Revista CENIC Ciencias Biológicas, Val. 29, No. 2, 1998.

OPTIMIZACION DE UN MEDIO DE CULTIVO PARA LA PRODUCCION DE ADD A PARTIR DE DE LA CAÑA DE AZUCAR S. Borrego, M.E. Espinosa, E. Martí y S.M. Fonseca.

SALINO FITOSTEROLES

Departamento de Esferoides, Centro Nacional de Investigaciones Científicas, Avenida 25 y 158, Playa, Cíudad de La Habana, Cuba.

Recibido: 23 de mayo de 1997.

RE!SUMEN. Mediante el diseño experimental plan compuesto cen- tral tridimensional con a = 1,6 8, se determinaron las concentra- ciones óptimas de las fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo en un medio de cultivo sintético que se utiliza para producir andro- stadiendiona (ADD) a partir de los fitosteroles de la caña de azúcar, mediante el mutante Mycobacterium sp. NRRL B-3683. Se obtuvieron cantidades optimas de ADD con el empleo de glicerol, 12 gL1; nitrato de sodio, 3,34 gL_’ y fosfatos de potasio mono y dibásico, 0,77 gL_‘.

ABSTRACT. A central composite three-dimensional design (with a = 1.6 8) has been employed to optimize the levels of carbon, ni- trogen and fosforous sources in a synthetic culture medium used to produce ADD from sugar cane phytosterols by Mycobacterium sp. NRRL B-3683. At concentrations of 12 gL_’ glycerol, 3.34 gL_’ of sodium nitrate and 0.77 gL_’ of K2HP04 and KH2PO4 the optima1 ADD leve1 was reached.

INTRODUCCION El diseño de medios de cultivo óptimos para el desarrollo

de procesos fermentativos es un aspecto de suma importan- cia, pues las concentraciones de los nutrimentos presentes en él pueden limitar el crecimiento y la excresión microbiana de los productos deseados. Para estos fines, se emplean diseños de experimentos, los cuales garantizan la obtención de un modelo estadístico con un número de experimentos re- lativamente bajo. A partir de estos modelos, se puede cono- cer la influencia relativa de los factores en estudio, así como de sus concentraciones sobre el aspecto de interés, que puede ser un crecimiento microbiano máximo o una produc- ción máxima de metabolitos.’

Dentro del campo de los esteroides, las fermentaciones se caracterizan por utilizar medios de cultivo que favorecen el crecimiento microbiano, aunque la naturaleza del sustrato esteroidal a biotransformar puede influir en el medio a em- plear,2v3 por ello, son necesarios los estudios encaminados a desarrollar medios de cultivo que permitan biotransformar esteroides eficientemente.

Los fitosteroles de la caña de azúcar constituyen una fuente de materia prima barata y asequible en el país que al ser biotransformada por mutantes de micobacterias, origina precursores esteroidales avanzados,4 a partir de los cuales se pueden producir múltiples fármacos.

En estudios previos5‘7 se analizaron cuestiones básicas relacionadas con las condiciones nutricionales necesarias para que el mutante Mycobacferiurn sp. NRRL B-3683 pro- duzca androstadiendiona (ADD) eficientemente a partir de los fitosteroles de la caña, las cuales permitieron formular un me- dio de cultivo sintético.

El objetivo de este trabajo fue optimizar este medio de cultivo para garantizar una elevada producción de ADD.

MATERIALES Y METODOS

Microorganismo

Se empleó la cepa Mycobacterium sp. NRRL B-3683, que produce preferentemente androstadiendiona (ADD) a par-

61

tir de los fitosteroles de la caña de azúcar,5-7 la cual se con- servó en agar nutritivo (OXOID) con glicerol al2%.

Condiciones de cultivo

Colonias puras de la cepa se cultivaron en sendos tubos de agar nutritivod urante3d.D os azadas se subcultivaron en el medio reportado por Conner y COI.,~ al cual se adicionó glicerol, 05 % y Tween 80(0,7 %). El cultivo se agito a 2OOr/ min durante4 8h ,a3 0 OC; luego, se centrifugóa 0 r/mind u- rante 10 min, se lavó con una disolución de Tween 80 (0,7 %) y se volvió a centrifugar en iguales condiciones. Posterior- mente, se agitó hasta homogeinización total. Los frascos en los que se llevó a cabo la biotransformación se inocularon con el 10% (v/v).

Biotransformación

Se utilizó el medio de cultivo salino siguiente (1 L): NaCI 5g ,F eS04 . 7HzO 0,l g, MgS04 7HzO 0,l g, CaCl 0,l g, MnS04. H20 0,059 ,e Ip Hs ea justóa .

