Pilar Guia Reuciente

PRACTICA N° 01

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA CLINICA

Los laboratorios de microbiología clínica son ambientes especiales con respecto a la seguridad de aquellos que trabajan en ellos y los riesgos pueden extenderse a laboratorios adyacentes y a las familias del personal, es por eso que ciertos aspectos de la organización, diseño y funcionamiento de este tipo de laboratorio deben ser aceptado en general como buenas practicas de seguridad en todas las áreas especializadas del laboratorio.

Existen dos fuentes importantes de riesgos biológicos en el laboratorio de Microbiología Clínica: El incremento de los riesgos que producen los cultivos de microorganismos. Y los microorganismos que se encuentran presentes en las muestras como sangre y otros

líquidos corporales, principalmente los virus de Hepatitis y VIH.

OBJETIVOS DE BIOSEGURIDAD Proteger al personal de laboratorio (Alumnos, docentes y técnicos) contra la exposición

innecesaria e injustificada a agentes infecciosos Salvaguardar la integridad de la muestra clínica, contra la degradación o contaminación

cruzada que pueda poner en peligro la validez de los hallazgos de Laboratorio. Mantener los agentes infecciosos dentro de los límites del laboratorio con la finalidad de

proteger a la comunidad.

CONCEPTO GENERAL DE BIOSEGURIDADLa bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas de sentido común para proteger la salud y la seguridad del personal que trabaja en el laboratorio, frente a diferentes riesgos producidos por agentes biológicos. Complementariamente se incluyen normas contra los riesgos producidos por agentes físicos, químicos y mecánicos.

PRINCIPIOS BASICOSUniversalidad: Asume que toda persona esta infectada y que sus fluidos y todos los objetivos que se ha usado en su atención son potencialmente infectantes, ya que es imposible saber a simple vista, si alguien tiene o no una enfermedad.

Colocación de barreras protectoras: Un medio eficaz para evitar o disminuir el riesgo de contacto con fluidos o materiales potencialmente infectado, es colocar una “barrera” física, mecánica o químico entre persona y objeto.

PRACTICAS O MEDIDAS DE BIOSEGURIDADLas siguientes medidas preventivas están diseñadas para minimizar los riesgos de infecciones.

1. Lavado de manos El lavado de manos es una de las medidas preventivas más eficaces y debe realizarse:

Antes de : Iniciar un procedimiento Después de : Manipular objetos o instrumentos contaminantes, tocar fluidos

corporales, piel, mucosas, sangre, etc.El lavado de manos debe ser riguroso, con jabón o soluciones que contengan yodoforos (Isodine, yovisol, etc.) por un tiempo de 3 – 5 minutos.Para el secado se debe utilizar toallas en forma individual y en lo posible papel toalla descartables.

2. Uso de barreras Contención primaria.- Es la protección del personal y del medio ambiente inmediato contra la exposición a agentes infecciosos y/o productos de riesgo químico. Se usan guantes, mandil, mascarillas, etc.

Contención secundaria.- Es la protección del medio ambiente externo contra la exposición de material infeccioso. Se logra por una combinación de las características de la edificación y practicas operacionales.

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3. Uso de antisépticosLos antisépticos se usan en la preparación de la piel y mucosas antes de cualquier intervención o para reducir el riesgo de infectarse después de cualquier contaminación superficial, y estos pueden ser :

Alcoholes (60 – 90°), etílico, isopropitico, alcohol metilado Gluconato de Clorohexidina (4%), Hibiscrub Hexaclorofeno (3%), phisohex Yodos (1-3%), acuoso y tintura, alcohol yodado Yodóforos, yodopovidona en diferentes concentraciones, Isodine, Betadine, Yovisol, etc.

4. Manejo de agujas hipodérmicasLas agujas y jeringas se deben de usar una sola vez y la cubierta protectora de las agujas se debe de colocar correcta y cuidadosamente. Al finalizar su uso se deben de descartar en recipientes de paredes resistentes e incinerarlos.

5. Limpieza, descontaminación y desinfección de alto nivel (DAN) Limpieza: Proceso que permite eliminar los desechos orgánicos y otros para facilitar el proceso de descontaminación.

Descontaminación: Proceso que permite disminuir notablemente los microorganismos presentes en materiales - instrumentos y superficies de trabajo probablemente contaminadas, este proceso se consigue mediante el uso de los siguientes agentes químicos:

Solución de cloro al 0.5% por 10 minutos Fenol al 5% Peroxido de hidrogeno al 6% Glutaraldehido Fomaldehido

DAN: Permite la erradicación del 94% de microorganismos, excepto esporas, se usan los siguientes agentes químicos:

Solución de cloro al 0.5% por 5 – 10 minutos Formaldehído al 8% por 24 horas Glutaraldehido al 2%, alcalina, neutra o ácido a 25° C (77 °F) por 20 minutos.

6. EsterilizaciónLa esterilización erradica el 100% de microorganismos y es necesario realizar cuando se cuenta con materiales como muestras biológicas, materiales con cultivos y otros antes de eliminarlos o reutilizarlos.La esterilización puede ser Físico o Químico:

Físico: Calor Húmedo : Autoclave a 121° C, 15 libras de presión por 20 – 30 minutos Calor seco : Horno a 180° C por 60 minutos o 160° C por 120 minutos

aproximadamente. Radiación UV.

Químico: Liquido : Inmersión en glutaraldehido al 2% por 8 horas.

Inmersión en ácido paraetico. Gas : Gas de oxido de etileno.

Gas de formaldehído.Vapor de peroxido de hidrógeno.

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7. Eliminación apropiada de los desechos y flujo de traficoUna vez concluido cualquier procedimiento, debe eliminarse en forma apropiada todo material u objeto contaminado. Los recipientes usados deben ser los adecuadas como:

Balde de plástico con tapa a prueba de fuga, que contengan soluciones cloradas al 0.5% o cualquier otro desinfectante

Recipiente resistente a los pinchazos, de boca lo suficientemente apropiada para que ingresen solo agujas y otros artículos punzo cortantes ya usados.

Recipientes con tapa a prueba de fuga para materiales contaminados (gasas, algodón)

TIPO DE LABORATORIO CON RELACION AL NIVEL DE RIESGOLos laboratorios se clasifican de acuerdo al nivel de riesgo, diseño y barreras de contención que requieran.

Laboratorio con nivel I de bioseguridadEs un laboratorio básico que permite el trabajo con agentes biológicos de bajo riesgo. El laboratorio no esta separado del edificio y el trabajo se realiza en mesas de laboratorio.

Laboratorio en centros de Salud Laboratorios de hospitales de Nivel Local Laboratorios de diagnostico Laboratorio de Universidad y Centros de enseñanza

Los agentes biológicos manipulados en el nivel I, son aquellos que no poseen potencial patógeno conocido para las personas inmuno competentes. Ejemplo: Bacillus Subtilis, Mycobacterium gordonae,

Laboratorio con nivel II de bioseguridadLaboratorio básico que cuenta con cámara o gabinete de bioseguridad y otros dispositivos apropiados de protección personal o de contención física para proteger al operadorLaboratorio de Hospitales Regionales y de Salud publica. Los microorganismos o agentes biológicos incluidos son los que se encuentran con mayor frecuencia en las muestras clínicas, incluyen todos los agentes comunes de enfermedades infecciosas. Ejemplo: Salmonella, Shigella, Mycobacterium tuberculosis.

Laboratorio con nivel III de bioseguridadLaboratorio en los que se incluyen, además de las precauciones del nivel II, otras como el diseño e ingeniería que aumentan el aislamiento del material potencialmente peligroso y el uso de vestimenta y dispositivos protectores apropiados. Es de acceso restringido.

Laboratorio de Diagnostico Especializado

Los procedimiento correspondientes al Nivel III de Bioseguridad han sido recomendables para el manejo de material que presuntamente contiene ciertos virus como el de la estomatitis vesicular, algunas arbovirus y arenavirus.

Laboratorio con nivel IV de bioseguridadLos laboratorios de nivel IV de Bioseguridad son de contención máxima por lo general aislado de los edificios, el personal y otros materiales son descontaminados antes de salir del laboratorio y todos los procedimientos se realizan bajo las máximas condiciones de aislamiento (trajes o gabinetes con presión regulada). Cuentan con sistemas de apoyo exclusivo y en cuyo diseño incluyen barreras de contención que dan protección máxima al personal y/o comunidad. Sirven para trabajar con agentes como el virus del Ebola.

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PRACTICA N° 02

NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOIA CLINICA

El laboratorio de microbiología clínica presenta muchos peligros para las personas desprevenidas y no entrenadas por lo que mediante este texto damos a conocer a los alumnos, docentes y otros, las normas generales de trabajo que se deben de cumplir con la finalidad de evitar accidentes.

NORMAS GENERALES: Estar presente en el laboratorio a la hora señalada para sus prácticas. Ingrese al laboratorio con su mandil puesto para evitar contaminar su ropa de uso diario

durante las prácticas, quitársela antes de abandonar el mismo. No coma, no beba ni fume dentro del laboratorio y evite llevarse cualquier objeto a la boca. Coloque sus enseres personales como libros, maletines u otros, en lugares apropiados,

donde no puedan estar sujetos a contaminación por las muestras, cultivos, etc. Evite salir con el mandil fuera del laboratorio, mientras se desarrolle la práctica. Evitar el contacto directo de las mesas de trabajo, papel u otro material de uso frecuente en el

laboratorio con las muestras biológicas potencialmente contaminadas. Mantenga el orden y la disciplina durante el desarrollo de la practica. No propicie ni fomente

los malos hábitos. Mantener las mesas de trabajos limpios y despejados de materiales innecesarios. Cumplir con el trabajo señalado por el profesor durante el desarrollo de las prácticas.

AL FINALIZAR LAS PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIAPara la finalización del trabajo práctico, el alumno tomara en cuenta lo siguiente:

a) Todos los cultivos que se incuben, deben tener las siguientes anotaciones: Grupo y mesa de trabajo Nombre del germen o muestra cultivada Fecha de Siembra.

b) Los tubos deben estar bien tapadas y colocadas en gradilla

c) Colocar los cultivos en la estufa a 35-37° C.

d) Concluida la practica: Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo. Dejar ordenado los materiales y/o reactivos para la siguiente practica Lavarse cuidadosamente las manos Anotar los requisitos o muestras necesarias para la siguiente práctica.

MATERIALES Y EQUIPOS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA CLINICA

Los materiales de uso en el laboratorio de microbiología clínica, especialmente los de vidrio, como tubos, pipeta y otro deben ser de vidrio neutro, encontrarse en buenas condiciones sin rotura ni rajaduras, limpios y estériles. Entre los materiales más usados tenemos:

Materiales de Vidrio Placas de petri Tubos de ensayo de diferentes medidas Láminas portaobjetos Varilla portaláminas Matraces Vaso de precipitación Pipetas Frasco gotero Probeta Agitadores o Baguetas

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Mecheros de ron o de alcohol.

Equipos Microscopio Autoclave Horno para esterilización Estufa de incubación a 37 °C Baño María Centrífuga Refrigerador Balanza

Otros Mechero de Bunsen Asa bacteriológica o de henle Pipetas automáticas Bombilla de seguridad

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PRÁCTICA N° 3

SELECCIÓN, RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLÍNICAS PARA EXÁMENES MICROBIOLÓGICOS

Objetivos Saber que tipo de muestra es necesaria y como ha de obtenerse para el estudio

microbiológico de las distintas patologías. Conocer los métodos de obtención de las muestras mas características (orina, heces, esputo,

etc.) Conocer como se deben transportar las muestras o especimenes, y los medios que se

disponen para ello.

Selección de la MuestraLas consideraciones más importantes que deben tenerse en cuenta son que la muestra debe ser representativa del proceso patológico y que la cantidad recogida sea suficiente para asegurar un examen completo y adecuado. Por ejemplo, una pequeña cantidad de suero drenado de la úlcera del pie de un diabético con una osteomielitis adyacente no es probable que permita encontrar microorganismos. En el ejemplo citado, la muestra ideal sería una biopsia de hueso (para ser estudiada histológica y bacteriológicamente). Aunque con frecuencia no es posible obtener tejido infectado, éste es sin duda la muestra ideal. En orden de conveniencia el siguiente es un exudado francamente purulento. En caso de una lesión progresiva de piel y tejido subcutáneo, el material del margen activo de la lesión es la elegida. El material obtenido de localizaciones normalmente estériles del organismo proporcionan un espécimen excelente. Si se sospecha de un anaerobio se debe tener todo el cuidado necesario para no ponerla en contacto con el medio ambiente.

Recolección o Toma de MuestrasGeneralmente el informe del laboratorio bacteriológico solo puede indicar los hallazgos obtenidos por examen microscópico y cultivo.De esta manera se confirma o no un diagnóstico etiológico. Sin embargo, el fracaso en el aislamiento del agente causal no se debe necesariamente a métodos técnicos inadecuados; a menudo se debe a una mala toma de muestras. Con frecuencia en los hospitales con muchos pacientes la recolección de la muestras se relega a personas que no comprenden los requisitos ni las consecuencias de tales procedimientos. El laboratorio es el que proporciona los materiales estériles y las instrucciones adecuadas. A continuación se presentan las recomendaciones generales para la toma de muestras:

Siempre que sea posible las muestras deben ser obtenidas antes de iniciar la administración de agentes antimicrobianos.

