterococo
1616 500,00 0 PP Ps 0 Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0
1506 700,00 0 PP Ps 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1606 700,00 0 PP 0 KES 0 Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 Enterococo
1617 750,00 0 PP 0 KES Enterococo Estafilococo 0 0 0 0 0 0
1707 750,00 Coli PP 0 KES Enterococo Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 0
1505 750,00 0 0 0 0 0 Estafilococo 0 0 0 0 0 0
1707 750,00 0 0 0 0 Enterococo Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 0
1449 750,00 Coli 0 0 KES Enterococo Estafilococo Coli 0 Enterobact Estreptoc Estafilococo 0
1456 1000,00 0 PP Ps 0 Enterococo 0 0 0 0 Estreptoc Estafilococo Enterococo
1449 1000,00 Coli 0 0 KES Enterococo Estafilococo Coli 0 Enterobact Estreptoc Estafilococo 0
Identificación bacteriana
H) V)
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verraco UFC/ml
Sensibilidad Kit H
Sensibilidad Kit V
Sensibilidad Kirbi-Bauer
86 6,00 NINGUNO AMP AMC CFP CN NINGUNO
1442 150,00 NINGUNO AMP AMC CFP CN NINGUNO
1443 25,00 NINGUNO AMP CFP CN NINGUNO
1449 1000,00 NINGUNO AMP+ COL, CFP, CN NINGUNO
1456 1000,00 NINGUNO CFP NINGUNO
1505 750,00 AMP CFP CN CN NINGUNO
1506 300,00 AMP CN AMP AMC CFP CN NINGUNO
1510 250,00 CN AMC AMP+COL NINGUNO
1603 100,00 AMP AMC CFP CN AMP AMC CFP CN CN
1606 350,00 NINGUNO AMC AMP NINGUNO
1609 150,00 NINGUNO AMP, CFP, CN CN
1610 250,00 NINGUNO CFP CFP
1612 250,00 AMP AMC CN AMP AMC CFP NINGUNO
1613 25,00 CN CFP CN NINGUNO
1616 500,00 AMP CFP CN AMP AMC CFP CN CN
1617 300,00 AMP CFP CN AMP AMC CFP CN CN
1707 750,00 AMP AMC CFP CN AMP AMC CFP CN NINGUNO
1712 150,00 NINGUNO AMP AMC CFP CN NINGUNO
1713 300,00 AMP CFP AMP AMC CFP CN NINGUNO
1726 100,00 AMP AMC CFP CN AMP AMC CFP CN NINGUNO
Antibiograma (AMC, AMP, CFP, CN)
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Nuevo kit rápido para antibiograma • Basado en detectar la actividad metabólica de las bacterias
• Cuadro de antibióticos que ofrecen no es específico del ámbito de la inseminación porcina
Control
Sin ATB
Dosis o eyaculado 1
ATB1 ATB2 ATB3 ATB4 ATB5 ATB6 ATB7 ATB8 ATB9 ATB10 ATB11
Dosis o eyaculado 2
Dosis o eyaculado 3
Dosis o eyaculado 4
Dosis o eyaculado 5
Dosis o eyaculado 6
Dosis o eyaculado 7
Dosis o eyaculado 8
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Preparación de la muestra
• Tomamos 1 ml de semen y lo
diluimos en 1 ml de tampón.
• Filtramos para eliminar
espermatozoides
• Repartimos 100 microlitros en cada
pocillo
• Cargamos cada fila con un
eyaculado diferente
• Cada columna contiene un
antibiótico diferente
• Añadimos 200 microlitros de medio
de crecimiento y dos gotas de
aceite de paradina en cada pocillo
• Incubamos a 37ºC
• Lectura:
• ROSA: actividad metabólica o
RESISTENCIA
• AZUL: ausencia de actividad
metabólica o SENSIBILIDAD
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Resultados
Control
Sin ATB
Dosis o eyaculado 1
ATB1 ATB2 ATB3 ATB4 ATB5 ATB6 ATB7 ATB8 ATB9 ATB10 ATB11
Dosis o eyaculado 2
Dosis o eyaculado 3
Dosis o eyaculado 4
Dosis o eyaculado 5
Dosis o eyaculado 6
Dosis o eyaculado 7
Dosis o eyaculado 8
• Cambio de color hasta en un mínimo de 30 minutos con concentraciones bacterianas superiores a 107 UFC/ml
• Para contaminaciones inferiores a 105 UFC/ml los cambios de color son más lentos y difíciles de valorar a ojo (colorímetro)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 2 4 6 8 10 12 14
Tt(Horas)
Log10 UFC/ml N=22 muestras x 5 ATB muestra
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¿Relación con otros métodos?
La presencia de coloración rosa se relaciona con la actividad metabólica medida por citometría.
Pocillo Ïndice de actividad
bacteriana
20 min
Ïndice de actividad
bacteriana
50 min
Ïndice de actividad
bacteriana
150 min
Control sin ATB
(n=6)
7,4% a 7,5%a 8,0%a
ATB no eficaz
(n=14)
5,9%ab 4,8%ab 4,5%b
ATB eficaz (n=16)
2,2%b 1,9%b 1,6%b
Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05)
En este contexto, su coincidencia con el antibiograma (Kirbi-Bauer) dependerá de la
bacteria, el antibiótico y el tiempo de incubación.
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Conclusiones
• A la espera de la generalización de otras técnicas (MALDI-TOF, PCR, secuenciación de ARN ribosomal) la
identificación bacteriiana que proporcionan los kits comerciales es insatisfactoria.
• Los antibiogramas de kits comerciales se basan en la detección de reacciones metabólicas y la inhibición del
metabolismo bacteriano no es lo mismo que la actividad bactericida que mide el método estándar (Kirbi-Bauer
)
• El citómetro permite determinar en 20 minutos la cantidad de bacterias del eyaculado o dosis y en 90-150
los antibióticos efectivos frente a esas bacterias
• La citometría puede ser una herramienta fundamental de trabajo para los CIAs en la era post-antibiótica