PCR 2da Parte (27 de Marzo)
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PCR
(Polymerase chain reaction)
Reaccin en cadena de la polimerasa
2da parte
Biotecnologa 2015
Joan Mir i Ferr
(1893-1983 )
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PCR en tiempo real / Real-Time PCR / qRT-PCR
PCR cuantitativo de alta precisin y
reproducibilidad.
Sistemas de deteccin fluorescente.
La cantidad de fluorescencia emitida es
proporcional a la cantidad de producto
amplificado en cada ciclo.
Los termocicladores poseen un detector que
mide la emisin de luz de las muestras.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., and Griffith, R. (1992).
"Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences"
Biotechnology 10:413417
PCR CUANTITATIVO
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3
R Q
Reportero Quencher
A T C G G Sonda
Taqman
oligonucleotido diseado para hibridizar con la secuencia del DNA a
amplificar que contiene dos
fluorocromos:
R
Q
Ubicado a 5(disponibles varios para permitir
reacciones mltiples. Ej: 6-carboxilfluorescena)
Ubicado a 3 (6-carboxi-tetrametil-rodamina)
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INTERCALADORES
BROMURO DE ETIDIO
MINOR GROOVE BINDERS
SYBR GREEN
Cuantificacin de DNA mediante la
unin de sustancias fluorescentes.
Tipos de unin al DNA:
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Rn: fluorescencia
Threshold: umbral sobre la lnea de base
CT: ciclo en el cual la Rn esta por encima de la lnea de base
(NTC: no template control)
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Gran variacin en la cantidad de producto
Muy poca variacin en la cantidad de producto
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Diluciones sucesivas (1/5)
del templado inicial
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Log C0
CT
C0: cantidad inicial de DNA genmico
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A260 : 1 50 g/ml DNA (0.01: 500 ng/ml)
Ethidium bromide fluorescence ( 0.1 0.05 g )
Southern blot ( 1 - 10 pg )
(~ 0.1 g DNA humano) PCR
(~10 g DNA humano) (Gen copia nica)
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Algunas consideraciones sobre
lmites de deteccin de la PCR
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FIGURE 5.
Titration curve to estimate threshold of detection of target kinetoplast DNA by the LV-B1 polymerase chain
reaction (PCR) and Southern hybridization using serial dilutions of Leishmania panamensis total DNA. A,
Agarose electrophoresis of PCR products. B, Southern hybridization analysis of the products. Lane 1, molecular
mass marker (1-kb DNA ladder); lanes 28, PCR products generated from the following amounts of L.
panamensis DNA: 3 g, 3 ng, 3 pg, 0.3 pg, 30 fg, 3 fg, and 0.3 fg; lane 9, monocyte DNA (0.6 g) from a
healthy control donor; lane 10, negative PCR control (minus DNA). The lower limit of detection was 3 fg of
DNA in the PCR and 0.3 fg in the Southern hybridization. bp = basepairs.
Am. J. Trop. Med. Hyg., 72(4), 2005, pp. 423-429
Copyright 2005 by The American Society of Tropical Medicine and Hygiene
AMPLIFICATION OF HUMAN DNA BY PRIMERS TARGETED TO LEISHMANIA KINETOPLAST DNA AND POST-
GENOME CONSIDERATIONS IN THE DETECTION OF PARASITES BY A POLYMERASE CHAIN REACTION
Carolina Vergel, John Walker, and Nancy G. Saravia
Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Mdicas, Cali, Colombia
3 g 3 ng 3 pg 0.3 pg 30 fg 3 fg 0.3 fg
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Se plantea que el contenido de ADN de una clula humana es de aproximadamente 5 pg, pudindose
inferir que en 100 ng de ADN de placenta existen cerca de 20 000 clulas. Tambin se conoce que en 1 pg
de ADN de PVH hay involucrados unos 70 000 genomas virales. La relacin que se establece entre los
planteamientos anteriores y los resultados del ensayo de sensibilidad (70 000/20 000) permiten concluir
que nuestro sistema es capaz de detectar 3,5 partculas virales por cada genoma diploide celular.
1n 100p 10p 1p 100f 10f 1f 0.1f 1n 100p 10p 1p 100f 10f 1f 0.1f
Southern blot ~10 ug DNA / PCR ~ 0.1 ug (100 ng) DNA ----- PCR ~ 100 veces mas sensible