Optimización de protocolos para la extracción de ADN y uso del...
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Optimización de protocolos para la extracción de ADN y uso del marcador SCAR ISPJ1 en Piñón (Jatropha curcas L.) Jessu Leandro Herrera Rengifo Zamorano, Honduras Diciembre, 2010
Transcript of Optimización de protocolos para la extracción de ADN y uso del...
Optimización de protocolos para la extracción
de ADN y uso del marcador SCAR ISPJ1 en
Piñón (Jatropha curcas L.)
Jessu Leandro Herrera Rengifo
Zamorano, Honduras Diciembre, 2010
i
ZAMORAMO
CARRERA DE CIENCIA Y PRODUCCIÓN AGROPECUARIA
Optimización de protocolos para la extracción
de ADN y uso del marcador SCAR ISPJ1 en
Piñón (Jatropha curcas L.)
Proyecto especial presentado como requisito parcial para optar
al título de Ingeniero Agrónomo en el Grado
Académico de Licenciatura
Presentado por
Jessu Leandro Herrera Rengifo
Zamorano, Honduras Diciembre, 2010
ii
Optimización de protocolos para la extracción
de ADN y uso del marcador SCAR ISPJ1 en
Piñón (Jatropha curcas L.)
Presentado por:
Jessu Leandro Herrera Rengifo
Aprobado:
________________________
Nils Berger, Dr. Sc. Agr.
Asesor Principal
________________________
Juan Carlos Rosas, Ph.D.
Asesor
________________________
Marcelino Guachambala, Ing.
Asesor
________________________
Abelino Pitty, Ph.D.
Coordinador de Fitotecnia
_______________________
Abel Gernat, Ph.D.
Director
Carrera Ciencia y Producción
Agropecuaria
_______________________
Raúl Espinal, Ph.D.
Decano Académico
_______________________
Kenneth L. Hoadley, D.B.A.
Rector
iii
RESUMEN
Herrera, J. 2010. Optimización de protocolos para la extracción de ADN y uso del
marcador SCAR ISPJ1 en Piñón (Jatropha curcas L.). Proyecto especial de graduación
del programa de Ingeniería Agropecuaria, Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano.
Honduras. 20 p.
El diagnóstico molecular es una herramienta que nos ayuda a distinguir secuencias de
interés para el mejoramiento genético de las plantas. La Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR, siglas en inglés) permite la detección de uno o más fragmentos
específicos de ADN para realizar trabajos más precisos en diagnóstico molecular. La
Jatropha curcas L. o piñón es una especie oleaginosa perenne, nativa de América tropical
que se distribuye en los trópicos que tiene potencial para la elaboración de biodiesel. No
existe información con respecto al número de introducciones y diversidad genética de las
poblaciones de piñón y su origen sigue siendo polémico. La finalidad de esta
investigación fue la optimización de protocolos para la extracción de ADN de Jatropha
curcas L. que permita identificar el origen de las accesiones que se tienen en la Escuela
Agrícola Panamericana, usando el marcador tipo SCAR ISPJ1. Se encontró que las hojas
jóvenes tienen la mayor cantidad de ADN extraíble usando el buffer etil xantogenato de
potasio (PEX). El protocolo de extracción optimizado permitió obtener una media de 750
ng/µL de ADN por muestra. El marcador SCAR ISPJ1 se optimizó a una temperatura de
acoplamiento de 63°C, generando una banda definida a 543 pb. El marcador ISPJ1
optimizado fue validado en 38 accesiones, de las cuales 18 presentaron la banda asociada
al origen hindú.
Palabras clave: ADN, centro de origen, diagnóstico molecular.