Las concentraciones de glicerol, NaNOs,K 2HPC4 y KHsP04 fueron objeto de estudio.

Como sustrato se utilizó una mezcla de fitosteroles de caña de azúcar (80% de pureza) que se preparó de acuerdo con la metodología de Borrego y ~01.~ y que se añadió asépti- camente a los erlenmeyers con medio de cultivo estéril antes de inocularlos.Los cultivosse agitarona 200 r/minduranteô d, a 30 OC Posteriormente, se extrajeron 5 mL de cada cultivo para medir el crecimiento.

Determinación del crecimiento

Los 5 mL que se extrajeronde cada cultivose centrifuga- ron en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. La biomasase lavó dos veces con agua destiladay por último, se resuspendió en 2 mL de NaOH3m ol/Lylm Ld ea gua destilada, después se calentó por 10mi n en un baño a 1 OO OC y se dejó reposar hasta su enfriamiento total. En el so- brenadante se determinaron las proteínas por el método de Lowry?

Determinación de ADD RESULTADOS Y DISCUSION De los cultivos estériles se extrajo el ADD con acetato de

etilo [cuatro veces (4x100 mL)] y la determinación se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución, con el em- pleo de un detector UV a 254 nm, una columna de fase re- versa RP-18 de 5 mm (125X4) (Merck). El sistema de disol- ventes que se utilizó fue una mezcla agua-metano1 35:65 y se empleó un flujo de 1,5. Se utilizó 17a-metiltestosterona como patrón interno.

Diseño experimental de optimización

Para determinar las concentraciones óptimas de las fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo, se utilizó un#an com puesto central tridimencional (PCCT) con a =l ,68 (Tabla 1) y cada experimento se repitió cuatro veces. Posteriormente, se seleccionaronlos puntos7, 12 y 14 del diseño y una variant? adicional que se formuló como resultado del análisis de los polinomios obtenidos (Tabla ll). Las condiciones experimen- tales( variantes) se denominaron 1, 2,3y4r espectivamentey se realizaronnueve repeticionesde cada una de ellas con el ob- jetivode seleccionada óptima. Las mediasse compararonmedi- ante el análisisde varianzasimpley la pruebade Duncan.”

En experimentos preliminares se observó que la produc- ción de ADD tendía a aumentar cuando se utilizaba: 1 g Le’ de fitosteroles, 3 g . Le’ de Tween 4Oy el pH inicial del medio se ajustaba a 6. Además, las concentraciones de glicerol de- bían estar entre 10 y 209 C’, la de NaNO por encima de lg Le’ y la de los fosfatos (K2HP04 yK H2P04) entre 0,5 y lg Le’. También se conocía la influencia de algunos iones inorgánicos, así como de determinados factores de cre- cimiento sobre la producción de este precursor esteroidal.5 Teniendo en cuenta todos estos aspectos, las concentracio- nes de los nutrimentos esenciales en el PCCT se ajustaron alrededor de estos intervalos de trabajo. Los resultados se muestrane nl af igural .

El polinomio relacionado con la producción de ADD que se obtuvo fue el siguiente:

YAOD = 33,6 + 1,81X2 + 2,32%X3

TABLA I Condiciones experimentales estudiadas en el plan

compuesto central tridimencional con a =1,68

No se obtuvo ningún efecto cuadrático de los factores estudiados y solamente resultaron significativos los coeficien- tes X2 (nitrato de sodio) y X23 (interacción entre NaNOs yf os- fatos), lo que indicó la necesidad de aumentar las concentra- ciones de estos dos nutrimentos con vistas a mejorar los re- sultados. Aunque X3 (fosfatos) no es significativo, reportó un valor positivo, lo cual influye en la interacción que se es- tablece entre los fosfatos y el nitrato de sodio e indica que las concentraciones de estos nutrimentos deben mantenerse al- rededor de las más altas (Tabla 1).

El coeficiente XI (glicerol), aunque no resultó significa- tivo, indicó que se puede disminuir ligeramente su concen- tración para obtener buenos rendimientos, es decir que se puede trabajar con una de las concentraciones más bajas del diseño (Tabla 1).

Experimento Glicerol NaNO Fosfatosa

ta Le11

1 12 132 0,23

2 28 192 0,23

3 12 298 0,23

4 28 298 0,23

5 12 172 0,77

6 28 172 0,77

7 12 278 0,77

8 28 278 0,77

9 6,36 270 0,50

10 33,44 230 0,50

ll 20 0,66 0,50

12 20 3,34 0,50

13 20 290 0,05

14 20 2,O 0,95

15 20 2,O 0,50

a Se utilizaron cantidades iguales de KeHP04 yK HzP04.