Las muestras deben ser tomadas de los lugares donde sea más probable encontrar al microorganismos y evitando la contaminación externa en los posible.

Se debe recolectar la muestra en el estadio de la enfermedad en el cual es más probable encontrarlo.

La cantidad de muestra colectada debe ser suficiente. Se deben colectar en recipientes estériles y evitar la contaminación externa del recipientes

con la muestra. Las muestras una vez obtenidas, deben ser remitidas rápidamente al laboratorio o ser

transportadas en un medio ideal. El laboratorio debe recibir la suficiente información clínica para guiar en la selección de los

medios y técnicas adecuadas.

Transporte de las muestras.En el examen microbiológico de las muestras clínicas es esencial que el envase que las contiene no contribuya con su propia flora microbiana. Además la flora originas no debe multiplicarse ni disminuir debido a una permanencia prolongada en la sala o una prolongada refrigeración en el laboratorio. En otras palabras debe usarse un recipiente estéril y la muestra debe inocularse tan pronto como sea posible.

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Existe una serie de medios de transportes, cuya finalidad es prolongar la viabilidad del microorganismo:

Hisopo de poliéster mas ampolla de vidrio con medio stuart. Medio de transporte Stuart Medio de transporte Cary-blair

Los medios de transporte consisten en un agar semisólido con pH regulado que carece de nutrientes, pero que contiene tioglicolato de sodio como agente reductor. Previenen la deshidratación de las secreciones durante el transporte y la oxidación y autodestrucción enzimática de los patógenos presentes, asi como la inhibición de la multiplicación de la flora total presente. A continuación se presentan las especificaciones para la recolección de las diferentes muestras:

SECRECIÓN FARINGEADebe tomarse muestras con hisopo estéril de cada área amigdaliana antes de obtener otras de la pared posterior de la faringe.

Recolección de la Muestra:Con ayuda de una espátula de madera, se deprime la lengua y se solicita al paciente que pronuncie la letra “a”, al mismo tiempo con un hisopo estéril humedecido en suero fisiológico se frota cada área de las amígdalas y sobre la faringe posterior a fin de obtener una adecuada muestra. No debe transcurrir más de 1 hora desde el momento de la toma de la muestra hasta realizar el frotis o su inoculación al medio de cultivo, a no ser que se utilice un medio de transporte.

SECRECIONES BRONQUIALES Y ESPUTOEl esputo es el material expulsado de los pulmones, tráquea o bronquios por la tos, y está formado en gran parte del exudado mucoso inflamatorio.

Recolección de la MuestraLa recolección y transporte del esputo, constituye un riego para la salud pública, para el laboratorista.Debe adoptarse toda clase de precauciones para evitar la contaminación externa del envase y salvaguardar al personal que manipule el material.Al recoger la muestra se debe instruir al paciente que previamente se enjuague la boca con agua, y en un frasco de boca ancha, con tapa rosca y cierre hermético, deposite sólo el material expulsado por la tos. Es recomendable escoger el esputo por la mañana, de no haber suficiente muestra, se tomará la cantidad total recolectada durante un periodo de 24 horas.La secreción del tracto respiratorio también puede obtenerse por aspiración bronquial.

MUESTRAS DE ORINALa formación de la orina se inicia en los glomérulos. La orina es un líquido de composición similar al plasma, que contiene agua, cristaloides y una pequeña fracción de proteínas de bajo peso molecular. En ella, existen sustancias de bajo umbral renal como los fosfatos, bicarbonatos, ácidos úrico, yodo y potasio, y sustancias sin umbral renal, que aparecen constantemente en la orina, como la creatinina y los productos finales del metabolismo.La orina secretada en el riñón es estéril, los mismos que la acumulada en la vejiga. Sin embargo, en la uretra se halla una flora normal, de modo que la orina expulsada en forma normal contiene una pequeña cantidad de bacterias. Debido a que es necesario distinguir los microorganismos contaminantes de los de importancia etiológica, sólo el examen cuantitativo de la orina puede producir resultados significativos.El examen bacteriológico de la orina se hace principalmente cuando los signos y síntomas son sugestivos de una infección de las vías urinarias, insuficiencia renal o hipertensión.

Recolección de la MuestraLa condición más importante para un examen de orina es la recolección convenientemente controlada de la muestra por examinar. Para la toma de la muestra se debe tomar en cuenta que el paciente no haya recibido antimicrobianos por lo meno 5 días antes del examen. Dicha toma de preferencia debe realizarse en el laboratorio.

En los varones, por lo general se obtienen muestras adecuadas aseando el meato con agua y jabón y recolectando en un envase estéril la porción media de la orina expulsada. En las mujeres, pueden

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conseguirse muestras equivalentes después de haber separado los labios y aseado con agua y jabón. En lactantes y niños menores se utiliza bolsitas plásticas estériles especialmente diseñadas, previo aseo con agua y jabón.Otras formas de recolectar orina, incluyen el uso de sondas y la punción suprapúbica, cuando es inevitable hacerlo, pero que acarrea el riesgo de introducir microorganismos a la vejiga.

MUESTRAS DE TRACTO GENITALLa gonorrea, la uretritis no gonocócica (chlamydias, microplasma) y el herpes simple son las más importantes infecciones que se manifiestan en los genitales. La sífilis, el chancro blando, LGV y el granuloma inguinal son enfermedades importantes pero menos comunes.

Recolección de MuestrasLa muestra a ser recolectada es el exudado vaginal o secreción uretral. Es esencial transportar en medios tamponados, debido al carácter delicado y a la multiplicidad de las especies que cusan infecciones genitales. La toma de muestra se realiza empleando un hisopo estéril. Inicialmente se debe realizar un frotis, así como un examen en fresco para buscar levaduras (hongos) y tricomonas.

MUESTRAS DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOSEl estudio microscópico de frotis y cultivos de muestras de heridas o abscesos a menudo proporciona indicaciones tempranas e importantes acerca de la naturaleza del microorganismo infectante, y de este modo ayuda en la elección de los antimicrobianos.

Recolección de la MuestraTomar muestras de las lesiones cutáneas problemáticas con torundas recubiertas en suero y del borde la lesión.

MUESTRAS DE HECESLa porción inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia: los microorganismos prevalentes son los anaerobios (bacteroides, bacilos grampositivos y estreptococos), microorganismos entéricos gramnegativos. Cualquier intento por aislar bacterias patógenas de las heces implica la separación de las especies patógenas, usualmente a través del uso de Medios Selectivos Diferenciales y de enriquecer previamente la muestra.

Recolección de la MuestraLas heces y los hisopados rectales son las muestras de que se dispone con mayor facilidad. El análisis de la muestra debe realizarse tan pronto como éste llegue al laboratorio, y en todo caso antes de las 2 horas.

MUESTRAS DE SANGREDado que la bacteremia con frecuencia augura un padecimiento que pone en peligro la vida, su detección oportuna es esencial.

Recolección de la MuestraLas muestras se pueden tomar antes o durante el tratamiento antimicrobianos, durante los accesos febriles u otros síntomas de infección activa.

CUESTIONARIO

1. Señalar los pasos a seguir para la obtención de sangre para un hemocultivo.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. Señalar los pasos a seguir para la obtención de LCR para su cultivo.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 4

METODOS OPTICOS PARA EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LAS ENFERNEDADES INFECCIOSAS

Leeuwenhoek realizó sus investigaciones hacia fines del siglo XVII; hasta entonces solo se podía especular acerca de la existencia de agentes infecciosos más pequeños que lo que el ojo humano podía distinguir. Desde ese momento, el microscopio óptico se ha transformado e uno de los medios mas importantes para el diagnostico de las infecciones. Aun hoy, a pesar del énfasis en los métodos rápidos de diagnóstico, muchos de los cuales requieren instrumentos complicados o reactivos inmunológicos, la simple observación microscópica de la muestra clínica obtenida de un paciente es la forma más rápida y específica de apoyar el diagnóstico clínico realizado por el médico.

De ahí que una observación microscópica o examen directo es el primer paso que nos permite orientar el resto del examen, nos ayuda a determinar la morfología, movilidad, características tintoriales, presencia de ciertos estructuras especificas, agrupación, etc.; estos estudios se complementaran con el cultivo, de aislamiento en medios adecuados, examen bioquímico, sensibilidad a los antimicrobianos.

En el estudio óptico o microscópico de los agentes infecciosos, se incluyen métodos muy diferentes, cada uno de los cuales va proporcionar información sobre distintas aspectos y propiedades de los microorganismos, que dependiendo del objeto que se requiera alcanzar, se seleccionará uno u otro método. Sin embargo muchos de los agentes infecciosos pueden ser observados en forma confiable con solo unas pocas coloraciones y un microscopio básico. Los métodos que se presentan a continuación incluyen muchas técnicas microscópicas comunes usadas durante décadas.

I. EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS.

Examen que se utiliza principalmente para la investigación de la motilidad bacteriana, morfológia, agrupación, observación de huevos y quistes de parásitos, división celular, etc. Se le conoce como la observación vital. Es el método más útil para la identificación definitiva de la mayoría de los parásitos y de muchos hongos.

Entre los metidos utilizados tenemos:

A. Examen en fresco.

Muchas muestras clínicas pueden ser examinados en el microscopio con campo claro o contraste de fase en su estado original, preferentemente ni bien se las recoge o de cultivo jóvenes (24 horas).

Las muestras se colocan directamente sobre la superficie de un portaobjeto y se cubren con laminilla, estas muestras incluyen esputo, exudado de lesiones, liquido de aspiraciones, heces liquidas, flujo vaginal y sedimento urinario, si el material es viscoso se debe diluir con solución salina estéril.

La mayoría de las observaciones del material se realizan con microscopia de campo claro, aunque la principal dificultad es la falta de contraste entre la célula bacteriana y el medio en el cual se encuentran suspendidos.El microscopio con contraste de fase resulta útil para la observación directa del material sin teñir. Las preparaciones se observan al microscopio con objetivo de inmersión y con poca intensidad de luz, para facilitar la observación. El aceite de inmersión es necesario para alcanzar la resolución suficiente para la visualización de la mayoría de las bacterias; usualmente se emplea el objetivo por 100 junto con oculares por 10 (aumento total por 1000).

Se incluyen dentro del examen en fresco a:

Montaje o preparado húmedo (en fresco)

Montaje o examen de la gota pendiente

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Montaje en tinta china.

Material.

Cultivo bacteriano joven

Laminas cubreobjetos

Laminas porta objetos

Laminas porta objetos con excavación

Asa de Kolle

Solución salina estéril

Mechero

Tinta china negra

Varillas porta láminas

microscopio

Aceite de inmersión

Procedimiento.

Coloque una gota de la muestra sobre la lámina porta objeto. Si la muestra es sólida, diluir con solución salina.

Cubra con la laminilla

Observe al microscopio con aumento final de 1000 x.

Resultado.

Observe la morfología y movilidad del microorganismo, también puede lograr observar agrupación.

B. Coloraciones vitales.

Son poco utilizados en la actualidad.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué finalidad tiene un montaje o preparado húmedo?. De ejemplos de ellos.………………………………………………………………………………………………………………..………………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿En que tipos de muestra y por que se utiliza montaje con tinta china?………………………………………………………………………………………………………………..………………………………………………………………………………………………………………..

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II. EXAMEN DE MICROORGANISMOS POST – MORTEN –DEFINITIVOS O COLORADOS.

El examen del material teñido, ya sea directamente a partir de muestras clínicas o del desarrollo en los cultivos es el método mas útil para la identificación presuntiva de las bacterias y de ciertos virus.

Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los colorantes básicos se manifiesta si tomamos en cuenta su principal contenido en ácidos nucleicos. Los colorantes básicos de mayor aplicación son los derivados del alquitrán de hulla (anilina); estos colorantes llevan carga electropositiva en su parte cromófora, la que tiene una fuerte afinidad por los grupos electronegativos, que normalmente presentan las bacterias en su protoplasma, entre las cuales se encuentran los ácidos nucleicos y sus derivados. Los colorantes más usados son el cristal violeta, fucsina básica, safranina, azul de metileno y verde de malaquita.

Pasos a seguir en cualquier coloración.

Se debe seguir cuidadosamente los pasos cualesquiera sea la coloración elegida, esto va garantizar la obtención de un resultado adecuado.

1. Extensión o “frotis”.-

Sobre un portaobjeto de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra, si el materiales viscoso es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjeto, se homogeniza y finalmente se extiende .

2. secado.-

Una vez extendido, se deja secar al medio ambiente.

3. fijación.-

Someter el frotis o extendido a la llama del mechero hasta que el vidrio este tan caliente que moleste al tacto, pero este procedimiento no es bactericida. Debe dejarse enfriar el preparado antes de colorear. Se puede usar otro fijador como el alcohol según la recomendación de la técnica.

4. coloración.-

Cubrir el extendido o frotis con el colorante, evitando la evaporación en el tiempo que debe actuar. Según la técnica se puede usar uno o más colorantes y mordientes.

