ASESOR

TUESTO

Planta P i l . o t o d e Tecnología d e carnes.

20 de mayo d e 1 9 9 1

2 air-eaci6n y la temperatura en e l c rec imiento y en la producción de l a

&! inul inasa extr -acelular en la levadura Kluvvet-omvces marxianus, pot- medio d i 1

fermentaciones empleando como Chica fuente de carbono l a i n u l i n a , l a cual

es un polisacdt- ida de f ructosa e inductora de la enzima.

I

La enzima producida por- esta levadura ofrece interesante.

per-spectivas para la pr-oduccidn de jarabes puros de f ructosa empleandosq !

i n u l i n a y se ha comprobado que se obtiene un rendimiento del 95% d e

f ruc tasa.

Convenriomalmente la produccign de los jarabes fructosados es i

p a r t i r de almidón empleadose 3 enzimas diferentes que son l a 0C- amilasa, le

ami loy lucosidasa y l a glucosaisomerasa obteniendose un rendimiento del 457

de f ructosa y un 54% de glucosa, e l rendimiento de f ructosa se incrvanenta i

un 90% a l someter l a mezcla anter ior a una separación cromatográfica.

En cambio los jar-abes fructosados producidos a p a r t i r de i n u l i n a si

emplea s ó l o una enzima, la inul inasa, obteniéndose un mayor rendimiento d{

fr-uctosa en un solo paso. Considerando que el consumo de l o s jarabe{ I

fructosados se ha incrementado remarcablemente en especial en los Estado

Unido+ y que además se ha comprobado que la fructosa posee un mayor pode

edulcorante que la sacarosa y es más saludable porque no causa problema: 4

4 relacionados a l a c a r i e s , la ar te roesc le ros is o l a d i a b e t e s , enfermedader

provocadas pot- e l a l t o consumo de sacarosa; los jarabes frurtosado!

producidos a p a r t i r de i n u l i n a se p e r f i l a n como una buena opción a n i v e

industr - ia l .

La inulina se o b t i e n e a partir" de plantas como la alcachafa dE

Jerusalem, l a da l ia o el maguey, ksto podria implicat- un uso f u t u r o del

La levadura emp1.eada en el pt-oyecto se denamina X-luyveromyced

marxianus vat-. marxianus. La cual se conoce d e s d e 1900 por Lirtder quieri

observo s u habilidad de fermentat- vigorosamente la inulina. Estas

obser-vac i ones f uerm conf i t-madas y amp 1 iadas por Graf e y Vouk ( 1919) , poq i

Kluyver (1914) y por Sacrhett i 11933). (1) I

&

Can b a 5 e en la r l a s i f i c a c i o 5 d e levaduras d e Loddet- ( 197w, se s a b e

que e l microorganismo Kluvveromyces marxianus_ es una levadur-:

ascosporogena, perteneciente al grupo de l o s Eucomyta d e l t i p c

Hemiascomycetes q u e pertenece a los Ascomycotina. Es del order

endomyretales; d e la familia Sacccharomycetaceae y subfaii 1 i ;

Saccharomycetoideae; d e l génet-o Kluyveromvces y de la especie mar-xianus. (2;

PI-oduce d e 1 a 4 ascosporas; su for-ma va d e t-enifavme a medii

luna, puede fermentar glucosa, galactosa, sacarosa, raf inosa, D-xilow E

inulina; puede asimilar galactosa, sacarosa, celobiosa,

rafinosa,' D-xilosa, L-arabinosa, D-manitol y acido succínico. No asimil '

nitrato; no crece e n 50%(p/p) d e glucosa y extr-acto d e levadut-a, crece

lactosaI

o 37 c. (2)

La inulina 5e empleo/ como unica f u e n t e d e carbono para llevar a cabc

la; fermentaciones. La inuliha es un poll'mero d e fr-uctosa que 56

encuentra como Ineserva d e carbohidrato en las plantas Composjitae \

Gramineae. ( 3 ) E l nombre se der-iva d e l genero Inula (blant) de la :

Compositae. Plantas como la a lcachafa d e . Jerusalem, d a l i a , card6n

L a inulins y a n á l o g o s d e l a misma san p o l i f r u c t a n o s , q u e c o n s i s t e n e r

u n a c a d e n a l i n e a r - en l a c u a l las moleculas d e 1 1 - f r u c t o s a e s t a n u n i d a s

p o r u n a u n i o n o((2-1). A l f i n a l de l a c a d e n a se e n c u e n t r a u n a molécula d4

glucosa u n i d a a l resto d e l a m o l e c u l a p o r el mismo e n l a c e . E l n6met-o d5

u n i d a d e s d e f r u c t d s a es a l r e d e d o r d e 30. La l o n g i t u d de l a c a d e n a dE

i n u l i n a v a r f a e n f u n c i d n de la p l a n t a de d o n d e se e x t r a i g a y l a e s t a c i 6 r

d e l año; i n c r e m e n t á n d o s e SLI l o n g i t u d e n las e s t a c i o n e s cál idas y se reducE

a l f i n a l d e éstas, este f e n o m e n o se cree se d e b e a l a a c c i ó n d e 1 ;

i n u l i n a s a p r o p i a d e l a p l a n t a . (3)

L a i n u l i n a p r e s e n t a un peso m o l e c u l a r a p r o x i m a d o e n t r e 3500 y 5300,

e& i n s o l u b l e en agua f r í a , es l i g e r a m e n t e s o l u b l e (3% p / v ) e n a g u a i C) O

cc 43 C. (3) L a molécula p r e s e n t a u n a r o t a c i ó n dB MID-40 . ( 4 )

di, L a i n u l i n a s a es p r o d u c i d a por K l u y v e r o m y c e s m a r x i a ' n u s a s f como p o

h o n g o s , bacter ias y otras levaduras. E x i s t e n i n u l i n a s a s que se o b t i e n e n ,

p a r t i r d e p l a n t a s q u e p u s e e n i n u l i n a como carbohidrato d e reserva; a esta!

i n u l i n a s a s se les c o n o c e como i n u l i n a s a s verderas p o r q u e solo d e g r a d a n I (

i n u l i n a . En cambio, l a s i n u l i n a s a s o b t e n i d a s a p a r t i r de m i c r o o r g a n i s m o :

t i e n e n l a capacidad d e deyradat- t a n t o l a i n u l i n a como otros o l i g o s a c d r i d m

como l a sacaroz;a, por lo q u e se les c o n o c e como i n u l i n a s a s falsas.

h i d r o l i z a b a n l o s mismo5 a z u c a t - e s . F i n a l m e n t e 1 0 5 trabajos d e Adams e_.. al. en 194.3 (41, S n y d e r y P h a f f e n 1960 y 1962 ( 4 ) ( 5 ) y de R o b e t - t J,;

R o w w e n h o r s t & al, e n 1990 (6) demostraron que l a , i n u l i n a s a e5 d i f e r e n t e q

l a i n v e r t a s a .