iv
CONTENIDO
Portadilla ................................................................................................................... i Página de firmas ....................................................................................................... ii
Resumen ................................................................................................................. iii Contenido ................................................................................................................ iv
Índice de cuadros, figuras y anexos........................................................................... v
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1
2. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................... 3
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................. 8
4. CONCLUSIONES ................................................................................................ 14
5. RECOMENDACIONES ...................................................................................... 15
6. LITERATURA CITADA ..................................................................................... 16
7. ANEXOS ............................................................................................................... 18
v
ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS Y ANEXOS
Cuadro Página
1. Accesiones de piñón usadas en la validación del marcador SCAR ISPJ1. ................ 3
2. Protocolos experimentales para la extracción de ADN en Piñón. ............................. 5 3. Características del primer ISPJ1 para identificar las accesiones de origen hindú ...... 6
4. Reactivos para PCR del marcador SH-13. ................................................................ 6 5. Perfil térmico del marcador SH-13 con variantes para el marcador ISPJ1. ............... 6
6. Concentraciones de ADN encontrados en el tejido muestreado. ............................... 8 7. Concentraciones de ADN obtenidas en protocolos experimentales. .......................... 8
8. Perfil térmico optimizado del marcador ISPJ1 a partir del protocolo del marcador
SH13. ...................................................................................................................... 12
Figura Página
1. Resultado de la electroforesis de la primera reacción de PCR con temperatura de
acoplamiento de 60°C (cinco repeticiones) .............................................................. 11 9. Resultado de la electroforesis del protocolo con temperatura de acoplamiento de
61°C (cinco repeticiones). ....................................................................................... 11 10. Resultado de la electroforesis de la tercera PCR con temperatura de acoplamiento
de 63°C (cinco repeticiones). ................................................................................... 12 11. Resultado de la validación del protocolo ISPJ1 en 38 accesiones de la EAP
Zamorano. ............................................................................................................... 13
Anexo Página
1. Protocolo Cuantificación de ADN. .......................................................................... 18
2. Rehidratación de primers. ........................................................................................ 18 3. Protocolo de extracción de ADN. Skroch et al. (1998). ............................................ 19
1. INTRODUCCIÓN
El piñón (Jatropha curcas L.) es nativo de América tropical y es un cultivo con potencial
para la elaboración de biodiesel. Este cultivo es de importancia por su periodo corto de
endurecimiento en sequía, bajo costo de la semilla, alto contenido de aceite, fácil
adaptación a tierras marginales, idoneidad como sustituto de los combustibles sin ningún
tipo de alteración en los motores existentes y el tamaño de planta hace que la recolección
de semillas sea más conveniente (Basha y Sujatha 2007).
El éxito de los programas de mejoramiento genético del piñón está en la identificación de
genotipos con material genético divergente que puedan generar combinaciones óptimas
para obtener variedades con caracteres deseados (Sakaguchi y Somabi 1987). No hay
información con respecto al número de introducciones y la diversidad genética de las
poblaciones del género Jatropha en Honduras y Mesoamérica. Varios investigadores han
tratado de definir el origen de ésta pero la fuente sigue siendo discutida (Dehgan y
Webster 1979). Se han reportado tres variedades muy utilizadas que son: Cabo Verde, una
variedad que se ha extendido por todo el mundo; Nicaragua, con pocas frutas de gran
tamaño; y una variedad mexicana que no es tóxica porque carece de los esteres de forbol,
la cual también puede ser utilizada en alimentación animal (Henning 2006).
El aislamiento y la masa de ADN genómico de alto peso molecular es un importante pre-
requisito para aplicar técnicas moleculares como herramienta para el mejoramiento
genético de un cultivo (Dhakshanamoorthy y Selvaraj 2009). Una herramienta útil en el
mejoramiento genético es la Selección Asistida por Marcadores Moleculares (SAM), la
cual se basa en el diagnóstico molecular de la presencia o ausencia de un fragmento de
ADN de interés ayudando a la investigación en plantas y animales, identificando los genes
y las características genéticas de un individuo.
La selección basada en información genética molecular utilizando marcadores
moleculares es confiable y consistente, siempre y cuando los protocolos estén adaptados a
un laboratorio. En Euphorbiaceae, marcadores moleculares como Polimorfismos de ADN
Amplificados al Azar (RAPD) han sido utilizados para determinar el alcance de la
genética y la diversidad en el caucho de élite (Hevea brasiliensis) y sus clones (Besse et
al. 1994; Varghese 1997), y en la yuca (Asante y Offei 2003). En Jatropha curcas,
marcadores de isoenzimas se utilizaron para determinar la relación genética de los
miembros del género Jatropha y Ricinus (Sathaiah y Reddy 1985).
