Revista Med

ISSN: 0121-5256

revista.med@umng.edu.co

Universidad Militar Nueva Granada

Colombia

Riveros Rivera, Alain

REGISTROS IN VIVO DE LA FACILITACIÓN POR PULSOS PAREADOS Y LA POTENCIACIÓN A

LARGO PLAZO EN LA REGIÓN CA1 DE LA RATA DESCRIPCIÓN Y PRUEBA DE UNA TÉCNICA

PARA LA EVALUACIÓN DE LA PLASTICIDAD SINÁPTICA

Revista Med, vol. 13, núm. 1, julio, 2005, pp. 75-85

Universidad Militar Nueva Granada

Bogotá, Colombia

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=91001308

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BELTRÁN O., QUINTERO L.

75Volumen 13 • No. 1 - Julio de 2005

REGISTROS IN VIVO DE LA FACILITACIÓN POR PULSOS PAREADOSY LA POTENCIACIÓN A LARGO PLAZO EN LA REGIÓN CA1 DE LA

RATA: DESCRIPCIÓN Y PRUEBA DE UNA TÉCNICA PARA LAEVALUACIÓN DE LA PLASTICIDAD SINÁPTICA

ALAIN RIVEROS RIVERA*MÉDICO DOCENTE BIOFÍSICA Y FISIOLOGÍA, FACULTAD DE MEDICINA

UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA

Resumen

En Colombia, la investigación básica en el campo de la neurofisiología demanda la introducciónde técnicas adecuadas para la evaluación de la actividad dinámica neuronal. La técnica que aquíse presenta describe los pasos esenciales para el registro poblacional de la actividad neuronal enel área CA1 del hipocampo. Este tipo de registro resulta útil para estudiar cambios plásticos enel sistema nervioso, tales como la facilitación por pulsos pareados (PPF) y la potenciación a largoplazo (LTP). Este último fenómeno es una evidencia experimental de cambios duraderos en laeficiencia sináptica, que podrían subyacer a procesos normales como el aprendizaje, o patológi-cos, como la epilepsia. En este trabajo se presentan de manera sencilla, los pasos básicos deestos procedimientos experimentales, con fin de que los investigadores colombianos puedanejecutarlos con estándares de calidad aceptados internacionalmente. Además, se muestran algu-nos registros que han permitido poner en evidencia las características básicas de los fenómenosde plasticidad neuronal antes mencionados. Como aporte final se recomiendan al lector lossitios de Internet en donde se puede consultar información adicional y descargar algunos pro-gramas que resultarán útiles para la implementación de la técnica.Tema: Electrofisiología del sistema nervioso. Tópico: Plasticidad sináptica en el hipocampo.

Palabras claves: potenciación a largo plazo, transmisión sináptica, hipocampo, plasticidadneuronal, electrofisiología.

RECORDING OF PPF AND LTP IN NEURONS OF CA1 IN VIVO INTHE RAT: DESCRIPTION AND TESTING OF THE TECHNIQUE

FOR THE EVALUATION OF THE SYNAPTIC PLASTICITY

Abstract

This paper has been published to show a technique for evaluation of the neuronal activity. Thetechnique presented here showed extracellular recordings of hippocampal neurons of CA1.These recordings may result useful in many electrophysiological studies of neuronal plasticity

* Dirección electrónica: alainriv@umng.edu.co, alainrmd@hotmail.comTel. 6409420 Ext. 133Dirección postal: Laboratorio de Fisiología, Facultad de Medicina, UMNG. Transv 3 No 49-00. Bogotá, Colombia.

Recibido: abril 14 de 2005. Aceptado: mayo 25 de 2005

REVISTA 13 (1): 75-85, 2005

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in the nervous system such as Paired-Pulse Facilitation (PPF) and Long-Term Potentiation(LTP). Especially, LTP is considered electrophysiological evidence of learning and may berelevant for the understanding of the mechanisms of memory. This paper describes a simpletechnique to record of the PPF and LTP with local resources available in our country but goodstandard of quality and presents recordings of these phenomena. Finally, this paper enlistedinternet sites for download programs and papers for implementation of this technique.Themes: Electrophysiology of the nervous system. Topics: Synaptic plasticity in thehippocampus.