K l u y v e t - a m y c e s m a t - x i a n u s p r o d u c e 2 t i p a s d e i n u l i n a s a : un 2

i n t r a c e l u l a r , l a c u a l se e n c u e n t r a l i g a d a a l a p a r e d ce lular ; y u n i

e x t r a c e l u l a r , q u e es arro jada a l medio d e f e r m e n t a c i ó n d o n d e c.rece el 1

m i c r o o r g a n i s m o . Ambas a n z i m a s t i e n e n c a p a c i d a d h i d r o l f t i c a s o b r e i n i t l i n a ,

sacarosa, e s t a q u i o s a y r a f i n o s a . ( 7 ) E l pH Ópt imo d e ambas e n z i m a 5 es dE

4 . 5 . S e m a n t i e n e n estables e n un rango de pH e n t r y 2.0 Y €3.~:) Y 5c)r

i n e s t a b l e s a valores mayor-es a 8 . 5 . S u t e m p e r a t u r a Ópt ima es ' a 55 C

p e r a 5 u a c t i v i d a d sobre i n u l i n a decr-ece r a p i d a m e n t e a r t - i b a d e l o s 60 C

4 O

O

sobre i n u l i n a (71, s i n embat-go s u a c t i v i d a d s o b r e sacarosa 5e m a n t i e n e a l t i

a t e m p e r a t u r a s a r r i b a d e 70 C. (8) O

L a p r o d u c c i ó n d e la i n u l i n a s a i n t r - a c e l u l a r 5e l l e v a a cabd

p a r a l e l a m n t e a l c r e c i m i e n t o c e l u l a r y d i s m i n u y e c o n la a u t 6 l i s i s d e lar

c 6 l ~ t l a s , mientras la i n u l i n a s a i n t r a c e l u l a r se va a c u m u l a n d o e n e l medi(

un poco a b a j o d e l c r e c i m i e n t o c e l u l a t - y se i n c r e m e n t a e n la false dc

m u e r t e . ( 7 )

L a i n u l i n a s a e x t r a c e l u l a r t i e n e u n a masa m o l e c u l a r e n t r e 335 y 454

KDa, c o n s i s t e d e 4 s u b u n i d a d e s d e p r o t e f n a (forma tetrame)r.ica), p r e s e n , t ;

alt-ededot- d e l 26 y 37 % d e s u masa como c a r b o h i d r a t o ( m a n o s a l u n i d o s a l i

a s p a r a g i n a . ( 6 ) (9)

E l papel f i s i u l oq i c o de l a i nu l inasa e5 el rompimientc) de lac:

fructanas fuera de l a enzima, ya que estos polímeros na pueden penett-at- h

traves de l a pared celular. ' La inulinasa ac tua sobre l a uni& % - 2 , l de 1;

inu l ina asf cornu en los enlaces N!", 1 de otros o l igosacar idos; pat- e$

t ipa de enlace que h i d r o l i z a s e l e conoce como 2,l-o(-D-ft-uctan-ft-uctana-.

hidt-olasa (E .C .3 .2 .1 .7 . ) pero se le conoce gendricamente como o(-

fructofuranosidasa.

/

/

De todas 105 géneros de la5 levaduras Kluyveromv~es, parece ser ~ U E

la especie marxianus es la que presenta un mayor rendimiento en 16

production de inulinasa. Snyder y Phaf f en 1961:) ( 1 ) indicaran que e l medic

debe set- aireado para que la producción de inulinasa sea favorecida as;

coma el crecimiento del microorganismo,

/

Se ha r-eportado l a producribn de l a enzima inul inasa en cultivo:

intermitentes y continuos de l a levadura Eluvvromvces marxianus. En lo:

cultivos intermitentes reportados, se trabajan tempet-aturas entr<e 28 a 30

a . pH 5.0 entre 220 y 280 RPM. ( 1 0 ) (11) (12) En los medios; que contenfar

c

inu l ina como fuente de carbono presentaron mayor producc ibn ds

inu l inasa 'en comparación con otras fuentes de carbono como l a glucosa0

fructosa, sacarosa y lactosa, estos Últimos produjeron bajos rendimiento!

de l a enzima debido a l a represi.Ón catabóllca que l e producen a

microorganismo. S i n embargo por e l a l to cos to de l a i nu l i na no e'

rentable su uso para la producción de l a i nu l i na sa a n i ve l i ndus t r ia l .

El cu l t i vo contfriuo a baja5 concentraciones de sustr-ato se hr

presentado comb una alternativa para la producción a nive l industr ia l de l..

enxima, a un menor- costo ya que se emplearfa fuentes de carbono mar

baratas coma l a cjacarosa.

J

calcul.aba extrapulando lecturas de absurbancia sobre curvas patrdr-

esspec I’f ].cas /

2.2. 1. 1.. Cut-va pa t ron de reduc tores para inu l ina .

Se preparo’ una soiuciÓn con 2.59 de fructosa:

pa ra que con d i ferentes concentrac iones de l a misma se cubriera un rango dd

I

I

c:t a 2.777Amoles/ml.

. -BPI L. .L. 1.2. Curva patrgn de reductores para sacarosa.