2
La Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) es un proceso que logra amplificar dos o
más fragmentos específicos de ADN, permitiendo la identificación de distintos genes de
interés (Rodríguez y Barrera 2004). Para poder realizar los análisis moleculares en
Jatropha curcas. se necesita mecanismos que den un ADN de excelente calidad, pero la
planta de piñón contiene polisacáridos y polifenoles que dificultan el aislamiento del
ADN genómico. Aunque existen varios protocolos para el aislamiento de ADN genómico
de esta planta (Ganesh Ram et al. 2008; Ranade et al. 2008; Pamidiamarri et al. 2008;
Basha y Sujatha 2007; Stein et al. 2001) no se ha reportado el uso del buffer Etil
Xantogenato de Potasio (PEX) con acetato de amonio, acetato de sodio, u otros reactivos
que son más accesibles, fáciles de manejar y menos tóxicos al ambiente.
Los análisis moleculares para identificar el origen de las variedades provenientes de
África, India y Centro América son muy pobres o son poco específicos como los análisis
con marcadores RAPD, aunque son útiles al momento de buscar diversidad genética en
una población (Basha y Sujatha 2007).
Basha y Sujatha (2007) investigaron, sobre la diversidad genética de germoplasma de
Jatropha curcas de la India, junto con un genotipo que no es tóxico de México,
utilizando marcadores RAPD e ISSR; logrando desarrollar dos marcadores específicos
que diferencian los genotipos de la India de los mexicanos.
El centro de origen del piñón no se ha definido hasta el momento (Basha y Sujatha
2007). Los niveles de diversidad genética entre las accesiones disponibles de Jatropha
curcas de la India y la amplia variación entre genotipos indios y mexicanos, requiere la
caracterización de más genotipos de otras colecciones, que cubra una mayor zona
geográfica y se debe realizar una comparación de las relaciones genéticas con
características morfológicas, que permitan analizar la distribución y la diversidad genética
del género Jatropha.
El objetivo de esta investigación fue optimizar un protocolo de extracción de ADN para
Jatropha curcas L., identificando el tejido adecuado para el muestreo de las plantas. Se
regularon los tiempos y temperaturas en el proceso de extracción con reactivos de fácil
manipulación, para identificar las 38 accesiones de la colección de la Escuela Agrícola
Panamericana por medio del marcador molecular tipo SCAR ISPJ1. Este identifica las
accesiones de origen hindú desarrollado por Basha y Sujatha (2007), con el fin de abrir
futuras investigaciones para el mejoramiento genético del piñón en Zamorano.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 UBICACIÓN DEL ESTUDIO
El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Aplicada del Programa de
Investigaciones en Frijol (PIF), de la Carrera de Ciencia y Producción Agropecuaria, de la
Escuela Agrícola Panamericana (EAP), Zamorano, ubicada en el Valle del Yegüare a 30
km de Tegucigalpa, Honduras.
2.2 MATERIAL EXPERIMENTAL
Para la optimización del protocolo se utilizó la accesión 108 con procedencia de Puerto
Cortes, Honduras, de la colección de la EAP Zamorano. El protocolo del marcador ISPJ1
fue validado con las 38 accesiones de la colección proveniente de diferentes localidades
de recolección y procedencias de introducción (Cuadro 1).
Cuadro 1. Accesiones de piñón usadas en la validación del marcador SCAR ISPJ1. Cantidad Nombre Procedencia
Colectadas de Honduras
5 Filomena, Arturo Araujo, Brasilia, Tanzania Yoro
1 108 Puerto Cortes
2 111, 112 San Pedro Sula
7 003, 004, 005, 006, 007, 008, 009 Los Hoyos
8 010, 011, 012, 013, 014, 016, 017, 018. San Matías
5 020, 021, 022, 023, 024 Jacaleapa
Introducidas a Honduras
1 Masaya Masaya, Nicaragua
9 Minas, Mali, Piñón 1, Piñón 2, Bravo, Bravo × Mali. Hibrido,
Embrapa, Brasil
Brasil
1 AA.AA Tecualuya, El Salvador
2 HB07, Criolla El Salvador
1 No tóxica México
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2.3 TOMA DE MUESTRA
Para optimizar el protocolo de extracción de ADN se muestrearon siete diferentes tejidos
de la planta en las siguientes cantidades:
1. Hojas jóvenes: 8 discos de microtubos.
2. Primordios foliares: 5 unidades.
3. Meristemo apical: 5 unidades.
4. Tallo joven: 1cm de la parte apical.
5. Peciolos: 3 unidades.
6. Flor masculina: 9 unidades.
7. Flor femenina: 6 unidades.
Se realizaron tres pruebas con tres repeticiones de las siete partes de la planta, luego se
cuantificó el ADN por fluorometría, y se compararon los datos por medio de un análisis
estadístico ANDEVA con un nivel de significancia <0.05 para los tejidos utilizados en la
extracción, y para los protocolos experimentales, y luego una separación de medias por
la prueba DMS (Cuadro 2).