5. lavado.-

Eliminar el exceso de colorantes con agua corriente o destilada a chorro suave y que no incida directamente sobre el frotis.

6. secado.-

Secar al medio ambiente, colocando el preparado inclinado para el escurrimiento. Se puede acelerar el secado agitando la lamina o con la llama del mechero, evitando sobrecalentamiento.

7. observación.-

Observar al microscopio con objeto de inmersión y aceite.

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Clases de Coloraciones:

A. Coloración simple.

Consiste en el agregado de un solo colorante y tiene como objetivo la observación de la morfología bacteriana. Se puede utilizar cualquier colorante básico como azul de metileno, safranina, verde malaquita, etc.

Material.

Cultivo bacteriano joven

Laminas cubreobjeto y porta objetos

Asa bacteriológica


Mechero

Colorante: Azul de metileno, safranina y verde malaquita

Varillas pórtala minas

Microscopio

Aceite de inmersión.

Procedimiento.

1. Preparar el frotis o extendido

2. Secar al medio ambiente

3. Fijar con la llama del mechero y luego dejar enfriar

4. Colorear con azul de metileno o safranina o verde malaquita, cubrir completamente el frotis y dejar actuar por 2 a 3 minutos.

5. Lavar para eliminar el exceso de colorante

6. Secar al medio ambiente

7. Observar al microscopio con objeto de inmersión

Resultado.

Observar la morfología bacteriana y agrupación.

Cuestionario:

1. ¿Cual es el objetivo de una coloración simple?…………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿Permite la coloración simple observar estructuras como flagelos?…………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………..

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PRÁCTICA N° 5

B. Coloraciones diferenciales.

Utilizan más de un colorante en pasos sucesivos y las células bacterianas teñidas se diferencian tanto por el color como por la forma. Las coloraciones diferenciales son clásicas, los más empleados en microbiología clínica y son:

Coloración GRAM.

Coloración ideada por Hans Christian Gram. a fines del siglo XIX, permite dividir a las especies bacterianas en dos grandes grupos : aquellos que por la coloración con alcohol acetona requieren el colorante básico, cristal violeta, tiñendo finalmente de azul violáceo (grampositivos) y aquellos que pierden el cristal violeta al ser decoloradas y se recolorean con safranina que es colorante de contraste, tiñéndose de rojo (gramnegativos).

Material.

Cultivo bacteriano jóvenes

Set de Gram. : Cristal violeta, lugol, alcohol acetona y safranina.

Laminas portaobjetos

Asa bacteriológica

Varillas portaláminas

Microscopio

aceite de inmersión

Procedimiento.

1. preparar el frotis o extendido

2. secar al medio ambiente

3. fijar con la flama del mechero y dejar enfriar

4. coloración:

cubrir con cristal violeta por 1 minuto

lavar a chorro lento con agua corriente

cubrir con lugol (mordiente) por 1 minuto

lavar a chorro lento con agua corriente

decolorar con alcohol acetona gota a gota hasta que no se desprenda mas colorante de la lamina o cubrir con el decolorante por un minuto.

Lavar a chorro lento con agua corriente

Cubrir con safranina como colorante final de contraste por 1 minuto

5. Lavar con agua corriente


7. observar utilizando objetivos de inmersión.

Mecanismo de la tinción.

Para explicar el mecanismo de la tinción Gram. Se ha optado por la hipótesis fundada en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos. El mecanismo de la tinción Gram esta reseñada en el siguiente esquema.

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Productos que se utilizan Reacción y coloración de las bacterias

1) cristal violeta

2) Lugol solución iodada

3) Alcohol acetona

4) Safranina

GRAM +

Células color violeta

Se forman el complejo CV-I. Las células continúan teñidas de color violeta.

Se contraen los poros. Disminuyen la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las células que continúan teñidas de color violeta.

Células no decoloradas; quedan teñidos de color violeta.

GRAM -

Células color violeta

Se forman el complejo CV-I las células continúan teñidas de color violeta.

Eliminación de las grasas de las paredes celulares. Aumentan la porosidad. El complejo CV-I se separa de la célula. Se decoloran.

Células decoloradas; se tiñen de color rosado.

Resultados.

Determinar la reacción (grampositivos o gramnegativos), morfología y agrupación de las bacterias utilizadas en las prácticas.

Nota.- Las bacterias gramnegativas son constantes en su reacción, mientras que los microorganismos grampositivos pueden presentar respuestas variables en ciertas condiciones (son gramlabiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias grampositivos pierden la propiedad de retener el complejo cristal violeta – yodo, y en consecuencia se tiñen por la safranina apareciendo como gramnegativas.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué componentes de la pared celular permiten que ciertas bacterias se comporten como grampositivos y otros como gramnegativos?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿Por qué no se utilizan cultivos de 48 horas a más o muestras añejas para realizar una coloración Gram?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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3. ¿Explique que función cumple el lugol en la coloración Gram?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

4. Explique la importancia y utilidad de la coloración Gram. en microbiología clínica?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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COLORACION ZIEHL NEELSEN.

La coloración Ziehl Neelsen se realiza para determinar la presencia de bacterias ácido – alcohol resistente. Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácido grasos (ácidos mícólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que le confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol ácido, después de la tinción con colorantes básicos (fucsina). Por esto se denominan ácido – alcohol resistente. La microbacterias como M. tuberculosis, M. Leprae y parásitos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl – Neelsen requiere calentamiento para que el colorante inicial básica atraviese la pared bacteriana que contiene ceras, las micobacterias son bacilos aerobios con la composición química de una pared celular grampositiva, pero no se tiñen con esta coloración por los ácidos grasos que poseen.

Materiales.

Muestra de esputo de pacientes sospechosos de tuberculosis.

Set. De Ziehl – Neelsen: Fucsina fenicada básica, alcohol ácido, azul de metileno.

Laminas portaobjetos nuevos

Varillas portalaminas

Bajalenguas


Mechero

Microscopio.

Procedimiento.

1. Extendido del esputo con el bajalengua

2. Secado al medio ambiente. No utilice la llama del mechero para secar, para evitar la formación de aerosoles.

3. Fijar a la llama del mechero

4. Coloración:

- Cubrir con fucsina fenicada básica, y con ayuda de un mechero calentar el preparado, pasándolo lentamente por debajo de la lámina portaobjeto, hasta que produzca la emisión de vapores, sin llegar a la ebullición. Repetir el procedimiento hasta completar 3 emisiones sucesivas en 5 minutos. Dejar enfriar.

- Lavar con agua corriente.

- Decolorar con alcohol ácido. Cubrir la totalidad del extendido y dejar por un minuto. Proceso diferenciador.

- Lavar con agua corriente. El preparado debe quedar de color rosa pálido, de lo contrario volver a cubrir con alcohol ácido hasta conseguir dicho propósito.

- Coloreado de fondo con azul de metileno. Cubrir el preparado con azul de metileno por 30 segundos.

5. Lavar con agua corriente


7. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

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Mecanismo de la Coloración Ziehl Neelsen.

Productos que se utilizan Reacción y coloración de las bacterias.

1. fuccina fenicada 5’ ,3 vapores.

2. alcohol ácido.

3. azul de metileno

BAAR

Células se tiñen de rojo.

Resisten a la decoloración debido a la presencia de ácidos grasos. Continúan teñidos de rojo.

Las bacterias no decoloradas continúan de rojo

NO AAR

Células se tiñen de rojo.

Se decoloran. No poseen ácidos grasos.

Las bacterias de coloradas se tiñen de color azul, al igual que los demás elementos de la muestra.

Resultado:

Determinar la presencia de bacilos ácido alcohol resistente (BAAR) que se observan de color rojo de forma abastonada aislados o agrupados sobre un fondo azul y realizar su conteneo promedio. Leer 100 campos o 5 minutos tratando de recorrer la lámina, sin duplicar el campo ya observado.

Informe:

Negativo (-) : No se encuentra bacilos ácidos alcohol resistente (BAAR) en 100 campos microscópicos observados

Positivo (+) : Se observan menos de 1 BAAR promedio por campo por 100 campos observados (10-99 bacilos en 100 campos).

Positivo (++) : Se observan de 1 a 10 BAAR promedio por campo en 50 campos observados.

Positivo (+++): Se observan más de 10 BAAR promedio por campo en 20 campos Observados.

Muestra paucibacilar: Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos microscópicos.

CUESTIONARIO:

1. ¿La coloración Ziehl Neelsen es útil y rutinaria en bacteorologia clínica? ¿Porque?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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C. Coloraciones especiales y estructurales.

Entre las coloraciones estructurales y especiales tenemos aquellas que permiten observar específicamente ciertas estructuras bacterianas como cápsula, flagelos, esporas, gránulos metacromaticos, etc. Una coloración especial usada comúnmente es la coloración vago.

Coloración Vago

Es propia de ciertas bacterias como las espiroquetas, que para poderlas observar se tienen que adherir con el mercurio cromo en un fondo violeta.

Materiales.

Muestra : Sarro dentario

Mercurio cromo al 2%

Violeta de genciana

Palitos mondadientes

Laminas portaobjetos

Varillas porta laminas

Mechero

Asa de Kolle


Microscopio.

Procedimiento.

1. frotis del sarro dentario, utilizando un mondadientes


3. fijar leve y rápidamente

4. colorear:

cubrir el frotis con mercurio como por 3 minutos

lavar con agua corriente

cubrir con violeta genciana por 3 minutos

5. lavar con agua corriente


7. observar con objetivo de inmersión

Resultado.

Observar la presencia de bacterias fusoespirales (espiroquetas) teñidos de color violeta.

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PRACTICA N° 6

OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE LA FLORA MICROBIANA NORMAL

Se considera flora microbiana normal aquellos organismos que pueden coexistir en forma pacifica en una relación equilibrada con su hospedero. La FMN se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de forma continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento reflejan la edad, nutrición y medio ambiente del individuo.

Objetivos:

Determinar la FMN de piel, nariz, boca y otros.

Seleccionar y recolectar adecuadamente la muestra.

Realizar correctamente el método de coloración elegido.

Materiales:

Hisopos estériles

Baja lenguas estériles

Recipientes estériles

Láminas portaobjetos

Set. De colorantes de Gram., Ziehl Neelsen y Simple.

Varillas porta láminas

Mechero

Microscopio


Aceite de inmersión.

Procedimiento:

1. Colectar adecuadamente la muestra

2. Realizar el procedimiento del método de coloración elegida.

Resultado:

Determinar el grupo de microorganismos presentes en determinadas regiones, indicando la morfología, agrupación, reacción o afinidad por los colorantes.

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PRÁCTICA N° 7 Y 8

CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PATOGENOS VIABLES

Aunque las tendencias en microbiología clínica apuntan claramente hacia el desarrollo de métodos rápidos, independientemente del crecimiento de los microorganismos, para determinar la presencia de agentes infecciosos, el aislamiento y la identificación de los patógenos viables son aún el “estándar de oro” para el diagnóstico actual de las enfermedades infecciosas. Para realizar pruebas bioquímicas diferenciales y estudios de sensibilidad han sido necesarios cultivos puros ya que los cultivos mixtos proporcionan información de poca utilidad e incluso errónea.

El cultivo es el procedimiento mediante el cual se promueve el crecimiento de los microorganismos, al proporcionarles las condiciones adecuadas, nutrientes, pH, temperatura y aereación; además de otros factores que deben ser controlados.

Medios de Cultivo

Son sustancia nutritivas líquidas o sólidas, que se utilizan en el laboratorio para el crecimiento de los microorganismos, pudiendo ser similares a sustancias naturales, en los cuales estos crecen normalmente. Sus componentes básicos deben satisfacer las mínimas exigencias nutricionales para el desarrollo microbiano y varía según el tipo de bacteria. Es más, para que un medio responda con éxito en el cultivo deben cumplirse las siguientes condiciones:

a. Contener todas las sustancias nutritivas necesarias para su crecimiento, como: Compuestos orgánicos nitrogenados, compuestos inorgánicos, carbohidratos, etc.

b. La humedad, la temperatura y el PH deben ser óptimo.

c. Evitar la contaminación para prevenir la competencia con otros microorganismos.

d. Estar previamente esterilizado.

La fuente de nitrógeno comúnmente es la peptona que consiste en una mezcla de proteasa, polipéptidos. La fuente de carbono se obtiene de los carbohidratos.

Ciertas bacterias exigentes requieren factores de crecimiento tales como: factor V, factor X, NAD, etc., etc.

Clasificación de los medios de cultivo

1. Según su estado físico.

a. Medios Sólidos.- Presentan en su composición un agente solidificante, el agar, en una proporción de 12 a 15 gramos por litro. También puede contener gelatina o albúmina.

b. Medios Semisólidos.- Presentan agar en su composición, en una proporción menor que los sólidos, p.ej., Agar Cistina Tripticasa: 2.5 g/lt.

c. Medios Líquidos.- No contiene ningún agente solidificante.

2. Según la utilidad o requerimiento diagnostico.

a. Medios Nutritivos Simples. Caldo y Agar Nutritivo, desarrollan la mayoría de microorganismos no exigentes.

b. Medios Selectivos, Inhibidores o de Aislamiento. Son medios con una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismos que se busca p. ej., Mac Conckey, Agar Sabouraud, Agar Hipertónico de Chapman, etc.