Se p r i p a r ó una solució’n equimolar con 2.59

2.2.2. Preparación de los t-eactivos Nelson y Somoyyi.

2.2.2.1. React ivo Somogyi.

2 .2 . , 2 .1 . i. React ivo No. 1

- 800 m 1 de aqua d e s t i l a d a

- 255 de car-bonato de sodio anhidro

I

de

u r

- 259 de ta r t r -a to de sodio-potasiol

t e t r a h i d r o ~,

- 2Og de bicarbonato de sod i0

- 2130g de s u l f a t o de sodio anhidro

Una vez d i sue l tas l as sus tanc ias en l o s 800 m 1 de agua se aforaron

cm 1 it ro.

2.2.2.1.2. React ivo No.2

- 200 m1 de agua d e s t i l a d a

- 305 de s u l f a t o de cobre pentahidratac

E l r -eact ivu Somogyi SP compone de 25 ml del t -eact ivu No. S y S m1 d e l

r e a c t i v o No. 2.

.

2.2.2.2. Reactivo Nelson.

-3 d . 2 . 2 . 2 . 1 . React ivo No. X

- 450 m 1 de aqua d e s t i l a d a

- 21 m1 de .&ido s u l f d r i c o

.- zsg de mol i bda to

t e t r a h i d r a t a d o

2.2.2.2.2. React ivo No.2

- 23 m 1 de agua d e s t i l a d a

- 3y de at-seniato

septahidratado

concentrado

de amon i c

de sodic

minutos.

2 . 2 . 5 . DeterminacioL de airutares reductores por e l mgtodo dc

Nelson-Somogyi. I i

- Se agrego' 1 m1 d e l r e a c t i v o Somogyi a los tubos de ensay

- Se l e a d i c i o n ó 1 m 1 de muestra a cada tubo y se a g i t a

1

A l tubo de blanco

- Se colocaron los

ebu 1 1 i c i Ón duran t e

se le a d i c i o n ó 1 m 1 de agua.

tubos en un baño con agua el

20 minutos.

- Se de ja ron en f r i a r l os t ubas y se l e5 ad i c ionó 1 m

d e l reac t i vo Nelson agitando Vigorosamente.

- Se l e s a d i c i o n ó 17 m 1 de agua y se ag i ta ron nuevamente.

- Se leyeron los tubos a 25Onm con t ra e l b lanco .

2.2.4. Medicia 'n d e a c t i v i d a d e n z i m a t i r a .

- E l s u s t r - a t o es i n u l i n a Q sacarosa a l 4% e n b u f f e r dE

acetatas (3. 1M a pH 5 .0 .

- Se c o l o c a r o n 9 m 1 d e s u s t r a t o e n u n t u b o d e ensay9 c)

d e n t r o d e un b a ñ o a SO C.

- Se le a d i c i o n o 1 m 1 d e e n z i m a a l t u b o con s u s t r a t o ,

t o m a n d o m u e s t r a s a d i f e r e n t e s tiempos ((3.5, 1 , 2 , 3 , 4 , E

m i n u t a s ) .

/

- Se d e t e t - m i n a r o n a z u c a r e s r e d u c t o r - e s por el método dE

N e l s o n - S o m o y y i .

- Con l a s l e c t u r a s o b t e n i d a s y c o n l a curva p a t &

a d e c u a d a , se o b f ; i e n e n l a c a n t i d a d d e pmoles/ml dE

f t - u c t o s a , e n el ca50 d e l a i n u l i n a , o depmoles/rn'l dE

f r u c t o s a y d e x t r o s a , e n el caso d e d e l a s a c a r - u s a .

2 .3 . D e t e r m i n a c i o n d e biomasa. #

- Se tomo) 1 m l d e l medio d a n d e este'disiuelta la l e v a d u r a .

- Se d i l u y ó 1 : 10 y se leya'a 650nm.

- Cuando las l e c t u r a s d e a b s o r b a n c i a f u e r o n mayores a (:).Snm S

d e b e h a c e r ctna d i l u c iÓn mayor-.

- Las l e c t u r a s d e a b s o r b a n c i a o b t e n i d a s se e x t r a p o l a r o n e n un

c u r v a p a t r 6 n d e a b s o r b a n c i a c o n t r a peso seco d e l e v a d u t - a e n g / l

2.4. C o n d i c i o n e s d e c u l t i v o .

2.4.1. F r e p a r a c i Ó n d e l medio d e c u l t i v o .

- Se p r e p a r o u n a s o l u c i o n c o n 1% d e i n u l i n a ( p / v ) y (3.5% dt e

e x t r a c t o d e l e v a d u r a < p / v ) .

- Se a j u s t o e l pH a 5.0 con & i d o acgtico d i l u i d o . #

#

p r - e s i o n .

- D e este medio d e c u l t i v o se tomÓ p a r a el media d E

2.4.2. T e c n i c a d e i n o c u l a c i ó n .

En e l medio d e i n o c u l a c i o n Eje le a g r e g a r o n #

s u f i c i e n t e s asadas d e l medio s 6 l . i d o d o n d e se propa& l a l e v a d u r a ,

o b t e n e r 1.028 g / 1 como m í n i m o e n e l medi'o d e i n o c u l a c i g n .

CI L . S . D e t e r m i n a c i ó n d e l efecto d e l a a i r - e a c i o ' n .

- En c u a t r o matraces E r l e n m e y e r d e 5W) m 1 se v i r t i e r o n 50,

170 y 250 m 1 d e l medio d e c u l t i v o . T o d o se realirÓ p o r d u p l i c a d c

y s e p r o m e d i a r o n 1 0 5 valores o b t e n i d o s .

-- S e le5 a d i c i o n o a cada matraz e l 5% d e l m e d i a d e i n o c u l a c i ó n cor /

respecto a su v o l u m e n . O

-" Se i n c u b a r o n los matraces a 30 C y 2OC) R. F . M . d u r a n t e 25

horasj.

- Se t o m a b a n 3 m1 d e l medio d e f e r m e n t a c i d n cada 2 horas

e m p l e a n d o s e 1 m 1 para l a m e d i c i g n d e biomasa y las 2 m

r e s t a n t e s se c e n t r i f u g a b a n a 5006 R.P.M. d u r a n t e 15 m i n u t o s .