2.4 EXTRACCIÓN DE ADN
Se extrajo ADN genómico basado en el método de Skroch et al. (1998) optimizado para
las condiciones del Laboratorio de Biotecnología (Anexo 3). Se compararon los datos por
medio de un análisis estadístico ANDEVA con un nivel de significancia de <0.05 y una
separación de medias por DMS
Se cuantificaron las muestras para determinar la parte de la planta que supere los 95 ng/ml
de ADN para trabajar con el marcador. Se probaron cinco protocolos con tres repeticiones
de cada uno con variaciones de tiempo y cantidad de reactivo (Cuadro 2). Se midió la
cantidad de ADN que tenía cada una de las muestras en ng/ml para determinar las partes
con mayor concentración de ADN.
2.5 CUANTIFICACIÓN DE ADN
La cuantificación de hizo de acuerdo al protocolo sugerido en el Manual del Laboratorio
de Biotecnología Aplicada (Anexo 1). Se utilizó un fluorómetro Hoefer TKO-100, λex +
365 nm λem + 460 nm calibrado con ADN estándar a una concentración de 100 ng/ml. Se
mezclaron 2 ml de buffer de cuantificación (10 μL de solución para tinción concentrada +
100 ml de buffer TNE 1×; pH= 7.4) con 2 μL de muestra de ADN, colocados en una
cubeta de cuarzo puro para minimizar el margen de error al momento de la lectura.
5
Cuadro 2. Protocolos experimentales para la extracción de ADN en Piñón. Pasos Protocolo 1 Protocolo 2 Protocolo 3
Cantidad Tiempo Cantidad Tiempo Cantidad Tiempo
Macerado 30/370 µL 3 min 30/470 µL 10 min 30/450 µ 20 min
Baño María con PEX 60 min 83 min 60 min
Centrifugación 1 14000 rpm 20 min 15000 rpm 15 min 15000 rpm 20 min
Precipitación Acetato de Amonio
45 min 20 min 50 min
Centrifugación 2 3000 rpm 6 min 4000 rpm 10 min 4000 rpm 20 min
Baño María con ARNasa 300 µL 45 min 300 µL 60 min 350 µL 70min
Centrifugación 3 14000 rpm 10 min 15000 rpm 3 min 15000 rpm 5min
Precipitación Acetato de Sodio 10 min 20min 20 min
Centrifugación 4 3000 rpm 3 min 4000 rpm 6 min 4000 rpm 7 min
Centrifugación 5 14000 rpm 50 seg 1000 rpm 30 seg 15000 rpm 30seg
Pasos Protocolo 4 Protocolo 5
Cantidad Tiempo Cantidad Tiempo
Macerado 50/450 µL 15 min 50/450 µL 5 min
Baño María con PEX 75 min 80 min
Centrifugación 1 15000 rpm 15 min 15000 rpm 15 min
Precipitación en Acetato de Amonio 25 min 45 min
Centrifugación 2 4000 rpm 10 min 4000 rpm 15 min
Baño María con ARNasa 350 µL 40 min 350 µL 50 min
Centrifugación 3 15000 rpm 5 min 15000 rpm 5 min
Precipitación en Acetato de Sodio 25 min 5 min
Centrifugación 4 3000 rpm 6 min 4000 rpm 6 min
Centrifugación 5 15000 rpm 15 seg 15000 rpm 30 seg
2.6 DILUCIÓN DEL ADN
Las muestras de ADN se diluyeron a 50 ng/ml con 100 μl de Buffer TE 0.1 X para
estandarizarlas y que alcancen la misma oportunidad de amplificarse en PCR.
2.7 AMPLIFICACIÓN DE PCR
El ADN genómico fue amplificado por medio de una reacción de PCR con los primers
ISPJ1 F y ISPJ1 R (Cuadro 3), los cuales se utilizaron a una concentración de 10 μM
(Anexo 2).
6
Cuadro 3. Características del primer ISPJ1 para identificar las accesiones de origen hindú Secuencias de Primer Orientación 5’ a 3’ ISSR
primer Tamaño (pb)
Referencia
ISPJ1-F:GAGAGAGAGAGAGAGGTG (GA)8 A 543 Basha, S; Sujatha, M.