Keywords: long-term potentiation, synaptic transmission, hippocampus, neuronal plasticity,electrophysiology.

Introducción

En 1973 los investigadores Bliss y Lomo presen-taron su trabajo sobre la plasticidad sináptica en elhipocampo, en el cual apareció por primera vezregistrado un fenómeno conocido desde entoncescomo potenciación a largo plazo (cuya sigla es LTP,del inglés Long Term Potentiation) (1;2). Hastala fecha, son numerosas las investigaciones que sehan llevado a cabo sobre la LTP no sólo en elhipocampo, sino también en otras regiones cere-brales como la amígdala o la médula espinal (3;4).La importancia de estudiar la LTP radica en elhecho de ser la primera evidencia electrofisiológicapor medio de la cual la modificación en los patro-nes de activación pre y postsináptica conducen acambios a largo plazo en la eficiencia sináptica(5;6). Precisamente, Donald Hebb postuló en 1949que la memoria es un proceso en el que aumentala eficiencia sináptica y que ocurre cuando unaneurona A descarga repetida y persistentementesobre una neurona B, de tal manera que entre ellasse genera un cambio que hace que B respondamás activamente a A (7). Los investigadores rápi-damente relacionaron los postulados hebbianoscon la LTP y desde entonces son fuertes los víncu-los que existen entre la LTP y los estudios celula-res del aprendizaje y la memoria(6).

Sin embargo, la LTP no es el único eventoelectrofisiológico que da evidencia de los cambiosplásticos de la actividad neuronal. Se encuentrantambién la potenciación a corto plazo (sigla STP,del inglés Short Term Potentiation), la potencia-ción postetánica (sigla PTP, del inglés Post TetanicPotentiation) y la plasticidad por pulsos pareados(8;8). Esta última resulta de la estimulación por

pares de pulsos de una población de neuronas, locual predispone a una modificación en la respues-ta sináptica. En caso de que la respuesta al segun-do pulso sea mayor que la respuesta al primero,hablamos de facilitación por pulsos pareados (si-gla PPF, del inglés Paired-Pulse Facilitation); encaso contrario, recibe la denominación de depre-sión por pulsos pareados (sigla PPD, del inglésPaired-Pulse Depression) (8). El objetivo de esteartículo es demostrar que es posible desarrollar enColombia técnicas de investigación para la eva-luación de la plasticidad sináptica, con estándaresde calidad internacional. Para ello se muestranregistros obtenidos en el Laboratorio de Fisiologíade la Universidad Nacional de Colombia en el pre-sente año y se explican las características esencia-les de los mismos.

Utilidad de la técnica

La técnica que se presenta en esta revisión es ade-cuada para la investigación de diferentes fenóme-nos de plasticidad sináptica en el sistema nerviosocentral. Además, se describen otras técnicas, quea pesar de ser poco conocidas, facilitan la fabrica-ción de elementos básicos para este tipo de inves-tigaciones y que normalmente sin ellas, podríanresultar costosos. Las posibles aplicaciones de latécnica presentada son las siguientes:

1. Potenciación a largo plazo (LTP) desencade-nada por la estimulación tetánica de aferenciassinápticas dirigidas a neuronas de la regiónCA1 de ratas.

2. Medición de los efectos de estimulación conbreves intervalos de estímulo y las modifica-

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ciones presinápticas a través de la Facilitaciónpor pulsos pareados (PPF).

3. Efectos farmacológicos en la modulación desistemas de plasticidad sináptica neuronal.

4. Efectos de la exposición a ambientes inusualesen las respuestas adaptativas del sistema ner-vioso central.

5. Neurofisiología celular.6. Estudios de la actividad neuronal poblacional

global.7. Diseño de redes neuronales artificiales.8. Enseñanza e investigación en ciencias básicas

para programas de pre y postgrado.