- A l s o b r e n a d a n t e o b t e n i d o se emplecf para la d e t e r m i n a c i ó n d

a c t i v i d a d e n z i m a t i c a e m p l e a n d o i n u l i n a como s u s t r a t o .

2.6. D e t e r m i n a c i ó n d e l efecto d e la temperatura. O

- .Se p r o b a r o n 4 t e m p e r a t u r a s d i f eren tes, 30, 3 5 , 40 y 45 C.

- En matraces E r l e n m e y e r d e 500 m 1 se le5 a d i c i o n o ' 60 m 1 d e l medit

d e c u l t i v o .

- Eje l e a d i c i o n g a cada m a t r a z 2 . 5 m 1 d e l medio de i n o c u . l a c i o n . /

cot-t-espandx'a durante 72 horas.

- Se tomaban 2.5 m1 de mcrestra del medio de fermentacidn cada t

horas. 4

- 1 m1 5e empleo para la medición de biomass-

El 1.5 m1 restantes se centrifugaban a 3000 R.P.M. durante X :

minutos.

- El aobrenadante obtenido se emple6 para la determinacidn de 1;

actividad enzimatica empleando sacarosa como 5ustr-ato. 1

1 1 1 . Definiridn de terminos.

3. 1. Unidad enzimática.

Una unidad de actividad de inulinasa se entiende p o r 1;

prodcrcciofh d e 1 fimo1 de t-eductor-es por minuto ( U . I . ) en las' condiciones de

la determinacidn.

3.2. Actividad específica.

E5 el cociente entre la actividad enzimatica y 1 4

biomasa correspondiente, se da en U.I./g.

3.3. Productividad enzimática:

E5 el cociente del valor de actividad enzimátira mayor y et ~

1 tiempa correspondiente en horas, se da en UI/h.

3.4. Productividad de biomasa.

E5 el cociente del valor de biomasa mayor y el tiempc

corre5pandiente en haras, 5e da en g/l.

~ -~

I

WTIVIDADES RECILIZfiDCSS

ju1. i .u -- ayasta: R e v i s i ó n b i b l i o g r s f ica.

septiembre - a c t u b r - e : E s t a b l e c i m i e n t o d e t é c n i c a s .

enero - febrero :

1

D e t e t - m i n a c i a ’ n d e l efecto d e l a t e m p e r a t u t - a .

m a r z o - a b r i l : R e a l i z a c i ó n d e l reporte f i n a l .

OBJETIVOS Y METCIS ALCANZCIDAS 1 1

Se d e t e r m i n a r o n t a n t o e l efecto de l a aireación como e l efecto d e l 4 .I

i t e m p e r a t u r a e n l a p r o d u c c i ó n y c r e c i m i e n t o d e l a l e v a d u r a K l u v v e r a m v c e ,

pr-oyecto.

~

(13) l a s temperaturas Óptimas para biamasa y rendimiento de l a enzima S E

comprenden entre 26 y 30 C tanto para el cultiva tipo intermitent€

como para el continuo. Un t-ango de pH entre 3.5 a 6.0 no afect; I[

praduccion de l a enzima, aunque e l n i v e l de biomasa fue ligeramente mayor'

a

#

# a pH 6.0 que a pH 3.5, y l a t en s i on c r í t i ca de oxígeno para la formacibn de

l a enzima es menor a l 2.5%.

i Por- o t r w lado, Robert J. Houwenhorst & en 1988 (8) reporta 'i

que obtuvieron una mayot- producción de inu l inasa en temperaturas entre 37 4 42 C donde aparentemente el rango de temperaturas de optima producción da

l a enzima corresponde a l a dptima temperatura de crecimiento de 1;

o . #

I

levadura, ademas indicaron que hay una mayor cantidad de inulinase

extracelular a temperaturas abajo del rango de temperatura Óptima y un;

reduccio'n de enzima extbacelular. Lo contrar io sucedió a temperatura:

mayores al rango de temper-atura Óptima.

Los procesos industr ia les que emplean invertasa de levaduras, oper-ar

frecuentemgnte a temperaturas arriba de l o s 55 C, la cua l esta arr iba de 1:

temperatura Óptima de la inulinasa. GrootWassink y Fleming en 1979 ( í e ;

trabajaron con invertasas e inul inasas a 55, 60, 70, 7 5 y 80 C: con un

concentración de sacarosa del 60% p/v, observaron que ambas enzima5 puede

trabajar a esa temperatura ya que l a concentración de sacarosa las protej i

de la desnaturalizaeidn por- ca lor y comprobaron que l a i nu l i na sa fue' l a má4

termoestable y l a que desar ro l ló un mayor rendimiento de h i d r d l i s i s dt

O

o

sacarosa que la invertasa.

OBJETIVOS GENERALES

E r j t u d i a t - l a i n f l u e n c i a d e la a i r e a c i 0 . n ,y t e m p e r a t u t - a e n l a p r o d u c c i a ' n

d e i n u l i n a s a y crecimiento d e t : : : luvv,t-omvces mawxianus. f OBJETIVOS ESPECIFICOS

E s t a b l e c e r c o n d i c i o n e s d e aireación en el q u e la l e v a d u r -

K l u y v e t - o m y c e s m a r x i a n u s t e n g a u n a mayor p r o d u c c i d n d e l a i n u l inas

e x t r a c e l u l a r . 1

E m p l e a n d o las c o n d i c i o n e s d e a i r e a c i 6 n anteriores e n c o n t r a r und

t e m p e r a t u r a especff ica d o n d e se i n c r e m e n t e la p r o d u c c i d n d e i n u l i n a s a .

MATERIAL Y METODOLOGIA UTILIZADA

I . M i c r o o r g a n i s m o : K l u v v e r o m y c e s m a r x i a n u s v a r . m a r x i a n u s d e la coleccia'd

d e l C e n t r o d e I n v e s t i g a c i ó n d e E s t u d i o s Q v a n z a d o 5 d e l I.P.N. CDBEL278.

11. T & n i c a s empleadas.

2 .1 . C o n s e r v a c i ó n d e l m i c r o o r g a n i s m o .