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c. Medios Enriquecidos. Suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores, tales como la sangre de carnero, la sangre del caballo, etc. Son medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes, ej. Agar Sangre, Agar chocolate., etc.

d. Medios de Transporte y Mantenimiento. Se utilizan en la recogida, transporte y conservación de muestras biológicas. Esencialmente, son medios no nutrientes, semisólidos.

e. Medios de Enriquecimiento. Son medios que permiten estimular el desarrollo de ciertos microorganismos particulares presentes en números escaso en un medio que incluye gran cantidad de representantes de la FMN. Ejm: Caldo Selenito, APA.

f. Medios Diferenciales. Contienen colorantes, azúcares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida, generalmente el color, p. ej., Agar Citrato, Agar Urea, TSI, etc.

Siembra.- La siembra es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de incubación pueda desarrollarse y multiplicarse “in vitro”, la siembra se realiza con la finalidad de obtener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra problema (orina, heces, secreciones, etc.), mediante el aislamiento.

Aislamiento.- Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra problema. Se requiere de un medio sólido con gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie, mediante la formación de colonias separadas. Si se aíslan especies distintas, cada colonia tendrá caracteres especiales.

Técnicas de siembra

A. Siembra por inoculación o agitación

Con un asa bacteriológica previamente esterilizada, se toma una cantidad suficiente de inóculo o muestra y se introduce en el centro del medio líquido, agitándose para luego retirar el asa.

B. Siembra por estría (en tubos de agar inclinado)

Con una asa bacteriológica sembrar por estrías la zona inclinada del agar, iniciando las estrías desde el fondo del tubo.

C. Siembra puntura profunda o picadura.

Con el asa bacteriológica en forma de aguja, se toma una pequeña cantidad de la colonia y se siembra en el agar semisólido introduciendo la aguja en forma vertical.

D. Siembra por incorporación o vertido de placa.

Para obtener colonias bien aisladas, es preciso hacer una serie de diluciones en varios tubos, puesto que no se conoce de antemano la magnitud de la población bacteriana contenida en la muestra original. Con una pipeta se coloca 1ml de muestra o dilución de ella en una placa de Petri estéril y luego se agrega medio licuado, mantenido a 45 °C, realizando movimientos rotatorios para homogenizar y se deja solidificar.

Incubación

Después de la siembra se debe incubar en la estufa a una temperatura y tiempo óptimo, generalmente a 37 °C, durante 18 a 24 horas, para favorecer el crecimiento de los

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gérmenes. Los tubos se colocan en gradillas y las placas de Petri en forma invertida para evitar que el agua de condensación bañe el medio de cultivo e impida una buena separación de las colonias.

Estudios de los cultivos

Transcurrido la incubación se procede al estudio del crecimiento bacteriano (características culturales) en los diferentes medios de cultivo.

1. Crecimiento en medio líquido.

Cantidad: Nulo, escaso, moderado o abundante.

Distribución: Uniforme (turbio), limitado a la superficie, flocúlenlo, formación de película, formación de anillo o acumulado en sedimento.

2. Crecimiento en medio semisólido

Interpretar si hay movimiento o no, verificando si el desarrollo bacteriano solo esta en la línea de siembra o se expandió.

3. Crecimiento en medio sólido en tubo

- Observar si hay crecimiento y la,

- Cantidad: Escaso, moderado o abundante.

4. Crecimiento en medio sólido en placa. (Identificación de Colonia)

Una vez que se ha logrado el aislamiento del microorganismo, podemos realizar una identificación preliminar de las colonias. La primera pauta para la identificación de la colonia aislada es la naturaleza del medio en el cual ha desarrollado el microorganismo, si es un medio selectivo, enriquecido o nutritivo, luego determinamos:

- Tamaño: desde fracción de milímetro hasta mm de diámetro.

- Forma. Circular, puntiforme, granular, rizoie, irregular.

- Borde: Entero, ondulado, rizado, filamentoso, dentado, lobulado.

- Elevación: Plana, elevada, convexo, umbilicada, acuminada o monticular.

- Consistencia: Cremosa, membranosa, mucosa.

- Caracteres Ópticas: Opacos, translúcidos u opalescentes.

- Cromogénesis: Pigmentados o no pigmentados.

Se debe concluir la identificación preliminar de las colonias con observación microscópica de estas.

Material

Cultivos bacterianos

Tubos con caldo y agar nutritivo

Tubo con medio semisólido

Placas con agar nutritivo, sangre y Mac – Conkey

Asa bacteriológica


Set de Gram.

Mechero

Microscopio

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Varilla porta láminas

Procedimiento:

Sembrar usando la técnica adecuada en medio líquido, sólido inclinado en tubo, semisólido y en medio sólido en placa.

Rotular, incubar y realizar la lectura o el estudio según lo indicado.

Resultados:

Anotar el desarrollo o crecimiento bacteriano en cada medio de cultivo según el protocolo.

CUESTIONARIO

1. ¿cómo se obtiene cultivos puros a partir de una muestra clínica?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿Cuál es comúnmente la temperatura de incubación para microorganismo que se desean aislar de una muestra clínica? Y ¿por qué?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..3. ¿todos las bacterias patógenas se pueden aislar mediante cultivo in vitro?.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..4. Señale cual es el proceso común para la esterilización de un medio de cultivo.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

5. ¿Las bacterias que se ha aislado son aerobias, anaerobias facultativas o anaerobias estrictas? Explique…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

6. Defina:Cultivo puro: …………………………..……………………………………………………………………….…………………………………………………………………………………………………………………..Cultivo mixto: ………………………………….…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

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PRÁCTICAS N° 9 Y 10

PRUEBAS BIOQUIMICAS METABOLICAS CONVENCIONALES Y RAPIDAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS.

El cultivo y la identificación de patógenos específicos a partir de muestras tomadas de pacientes con una presunta infección es el método más confiable, aunque no es el más rápido, para el diagnóstico. Sin embargo, hasta que las técnicas de la biología molecular hayan avanzado hasta el punto de que los microorganismos responsables de enfermedades infecciosas pueden ser identificadas mediante marcadores genéticos totalmente individuales, el diagnóstico definitivo de la mayoría de las infecciones continuará exigiendo el aislamiento e identificación del agente etiológico. En el capítulo anterior se trató sobre las características morfológicas básicas (colonias) en este capítulo trataremos las pruebas enzimáticos y bioquímicas que se emplean para identificar estos patógenos, una vez que han sido aislados.

I. Pruebas Bioquímicas o Enzimáticos Extremadamente Rápidas.

Todas las pruebas que se describen aquí pueden ser realizados directamente con inóculo obtenido de colonias desarrolladas en las placas de aislamiento primario. Los resultados se obtienen rápidamente, estas pruebas permiten avanzar otro paso en la caracterización de un germen de morfología conocida y orientar la elección de procesos adicionales necesarios para la identificación.

Prueba para Catalasa.- Esta prueba es útil para la identificación de muchas bacterias. Por ejemplo, los estreptococos no poseen la enzima Catalasa que cataliza la liberación de agua y oxígeno a partir del peroxido de hidrógeno, un producto final del metabolismo, pero todos los estafilococos son Catalasa positivos.

Material:

Cultivo de staphylococcus y streptococcus

Peroxido de hidrógeno


Asa bacteriológica

Procedimiento

Colocar una porción de la colonia en estudio en la lámina portaobjetos, y agregar una gota del peroxido de hidrógeno. La reacción se observa de inmediato.

Resultado:

Catalasa + : Se observa el burbujeo

Catalasa - : No hay reacción.

Prueba para coagulasa

Se puede determinar coagulasa unida, denominado factor de agregación y se realiza en lámina, leyéndose a los pocos segundos. La coagulasa libre se realiza en tubo y se lee después de 4 horas. La coagulasa es un enzima que poseen ciertos microorganismos como S. aureus, esta enzima es capaz de aglutinar el plasma

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tratado con oxalato, citrato o etilendiaminotetracético o heparina en presencia de un factor contenido en el suero.

Material:

Cultivo de S. aureus

Plasma citratado o oxalatado

Tubo de ensayo

Asa bacteriológica

Procedimiento:

En un tubo ensayo colocar 0.5 ml de plasma, e inocular la cepa microbiana, incubar en baño maría, y observar la reacción a las 4 horas a más.

Resultado:

Coagulasa + : si se observa que el plasma es coagulado

Coagulasa - : No se observa coagulación.

Prueba para la oxidasa.

Esta prueba indica la presencia de la enzima citocroma oxidasa y se aplica en la identificación de bacterias como Neisseria, Vibrio Cholevae, Psedomonas , etc. Actualmente se usan tiras de papel de filtro embebido con el reactivo o ampollas de vidrio conteniendo el reactivo y son comparables con las pruebas convencionales.

Materiales.

Cultivo de Pseudomonas

Tiras reactivas de oxidasas


Procedimiento.

Colocar una porción de la colonia en el extremo reactivo de la tira, esperar unos segundos y observar la reacción

Resultados

Oxidasa + : la colonia se oscurece a violeta oscuro o negro

Oxidasa - : no se observa tal reacción

Información miscelánea

Así como la morfología de la colonia, también la producción de pigmento (Pseudonomas), difusividad (proteus) , reacciones hemolíticas en Agar sangre y otras , son muy útiles para ir acotando las posibilidades de identificación

II. Pruebas bioquímicas metabólicas convencionales

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Una fraccion relativamente pequeña de la información genética de las bacterias esta implicada en la producción de enzimas que metabolizan diversos sustratos. Estas enzimas han sido usadas tradicionalmente como marcadores para diferenciar grupos de especies. Si un microorganismo posee una enzima dada y es capaz de utilizar unsustrato, podrá formar un producto final capaz de modificar el pH. Las pruebas pueden ser de oxidación y fermentación, de hidrólisis, degradación de amonoacidos, utilización de un único sustrato, reacciones para intratos.etc.

Reacción de agar triple azúcar hierro (TSI)

Esta prueba permite la orientación en la identificación de los bacilos gramnegativos, en especial de los miembros de la familia Enterobacteriaceae. Este medio puede detectar tres características principales de una bacteria: La capacidad de generar gas en su proceso de fermentación de azúcares, la formación de sulfuro de hidrogeno gaseoso (que se visualiza por la formación de un precipitado negro que contiene hierro) y la capacidad de fermentar lactosa, sacarosa, glucosa.

Material

Cultivos de E.coli, Salmonella, Proteus

Medio de cultivo TSI

Asa bacteorológica

Procedimiento

Inocular la cepa por puntura y estría TSI, incubar por 18-24 hrs. A 35-37°C

Resultado

Observar y anotar las diferentes reacciones. Presencia o ausencia de gas, hidrogeno sulfurado y fermentación de azúcares.

Regradación de aminoácidos: descarboxilacion de la lisina

Ciertas enzimas formadas por los microorganismos pueden desaminar, dehidrolizar o descarboxilar aminoácidos, degradándolos en componentes más pequeños. En esta ocasión trataremos sobre la descarboxilación del aminoácido lisina, en una amina (cadaverina) y amoniaco, productos alcalinos lo cual eleva el PH del medio, observándose un viraje de su color original.

Material

Cultivo de E.coli, Shigella, Citrobacter

Medio de cultivo LIA

Asa bacteriológica

Procedimiento

Inocular a cepa por pontura y estrías, incubar por 18-24 hrs a35-37°C.

Resultado

Observar si se ha presentado descarboxilación o no por la apreciación del color.

Prueba para INDOL

Los microorganismos que producen la enzima triptofanasa son capaces de degradar al aminoácido triptofano y dar ácido pirúbico, amoniaco e indol. Este último se detecta por su combinación con el aldehído indicador que forma un producto final coloriado.

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Material

Cultivo de E-coli y Klebsiella o Salmonella

Caldo peptonado

Reactivo de Kowac’s

Asa bacteriológica

Procedimiento

Sembrar la cepa por agitación en el caldo peptonado, incubar a 35-37°C por 18.24 hrs.

Resultado

Indol + : Formación del anillo rojo

Indol - : Formación de un anillo incoloro o amarillo

Prueba de hidrólisis: hidrólisis de la Urea

Una enzima que disocia un sustrato incorporando los componentes del agua en ciertos uniones de la molécula de este ultimo se denomina enzima hidrolitica. Los productos se determinan mediante alguna reacción visual.

Material

Cultivo de E.coli, Proteus, Vulgaris o Klebsiella Preumoniae

Medio de cultivo Agar urea

Asa bacteriológica

Procedimiento

Sembrar la cepa por estrías, incubar a 35-37°C por 18-24 hrs.

Resultado

Urea + : Viraje a rojo púrpura o fucsia

Urea - : Amarillo

Utilización de un único sustrato: Citrato

Muchos microorganismos pueden ser reconocidos por su capacidad para crecer en presencia de un único compuesto que satisface todos sus requerimientos nutricionales.

Material

Cultivo de E.coli y Klebsiella preunoniae

Medio citrato

Asa bacteriológica

Procedimiento

Se siembra por estría en el medio citrato, se incuba a 35-37°C por 18-24 hrs.