Descripción de la técnica

Los pasos esenciales a la hora de iniciar el montajeexperimental son los siguientes:

1. Tiempo requerido

El promedio de tiempo requerido desde el iniciode la anestesia hasta el comienzo del registro esde máximo 45 minutos para un investigador ex-perimentado. La duración de cada uno de los pa-sos se enlista a continuación:

1. Anestesia (10 minutos).2. Preparación del campo quirúrgico (15 minu-

tos).3. Localización de los puntos para inserción de

los electrodos (5 minutos).4. Inserción y optimización de la posición de los

electrodos de estimulación y registro (15 mi-nutos).

Luego de terminada la preparación, la duraciónde los registros promedia los 150 minutos y de-pende de la calidad de los mismos y de la facilidadpara obtener una respuesta tetánica.

2. Materiales

Animales: Ratas adultos machos de la cepa Wistarcon un promedio de peso de (200-250 g) mante-nidas bajo condiciones estándar, con un ciclo luz/oscuridad de 12 horas y alimentación ad libitum.

Equipo para la preparación:

1. Marco estereotáxico para ratas.2. Micromanipuladores.3. Instrumental quirúrgico que incluye hojas de

bisturí Nº 24 (Hard-Parker, N.J. U.S.A.),separadores de campo, brocas de trepanaciónNº11, taladro manual, hisopos de algodón.

4. Jeringas y agujas (1 ml y 27G X 13 mm, BDPLASTIPAK(r)).

Equipo para registro y estimulación:

1. Equipo de registro electrofisiológico Axon-Instruments(®).

2. Estimulador de corriente.3. Equipo para el control de las pautas de estimu-

lación Tarjeta National Instruments(®) con soft-ware Labview(®) versión 7.

4. Electrodos de tungsteno (70 mm con impe-dancias entre 3 y 5 MΩ -Ver anexo).

5. Electrodo de estimulación bipolar de tungste-no (200 micras entre puntas - Ver anexo).

3. Procedimiento detallado

Anestesia: La anestesia se realiza con uretano,dado que esta molécula no interfiere con la activi-dad de los receptores de glutamato NMDA (N-metil-d-aspartato), cuya activación es necesaria para lainducción de LTP (9;10). Hay que tener en cuentaque esta es una sustancia carcinogénica y comotal debe manipularse con medidas de bioseguridad.La dosis para administración intraperitoneal es de1,5 a 2,0 g/Kg, siendo necesarias generalmenteentre 2-3 dosis, con un intervalo promedio entreellas de 30 minutos (3). La abolición de los reflejoscorneano y de retirada se considera buen indica-dor de un adecuado nivel de anestesia.

Preparación del área quirúrgica:

1. Se coloca la rata en decúbito ventral y se ra-sura el pelo en un área que abarque toda lasuperficie craneal. Se recomienda el uso detijeras para evitar lesionar al animal.

2. Con la rata en un buen nivel de anestesia semonta en el marco estereotáxico.

3. Una vez despejado el campo se realiza unaincisión continua a lo largo de la línea mediaempezando desde la región frontal. La incisióntermina en un punto cercano a la región occi-pital, teniendo cuidado de no cortar la muscu-

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latura cervical, ya que esto puede desencade-nar gran sangrado.

4. Con los separadores se mantiene la piel lomás alejada posible para que se puedan verlas suturas craneales. Aunque una buena téc-nica de incisión garantiza poco sangrado, esposible que sea necesaria la compresión pe-riódica con hisopos para favorecer la hemos-tasia. Se debe retirar el periostio de la superfi-cie del cráneo, especialmente cuando se vayana implantar electrodos para registro crónico.

5. El punto de referencia para las coordenadasesterotáxicas de esta preparación es el puntobregma (unión de las suturas sagital y coronal).Aunque puede utilizarse el eje interauricular,se prefiere bregma por los buenos resultadosy por lo fácil que resulta localizar los puntosde registro y estimulación.