Se c o n s e r v 6 e n t u b o s i n c l i n a d o s d e a 9 a r - p a p a - d e x t r o s a .

#

2.2. D e t e r m i n a c i o n d e a c t i v i d a d e n z i m a t i c a . 0

Se d e t e r m i n g la. a c t i v i d a d e n z i m á t i c a m i d i e n d o e l i n c r e m e n t o d

g r u p o s red~tctot-es pot- el m&todo d e N e l s o n - S o m o g y i , e m p l e a n d o sacarosa / i n u l i n a como s c t s t t - a t o .

2.2.1. C u r v a s p a t r ó n .

La c o n c e n t r a c i ó n d e r e d u c t o r e s 5e d i Ó e n pmoles/ml q u e SE

144831

RESULTADOS Y DISCUSION

I . I n f l u e n c i a d e l a a i r - e a c i Ó n .

En' l a qra'f i c a de p r o d u c c i ó n d e biomasa (l. 1 . 1 se p u e d e o b s e t - v a t - qu(

el comportamiento d e las c u a t r o c u t - v a s es not-mal, su fase ewponecial iAici

irn poco antes de l as b horas y f i n a l i z o a l a s 12 horas , s i n embargo 1 7

c u r v a d e l m a t r a z c o n 50 ml d e medio p t - @ s e n t Ó un. i n c r e m e n ' t o a p a r - t i t - d e la4

16 horas.

. 4 0 i

I

I

La mayor p r o d u c c i ó n de biomasa f u e d e 7.9 g i l , a l f i n a l i z a r - l a .fase

e x p o n e n c i a l , d e l m a t r a z c o i 50 m1 d e medio e l c u a l f u e el v o l u m e n dd

trabajo m e n o r pero permitid t e n e t - u n a mayor area l i b r - e d e n t r o d e l matt-ar,

ést0 conf i rma q u e la l e v a d u r a crece e n c o n d i c i o n e s aerobias.

..

Con respecto a La p r o d u c c i d n e n z i m a t i c a (gráf ica i . 2 . ) , se abser -va

q u e a l a s 1 6 horas t o d a s l a s c u r v a s p r e s e n t a n su p u n t o m g x i m o , sierido l a

mas notable la c o r r e s p o n d i e n t e a l a c u r v a d e 50 m 1 c o n 0.63 UI/ml; d i c h q

c u r v a e5 l a d n i c a q u e p r e s e n t a i n c r e m e n t o s y d e c r e m e n t o s en su p r o d u c c i & j

m u y p r a u n c i a d o s , además t u v o u n s e g u n d o i n c r e m e n t o d e 0.52 UI/ml a p a t - t i

de l a s 18 horas, éste se d e b i ó a l a e l e v a c i ó n e n la c a n c e n t r a c i d n d

biomasa e n ese mismo p e r f o d o d e tiempo.

A l o largo d e l a f e r m e n t a c i ó n , t a n t o e n la p r o d u c c i d n d e biamas

como d e a c t i v i d a d e n z i m á t i c a , l a c u r v a d e 50 m1 se e n c u e n t r a a r r i b a d

todas, s i g u i e n d o l e l a c u r v a de 100 m l , d e s p u e s la d e 170 m 1 y f i n a l m e n t e l(

d e 250 m l . E s t a s tres ~11timas curvas m u e s t r a n u n desarr-ol l o simi lar- per t

c a n diferencia n o t o r i a c o n respecto a l a d e 50 m l . ' E s t a d i f e r e n c i a se debe

p r o b a b l e m e n t e a q u e 1 0 5 v o l t h e n e s d e l medio de f e r m e n t a c i d n r e d u c f a n er

cada m a t r a z e l at-ea libre por- lo q u e l a d i s p o n i b i l i d a d d e l o x f g e n o P P ~

i

Fur otr-o lado, lac; curva? d e a c t i v i d a d especif ica (grá f i ca 1.3.)

muestran que l a s c u a t r o c u r v a s p r e s e n t a n un desarro l lo similar a lo

d e l a f e r m e n t a c i c h ; t i e n e n su p u n t o ma’ximo a l a s 16

c o r r e s p o n d i e n d o l e el v a l o r mas a l t o d e 74.62 UI/g a l a c u r v a d e 3:) m l . Sir,

embargo se o b s e r v a u n a d i f e r e n c i a muy (;equeFia en la5 c u r v a s entre ése4

n o s i n d i c a que la r e d u c c i b n d e l a a i r e a c i d n n o es un factor que i n f l u y a er

l a p t - o d u c c i 6 n d e i n u l i n a s a , como s u c e d e c o n l a p r o d u c c i c h d e p e c t i n a s a s pot

l a m i s m a l e v a d u r a e m p l e a n d o tomo f u e n t e d e carbono l a pectina. ( 1 4 ) E s t c !

c o n f i r m a l o o b s e r v a d a p o r S n y d e r y F h a f f e n 1962 (3) en c u l t i v a s dE I

K l u v v e r * o m v c e ? s m a r x i a n u s s i n a i r e a c i 6 n q u e m u e s t r a n un c r e c i m i e n t o p o b r e )

baja p r o d u c c i o ’ n d e i n u l i n a s a .

a r 7

horasi

P o r l o que podemos decir q u e l a p r o d u c c i ó n d e biomasa es i n v e r s a m e n t 5

p r m p o r c i o n a l al v o l u m e n de f e r m e n t a c i ó n empleada y e n c o n s e r u e n c i ;

i n c r e m e n t a n d o s e l a a c t i v i d a d e n t i m á t i ’ c a t o t q l .

1 1 , I n f l u e n c i a d e l a t e m p e r a t u r a .

O b s e r v a n d o l a gráfica 2.1 l a c u a l m u e s t r a e l c r e c i m i e n t o d e 1;

l e v a d u r a a d i s t i n t a s t e m p e r a t u r a s , es n o t a r i o q u e l a mayor p r o d u c c i ó n dc

biomasa es a 50 ? p r e s e n t a n d o un c r e c i m i e n t o m a x i m 0 a las 48 horas; cor

36.31 g / l , p o s t e r i o r m e n t e decrecib d r a s t i c a m e n t e . C o n las 0tr-a:

t e m p e r a t u r a s se obtuvo l a mayor p r o d u c c i ó n alrededor d e l a s 18 y 30 horas ,

I o

p a s a n d o este i n t e r v a l o c o m e n z d su fage e s t a c i o n a r i a .