2007
ISPJ1-R:GAGAGAGAGAGAGAAAACAAT
Como estabilizador se utilizó el buffer PCR 5 X Green Go Taq®, los DesoxiNucleotidos
Trifosfatos (dNTP’s) con cloruro de magnesio (MgCl2), enzima Go Taq® Flexi DNA
Polymerase y ADN de los genotipos seleccionados como ADN molde o templete. El
volumen final de la mezcla maestra por muestra fue de 15 μL. Como referencia se utilizó
el protocolo del marcador SH 13 de frijol porque las condiciones de termociclado y
reactivos de la mezcla maestra amplifican un fragmento de ADN similar al esperado con
el marcador ISPJ1 (Cuadro 4).
Cuadro 4. Reactivos para PCR del marcador SH-13. Reactivos SH-13
ddH2O 7.1 µL
Buffer 3.0 µL
Primer ( R ) 0.5 µL
Primer ( F ) 0.5 µL
AND 2.0 µL
dNTP´s 1.2 µL
Taq 0.7 µL
Se realizaron cambios en el perfil térmico para encontrar el tiempo y temperatura de
acoplamiento adecuada para el marcador ISPJ1 (Cuadro 5).
Cuadro 5. Perfil térmico del marcador SH-13 con variantes para el marcador ISPJ1. Perfil térmico SH-13 ISPJ1
Desnaturalización inicial 94°C/30 s 94°C/30 s
Desnaturalización 94 °C/30 s 95 °C/30 s
Acoplamiento 59 °C/1 min 60, 61, 63°C
Elongación 72°C/ 1min 30 s 72°C/ 1 min 30s
Extensión Final 72°C/ 1 min 30 s 72°C/ 1 min 30 s
Número de ciclos 36 36
Los reactivos usados en los protocolos base son los mismos que en los nuevos marcadores, solo varia la
temperatura de acoplamiento.
7
2.8 VISUALIZACIÓN DE ADN
Para observar los fragmentos de ADN se utilizó la técnica de electroforesis horizontal. El
ADN obtenido en las extracciones y los productos de PCR fueron observados en geles de
agarosa a una concentración de 1.2%, en solución tampón TBE 0.5 X (Tris-HCl, pH 7.5;
ácido bórico, EDTA) en tanques de electroforesis. Las muestras fueron separadas a 100 V
durante 60 min en geles pequeños y 90 min en geles grandes, teñidos en una solución 1:10
de bromuro de etidio: agua destilada durante 15-20 min; luego se visualizaron las bandas
de ADN en el transiluminador y se fotografiaron bajo luz ultravioleta. Se utilizó una
escalera molecular de ADN con un rango de 100-1500 pb, para verificar la presencia o
ausencia de bandas.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 MUESTREO DE LAS PARTES DE LA PLANTA.
La cuantificación del ADN mostró que las hojas jóvenes presentan la mayor cantidad al
muestrear la planta con una media de 466 ng/ml y una diferencia altamente significativa
(Cuadro 6). Esto se debe a que el material presenta bajos niveles de lignificación por ser
tejido joven. A pesar de que los primordios foliares y los meristemos apicales son más
jóvenes que las hojas, presentan una capa cerosa que los recubre lo cual dificulta el
proceso de extracción en el laboratorio.
Cuadro 6. Concentraciones de ADN encontrados en el tejido muestreado.¹ Parte Muestreada Media (ng/ml) Separación de Medias
Hojas jóvenes 467 A
Primordios foliares 137 B
Meristemo apical 110 BC
Tallo joven 74 BC
Peciolos 57 C
Flor masculina 40 C
Flor femenina 38 C
1. Medidas con diferente letra son estadísticamente diferentes P≤0.05
3.2 OPTIMIZACIÓN DEL PROTOCOLO PARA EXTRACCIÓN DE ADN
Se optimizó un protocolo para extracción de ADN que presenta cambios en tiempos y
cantidades de reactivos, el protocolo seleccionado fue el PJ3, con el cual se obtuvieron
altas cantidades de ADN con una media de 750 ng/ml por muestra, mostrando una
diferencia significativa con los demás protocolos experimentales (Cuadro 7).