6. Dado que la fimbria (proyección de neuronaspiramidales desde CA3 hacia neuronas pira-midales de CA1 contralateral) contiene grancantidad de fibras comisurales, es el sitio reco-mendado para la estimulación (11). La prepa-ración de electrodos contralaterales facilita eluso simultáneo de manipuladores para ambos

electrodos. Las coordenadas óptimas para laimplantación de los electrodos son:a) Fimbria: 1,3 mm por detrás de bregma;

0,6 mm lateral a la línea sagital y 6 mm deprofundidad.

b) CA1: 3,6 mm atrás de bregma; 2,5 mmlateral a la línea sagital y 2,2 mm de pro-fundidad.

Técnica electrofisiológica: Una vez posicionadoslos electrodos de estimulación y registro, se im-planta el electrodo de referencia (preferiblementede platino) en la musculatura cervical. Las caracte-rísticas recomendadas para el registro extracelularen el hipocampo son las siguientes:

a) Frecuencia de muestreo: 10 KHz.b) Ancho de banda: 10 Hz a 10 KHz.

A continuación se procede a aplicar la denominada«prueba de estimulación», la cual consiste en obser-var la respuesta de potenciales excitatoriospostsinápticos de campo (sigla fEPSP, del inglés fieldExcitatory PostSynaptic Potentials) en condicionesbasales. El objetivo específico es determinar la rela-

FIGURA 1. Potenciales postsinápticos excitatorios de campo (fEPSP) obtenidos por estimulación con un parde impulsos con una diferencia entre ellos de 50 ms. Aquí se ve la respuesta promediada de 20 minutos deregistro. Se observa claramente como la amplitud del segundo fEPSP es mayor que la del primero. Estefenómeno se conoce como facilitación por pulsos pareados o PPF.

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ción entre la intensidad del estímulo y la magnitudde la respuesta, con lo que se pueden determinarlas intensidades umbral y de saturación. Se sueleaplicar una corriente in crescendo hasta encontrarun nivel de respuesta máximo. La cantidad de co-rriente varía según la preparación y el individuo,pero está en los rangos de micro a miliamperios.

La intensidad de estímulo seleccionada con estepaso será la que se utilice para la evaluación de larespuesta sináptica. Se recomienda utilizar comointensidad de estímulo el 60% de la corriente queprodujo la respuesta máxima. La razón de no uti-lizar valores superiores o inferiores de intensidad,radica en el hecho que la magnitud de la LTP ob-tenida, se afecta directamente por la intensidaddel estímulo de la prueba de estimulación. Si seutilizan estímulos que desencadenan pequeñosfEPSP, se tendrá un gran rango sobre el cual larespuesta puede aumentar y con ello la LTP puedeaumentar enormemente en términos porcentuales.En el caso contrario, es decir, si el estímulo desen-cadena grandes fEPSP, el rango para que se au-mente la respuesta es muy estrecho y por ello laLTP será más pequeña (8).

Una vez que se haya podido determinar la intensidadde corriente, se puede evaluar la respuesta sinápticacon la estimulación por pulsos pareados. El objetivoes poner en evidencia la PPF, para lo cual se puedenutilizar un par de estímulos con diferencia entre ellosde 50 milisegundos y entre cada par de 10 segun-dos (ver figura 1). Este procedimiento permite ade-más, determinar cuál es la respuesta basal a laestimulación de la región hipocampal.

Una vez que la preparación se ha estabilizado yque se ha registrado la respuesta poblacional deCA1 (un paso que dura aproximadamente 30 mi-nutos), procedemos a aplicar la técnica de condicio-namiento de LTP. Es conveniente recalcar aquí, laimportancia de tener una línea de base estable, yaque desviaciones en su valor durante el tiempo deregistro (media hora) tan pequeñas como del 10%,podrían en un lapso de tres horas, conducir a des-viaciones hasta del 60%. El no tener en cuentaesta modificación paulatina de la línea de base,podría constituir un error sistemático de registro ypor ende conducir a una mala interpretación delos datos (8).