Resultado

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Citrato (+) : vira al calor azul y se observa colonias

Citrato (-) : verde, sin desarrollo de colonias

CUESTIONARIO:

1. Mencione otros 2 microorganismos de importancia clínica que son Catalasa positivo.……………………………………………………………………………………………………………..……………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿Qué reacción ocurre al observarse la coloración lila en la prueba de descarboxilación de la lisina?……………………………………………………………………………………………………………..……………………………………………………………………………………………………………..

3. Qué tipo de ácidos se forman en la degradación de los carbohidratos por los microorganismos?……………………………………………………………………………………………………………..……………………………………………………………………………………………………………..

4. Indicar que pruebas son mayormente usadas para la identificación de entero bacterias.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 11

DIACNOSTICO INMUNOLOGICO: REACCIONES SEROLOGICAS DE AGLUTACION

Tradicionalmente el diagnostico definitivo pasa por la identificación, el aislamiento en cultivo puro del patógeno, de este modo la morfología, actividad bioquímica y patrón de sensibilidad a los antimicrobianos podrán ser examinados y evaluados. Sin embargo algunos microorganismos no se pueden cultivar in vitro como Treponema pallidum, Mycobacterium Leprae y en algunos otras enfermedades infecciosas un diagnóstico serológico es mucho mas económico y rápido, pero no definitivo. Otra forma de diagnostico es por la detección de un producto específico del agente infeccioso que no puede formarse sin la presencia del agente en el material clínico obtenido del paciente.

El método serológico tradicional para el diagnóstico de enfermedades infecciosas demuestra (mediante un aumento significativo del titulo) una respuesta de anticuerpos específicos humorales contra el microorganismos en cuestión. Ejemplos de reacciones serológicas de aglutinación son las pruebas para anticuerpos contra Brucella y Salmonella que son parte de un panel de pruebas para aglutinaciones febriles.

Aglutinación bacteriana

Una de las aplicaciones de aglutinación bacteriana es la llamada prueba de “Reacciones febriles” que esta basada en la investigación de la presencia de aglutininas (anticuerpos) contra la fiebre tifoidea, La brucelosis y el tifo, que indican que el individuo padece enfermedad o que ha estado en contacto con el germen (antígeno) sin llegar a contraerla. Estas reacciones febriles comprenden la Reacción de Widal para la fiebre tifoidea y paratifoidea, La Reacción de Huddlesson para la brucelosis y La Reacción de Weil- Félix para el tifo.

Reacción de Widal

La reacción de Widal utiliza como antigeno una sepa de Salmonella Typhi en fase O (o sea sin flagelos) y otra en fase H (flagelo). Además se tienen otros antigenos Salmonella paratyphi A-B.

Reacción de Huddlesson

Se lleva a cavo con antigeno de Brucella abortus para detectar anticuerpos contra fiebre de malta.

Reacción de WEIL-Félix

La reacción de Weil-Félix utiliza Proteus OX-19 como antígeno para detectar anticuerpos contra Rickettsia prowaseki, debido a que posee los mismos antígenos y por la facilidad de su manejo en el laboratorio.

Material.

Suero de paciente

Antigeno (tifico O y H, paratífico A y B, brucela, proteus OX-19.

Láminas de vidrio para aglutinaciones

Pipetas serológicas de 0,2 ml


Procedimiento.

Técnica cualitativa:

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1. Colocar una gota de suero problema en cada uno de los espacios marcados en la lámina

2. Agregar una gota de cada uno de los antígenos sobre la gota de suero problema

3. Mezclar uniformemente con un mondadientes cada gota, rotar la lámina por 3 minutos y observa los resultados.

Lectura.

Positivo: Aparición de grumos de tamaño variables que tienden a agruparse en la superficie de la gota.

Negativo: La mezcla permanece homogénea.

Técnica cuantitativa.

1. Con una pipeta de 0,2 ml. Depositar 0,08, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005 del suero problema en la lámina.

2. Añadir una gota de antígeno que dio aglutinación en la prueba cualitativa a cada cuota del suero.

3. Con el mondadientes mezclar y rotar la lámina durante 3 minutos.

Lectura:

Realizar la lectura teniendo en cuenta la presencia de grumos de acuerdo a la siguiente equivalencia:

Suero problema: Título:

0.08 ml 1/20

0,04 ml 1/40

0,02 ml 1/80

0,01 ml 1/160

0,005 ml 1/320

Títulos mayores de 1/80 tienen significación diagnóstico.

Resultados:

AntigenoTítulos de Suero

1 2 3

Tífico O

Tífico H

Paratífico A

Paratífico B

Brucella

Proteus OX-19

CUESTIONARIO:

1. Explique alguna (s) desventajas en el diagnóstico serológico…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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2. ¿Qué es título en serología?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

3. ¿Qué enfermedades a parte de las ya mencionadas, se diagnostica mediante serología?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

4. Mencione otras pruebas usadas para el diagnóstico inmunológico.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

5. Señale en que condiciones las pruebas de Widal y Huddlesson, puede comportarse como falso negativo y falso positivo.

..………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 12

CONTROL MICROBIANO: ACCION DE LOS AGENTES FISICOS Y QUIMICOS

El crecimiento de los agentes infecciosos causales de las enfermedades y de sus mecanismos de transmisión trajo como consecuencia muy importante la posibilidad de tomar medidas para su control. La inhibición del crecimiento y la destrucción de microorganismos patógenos se realizan ya sea por medios físicos o químicos. Algunos métodos de control microbiano solo se aplica a objetos inanimados, en tanto que otros muestran una toxicidad selectiva y pueden utilizarse in vivo.

Agentes físicos:

El control de microorganismos potencialmente patógenos en el ambiente, se lleva a cabo por métodos físicos mediante la desinfección o la esterilización. Entre estos tenemos:

a. Calor.

El calor es el método de elección mas usada para la esterilización de todos los materiales, excepto los que puedan ser alterados por el.

Llama directa.-Para estirilizacion del asa bacteriológica.

Esterilización con calor seco.-Se hace uso del horno, para esterilizar materiales como placas Petri.

Esterilización con calor húmedo.-Se usa el autoclave, el papel del agua en la desnaturalización de proteínas por el calor se evidencia en la utilización del vapor de agua. Se utiliza para esterilizar muestras clínicas.

Pasteurización.-consiste en el calentamiento a 62°C durante 30 minutos tres veces. Se utiliza en alimentos.

b. Congelación.

Los cristales de hielo pueden lesionar a las bacterias.

c. Radiación ultra violeta. Cuando se usan radiaciones de onda cada vez mas cortas a partir de 330 nm se produce estirilizacion bacteriana, la luz UV lesiona el DNA bacteriano que impide su replicación. Estas radiaciones tienen acción esterilizante sobre la mayoría de los microorganismos y se les emplea en ambientes quirúrgicos, cubilos bacteriológicos ya que su acción se limita a superficies o partículas suspendidas en el aire.

d. Radiaciones ionizantes. Pueden utilizarse fuentes de radiactividades intensas para esterilizar materiales hospitalarios, alimentos, etc. pero sobre todo en estos últimos, donde deben utilizarse dosis elevadas (millones de Rad.) alteran notablemente el sabor de los alimentos.

Agentes mecánicos:

a. Ondas sónicas y supersónicas.- Los ultrasonidos (con frecuencias que oscilan entre 15,000 y varios centenarios de miles de vibraciones por segundo) desnaturalizan proteínas y destruyen bacterias.

b. Filtración.- Si se utilizan filtros con poros menores de 1nm, se pueden obtener filtrados libres de bacterias. Esto se utiliza con soluciones que no se pueden esterilizar con calor.

Agentes Químicos:

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La acción de las sustancias químicas sobre los microorganismos varia dependiendo de la composición fisicoquímica del medio ambiente, la concentración, la temperatura y el tiempo que dura este contacto. En relación al efecto biológico se tiene una acción “bactericida”, es decir, destrucción de la bacteria; y una acción “bacteriostática”, ósea que inhibe el crecimiento bacteriano. Dentro de los agentes químicos tenemos a los desinfectantes, aquellos que son utilizados en superficies inanimadas y antisépticos usados sobre piel.

Metales pesados

Halógenos

Agentes alquilantes

Agentes con propiedades tensioactivas o tensoactivas

Fenoles

Alcoholes

Material.

Cultivos bacterianos de Bacillus, E.coli, Salmonella, Pseudomonas.

Tubos con caldo BHI o nutritivo, pH7, pH9, pH3

Placas con agar BHI o nutritivo

Discos estériles de papel de filtro

Pinza estéril

Hisopos o torundas estériles

Frascos con alcohol, fenol, mertiolate, mercurio cromo, violeta de genciana.

Asa bacteriológica

Procedimiento.

1. Sembrar en tres tubos con caldo nutritivo pH7 por agitación, incubar por 18-24 hrs., uno a 60°C, otro a 37°C, y finalmente otro a -8°C.

2. Sembrar en tres tubos con caldo nutritivo o BHI, uno a pH7, otro a pH9 y otro a pH3, incubar todos a 35-37°C por 18-24 hrs.

3. Introduzca un hisopo estéril es la cepa bacteriana, y siembre en toda la superficie de la placa con agar BHI o nutritivo, deje reposar 5 minutos y proceda a colocar los discos de papel de filtro embebidos en los diferentes desinfectantes y antisépticos (un disco para cada desinfectante o antiséptico) coloque una a distancia prudente del otro. Luego incube las placas a 35-37°C por 18-24 hrs.

Resultados.

1. En los tubos incubados a diferente temperatura observe si hubo crecimiento por la presencia o ausencia de turbidez. Explique a que se debe ese resultado.

2. En los tubos sembrados a diferentes pH, también observe si hubo crecimiento por la presencia y ausencia de turbidez, anote los resultados y explique el por que.

3. Observe alrededor de los discos impregnados con cada uno de los deferentes antisépticos o desinfectantes, si hay o no un halo alrededor, que demuestra si el agente químico es eficaz o ineficaz para actuar contra el microorganismo. Anote todos los resultados y explique por que algunos químicos son eficaces y otros no.

CUESTIONARIO:

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1. ¿Qué bacterias son más resistentes al calor?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿Qué agente químico era utilizado por Lister, hoy en día se sigue

Usando?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

3. ¿Qué antisépticos son los más usados?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

4. ¿Qué desinfectantes son de uso común en el laboratorio?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 13 Y 14.

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO ANTIBIOGRAMA

El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente con frecuencia no es suficiente para establecer la terapia adecuada. Muchas bacterias y algunos hongos presentan resistencia a los agentes antimicrobianos y algunos virus han desarrollado resistencia a los agentes antivirales más nuevos. Los patrones de resistencia cambian en forma constante. No importa cuan rápidamente se introducen los nuevos agentes terapéuticos, los microorganismos parecen estar dispuesto a sobrepasarles.

Cuando no se conoce o no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias, hongos y virus a los agentes antimicrobianos, es necesario estudiar la sensibilidad individual de cada agente a estas drogas, pudiendo elegir entonces el agente adecuado (el mas activo contra el patógeno, el menos toxico para el huésped, con la características farmacológico apropiadas el mas económico y que se encuentre en el mercado), que proporciona mayores posibilidades de una evolución favorable. El clínico toma la decisión final, contando con los resultados obtenidos in vitro enfermedad subyacente, condición clínica del paciente, la administración de otros agentes terapéuticos, experiencia clínica y otros factores.

Para realizar las pruebas de sensibilidad in vitro, es necesario emplear un inóculo estándar que contenga 106 a 108 microorganismo por ml; un medio de cultivo que no interfiere con la eficacia de los antibióticos ni con el crecimiento del microorganismo, en cantidad conocida y un pH regulado como el Miuller Hinton en caldo o Agar medio suplementado con los cationes magnesio y calcio.

Método de dilución en caldo

Método que sirve para evaluar cuantitativamente la actividad de un antibiótico. Se colocan concentraciones decreciente del agente antimicrobiano, generalmente diluciones al medio (1:2), en tubos con caldo de cultivo Miuller Hinton que sostendrá el desarrollo del microorganismo, luego se inocula el microorganismo. Un tubo de caldo se mantiene sin el antibiótico y es conocido como el control, luego se llevan a incubar todos los tubos y al día siguiente se observa la turbidez que indicara desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los otros que no contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir el desarrollo. La concentración mas baja que impide el crecimiento bacteriano se considera concentración inhibitoria mínima (CIM) del fármaco y esta es detectada por falta de turbidez.

Material.

Cultivo bacteriano que contenga 106 - 108 microorganismo por ml.

Solución de antibiótico que contenga 1000 unidades

Tubos 13x 100 ml. Estériles

Pipetas estériles

Caldo Miuller Hinton

Procedimiento.

Colocar 10 tubos 13x100 ml estériles enumerados del 1al 10.

Diluir el antibiótico que contenga 1000 U. en proporción 1:5 en caldo, obteniendo una concentración 200 u. por ml.

Con una pipeta estéril colocar 0.5 ml del caldo en los tubos marcados del 2 al 10.

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Agregar 0.5 ml del antibiótico a los tubos 1 y 2, mezcle el contenido del segundo tubo y trasvase 0.5 ml al tubo 3, continuando de igual forma hasta el 9no tubo. Retirar 0.5 ml del 9no tubo y descartar; el 10mo no recibe antibiótico y sirve como control.