Cuadro 7. Concentraciones de ADN obtenidas en protocolos experimentales.¹ Protocolo Media ng/ml Separación de Medias
PJ3 (Intermedio – 20 PEX) 750 A
PJ4 (Inter- Lento – 20 PEX) 648 A
PJ2 (Rápido – 3 PEX) 584 A
PJ1 (Base Frijol ) 557 A
PJ5 (Lento) 203 B
1. Medidas con diferente letra son estadísticamente diferentes P≤0.05
9
El protocolo seleccionado PJ3 emplea 20 minutos más con el reactivo PEX que el
protocolo original, con un total de 80 minutos distribuidos en 20 minutos a temperatura
ambiente y con dos agitaciones en el vortex y 60 minutos en baño maría a 65°C, para
desnaturalizar más las proteínas del tejido vegetal, ya que es una de las etapas decisivas en
la obtención de baja cantidad de ADN en las extracciones. El protocolo seleccionado tiene
20 minutos más con acetato de amonio en el periodo de precipitación y la peletización del
las muestras tiene 10 minutos adicionales al protocolo original, con el fin de obtener
menores residuos vegetales y pellets más firmes para las transferencias entre microtubos.
Para lograr obtener ADN sin contaminación de ARN se incubó por 70 minutos a 37°C
con la enzima ARNasa, es decir 10 minutos más a lo sugerido por el protocolo inicial. La
centrifugación para precipitar los residuos de la digestión de la enzima fue aumentada a
20 minutos para precipitar los residuos del tejido usado para la extracción. Al igual en las
siguientes, se subió a 20 minutos en la precipitación de los ácidos nucleídos, cinco
minutos en la segunda precipitación de tejidos remanentes, y siete minutos en la
precipitación del ADN final, con el propósito de obtener pellets más fijos para facilidad de
trabajo.
Los otros pasos del lavado y secado fueron dejados de igual forma al protocolo original,
ya que al hacer cambios en ellos no varió el resultado obtenido al final.
Protocolo optimizado para la extracción de ADN de Jatropha curcas L. 1. Cosechar tejido fresco de plantas (8 discos con 0.5 cm de diámetro de hojas jóvenes).
2. Agregar 50 L del buffer de extracción (PEX) en un tubo para microcentrífuga
eppendorf de 1.5 ml. Macerar el tejido en el tubo usando una barra de plexiglás de
laboratorio. Agregar 450 l adicionales de buffer PEX y agitar el tubo en el vortex.
3. Dejar reposar muestras durante 20 min a temperatura ambiente con el PEX.
4. Lo más pronto posible (antes de 10 min), colocar los tubos con las muestras de tejido
en baño maría a 65 ºC durante 60 min.
5. Centrifugar la muestra durante 20 min a >14,000 RPM (alta velocidad) usando una
microcentrífuga, para concentrar los residuos de tejido (pellet).
6. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5 ml limpio. Precipitar los ácidos
nucleicos llenando los tubos con una mezcla 6:1 de etanol:acetato de amonio 7.5 M.
Mezclar invirtiendo los tubos y dejar precipitar por 50 min a temperatura ambiente.
7. Agitar los tubos manualmente para romper el precipitado. Peletear los ácidos
nucleicos precipitados, centrifugando las muestras a 3,000 RPM (baja velocidad)
durante 20 min en una microcentrífuga.
10
8. Eliminar el sobrenadante. Agregar a los tubos con los pellets 350 l de RNAasa A
(concentración de 100 g/ml) + buffer TE 0.1 X (juntas). Agitar los tubos
manualmente y colocarlos a incubar en baño maría a 37 ºC por 70 min.
9. Centrifugar las muestras a >14,000 RPM por 5 min para peletizar los residuos de
tejidos remanentes.
10. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio de microcentrífuga de 1.5 ml.
11. Precipitar el ADN llenando los tubos con una mezcla 10:1 de etanol:acetato de sodio 3
M. Mezclar invirtiendo los tubos y permitir que se precipiten a temperatura ambiente
por un tiempo no mayor a 20 min.
12. Agitar bien los tubos manualmente para romper el precipitado, antes de proceder a
peletearlo. Centrifugar las muestras por 7 min a 3,000 RPM para peletizar el ADN.
13. Vaciar el etanol/acetato de sodio y lavar los pellets llenando los tubos con 70% etanol;
agitar manualmente.