Existen varios protocolos para desencadenar LTPconocidos como protocolos de inducción, de condi-cionamiento o de estimulación tetánica. Los patro-nes utilizados dependen del tipo de preparación,el sujeto experimental y el área donde se quieraregistrar.

En resumen, se dispone de tres protocolos bási-cos de estimulación (8):

1. El protocolo clásico consiste en la aplicaciónde 100 estímulos a una frecuencia de 100 Hz,con lo cual se logra LTP que puede durar va-rias horas.

2. El protocolo «priming» consiste en la adminis-tración de un estímulo inicial seguido 200 mili-segundos después por un tren de dos o cuatroestímulos con una frecuencia de 100 Hz.

3. El protocolo «theta» consiste en la administra-ción de una frecuencia de estimulación pare-cida al patrón fisiológico de las neuronashipocampales de 5 ciclos por segundo (ritmotheta). Se pueden aplicar diez trenes con unintervalo entre ellos de 200 milisegundos (rit-mo theta); cada tren contiene cuatro estímu-los de 100 Hz. Los registros presentados aquí,han sido desencadenados por una modifica-ción en la cual se administraron 20 trenes conun intervalo theta entre ellos y cada tren con-formado por cinco estímulos de 100 Hz; estemismo patrón se aplica cada dos minutos paraun total de 400 estímulos que comparado conlos otros protocolos (100 estímulos en total),aseguran mejores resultados en la potenciaciónsináptica.

4. Un vez que concluye la fase de condiciona-miento se evalúa nuevamente la respuestaobtenida por la estimulación del hipocampo.

Resultados de las pruebas

Los registros característicos obtenidos por la esti-mulación por pulsos pareados se presentan en lafigura 1. Aunque el gradiente temporal entre losdos estímulos para conseguir una adecuada res-puesta puede variar con la etapa del desarrollo delsistema nervioso (12), se han utilizado en este casopautas de estimulación con un intervalo de 50milisegundos.

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FIGURA 2. Potenciales postsinápticos excitatorios de campo (fEPSP) obtenidos por estimulación con un parde impulsos con una diferencia entre ellos de 50 ms. Aquí se ve la respuesta promediada de 20 minutos deregistro después de que se ha aplicado el protocolo de estimulación tetánica que desencadena LTP. Se observaclaramente como a diferencia de los registros vistos en la figura 1, la amplitud del segundo fEPSP no tienediferencias significativas con respecto al primero.

FIGURA 3. Potenciales postsinápticos excitatorios de campo (fEPSP) obtenidos por estimulación con un par deimpulsos y con una diferencia entre ellos de 50 ms. Aquí se comparan las respuestas obtenidas antes y despuésdel protocolo de estimulación tetánica. Es evidente la drástica modificación suscitada en la PPF por la LTP.

Existe controversia acerca de las interacciones quese puedan presentar entre diferentes tipos de plas-ticidad sináptica. Una de las más estudiadas es laque existe entre la PPF y la LTP. (13) En la figura2 se presenta la respuesta obtenida por la estimu-

lación por pulsos pareados luego de la técnica decondicionamiento. Para facilitar la comparaciónse presentan además los registros de pulsos pa-reados antes y después del protocolo de condicio-namiento (figura 3).

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Una representación clásica de la potenciación alargo plazo se muestra en las figuras 4 y 5, dondese grafica la relación porcentual en la pendiente y

amplitud de los fEPSP antes y después de la admi-nistración del protocolo de condicionamiento.

FIGURA 5. Potenciales postsinápticos excitatorios de campo (fEPSP) obtenidos antes y después de laestimulación tetánica. Aquí se ve la respuesta promediada de 20 minutos de registro antes, conformando lalínea de base al 100%. Se observa además un aumento porcentual en la pendiente luego del tétanos. Llama laatención que el cambio no fue tan evidente como el de la amplitud visto en la figura 4.