Agregue 0.5 ml de la cepa bacteriana a todos los tubos

Incubar a 35-37°C por 24 horas

Resultado.

Realice la lectura e interprete los resultados obtenidos.

Determine la CIM del fármaco estudiado.

Determine si el microorganismo probado es sensible o resistente al fármaco probado haciendo uso de la tabla.

Interprete correctamente el resultado obtenido

Método de difusión de Agar.

Conforme se dispuso de mayor numero de agentes antimicrobianos para el tratamiento de una gran variedad de bacterias, se hicieron aparentes las limitaciones del macro método de dilución en caldo. Por este método se prueba simultáneamente un germen aislado de un paciente frente a mas de un agente antimicrobiana, y esto se consigue inoculando la superficie de la placa de agar Miuller Hinton con el microorganismo en estudio, transcurrido 5 minutos se procede a colocar los discos de antibióticos (con una concentración conocida) equidistante uno de otro, los antibióticos difunden en el medio en forma radial alrededor del disco e inhibe el desarrollo microbiano en la zona donde su concentración es suficientemente alta (halo de inhibición), trascurrido la incubación a 35-37°C por 24 hrs. Este método también es conocido como disco-difusión y es una técnica cualitativa. En 1966 después del estudio Kirby-Bauer y otros se uniformizaron criterios y se estandarizó la prueba tomando en cuenta los conceptos de concentración mínima inhibitoria (CIM ) y la concentración promedio en sangre de las drogas frecuentemente usadas.

Material.

Placas con agar Miuller Hinton

Disco de antibióticos

Torundas estériles

Pinzas estériles

Cepa bacteriana en caldo con una concentración de 10 6 – 108 microorganismo por ml

Procedimiento.

Introduzca la torunda en la cepa bacteriana, escurrir oprimiendo contra las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la placa de Agar Miuller Hinton.

Dejar reposar 5 minutos y colocar con la ayuda de la pinza los discos de diferente antibióticos en la superficie del Agar y presionarlos suavemente.

Los discos deben estar equidistantes unos de otros

Incube a 35°C 24 hrs.

Resultados

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Para realizar la lectura, mida el halo de cada disco de antibiótico en mm, conocidos los diámetros utilice la tabla para categorizar si el microorganismo es sensible, moderadamente sensible o resistente a los diferentes antibióticos.

Explique cual es o son los mejores antibióticos según el antibiograma in vitro.

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CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es limite crítico de un agente antimicrobiano para este tipo de prueba?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿ La CIM y CBM ( concentración bactericida mínima ) de un agente antimicrobiano son iguales?. Explique.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 15

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Staphylococcus.

El genero Staphylococcus es miembro de la familia micrococaceae; forman parte de la flora microbiana normal de la piel y mucosas del hombre y en ciertas circunstancias pueden comportarse como patógeno. El Staphylococcus aureus (en general estafilococos coagulasa positivos) ha sido reconocido históricamente como un patógeno humano virulento e importante causante de abscesos, diversas infecciones piogénas, neumonía, endocarditis e incluso septicemia mortal. También durante los últimos años los estafilococos coagulasa negativos han surgido como patógenos importantes, principalmente de huéspedes deficientes incluyendo pacientes con algún tipo de prótesis, estos son los Staphylococcus epiderminis, los Staphylococcus saprophyticus son responsables de ITU en mujeres jóvenes. Últimamente los estafilococos coagulasa negativos son responsables de bacteriemia en pacientes neutropénicos, de infecciones relacionadas con catéteres permanentes.

Los antifilococos son cocos esféricos, grampositivos, inmóviles, aerobios anaerobios facultativos y Catalasa positivo, no esporulados, agrupados en racimos, tetradas o aislados. Crecen en cualquier medio de cultivo que permita el desarrollo de los grampositivos, dando colonias redondas, opacas y lisas, por lo general consistencia cremosa.

Material

Placas con Agar sangre

Placas con Agar Manitol hipertónico o baird Parker

Láminas portaobjeto

Set de colorantes Gram.

Tubos con caldo tioglicolato

Plasma citratado

Disco de novobiocina

Peróxido de hidrógeno

Asa de kolle

Muestra clínica: Absceso, S. nasal, ántrax.etc.

Procedimiento

Examen directo de la muestra clínica. Realizar una Tinción Gram de la muestra y buscar cocos Gram +.

Cultivo.

a. Enriquecer en caldo tioglicolato, inoculando la muestra previamente incube a 35-37°C x 18-24 hrs.

b. Aislar en Agar sangre y/o Agar Manitol hipertónico u otro medio selectivo, sembrado por estiras y agotamiento en 4 cuadrantes: Incube a 35-37°C x 18- 24 hrs.

c. Identificación:

1. Identificación preliminar de las colonias típicas de Staphylococcus.

2. Observación de la morfología bacteriana mediante una coloración Gram a partir de la colonia seleccionada.

3. Pruebas bioquímicas o enzimáticos

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Realizar las pruebas de:

Catalasa

Coagulasa

Hemolisina

Resistencia a la novobiocina

Resultado

Anotar lo obtenido en el examen directo

Anotar el crecimiento en caldo tioglicolato

Describir las colonias típicas de los diferentes Estafilococos según el medio en el que se aislado, luego la morfología microscópica bacteriana y las reacciones en las pruebas bioquímicas

Anotar el Staphylococcus aislado e identificado y si hay correlación con el ex. Directo

CUESTIONARIO.

1. ¿Qué característica tiene el tioglicolato que permite crecer a estafilococos?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. Qué otras pruebas se utilizan para confirmar la identificación de S. aureus?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

3. Si aísla S. epidermidis de lesión a nivel de piel, ¿Consideraría el patógeno?, explique.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

4. ¿Qué otras especies de estafilococos coagulasa negativos son de importancia clínica?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 16

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION Streptococcus Pyogenes

Los miembros del genero Streptococcus son cocos Gram. Positivo, Catalasa negativos que tienden a crecer desarrollando cadenas en los medios líquidos, son anaerobios facultativos, son miembros de la FMN y además de agentes etiológicos, de varios enfermedades graves como faringitis exudativa estreptocócica infecciones de herida, piel y abscesos. La fiebre reumática aguda y la glomerulonefritis posestreptocócica son secuelas secundarias de una infección por Streptococcus Pyogenes. En Agar sangre forman colonias betas hemolíticas, pequeñas, circulares, transparentes a lechosas, aunque existen variantes.

Material

Placas con Agar sangre y otros con medio selectivo CNA

Tubos con caldo tioglicolato


Set de Gram.

Discos de bacitracina

Muestra clínica: hisopado faríngeo

Procedimiento

Examen directo de la muestra clínica: Realizar un Gram. o determinación del carbohidratos de la pared o antigeno de grupo, utilizando un suero que contiene los anticuerpos contra estos antígenos

Cultivo:

a. Enriquecer la muestra en caldo tioglicolato, inoculando el espécimen clínico en el medio de cultivo y dejar incubar a 35-37°C por 18-24 hrs.

b. Aislar en Agar sangre y CNA, sembrando por estría y agotamiento e incubando a 35-37°C por 18-24 hrs.

c. Identificación:

1. El paso inicial de la identificación es realizar un examen cuidadoso de la morfología de la colonia.

2. Realice un Gram. de la colonia y observe la morfología bacteriana microscópica.

3. Pruebas bioquímicas o enzimáticas.

Realizar las siguientes pruebas:

Catalasa

sensibilidad a la bacitracina

determinación los carbohidratos de la pared celular o antigeno de grupo.

Resultados:

Anotar los resultados obtenidos en el examen directo.

Anotar características del crecimiento en caldo tioglicolato.

Describir las colonias típicas del S. Pyogenes, morfología microscópica y reacciones bioquímicas.

Anotar si el resultado definitivo se correlaciona con el examen

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CUESTIONARIO:

1. ¿Qué hemolisina es responsable de la zona de hemólisis?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. señale otras pruebas bioquímicas que permiten identificar al S. Pyogenes.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

3. ¿Qué es ASO, y explique la importancia?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 17

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Streptococcus pneumoniae

Al igual que los S. Pyogenes, son cocos lanceolados Gram positivos, que se pueden presentar en pareja o formando cadenas cortas, encapsulados, se encuentran en la flora nasofaringea y oro faríngea normal de muchos niños y adultos, son alfa hemolíticos es decir en Agar sangre desarrollan colonias pequeñas con un halo de color verde, por eso también se denomina hemólisis parcial, estas colonias tienen aspecto mucoide y lustroso, y con tendencia a hundirse en el centro al prolongarse el tiempo de incubación debido a la acción de enzimas autolíticas.

Material

Placas de Agar sangre


Set de Gram.

Peroxido de hidrogeno

Disco de etilhidrocupreina u optoquinona

Muestra clínica: Esputo

Procedimiento

Examen directo de la muestra clínica .- Realizar un Gram. de la muestra directa o la prueba de Quellung previamente y luego llevar al microscopio.

Cultivo

a. Inocular la muestra en Agar sangre por estría y agotamiento, dejar incubar por 18-24 hrs. a 35-37°C.

b. Identificación :

1. Pasado las 18-24 hrs., reconocer las colonias típicas.

2. Hacer una frotis de la colonia y teñir con Gram.

3. Realice las pruebas bioquímicas.

Catalasa

Sensibilidad a la optoquinona

Solubilidad en bilis

Resultado

Anotar lo obtenido en el examen directo.

Describir las colonias típicas, morfología microscópica y reacciones bioquímicas.

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PRACTICA N° 18

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Neisseria

La familia Neisseriaceae incluye varios géneros entre ellos el género Neisseria y Branhamella. La Neisseria son cocos gramnegativos. Algunas Neisserias son comensales y otras como N. gonorrhoeae y N. meningitidis son patógenos. En un frotis de muestra clínica coloriado con Gram., estos microorganismos se presentan como diplococos de forma arriñonada (o granos de café) y se pueden observar dentro de los neutrófilos polimorfonucleares, esta presentación se conoce como diplococos intracelulares gramnegativos y contribuyen a la identificación de una verdadera infección .

Aunque estos cocos son aerobios estrictos desarrollan mejor en un medio enriquecido con atmósfera de 2-10% de co2. Las Neisseria patógenas son muy sensibles a las variaciones de temperatura, por la que las muestras clínicas deben ser inoculadas lo más pronto posible. Luego de 24-48 hrs. de incubación la N. gonorrhoeae forma colonias pequeñas (0.5.- 2 mm), traslucidas, grisáceas, convexas, brillantes, con bordes lisos, con frecuencia se despegaran completamente de la superficie del Agar y pueden ser mucoides o gomosas. Son autolítico

Material

- Placas con agar chocolate y Thayer Martín modificado

- Láminas

- Set. De Gram.

- Reactivo para Oxidasa

- Muestra: Uretral, cervix y canal anal y de otros localizaciones LCR.

Procedimiento

Examen directo de la muestra clínica .- Hacer un frotis de la muestra y teñir con Gram.

Cultivo

a. Sembrar la muestra en agar chocolate y/o Thayer Martín modificado por estría y agotamiento para obtener colonias aisladas, incubar 24-48 hrs. a 37°C y con CO2 2-10%.

b. Identificación:

1. Identificar las morfologías típicas de las colonias

2. Realizar un Gram. de estas colonias.

3. Realizar las siguientes pruebas bioquímicas o enzimáticas.

- Test de oxidasa

- Fermentación de glucosa, maltosa, fructuosa, Sacarosa, Lactosa.

Resultados

- Anotar los resultados obtenidos en el examen directo.

- Describir las colonias típicas aisladas, morfología microscópica y reacciones bioquímicas.

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CUESTIONARIO:

1. Las Neisserias patógenas desarrollas a 22°C.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿Cómo se encuentran localizadas los gonococos en los PMN en un proceso agudo y crónico?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 19

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae son los que se aíslan con mayor frecuencia de las muestras clínicas, son bacilos gramnegativos, desarrollan bien en Agar sangre, chocolate y forman colonias distintas en los medios selectivos que permiten su crecimiento dependiendo de sus propiedades y de los componentes, del medio. Algunas especies son patógenas clásicas y su sola presencia en las muestras clínicas los señalan como agentes etiológico de enfermedad, independientemente del numero de unidades formadoras, otras especies pueden colonizar sin estimular ninguna patología, como las que colonizan el tracto intestinal. Si estos microorganismos “comensales”son introducidos en algún sitio susceptible (como cavidad peritonial, pulmones de un huésped inmunosuprimidos, LCR, etc.). Son capaces de provocar enfermedad.

UROCULTIVO

Uno de los cultivos más comunes que se solicitan a un laboratorio son los cultivos de orina. Se calcula que aproximadamente 20% de las mujeres tienen una ITU por lo menos una vez en la vida, en los hombres es muy bajo, pero aumenta después de los 60 años donde la hipertrofia prostática facilita el desarrollo de ITU. Ciertos microorganismos colonizan la uretra anterior por lo tanto son considerados como FMN, así tenemos a los estafilococos coagulasa negativos, estreptococos no hemolíticos y del grupo viridans, lactobacilos, difteroides, Neisserias saprofitas micobacterias saprófitas y otros bacilos gramnegativos. Puesto que con los métodos no invasores para recolectar la orina se obtienen una muestra que a pasado por un medio contaminado, la interpretación de los resultados de los cultivos de dichas muestras requiere la aplicación de algunos criterios discriminatorios.