14. Colectar los pellets centrifugando por 30 segundos a 14,000 RPM.
15. Vaciar el etanol y secar los pellets invirtiendo los tubos sobre papel toalla (2-3 horas o
de un día para el otro).
3.3 OPTIMIZACIÓN DE LA REACCIÓN DE PCR PARA EL MARCADOR
ISPJ1.
Se realizó la primera reacción de PCR utilizando una temperatura de acoplamiento de
60°C con ADN de cinco accesiones que se tenían conocimiento de su origen hindú
(Figura 1). Luego de examinar los resultados, en las pruebas siguientes se utilizö la
accesión “108” que presentó mayor definición en la banda de 543 pb (Figura 2 y 3).
En las dos primeras muestras se observa la banda de 543 pb, que es la medida
predeterminada del marcador ISPJ1. Las dos corresponden al genotipo hindú; una
presenta mejor intensidad, a pesar de tener dos pegas inespecíficas fuera del marcador a
una longitud aproximada de 460 pb y a 200 pb; por tanto, se seleccionó esta accesión
para realizar las siguientes pruebas usándola como control positivo. Se aumentó la
temperatura de acoplamiento para eliminar las pegas fuera de la secuencia deseada.
11
Figura 1 Resultado de la electroforesis de la primera reacción de PCR con temperatura de
acoplamiento de 60°C (cinco repeticiones).
En la segunda reacción de PCR con una temperatura de acoplamiento de 61°C, se observa
una buena amplificación del marcador en las cinco repeticiones de la banda de 543 pb
(Figura 2).Sin embargo, esta reacción presentó pegas inespecíficas a 210, 240 y 450 pb,
por lo cual se decidió subir dos grados más la temperatura de acoplamiento para
eliminarlas.
Figura 2. Resultado de la electroforesis del protocolo con temperatura de acoplamiento de
61°C (cinco repeticiones).
En la tercera reacción a 63°C se logró ver de manera definida las bandas a 543 pb en las
cinco repeticiones y sin pegas inespecíficas. Las bandas son claras y bien definidas, razón
12
por la cual se sugirió establecer este protocolo y usar el genotipo “108” como control
positivo para la validación del protocolo (Cuadro 8).
Figura 3. Resultado de la electroforesis de la tercera PCR con temperatura de
acoplamiento de 63°C (cinco repeticiones).
Cuadro 8. Perfil térmico optimizado del marcador ISPJ1 a partir del protocolo del
marcador SH13.
Perfil térmico SH-13 ISPJ1
Desnaturalización inicial 94°C/30 s 94°C/30 s
Desnaturalización 94 °C/30 s 95 °C/30 s
Acoplamiento 59 °C/1 min 63°C
Elongación 72°C/ 1min 30 s 72°C/ 1 min 30s
Extensión Final 72°C/ 1 min 30 s 72°C/ 1 min 30 s
Número de ciclos 36 36
3.4 VALIDACION DE PROTOCOLO OPTIMIZADO
El protocolo optimizado para el marcador ISPJ1 fue validado con 38 accesiones de la
colección de Jatropha curcas de la EAP Zamorano (Cuadro 1). Se utilizó como control
positivo la accesión “108”. Las variedades Filomena, Arturo Araujo, Brasilia, Tanzania,
108, Jamastran, Masaya, Minas, Mali, Piñon 1, Piñon 2, Bravo × Mali, Hibrido, Embrapa,
13
No tóxica, 006, 014, 016 presentaron la banda del marcador ISPJ1 para la procedencia
hindú con una amplificación correcta del marcador a 543 pb (Figura 4).
Figura 4. Resultado de la validación del protocolo ISPJ1 en 38 accesiones de la EAP
Zamorano.
4. CONCLUSIONES
Las hojas jóvenes en la planta de piñón presentaron la mayor concentración de
ADN con una media de 467 ng/ml.
El protocolo de extracción de ADN para piñón PJ3 (Intermedio – 20 PEX) extrae
una cantidad promedio de 750 ng/ml de ADN por muestra, suficiente para realizar
análisis moleculares.
Se optimizó el protocolo para el marcador ISPJ1 a temperatura de acoplamiento de
63°C, el cual presentó una excelente definición de bandas a 543 bp.
Se validó el protocolo optimizado del marcador ISPJ1 en 38 accesiones de la EAP
Zamorano, encontrándose 18 genotipos positivos para el marcador usado para
identificar el origen hindú.