FIGURA 4. Potenciales postsinápticos excitatorios de campo (fEPSP) obtenidos antes y después de laestimulación tetánica. Aquí se ve la respuesta promediada de 20 minutos de registro antes, conformando lalínea de base al 100%. Se observa además un aumento porcentual en la amplitud luego del tétanos. Esevidente que la eficacia de la sinapsis aumentó considerablemente, fenómeno conocido como potenciación alargo plazo o LTP.

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postetánicas son potenciadoras o inhibidoras, yaque se han obtenido respuestas de los dos tipos.(13)

El segundo fenómeno puesto en evidencia, la LTP,consiste en el fortalecimiento de la conexiónneuronal a través de mecanismos pre y postsináp-ticos (6). Para que esto tenga lugar se necesita unaactivación presináptica repetitiva, la cual se lograexperimentalmente por medio de la aplicación deun estímulo tetánico el cual se ha descrito anterior-mente. Se cree entonces que la gran liberacióndel neurotransimor y la potenciación de la neuro-na postsináptica conducen al fortalecimiento de laconexión, que a diferencia de la PPF, puede durarmedia hora o más. Dentro de los protagonistasmoleculares de este fenómeno se encuentra prin-cipalmente el receptor para el glutamato conoci-do como receptor NMDA. Es cierto que para laaparición de LTP en algunos circuitos cerebralesno se necesita de este receptor (como por ejem-plo la sinapsis entre las fibras musgosas y CA3);sin embargo, la vía que se evalúa en este protoco-lo (conexión CA3-CA1), necesita de dicho recep-tor (10).

En las figuras 4 y 5 se pone en evidencia la LTPhipocampal donde se grafican las pendientes y lasamplitudes de los fEPSP en términos porcentua-les. Se asume que los valores de estas variablesantes de la aplicación del estímulo tetánico corres-ponden al 100 %. Se ve que luego del condiciona-miento se modifican considerablemente las ampli-tudes y las pendientes de los fEPSP; sin embargo,llama la atención que son más dramáticos los cam-bios en la amplitud en comparación con los cambiossuscitados en la pendiente.

La evaluación y representación de los datos quese muestran con esta técnica, reclaman el uso dealgunos programas de análisis y graficado que re-comendamos al investigador. Para el análisis delos datos, el experimentador encontrará la versióndemo gratis de pCLAMP 9 que se puede descar-gar gratis desde la referencia 2 de internet. Estesoftware permite calcular las pendientes de losfEPSP y también la amplitud de los mismos. Unaopción adicional y que se puede descargar total-mente gratis es el programa «LTP program» paraDOS desde la referencia en internet 3 (14). Losdatos obtenidos se pueden exportar a una hoja de

Discusión

El tipo de estimulación y los registros de la regiónhipocampal mostrados en este estudio permitenevidenciar fenómenos de plasticidad sináptica enel sistema nervioso central, los cuales puedenimplementarse con miras a la formación investi-gativa en programas de pregrado y postgrado. Elprimero de ellos es la PPF, un fenómeno en elcual se cree que la activación presináptica con laconsecuente entrada de calcio a la terminal axonal,predispone a la sinapsis para que genere una ma-yor liberación de neurotransmisor si se llega a pre-sentar un estímulo temporalmente cercano (8). Seevidencia, por ejemplo, cómo la aparición de dosestímulos muy cercanos en el tiempo puede con-dicionar el tamaño de los fEPSP. En la figura 1, seve que el tamaño del segundo potencial es consi-derablemente superior al tamaño del primero, unevento que está particularmente relacionado conla cantidad de calcio en la terminal presináptica.Se cree que el primer estímulo presináptico pre-dispone una mayor liberación de neurotransmisorpor la presentación muy cercana de un segundoestímulo, así que el calcio que entra normalmentepor este último, se suma al calcio que aún no hasido retirado de la terminal axonal. La mayor dis-ponibilidad de calcio aumenta la cantidad de vesí-culas sinápticas que liberan su contenido y con ellola cantidad de neurotransmisor en la hendidurasináptica (12). Estos sucesos conducen en últimasa que se desencadene una mayor activaciónpostsináptica, la cual se ve reflejada en un aumentode los fEPSP evocados por el segundo estímulo.