La mayoría de infecciones que afectan las vías urinarias son adquiridas por vías ascendentes y muy pocas por vías hematógena, linfática o vía descendente. Las bacterias que se aíslan mas a menudo son E. coli, Klebsiella, Enterobacter y S. Saprophyticus.

Material.

- Láminas portaobjetos y cubre objetos

- Tubos de ensayos limpios

- Asa bacteriológica

- Placas con agar sangre, Mac Conkey, Manitol Hipertónico

- Set de Gram.

- Muestra : Orina patológica

Procedimiento.

I. Pruebas de selección rápida de las muestras para ITU.

Son pruebas de diagnostico presuntivo:

Gram de gota fresca (Washington)

Colocar una gota de orina total en una lamina portaobjetos, dejar secar y colorear con Gram, observar al microscopio a 1000 x.

Prueba de Griess

Se introduce una cinta o tira reactiva en el espécimen.

Sedimento urinario

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Colocar en un tubo de ensayo limpio 6 ml de orina, centrifugar por 3 minutos a 2500 RPM; decantar y colocar una gota del sedimento en una lamina portaobjeto, cubrir con laminilla y observar a 400 x.

II. Cultivo – Urocultivo.

Una vez que se ha clasificado la orina como presuntamente patológico se procede a sembrar en el medio de cultivo elegido con un asa bacteriológica calibrada, se incuba a 35-37°C generalmente por 18-24 hrs. y se realiza la lectura. Luego la identificación bioquímica sembrando en TSI, LIA, citrato etc. y las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos

Resultados

- En la técnica de Washington se debe observar 01 microorganismo por 20 campos que vendría a considerarse bacteriuria significativa por lo tanto orina presuntamente patológica.

- En la prueba de sedimento urinario se debe observar de 5-10 leucocitos por campo, bacterias, hematíes y otros de menor importancia.

- En el cultivo se debe realizar el recuento de colonias en unidades formadores de colonias por mililitros de orina (UFC/ml de orina) en toda la placa, luego se multiplica por el factor del calibre del asa de siembra y se debe interpretar dependiendo del tipo de muestra.

UFC/ml. de orina = N° de colonias totales x factor del asa

A. Muestra chorro medio:

- Urocultivo negativo : <10,000 UFC/ml de orina

- Urocultivo dudoso de : 10,000 a 100,000 UFC/ml de orina.

- Urocultico Positivo : > 100,000 UFC/ml de orina

B. Muestra punción suprapúbica: En este caso cualquier número es importante.

C. Muestra por cateterización vesical. Recuentos mayores de 100 UFC/ml de orina se considera positivo

- Finalmente se realiza la identificación interpretando la reacción de las diferentes pruebas bioquímicas y anotando a que droga es sensible el patógeno

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué microorganismos están implicados en una ITU vía hematógena?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. Indiqué aproximadamente con que frecuencia las enterobacterias son agentes casuales de ITU.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

3. ¿Qué significa bacteriuria y piuria significativa?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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4. ¿Por qué en una muestra de orina obtenida por punción suprapúbica, cual quier número de bacterias aisladas se considera patológico?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 20

COPROCULTIVO

Viene a ser el cultivo de las heces con la finalidad de aislar a patógenos intestinales como Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, Vibrio cholerae, E. coli patógenos. Se utiliza medios en algunas ocasiones para enriquecer las muestras y otros se aíslan directamente en medio selectivos o altamente selectivos, estos medios tienen capacidad de inhibir el desarrollo de la flora acompañante. Los patógenos intestinales son generalmente lactosa negativos excepto las E.coli patógenos.

Material

- Muestras de heces diarreicas o hisopado rectal.

- Tubos con caldo selenito y agua peptonada alcalina.

- Placas con Agar Mac.Conkey.

- Placas con agar Eosina Azul de metilino.

- Placas con Agar Salmonella - Shigella

- Tubos con TSI, citrato, Urea, agua peptonada, SIM.

- Asa bacteriológica.

- Placas con agar TCBS.

- Reactivo de Oxidosa

Reactivo de Kowac’s.

- Desoxicolato de sodio al 0.5%

Procedimiento

a. Enriquecimiento de la muestra.

Inocular una asada de heces o introducir el hisopo en caldo Selenito si se deja enriquecer la muestra para Salmonella, Shigella o APA si se desea enriquecer para Vibrio cholerae.

Incubar 6-12 horas a 35-37°C.

b. Aislamiento

A partir de la muestra enriquecida (Selenito) sembrar por estría y agotamiento en placas de MacConkey, EMB y SS si desea aislar Salmonella y en TCBS a partir del APA, si se desea aislar Vidrio Cholerae. Incubar 18-24 horas a 35-37°C.

c. Identificación

- Si en los medios MacConkey, SS, y EMB se obtienen colonias lactosas negativas se consideran sospechosas de ser algún patógeno intestinal. Y si en el TCBS se observan colonias amarillas sacarosas positivas, se considera sospechoso de Vibrio cholerae.

- Se realiza la identificación microscópica realizando un Gram de la colonia.

- Luego se realiza la identificación enzimático o bioquímica para Salmonella, Shigella: Apartir de la colonia sospechosa se siembra en TSI, LIA, citrato, urea, caldo peptonado, SIM.Incubar 18-24horas a 35-37°C.

Para tipificar se usa serologia.

Vibrio cholerae: A partir de la colonia sospechosa se realiza oxidasa y String Test. Si resulta positivas las pruebas se procede a sembrar en TSI, LIA, citrato, urea, caldo

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peptonado, SIM. Luego se incuba por 18-24 hrs a 35-37°C. Para tipificar se usa serología.

Resultados

- Anotar las características de las colonias sospechosas de ser algún patógeno en los diferentes medios de aislamiento indicando el posible patógeno.

- Anotar las características microscópicas de la colonia.

- Anotar el comportamiento bioquímico y concluir si se identifico o no el patógeno.

CUESTIONARIO.

1. ¿Si se desea mantener la muestra de heces por más de 2 horas, cual es procedimiento ideal?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿Cuál es la finalidad incubar en los medios de enriquecimiento solo 6 a 12 horas?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

3. ¿Qué características tienen las muestras de heces generalmente para un coprocultivo?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 21

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Mycobacterium Tuberculosis

Las micobacterias han causado enfermedad en el hombre desde el comienzo mismo de la época histórica; en momias egipcias han sido identificadas claramente lesiones causadas por micobacterias. Mycobacterium tuberculosis, es el agente causal de la tuberculosis y es responsable de un gran número de muertes y de una gran morbilidad en muchos países. La pared celular de las bacterias contiene ácido mícólico que son ácidos grasos de cadena larga con múltiples uniones cruzadas. Los ácidos micólicos hacen que sea difícil colorear su pared y le confiéren la características de ácido alcohol resistencia. Otra micobacteria de importancia es Mycobacterium Leprae, microorganismos mismo no cultivable in Vitro. Estos microorganismos son aerobios inmóviles.

La investigación bacteorologica en tuberculosis comprende la realización de la baciloscopía, cultivos, pruebas de sensibilidad y tipificación.

Material

- Muestra de esputo de pacientes sospechosos de tuberculosis

- Tubos con medio de ogawa

- Láminas portaobjetos nuevos

- Set. De colorantes Ziehl Neelsen

Procedimiento.

Examen directo

Es una herramienta fundamental rutinaria para el diagnóstico de la tuberculosis y el seguimiento del tratamiento de los pacientes con tuberculosis.

El examen directo de esputo se realiza mediante la coloración Ziehl Neelsen denominado Baciloscopía, tiene una especificidad del 98% y sensibilidad del 60-80%.

Otros métodos directos son Kinyoun y Rodamina-auromina

Cultivo

a. El cultivo de Mycobacterium Tuberculosis permite diagnosticar los casos que presentan baciloscopía negativa, y aporta hasta un 20% más de conformidad bacteriológica (especificidad del 100% y sensibilidad del 80-90%).

Antes de la siembra se debe de descontaminar las muestras que así lo requieran, como esputo y otras contaminadas, para ello se procede a agregarle igual cantidad al de la muestra de un álcali como el NaOH por un tiempo promedio de 20 minutos, durante ese tiempo se debe hacer centrifugado e incubado en baño Maria acto seguido siembran y las muestras como LCR se siembran directamente.Se deja incubar a 37°C hasta 60 días.

b. Identificación

1. Calificar las colonias típicas que deben haber desarrollado transcurrido las 8 días a mas, con las siguientes características: Colonias secas, rugosas,

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polimorfas y con dimensiones muy variables de color crema y excepcionalmente algo rosado “cabeza de coliflor”.

2. Realizar la identificación microscópica, haciendo un Ziehl Neelsen de la colonia.

3. Realizar las pruebas bioquímicas:

- Test. de niacina

- reducción de nitratos

actividad Catalasa

- Hidrólisis del Tween 80

- Reducción de telúrico

Resultados

- Cuantificar los BAAR en el Ziehl Neelsen del examen directo.

- Cuantificar las colonias:

(-) no se observan ninguna colonia

No de colonias totales cuando son menos de 20

(+) De 20 – 100 colonias

(++) Mayor de 100 colonias

(+++) Toda la superficie

CUESTIONARIO:

1. Mencione cuales son las muestran que en la actualidad se remiten para cultivo de M. Tuberculosis.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿si tiene un SR, cuantas veces como mínimo debe remitir la muestra al laboratorio para los análisis respectivos?…………………………………………………………………………………………………………………..……………………………………………………………………………………………………………

3. ¿en aquellos pacientes que por diversas causas no producen esputo, cual es la muestra ideal, si se sospecha de tuberculosis pulmonar?

………………………………………………………………………………………………………………….…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA N° 22

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Treponema pallidium

El género Treponema incluye especies no patógenas y patógenas como el Treponema causante de sífilis, pinta, pian y bejel. Las cepas virulento de estas espiroquetas son de dificil cultivo, solo se pueden cultivar en testículo de conejo o almohadilla plantar del ratón, en 1981 Fieldsteel y Col. obtuvieron el cultivo de T. pallidum, biotipo pallidum, agente causal de la sífilis, empleando un cultivo celular muy complejo constituido por monocapas de fibroblasto. Son microorganismos microaerófilos, Gramnegativos. Como el microorganismo no es cultivable por métodos convencionales, el diagnóstico de laboratorio se realiza básicamente por serología, visualización en microscopio de campo oscuro y la sintomatología clínica.

En la muestra de una lesión primaria de sífilis en la fase precoz denominada chancro sifilítico se puede observar la presencia de espiroquetas móviles con un microscopio de campo oscuro.

Pruebas Serológicas

I. Pruebas no treponémicas.

Son de gran sensibilidad y baja especificidad, de fácil ejecución, bastante usado en Screning, pueden ser cualitativos y cuantitativos, pueden dar falsos positivos que pueden ser atribuidas a una variedad de condiciones agudas o crónicas como embarazo, lupus eritematoso etc.las pruebas no treponémicas son VDRL y RPR.

II. Pruebas treponémicas

Es más específica, se usa para confirmar al diagnóstico serológico de sífilis si la prueba resultara positivo con las pruebas no treponémicas. Dentro de ellos tenemos:

- FTA – ABS

- TPI

- Hemoaglutinación

Material

Muestra: suero sospechoso

Reactivo de RPR, VDRL y controles

Micropipetas o pipetas automáticas

Láminas de vidrio con hoyos

Procedimiento Cualitativo

1. Colocar 50 ul (1 gota) de suero muestra en un círculo de la lámina

2. Añadir al lado de la anterior 20 ul de suspensión de reactivos RPR o UDRL.

3. Mezclar ambas gotas y rotar durante 4 minutos con VDRL y 8 minutos con RPR.

4. La técnica con VDRL se lleva al microscopio y se observa si hay floculación o agrupación y la técnica RPR se observa a simple vista

Resultado

Reactivo: Presencia de floculación

No reactivo: ausencia de floculación

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Para determinar el título se debe de usar la técnica en forma cuantitativa, haciendo uso de tubos.

Tubo 1

-0.5 ssf

-0.5 suero

Tubo2

- 0.5 ssf

- 0.5 del T. 1

Tubo 3

- 0.5 ssf

- 0.5 del T. 2

Tubo 4

-0.5 ssf

- 0.5 del T. 3

Tubo 5

- 0.5 ssf

-0.5 del T. 4

1 : 2, 2 dils 1:4, 4 dils 1:8, 8 dils 1:16, 16 dils 1:32, 32 dils

CUESTIONARIO.

1. Mencione cinco casos que puedan dar pruebas falsas positivas en RPR.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. ¿En que casos esta indicado la prueba de FTA – ABS?…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRÁCTICA N° 23

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS

Históricamente, los hongos han sido considerados como causas de infecciones relativamente insignificantes, sin embargo, en los últimos años se ha comprobado un gran aumento en el número de infecciones micóticas. Actualmente se consideran aproximadamente 100 especies patógenas. Estos microorganismos en general viven como saprófitos en la naturaleza, sobre materia nitrogenada en descomposición donde son capaces de mantener una existencia libre, alguno de ellos cumpliendo ademas un ciclo parasitario en el hombre o animales.