5. RECOMENDACIONES
Realizar pruebas con marcadores que identifiquen las accesiones con posible
origen Mexicano, y/o utilizar otras técnicas moleculares que permitan definir más
claramente el origen de las accesiones.
Antes de establecer un programa de mejoramiento genético con las accesiones
estudiadas, se deberá hacer la caracterización morfológica, agronómica y valor
industrial (aceite) de las accesiones de la colección de Jatropha disponible en la
EAP Zamorano.
6. LITERATURA CITADA
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7. ANEXOS
Anexo 1. Protocolo Cuantificación de ADN.
1. Colocar 2 ml de buffer de cuantificación en un recipiente cúbico (cuvette) limpio y
calibrar el fluorómetro a cero.
2. Agregar 2 μL de muestra de ADN al buffer cuantificador.
3. Mover ligeramente el cubo para mezclar la muestra.
4. Colocar el cubo en la celda del fluorómetro y leer la concentración de ADN en ng/ml.
5. Vaciar el cubo, enjuagarlo con agua destilada, y airearlo un poco, antes de colocar la
siguiente muestra.
Anexo 2. Rehidratación de primers.
1. Encontrar la concentración inicial de los primers en μM:
Multiplicar el valor OD por el valor de nanomol (nmol) por OD, estos valores son
característicos de cada primer. El valor resultante es la cantidad de nanomoles en
el pellet que contiene el primer.
El resultado dividirlo para el valor de ug’s (μL de agua). Se obtienen nanomoles
por microlitro.
Convertir el resultado a picomoles/μL ≈ μM
2. Reemplazar en la ecuación CiVi=CfVf para conocer el volumen inicial de primer
rehidratado que se va a depositar en 500 μL de agua destilada y desionizada. Sabiendo
que la concentración final buscada es 1 μM.
19
Anexo 3. Protocolo de extracción de ADN. Skroch et al. (1998).
1. Cosechar tejido fresco de plantas (6-8 mitades de hojas jóvenes).
2. Agregar 50 L del buffer de extracción (PEX) en un tubo para microcentrífuga
eppendorf de 1.5 ml. Macerar el tejido en el tubo usando una barra de plexiglás de
laboratorio. Agregar 450 L adicionales de buffer PEX y agitar el tubo en el vortex.
3. Lo más pronto posible (antes de 1 hora), colocar los tubos con las muestras de tejido
en baño maría a 65 ºC durante 30-60 min.
4. Centrifugar la muestra durante 10 min a >14,000 RPM (alta velocidad) usando una
microcentrífuga, para concentrar los residuos de tejido (pellet).
5. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf limpio de 1.5 ml. Precipitar los ácidos
nucleicos llenando los tubos con una mezcla 6:1 de etanol:acetato de amonio 7.5 M.
Mezclar invirtiendo los tubos y dejar precipitar por 30 min a temperatura ambiente.
6. Agitar los tubos manualmente para romper el precipitado. Peletear los ácidos
nucleicos precipitados, centrifugando las muestras a 3,000 RPM (baja velocidad)
durante 10 min en una microcentrífuga.
7. Eliminar el sobrenadante. Agregar a los tubos con los pellets 300 l de RNAasa A
(concentración de 100 g/ml) + buffer TEa 0.1X (juntas). Agitar los tubos
manualmente y colocarlos a incubar en baño maría a 37 ºC por 1 hora.
8. Centrifugar las muestras a >14,000 RPM por 1 min (3 min si se desean muestras más
limpias), para peletizar los residuos de tejidos remanentes.
9. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio de microcentrífuga de 1.5 ml.
10. Precipitar el ADN llenando los tubos con una mezcla 10:1 de etanol:acetato de sodio 3
M. Mezclar invirtiendo los tubos y permitir que se precipiten a temperatura ambiente
por un tiempo no mayor a 30 min.
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11. Agitar bien los tubos manualmente para romper el precipitado, antes de proceder a
peletearlo. Centrifugar las muestras por 5 min a 3,000 RPM para peletizar el ADN.
12. Vaciar el etanol/acetato de sodio y lavar los pellets llenando los tubos con 70% etanol;
agitar manualmente.
13. Colectar los pellets centrifugando por 15 segundos a 14,000 RPM.
14. Vaciar el etanol y secar los pellets invirtiendo los tubos sobre papel toalla (2-3 horas o
de un día para el otro).