La maquinaria celular implicada en los procesosde plasticidad sináptica puede inclusive producirefectos cruzados entre los diferentes tipos. Unode los más estudiados es la interacción entre laPPF y la LTP; en la figura 3 se observa que alintentar aplicar nuevamente los estímulos parea-dos luego del protocolo de condicionamiento, nohay mayor diferencia entre el primer y el segundoestímulo. Este hecho parece estar relacionado conlas modificaciones presinápticas relacionadas conla probabilidad de liberación del neurotransmisor,pues se sabe que la PPF está inversamente relacio-nada con ésta y la LTP aumenta la probabilidad deliberación del neurotransmisor y por ende dismi-nuye la aparición de PPF. Sin embargo, aún exis-te controversia respecto a si las modificaciones

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cálculo que muestre los promedios y desviacionesestándar cada minuto y las gráficas de la actividadneuronal antes y después del tétanos. Las varia-bles que se utilizan como referencia son la ampli-tud y la variación en porcentaje de la pendienteinicial de los fEPSP, siendo 100% el valor inicial.

Conclusiones

Los registros electrofisiológicos constituyen unarica fuente de información acerca del funciona-miento del sistema nervioso, lo cual ha motivadoa que esta línea de investigación se haya desarro-llado bastante durante el último siglo. Sin embar-go –y a pesar de la importancia que tiene para lacomunidad científica mundial– las investigacionesque se realizan en Colombia en el área básica yque se publican en las revistas indexadas son pro-porcionalmente bajas; una posible razón es la

dificultad en el montaje de laboratorios con instru-mental adecuado. El objetivo de este artículo fueel de presentar en forma explícita, los requerimien-tos mínimos para la consolidación de una técnicaelectrofisiológica que permita la enseñanza e in-vestigación de los procesos de plasticidad neuronal.En esta área, específicamente, resulta de gran in-terés por las implicaciones que tiene en la modifi-cación de procesos fisiológicos, e incluso patológi-cos, tales como la epilepsia, enfermedad deParkinson y enfermedad de Alzheimer (15). Comose pone de manifiesto, estas técnicas se puedendesarrollar en nuestro país y conducen al fomentode líneas de investigación en ciencias básicas. Unade las pretensiones de nuestro grupo de trabajo esconsolidar una línea de investigación que permitaesclarecer estos fenómenos y obtener una aproxi-mación terapéutica desde la perspectiva fisiológi-ca a las condiciones anteriormente descritas.

ANEXO

FABRICACIÓN DE ELECTRODOS DE REGISTRO EXTRACELULARY ELECTRODOS BIPOLARES DE ESTIMULACIÓN

En la fabricación de electrodos de registro y estimu-lación es necesario tener en cuenta varios aspectos,dentro de ellos el tipo de material, pues dependien-do de él, se evitan modificaciones drásticas de losregistros. Además, este debe ser inerte, con el ob-jeto de evitar reacciones tisulares, sobre todo cuan-do se trata de electrodos implantados crónicamente.Otro fenómeno a tener en cuenta es la polarización,la cual se evita con materiales específicos, como eloro, la plata, el platino, el iridio y el tungsteno. Esteúltimo es bastante recomendable, pues resulta fácilde aguzar de acuerdo con las necesidades y porquelos registros obtenidos son de buena calidad.