Los hongos se pueden cultivar en diversos medios para hongos como el Agar sabouraud con o sin antibiótico, otros como Agar czapek, Mycosel, Agar sangre, BHI. Se deben incubar a 25 – 30 °C (temperatura ambiente) y dependiendo del grupo de hongos el tiempo de incubación varia.

En el proceso de identificación se considera los siguientes criterios:

1. Velocidad de crecimiento

2. Características macromorfológicas de la colonia

- Aspectos del micelio, haz y enves

3. Características micromorfológicas de la colonia

- Se observa hifas, conidioforo, vesícula, microconidias, macroconidias, pigmentación, etc.

4. demostración del dimorfismo térmico o prueba de exoantígeno.

5. Asimilación de azúcares y ureasa.

6. Serología

Examen directo de hongos

Tradicionalmente, las preparaciones con hidroxido de potasio a sido el método recomendado para la observación microscópica directa de las muestras, sin embargo existen otros métodos como la tinción con blanco de calcofluor, tinta china, metanamina de plata, ácido peryodico de schiff (PAS), Wright, Gram. Otras pruebas directas tenemos la de aglutinación con látex para determinar antígeno de criptococcus, inmunodifisión, fijación de complemento.

Materiales

Muestra clínica: Escamas de piel, pedazos de uñas y cabello, esputo, S. vaginal, uretral y otros.

Láminas portaobjetos y laminillas

Tinta china

Set de Gram

KOH al 10%

Azul de lactofenol

Microscopio

Asa bacteriológica

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Procedimiento: Montaje con KOH al 10%

1. Colocar la muestra sobre el portaobjetos, agregar una gota de KOH al 10 %, dejar actuar por 10 – 20 minutos, ayudar con el calentamiento suave con el mechero.

2. Trascurrido el tiempo, agregar una gota al azul de lactofenol.

3. Cubrir con laminilla

4. Obs. Al microscopio a 100x ó 400x de aumento.

Otras muestras pueden ser observadas utilizando la técnica de GRAM o tinta china.

Resultados

Anotar los elementos micóticos que se observan en el preparado con KOH, tinta china y GRAM.

CUESTIONARIO

1. Indicar cuales son los medios ideales para el aislamiento de dermatofitos, Parococcidiodes, Candida, Aspergillus.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

2. Si se desea aislar hongos a partir de una muestra de sangre, cual es el medio ideal para el aislamiento.…………………………………………………………………………………………………………………..…………………………………………………………………………………………………………………..

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PRÁCTICA N° 24

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS OPORTUNISTAS

Los hongos ambientales, oportunistas o de patogenicidad condicionada causan micosis oportunistas, micosis que se encuentra casi exclusivamente en pacientes inmunodeficientes. Si bien existen una lista creciente de hongos causantes de micosis oportunistas, algunos de ellos se observan con mayor frecuencia e incluyen a: Aspergillus, Mucor, Alternaria, Fusarium, Penicillium, Candida y Criptococcus. Estos hongos son de crecimiento rápido, bien pigmentados, desarrollan en medios que no incluyen cicloheximida, solo con cloramfenicol.

Material

- Cultivos de los hongos oportunistas

- Láminas de los hongos oportunistas

- Otros

Procedimiento

- Estudiar a las colonias que se le presentan en las placas.

- Estudiar las características micromorfológicas.

- Estudiar el comportamiento bioquímico y otros

Resultado

Identificar a todos los hongos oportunistas tanto Mohos como levaduras por su morfología o por su estudio macroscópico, microscópico y bioquímico.

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PRÁCTICA N° 25

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DERMATOFITOS Y SUPERFICIALES.

Los dermatofitos causan micosis cutánea o dermatomicosis, estos hongos invaden las áreas superficiales del cuerpo incluyendo piel pelos y uñas. Los géneros Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton son los únicos asociados con dermatomicosis.

Estos hongos se cultivan en sabouraud mas antibióticos como cicloheximida y cloramfenicol o en medios selectivos como Mycosel o Micobiotic; son de crecimiento más lento que los oportunistas y generalmente las colonias se observan blancas, amarillentas o anaranjadas, rara vez forman pigmentación oscura o notoria, pero si producen pigmentos hidrosolubles de color amarillo, anaranjado o rojo que difunde hacia el agar, con el cual el reverso de la colonia presenta una coloración. Entre los hongos que causan micosis superficial tenemos a Malassezia furfur, Exophiala werneckii, Piedraia hortae, Trichosporon beigelli .

Material

- Cultivos de hongos dermatofitos

- Láminas de hongos dermatofitos para la observación microscópica

Procedimiento

- Estudiar los cultivos

- Estudiar las láminas al microscopio

Resultado

Identificar por el aspecto macroscópico y microscópico de la colonia.

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PRÁCTICA N° 26

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS CAUSANTES DE MICOSIS SUB-CUTANEA

Los hongos que son capaces de afectar la piel y el tejido subcutánea son los conocidos como causantes de micosis subcutánea, generalmente sin desiminación a otros órganos. El mas común es el Sporothrix schenckii que es un hongo dimórfico de crecimiento de 4 – 45 días en promedio, en sabouraud desarrollando colonias al inicio blanquecina, luego oscurece y toma el aspecto de “cuero”. La fase levadura se cultiva en Agar Sangre o BHI. Otros hongos que ocasionalmente causan micosis subcutánea son Cladosporium, Phialophora, y Fonsecae que causan cromoblastomicosis y el agente etiológico mas comun de un Micetoma Eumicótico es Pseudallescheria boydii.

Material

- Cultivo de Sporothrix schenckii

- Láminas de S. shenckii y Cladosporium

- Otros

Procedimiento

- Estudiar los cultivos y las láminas

Resultados

Identificar los hongos productores de micosis subcutánea, por las características que se presenten en el cultivo y la microscopia.

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PRÁCTICA N° 27

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS PATOGENOS

Los hongos patógenos son dimórficos, y causan micosis sistémica entre ellos se encuentran a Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasilensis, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis y Penicillium marneffi, son hongo de crecimiento lento de 10 – 45 días y forman colonia blanquecinas a amarillas en medio sabouraud con antibióticos, la fase levadura se cultiva en Agar sangre y BHI.

Materiales

- Cultivos de los hongos patógenos

- Láminas de los hongos patógenos para la observación microscópica

- Otros

Procedimiento

Estudiar las láminas y los cultivos.

Resultados

Identificar los hongos patógenos por su estudio macroscópico y microscópico y demostración del dimorfismo térmico.

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PRACTICA N° 28

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE VIRUS

Los virus son agentes infecciosos cuya reproducción es exclusivamente intracelular, por lo tanto no se puede cultivar en ningún medio convencional. Los virus solo pueden ser cultivados en animales, huevos embrionados y células. Existen una afinidad especifica por cada sistema, por lo tanto algunos virus se pueden cultivar en línea celular, otros en huevos embrionados o en animales.Alguno de los virus son de difícil aislamiento en cultivos celulares y las infecciones causadas por ellos son diagnosticados por otros métodos.Por lo que el diagnóstico viral se puede realizar por:

Examen citológico de la muestra.- Es la técnica mas accesible y rápida para el diagnóstico de ciertas enfermedades virales; mediante esta técnica se busca inclusiones virales características, estas estructuras intracelulares pueden ser agregados de virus en el interior de una célula afectada o acúmulos anormales de material celular que se producen como consecuencia del trastorno metabólico inducido por el virus. También se puede encontrar Sincitios, acúmulos de células que contienen más de un núcleo. Cuerpos de negrí, inclusiones virales rábicas en el tejido cerebral.

Detección de antigeno viral.- El examen directo de los tejidos o exudados infectados con el virus puede realizarse mediante anticuerpos virales específicos conjugados con fluorescencia. Métodos como inmunofluorescencia indirecta, radioinmunoensayo, ELISA, hibridación de acidos nucleicos para la detección del material genético viral en muestras clínicas.

Microscopia Electrónica.- La ME es útil sobre todo para la detección de virus que desarrollan mal o no desarrollan en cultivos celulares, hoy en día se emplea para detectar rotavirus y otros virus probables agentes de gastroenteritis.

Serelogía Viral.- Ciertos virus, como los de hepatitis A y B, rubéola, sarampión y corona virus; son difícil de aislar en cultivos celulares y las infecciones causadas por ellos son diagnosticadas por técnicas serológicas. Se recomienda extraer una muestra de suero en el periodo agudo y otra en el periodo de convalecencia. Los métodos usados son las pruebas de inhibición de la hemaglutinación, neutralización, fijación de complemento, ELISA, etc.

Cultivo.- Diversos tipos de cultivos celulares se emplean habitualmente para el aislamiento de virus. Los cultivos celulares pueden ser primarios, de bajo pasaje o líneas celulares. Los cultivos primarios, por ejemplo, riñón de embrión de humano o de mono, son sensibles a los virus sólo durante uno o dos pasajes, mientras que los cultivos de fibroblasto diploides pueden mantener su susceptibilidad durante 20 a 50 pasajes. Las líneas celulares continuas como Hep-2 son sensibles a los virus aun después de más de cien pasajes. Las muestras se inoculan a las células, se incuban y luego el crecimiento y la identificación de un virus, se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular que se denominan efecto a acción citopático (ECP o ACP), estos ECP son cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de sincitios, cuerpos de inclusión. Otra forma de identificar en el crecimiento en línea celular es la hemoadsorción/hemoaglutinación de eritrocitos de cobayo, con frecuencia, la determinación del tipo, rapidez y selectividad del ECP o ACP en cultivos celulares es suficiente para permitir la identificación preliminar o definitiva de un aislamiento.

Material- Suero sospechoso HIV- Policubetas y recipientes para lavado- Micropipeta- Reloj- Reactivos- Láminas para la observación del ACP.

ProcedimientoInmunoensayo sobre soporte sólido para la detección de anticuerpos contra de inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2).

1. Deposite 2 gotas de diluyente de la muestra en cada pocillo a usar:

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2. Colocar 100 ul de control negativo, 100 ul de muestra suero problema y 100 ul de control positivo, cada uno en pocillos diferentes.

3. Colocar el peine en cada pocillo, dejarlo reposar por 10 minutos.4. Lavar5. Agregar 3 gotas de revelador en cada pocillo y colocar el peine por 10 minutos, lavar y observar.

ResultadoMuestra reactiva : Repetir por duplicado, si continua reactivo, confirmar con Western

Blot.Muestra no reactiva : Se presume que no tiene anticuerpo Hiv 1–Hiv 2Leer las láminas y observar ACP del virus.

Cuestionario

1. Que virus de importancia clínica pueden ser aislado en los sistemas celulares descritos.………………………………………………………………………………………..………………………...………………………………………………………………………………………..………………………...

2. Que virus de importancia clínica se diagnostican generalmente por serología.………………………………………………………………………………………..………………………...………………………………………………………………………………………..………………………...

3. Que virus de importancia clínica se detectan por la microscopia electrónica.………………………………………………………………………………………..………………………...………………………………………………………………………………………..………………………...

4. En que casos de posibles enfermedades virales es útil la citología.………………………………………………………………………………………..………………………...………………………………………………………………………………………..………………………...

5. Que virus de importancia clínica se diagnóstica mediante detección de antígeno.………………………………………………………………………………………..………………………...………………………………………………………………………………………..………………………...

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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Bendezú M, Guido. Guía de Prácticas de Microbiología. Ica. 1997

Delgado I. Alberto. Laboratorio Clínico. Microbiología. Primera Edición. España. 1994

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Mazzafero, Vicente. Medicina en Salud Pública. Segunda edición. Editorial Ateneo. Buenos Aires. 1994

Ministerio de Salud. Manual de Laboratorio del Cólera. N° 02. Tercera edición. Lima. 1997.

Ministerio de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de arbovirosis. N° 16. Lima. 1996.

Ministerio de Salud. Manual de Procedimientos de pruebas de sensibilidad antimicrobiana por el método de disco difusión. N° 30. Lima 2002.

Ministerio de Salud. Manual de procedimientos para el diagnóstico bacteriológico de Neisseria gonorrhoeae. N° 33. Lima. 2002

Ministerio de Salud. Manual de procedimientos de obtención de muestras para el diagnóstico bacteriológico en infecciones intrahospitalaria. Lima. 2002.

Ministerio de Salud. Actualización de la doctrina, normas y procedimientos para el control de la tuberculosis en el Perú. Segunda edición. Lima. 2001.

Ministerio de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico histopatológico N° 24. Lima. 1997.

Ministerio de Salud. Manual para la investigación de brotes de infecciones intrahospitalarias producidas por bacterias mediante métodos de biología molecular. N° 35. Lima. 2002.

Mins Planfair et al. Microbiología Médica. Primera edición. Mosby/Doyna. Madrid. 1995.

Sydney M. Finegold y Ellen Jo Baron. Diagnóstico Microbiológico Bailey/Scout. Sétima edición. Editorial Médica Panamericana. España. 1996.

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Pilar Guia Reuciente

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