La fase e x p o n e n c i a l d e las c u a t r o c u r v a s i n i c i ó a las 6 horas,

t e r m i n a n d o a l a s 3 3 horas a l o s 35, 40 y 45 C , a las 36 C t e r m i n o ’ a l a s 4t

horas ; el desarrol la d e l a s primet-as tres a l o largo d e l a f e r % m e n f a c i Ó n f u c

O o

nopfnal, en cambio a los :300C el cornpot-tamiento de la cut-va no es nor-mal,

deb ido probablemente a et-t-ores experimentales. Sin embargo, se puede dec i r

que l a s tempet-atut-as de 3:) y 4C) C son adecuadas para l a mayor producción d f

biamasa. E s to se puede ver en l a g r g f 'ica 2.6, en donde e l p i co ma/:.:ima $4 obtiene a 3:) C y e l segundo a l o s 40 C. S i n embargo, en la productiv idad dl

O

t

O O I

O siguiendole un poco l a pt-oductividad a l o s 35 C con. 0 .bZ g / l . h ,

finalmente con valores no arr iba de 0.3, , l a s tempet-atut-as de 40 y 45 C:

EsLu nos indica ylte 30 C es l a temperatura Óptima para la producción d$

b i omasa.

O

o

I 1 I

I

I

o 1 Pot- o t r o lado, l a mayor activ idad de inul inasa fue a l o s 95 C c a r

3.44 UI/ml, l a segunda mayor producción fue a 40 C con 2.15 UI/ml, en lac

otras dos temperaturas se obtuvo una producción no mayor- a 1 UI/ml (gr-zffica

2 . 2 . 1 , l a producción máxima alcanzada a 33 C e s 11.47 veces mayor a l valor

ma':.: imo obten ido a 50 C. Para todas las temper-aturas, siu má:.:imq

pt-oduccio'n se d io ent re l a s 24 y 30 horas, este inter-valo coincide cod

O

O

O

e l f i na l de l a fase exponencial de l a levadura (grafica 2.1.1, la act iv idaq

enzimatica despues de este intervalo disminuyó posiblemente debida a un

lisis celular.

8

O

Esto Último no se d i d a l o s 313 C en donde l a actividad enrimática 5

detuvo aparentemente a l a s 30 horas y s i n embargo l a pt-oduccicftn de biomas

s i g u i 0 incrementgndose. E s to se debid probablemente a que la cantida

i n i c i a l de enzima producida fue la suficiente para mantener a

microorganismo durante toda l a fermentación, ya que 5e pudo comprobar 1

presencia de l a enzima en e l sobrenadante de l a muestra de l a s 30 horas

3:) C rea l i zando l a detet-minacid" de la act iv idad enz imit ica a tiempos ma

0

O

4

O

Se puede d e c i r que 35 C es l a temperatura Óptima para l a producci6r

de la inu l inasa ex t race lu la r . Es ta tempera tura co inc ide con la repor tadq

con H. J. Rouwenhorst & en 1988 '(9) que a temperaturas menor-es a

i n t e r v a l o de 37 y 42 C se obtienen una mayar cant idad de i nu l i nas . 1 ext race l \ " \ ia r , gs to mi,smo se puede obset-var mas claramente-. en las g rá f i ca .

2.5. y 2 . 4 . , donde a l o s 35 C se se obtuv ieron los puntos ma:.:imos er:

produc t iv idad y a c t i v i d a d máxima enzimática. Cabe señalar que a los 40 C SE

obtienen valores siempre abajo a l o s de 35 C, e'sto i n d i c a que 40 C puedcl

I

Q

O <

O

O O

ser- una segunda opci6n con l a que 5e obtengan una buena product iv idae

enzimst ica, a pesar de que se'obtenga una ba ja p roduc t iv idad en l a biomasa. 1

Con respecto a l as ac t i v i dades espec r f i cas (g ra f i ca 2.3. ) , todas la.-

curvas a l i n i c i o de l a fermentacio% siguen un desar ro l l o d i f e ren te , exceptc

las curvas de 40 y 45 C que a p a r t i r de l a s 36 horas presentan ur

d e s a r r o l l o s i m i l a r . La curva a los 35 C e5 ta po r a r r i ba de las o t r a s ?

O

O

habiendo una d i f e r e n c i a de va lo res muy considerable;, e l valor- maximo 5~

alcanzo a los 35 C a l a s SO horas con 466.39 UI/g e l c u a l es 13.63 vecec

mas grande al v a l o r ma>:imcr alcanzado a 3:) C.

8

8 o

/ O

La5 d i fe renc ias t a n considerables ent re las cuat ro curvas hac

suponer que l a temperatura es un factot- que i n f l u y e en l a produccidn de 1

i n u l i n a s a e x t r a c e l u l a r . .

12 11 10 8 8 7 6 5 4 3 2 1

graflca 1.1 EFECTO DE LA AEREACION EN LA

PRODUCCION DE BIOMASA

biomasa (g/l)

"vol 50 ml

+ vol 100. m1

x- vol 170 ml

*vol 250 ml A-

tiempo (h)

~

grafica 1.2 EFECTO DE LA AEREACION EN LA

PRODUCCION DE ENZIMA

actividad (Ul/ml) 0.7 r

t 0.6 -

0.5 -

0.4

0.3

0.2

o. 1

-

0 -

*-vol 50 ml

+VOI 100 m1

-

6 a 10 12 14 16 18 20 22 24

tiempo (h)

-

I

\v

80

70

60

SO

40

30

20

10 CJ

grafica 1.3 EFECTO DE LA AEREACION EN LA

ACTIVIDAD ESPECIFICA

act. esp. (Ul/g biornasa)

*vol 170 ml

*vol 250 ml .