TABLA II Concentración de los nutrimentos en estudio de las condiciones experimentales (variantes)

seleccionadas uara determinar la óutima

Nutrimentos (g .L-‘)

Variantes

1234

Glicerol 12 202 0 12

NaNO 278 3,34 2 3,34

Fosfatosa 0,77 035 0,95 0,77

a Se utilizaron cantidades iguales de KnHP04 yK WQ.

Al analizar el crecimiento, se observó que las concentra- cionesde proteínase encontrabanalrededorde 0,5 mg mC’. El polinomio obtenido fue el siguiente:

Yb = 0,46 + 0,08X1

Sólo el glicerol (XI) influyó significativamente en el cre- cimiento microbiano, ya que es necesario utilizar concentra- ciones que oscilen entre las medias y las altas para beneficiar este proceso.

Teniendo en cuenta estos resultados, se tomaron las mejores variantes del diseño, que se denominaron 1,2y3 , así como una teórica obtenida del análisis de los coeficientes delp olinomio ques ed enominó4ys e compararonm ediante el análisis de varianza simple y la prueba de Duncan.

En la variante 2, correspondiente al experimento 12 del PCCT (Tabla III), el rendimiento de ADD que se obtuvo re- sultó significativamente más bajo, mientras que en las otras, los resultados fueron contrarios y no se presentaron diferen- cias significativas entre ellas y la variante 4.

La selección de la mejor variante de medio de cultivo, se realizó teniendoen cuentael rendimientode ADD, ya que el cre- cimiento microbianoes un aspecto secundarioen este análisis, porello,se tomó la condiciónexperimental como la óptima.

CONCLUSIONES

El análisis de los polinomios obtenidos permitieron di- señar una variante de medio de cultivo que resultó óptima para la producción de ADD, la cual se caracteriza por poseer parall ,1 2gd eg licerol, 3,34gd eN aNO yo, 77gd e K2HP04 yK H2PO4.

62

5. ,W) (mg/mL) , -

40 -

30 -

20 - o-u 10 - I 2

I,U

0,a

:ls I 4 5

r

ll l- h llll. 8 9 10 II

t., h.- 13 14

1 . 15

096

0,4

0,2

0

3 6 7 12

Experimentos

q YP/S (slo 0 Proteína (mg/mL)

Fig. 1. Rendimiento de ADD y crecimiento microbiano obtenidos con la aplicación del diseño experimental plan compuesto central tridimensional.

TABLA III Producción de ADD en cuatro variantes experimentales

del medio de cultivo en estudio

Variantes Y(P/S) (%)

Proteínas (mg mC’)

14 2,l f 3,0 (ab) 0,49 f 0,04

2 39,6 * 2,4 (b) 0,67 f 0,Ol

34 1,l f3,l (ab) 0,54 f 0,02

4 46,8 f 3,6 (a) 0,57 f 0,02

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Francisco Martínez Luzardo por el asesoramiento

estadístico, así como al Dr. Gerardo Iglesias por donar el pro-

grama de computación que sirvió para el análisis estadístico

de todos los resultados.

BIBLIOGRAFIA 1. Sarra M., Redin I., Ochin F., Godia F. and Casas C. Biotechnol.

Lett., 15, 559, 1993. 2. Weber A., Kennecke M. and Mller R . US Patent 4431732, 1984. 3. Salmond W., Sacks C. y Wovcha M. Patente Francesa 2510120,

1982. 4. Sierra P., Patrón M.A., Pérez I., Villant J., Orozco L.R., Borrego S.

y Fajardo M. Utilización biotecnológica de los fitosteroles de la caña de azúcar. ll Seminario Científico sobre Intetferón y I Semi- nario Cubano sobre Biotecnología, Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, La Habana, 1986.

5. Borrego S., Herrera A., Espinosa M.E., Martí E. y Fonseca M. Re- vista CENIC Ciencias Biológicas, 26,40, 1995.

6. Herrera A., Espinosa M.E., Borrego S., Ramírez A.M. y Martí E. Revista CENIC Ciencias Biológicas, 26, 44, 1995.

7. Herrera A., Espinosa M.E., Borrego S., Guillén F. y Falero A. Re- vista CENIC Ciencias Biológicas, 26,47. 1995.

8. Conner A.H., Nagaoka M., Rowe J.W. and Perlman D. Appl. En- viron. Microbiol.,32,310, 1976.

9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. J. Biol. Chem., 193,265.1951.

10. López R. Diseño estadístico de experimentos. Editorial Científice Técnica, Instituto Cubano del Libro, La Habana, 103-l ll, 1988.

63