PCR PV92 Secuencias Alu. Genes divididos en eucariotas Gen codifica la proteína Esta secuencia no...
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PCR PV92Secuencias Alu
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Genes divididos en eucariotas•Gen codifica la proteína•Esta secuencia no es corrida de principio
a fin•La secuencia de ADN en genes eucariotas
presenta interrupciones•Interrupciones: Intrones•Regiones codificantes: Exones
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“ Splicing“• El transcrito primario es procesado por splicing• Elimina los intrones y une los exones
• Ejempo: Gen de la distrofina tiene 74 intrones
ARNm
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ADN repetitivo
•Secuencias repetitivas encontradas en todo el genoma
•Parte del “ADN chatarra”•Pueden variar en longitud:
▫LINEs: miles de pb▫SINEs: 200-300pb
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SINEs (short interspersed nuclear elements)
• SINE tienen menos de 500pb• En un genoma humano se pueden encontrar
500 000 o más. • Los SINEs humanos mejor caracterizados:
familia Alu (el nombre se debe a la presencia de sitios de restricción para la endonucleasa AluI).
• Miembros de familia Alu tienen entre 200 y 300pb de longitud y se encuentran dispersos bastante uniformemente por todo el genoma, tanto entre genes como dentro de ellos.
• En humanos, secuencias Alu son más 5% del genoma completo.
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BRCA1
Rojo: exones
Flechas: Alu (más del 40% de los intrones)
Flechas azules: Alu involucrados en deleciones y duplicaciones (recombinación con otros Alu)
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Screening para secuencia Alu en locus PV92• 2 alelos posibles: con o sin inserción de Alu• Lo detectamos por PCR
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Herencia mendeliana del polimorfismo de Alu
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Electroforesis • Banda más pesada puede ser más tenue
• Cuidado para no hacer errores en asignar genotipo
• En heterocigotas se puede formar heteroduplex que migra más lento
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Dímeros de primer en PCR
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Primer dimers
•Complejos de los dos primers
•Más frecuentes cuando reacción no amplificó, también cuando se usa un exceso de primers
•Cuidado cuando se corren geles poco tiempo
Primer dimer
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Importancia de intrones en estudios de variación genética•Proporción importante de la variación
genética en los intrones o regiones entre genes. ¿Por qué?
•Importantes en: identificación de individuos y genética de poblaciones
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Resolución de problemas de PCRhttp://bitesizebio.com/articles/the-essential-
pcr-troubleshooting-checklist/
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Ejercicio
•Primers para locus PV92:
•Hacer PCR in silico
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Ejercicio
•Copiar secuencia amplificada
•Hacer un BLAST:▫Nucleotide BLAST▫Contra base de datos nr/nt▫Somewhat similar sequences (blastn)
•Identificar secuencias similares, ver valores de E
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Ejercicio
•Analizar secuencias:
▫Human Alu repeat ¿Qué observa flanqueando la secuencia Alu? ¿Cómo termina la secuencia Alu?
▫Homo sapiens isolate BAS101 AluPV92 repeat sequence ¿Cuál es la relación entre esta secuencia y la
anterior?
Leer artículos de Alu y diversidad genómica, inserción