8 10 12 14 16 CL

tiempo (h)

18 20 22

temp. 30 C, pH 5. . " " ~

.., ..

grafica 2.1 INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN

LA PRODUCCION DE. BIOMASA

40

30

20

10

03 I

biomasa (g/l)

30 40

tiempo (h)

20 50 60 70

60 ml. DH 5

4

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

grafica 2.2 INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN

LA PRODUCCION DE ENZIMA

actividad (Ul/ml)

-30 C

O

tiempo (h)

500

400

300

200

1 O 0

grafica 2.3 EFECTO DE LA TEMPERATURA EN

LA ACTIVIDAD ESPECIFICA

act. esp. (Ul/g biomasa)

c.r o - - b b " o 10 20 30 40 50 60 70 CI tiempo (h) a0 w

-

v a 60 ml, pH 5.

4

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

grafica 2.4 ACTIVIDAD ENZIMATICA MAXIMA A DIFERENTES TEMPERATURAS

O 29 31

401. 60 ml, pH .. ~ . 5.

33 35 37 39 41 temperatura ( C)

43 45 47

.. .

grafica 2.5

Om12

Om 1

O. 08

Om 06

Om 04

Om 02

O

60 ml, .

PRODUCTIVIDAD ENZlMATlCA A DIFERENTES TEMPERATURAS

produc. enz, (UI/ml h)

L I I I I I I I I I -

29

PH 5.

30 31 32 33 34 35 36 37 38

-

I I I I I I I I I

39 40 41 42 43 44 45 46 47

temperatura ( C)

40

30

20

10

c

. . ."

arafica 2.6 BIOMASA M"WIMA PRODUCIDA A

DIFERENTES TEMPERATURAS

I I I I I I I I J I I I I I

3 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 I I I I

temperatura ( C)

vol. 60 ml, pH 5.

grafica 2,7 PRODUCTIVIDAD DE BIOMASA A DIFERENTES TEMPERATURAS

produc. biomasa (g/l h) 0,8

0.6

0.4

0.2

v 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47

temperatura ( C)

vol. 60 ml, pH 5.

CONCLUSIONES

La ait-eacinn / no es un factor que in f luya en l a producci&n de l a

inl l l inasa extracelular, solo es una condición necesaria para que la

levadura pueda crecer y por consiguiente producir la enzima.

O

Con 1-especto a l a temperatuya, a l o s 30 C se obtuvo una a l ta

productividad de biomasa pero con una productividad enzimdtica m u y baja. F

l o s 35 C . 5e obtuvo la segunda mayor productividad de biomasa y l a mayor. O

O

productividad enzimatica, por lo que 35 C e s l a tempet-atura optima / para l a

producción tanto de l a inulinasa extracelular-, como de l a biomasa.

i

F o r lo tanto, la temperatura e s cm factor determinante tanto en l e

produccich de la i nu l inasa ext race lu la r coma en l a producción de biomasa.

"_

RECQMENDWIONES

I . E f e c t o d e l a a i r e a c i o n . 4

- D e b i d o a que se r e a l i z a b a n f e r m e n t a c i o n e s de 20 horas se t u v o l a

n e c e s i d a d d e r e a l i z a r l a s de forma desfasada, esto p r o v o c a b a errores en

c u a n t o a l a c o n c : e n t r a c i d n d e m i c r o o r g a n i s m o s . P o r l o q u e creo c o n v e n i e n t €

que la i n o c u 1 a ; i Ó n d e la l e v a d u r a se realice c o n p i p e t a s a u t o m á t i c a s y a s í

d i s m i n u i r e l r a n g o d e error.

- C o n s i d e r o q u e el tiempo d e f e r m e n t a c i o n d e 20 horas n o f u e s u f i c i e n t e , ,

ya que cam$ se p u e d e o b s e r v a r - e n l a s gr i f f i cas 1 . 1 . y 1.2. d e c r e c i m i e n t c

d e l m i c r o o r g a n i s m o y d e p r o d u c c i a n d e l a e n z i m a r e s p e c t i v a m e n t e , l a s c u r v a s

t i e n d e n a c o n t i n u a r a ú n , p o r lo q u e creo q u e p o d r f a i n c r e m e n t a r s e e l t i e m p c

a u n a s 5 a 1 0 horas mas.

11. Efecto d e l a t e m p e r a t u r a . I - Las gráf i ras 2. l., 2.2. y 2.3. m u e s t r a n q u e todas c u r v a s c a e n a laq

36 horas y c o n t i n ú a n u n a p r o d u c c i ó n d e c r e c i e n t e . Por- l o q u e c o n s i d e r o q u

estas f e r m e n t a c i o n e s p o d r i a n d e t e n e r s e a las 36 horas. i 111. En g e n e r a l .

- Se d e b e n a g i t a r p e r f e c t a m e n t e las d i l u c u i n e s d e l a s m u e s t r a s dd

biomasa, asi como las d i l u c i o n e s d e las m u e s t r a s e n z i m a ' t i c a s .

- Las t g c n i c a s d e b e n , set- p r o p o r c i o n a d a s l o mas detallada& p o s i b l e p a r i

r e d u c i r e l m a r g e n d e error e n l o s r e s u l t a d o s .

C I T A S

( 1 ) S n y d e r , H. E. y H. J., P h a f f . ( 1 9 6 0 ) . S t u d i e s on a B e t a - f r u c t i s i d a s ~

( i n u l i n a s e ) p r o d u c e d by S a c c h a r o m y c e s f racri 1 is. A n t o n i e v a n L e e u w e n h o e k .

( 2 ) Kreger - van R i j, ' N. J. W. ( 1 9 8 4 ) . T h e yeast a t a x o n o m i c s t u d y . 3 e r z

e d i c i ó n . E lsevier- . Amsterdam. 2 - 236. ~

(3) Vandamme, E. J. y D. G . D e r y c k e . ( 1 9 8 3 ) I M i c r o b i a l i n u l i n a s e s :

f e r m e n t a t i o n , process, p r u p e r t i e s a n d a p p l i c a t i o n . A d v a n c e s i n A p p l i e c

M i c r o b i u l o g y . 29: 1 3 9 - 1 7 6 .