Del alambre de tungsteno, cuyo diámetro puedevariar entre 150 y 300 µm, se toma una piezarecta de aproximadamente 70 mm. Uno de susextremos se conecta a una fuente de voltaje de 2-6 V y el otro se pone en contacto con un recipien-te que contiene una solución de nitrito de potasio

(KNO2) o hidróxido de potasio (KOH), este últi-mo a una concentración 0,17 M (figura 6). La so-lución hace contacto con un electrodo de carbón,el cual está conectado a la otra salida de la fuentede voltaje, por lo cual cada vez que el alambre detungsteno hace contacto con la solución, se cierrael circuito. Lo que aquí se produce es una reac-ción electrolítica que irá perfilando una fina puntaal electrodo, hasta alcanzar valores tan pequeñoscomo de 0,5 µm. Sin embargo, para los registrosextracelulares bastará con un diámetro de entre10-50 µm. Cuando se tenga a punto el electrodose suelda un pin macho en el extremo no afilado,para conectarlo al equipo de registro. Para lograrel aislamiento del electrodo se puede usar siliconalíquida diluida, o una solución de acetato de etilo,tolueno, butanol y plastificante (16).

El último paso para asegurar un buen registro esmedir la resistencia exacta del electrodo. Para la

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implementación de este protocolo se ha utilizadoel «electrode test», una función incorporada a losequipos de registro Axon instruments(®). Los va-lores recomendados oscilan entre 2 a 7 MΩ.

Para la construcción de los electrodos bipolares esnecesario recubrir primero el alambre de tungste-no con la solución de aislamiento y posteriormen-te entorchar en espiral los dos alambres. A cadauno de los extremos se conecta un pin hembraque sirve para la llegada de la señal del estimulador.

Referencias a la literatura esencial

Los trabajos originales de Timothy Blis y TerjeLomo resultan una guía indiscutible para el inves-tigador del área, los cuales pueden ser consulta-dos en la base de datos de la Hemeroteca Nacio-nal anexa a la Biblioteca Central de la UniversidadNacional de Colombia (1;2). El lector también en-contrará agradable e instructiva la lectura deBortolotto y colaboradores(8), una revisión que sepuede descargar gratis desde Internet.

Referencias en Internet

1. http://www.moleculardevices.com/pages/instruments/axon_guide.html

Axon guide: se encuentran guías sobre aspectos básicosdel registro electrofisiológico.

2. http://www.moleculardevices.com/pages/software/cn_pclamp90.html

Se puede descargar gratis el programa pCLAM 9 demo, elcual permite el análisis de registros electrofisiológicos.

3. http://www.ltp-program.com/LTP PROGRAM: Software de análisis de registros de LTP.Corre con DOS. Incluye guía. El fabricante no cobra porla descarga y sólo reclama el reconocimiento de la utiliza-ción del programa en los trabajos que lo implementen.

Referencias

1. Bliss TV, Gardner-Medwin AR. Long-lasting potentiationof synaptic transmission in the dentate area of theunanaestetized rabbit following stimulation of the perforantpath. J Physiol 1973; 232(2):357-374.

2. Bliss TV, Lomo T. Long-lasting potentiation of synaptictransmission in the dentate area of the anaesthetized rabbitfollowing stimulation of the perforant path. J Physiol1973; 232(2):331-356.

3. Svendsen F, Rygh LJ, Gjerstad J, Fiska A, Hole K, TjolsenA. Recording of long-term potentiation in single dorsalhorn neurons in vivo in the rat. Brain Res Brain Res Protoc1999; 4(2):165-172.

4. Yaniv D, Schafe GE, LeDoux JE, Richter-Levin G.Perirhinal cortex and thalamic stimulation induces LTP indifferent areas of the amygdala. Ann N Y Acad Sci 2000;911:474-476.

5. Martinez JL, Jr., Derrick BE. Long-term potentiation andlearning. Annu Rev Psychol 1996;47: 173-203.

6. Lynch MA. Long-term potentiation and memory. PhysiolRev 2004;84(1):87-136.

FIGURA 6. Montaje para la fabricación de electrodos de tungsteno. Se recomienda además un manipuladorcontrolado por un motor de paso, para emerger paulatinamente el electrodo y así obtener diámetros de puntaestándar.

RIVEROS RIVERA A.

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