( 4 ) Whistler, H. J. ( 1 9 6 5 ) . M e t h o d s i n c a r b o h y d r a t e chemistry V. Academic

P r e s s : 1 5 7 - 158.

15) S n y d e r , H. E. y H. J. P h a f f . ( 1 9 6 2 ) . T h e p a t t e r n o f a c t i o n of i n u l i n a s s

' from S a c c h a r o m y c e s fratailis o n i n u l i n . T h e J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h e m i s t r y

237 (8) : 2 4 3 8 - 2 4 4 1 .

(6) H o u w e n h o r s t , H. J . ; M. H e n s i n g ; J. V e r b a k ' e l ; W. A. S c h e f f e r s y S . F

v a n D i j k e n . ( 1 9 9 0 ) . S t r u c t u r e a n d p r o p e r t i e s o f t h e e x t r a c e l u l a r i n u l i n a s

of E l u v v e r o m v c e i m a r x i a n u s CBS 6556. A p p l i e d a n d E n v i r o m e n t a l M i c r o b i o l o g y

56: 3337 - 3345.

( 7 ) Neyoro, H. < 1 9 7 8 ) . I n u l i n a s e from K l u v v e r o m v c e s f racli 1 is; J o u r n a

F e r m e n t T e c h n o l o g y . 56 (2): 1 0 2 - 1 0 7 .

(8 ) H o u w e n h o r s t , R. J . ; L . E. Visser; A. A. v a n D e r B a a n ; W. A. S c h e f f e r s

J. P. v a n D i j k e n . ( 1 9 8 8 ) . P r o d u c t i o n , d i s t r i b u t i o n a n d K i n e t i c p r o p e r t i e s

o f i n u l i n a s e i n c o n t i n u o u s c ~ t l t u r e s of K l u y v e r o m y c e s m a r x i a n u s CBS 6556,

Applied and Eviromental Microbiology. 54 (5): 1131 .- 1137.

(9) Rouwenhorst, R. J. ; W. S. Ritmeester; W. A. Scheffers y J. P. van

Di jken. (1990). Localitation of inulinase and invertase in Kluyveromyces

species. Applied and Enviromental Microbiology. 56 (11): 3329 - 3336.

(10) GrootWassink, J. M. y G. M. Hewitt. (1983). Inducible and constitutive

formation of beta-fructofuranosidase (inulase) in batch and continuous

cultures of the yeast Fluyveromyces f.raui lis. Journal of General

Microbiology. 129: 31 - 41.

I l l ) Parekh, S. y A. Margaritis. (1985). Inulinase (beta-fructofuranosidase~

product ion by Kluyveromyces marxianus in batch culture. Appl iec

Microbiology Biotechnology. 22: 446 - 4443.

(12) Tsang, E. W. T. y J. W. D. GrootWassink. (1988). Stability of e m -

inulase production on lactose in batch and continuous culture of ci

Kluyveromyces fraailis hyperproducing mutant. Enzyme Microbiolmgj

Technology. 10: 297 - 301.

(13) GrootWassink, J. W. D. y S . E. Fleming. (1980) Non-specific beta-

f ructafuranosidase (inulase) f ram Kluyveromyces f r a o i 1 is: batch an

continuous fermentation, simple. recovery method and some industria

properties. Enzyme Microbiology Technology. 2: 45 - 53.

(14) Garcr’a G., M.; L., GÓmez H. y E. Bgrzana. 1987. Studies on th

simultaneous production of single cell protein and poligalacturonase frat

Kluyveromyces fraailis. Biotechnology Letters. 9 ( 6 ) : 411 - 416.

EIBLIOGRAFIA

-!

1.- GrootWassink, J, W. D. y S. E. Fleming. 1980. Non-specific beta-

f ructofuranosidase (inulase) from Kluvveromvceq f raailis: batch and

continuous fermentation, simple recovery method and 'some industrial

properties. Enzyme Microbiology Technology. 2: 45 - 53.

2.- GrootWassink, J. W. D. y G. M. Hewitt. 1983. Inducible and constitutive

formation of beta-fructofuranosidase (inulase) in batch and continuous

c~tltures of the yeast Kluyveromyces f raPil is. Journal of General

Microbiology. 29: 31 - 41.

S,.-. Kin Sing Lam y J. W. D. GrootWassink. 1990. Enzymatic digestion of

spent cells f o r nutrient recycling in inulinase production. Jour-nal of

Industrial Microbiology. 6: 207 - 210.

4.- KreQer - van R i j, N. J. W. 1984. T h e yeast a taxonomic study. Elsevier.

tercera edición. Amsterdam. 1984. 236.

5 . - Garcfa G., M.! L., GÓmez R. y L . B&ziana, E. 1987. Studies on the

simulteneou~. .prOduction of single cell protein and polygalacturonare frac

Kluvveromvces fratailis. Biotechnológy Letters. 9 (6): 411 - 416.

6. - Negatm, H. 1978. Inulinase P r a m Kluvveramyces fracli lis. Journal Fermen

Technology. 1978. 56 ( 2 ) : 102 - 107.

7.- Nelson, N. 1944. A photometric adaption of Somogyi method for th

determination of gluc05e. 3: S35 - 381.

8.- Parekh, S. y A. Margaritis. 1985. Inulinase Ibeta-fructofuranisidase.

production by Kluvveromvces marxianus in batch culture. Appliet

Microbiology Biotechnology. 22: 446 - 448.

16.- Vandamme, E. J. y D. G. Der-ycke. 1983. Microbial i n u l i n a s e s :

F e r m e n t a t i o n process, p r o p e r t i e s a n d a p p l i c a t i o n s . Advances i n A p p l i e c

Microbiology. 29: 1.3Y - 176. !

17.- W h i s t l e r - , R. J. Methods i n c a r b o h y d r a t e chemistry V. 1965. Academid

Press: X57 - 158.

18.- Wot-kman, W. E. y D. F. Day. 1983. P u r i f i c a t i o n a n d p r o p e r t i e s af thq

b e t a - f r u c t o f u r a n o s i d a s e from Kluvveromvce~ f racri 1 is. E l s e v i e r Sciencd

Pub1 ishers. 16C) ( 1 , 2) : 16 - 20.