CURSO : GENÉTICA MÉDICA

DOCENTE : DR. CESAR GUZMAN VIGO,

MGTER. MARCO ANTONIO GUZMAN TELLO.

TEMA: polimorfismos del DNA

INTEGRANTES : Benavides Vásquez francisco Bustamante Díaz Aldair Gil Salazar Norbil

POLIMORFISMO GENETICO

INTRODUCCIÓN:

El polimorfismo biológico está definido en la Enciclopedia Británica (1995) como: “la variación estructural o funcional encontrada entre miembros de una misma especie”. Esta variación puede “estar determinada por diferencias genéticas o por diferencias en las circunstancias en las que cada individuo vive”. En efecto, algunas diferencias biológicas son de origen puramente genético, sin que el ambiente pueda ejercer influencia sobre éstas: es el caso de los grupos sanguíneos. Sin embargo, la mayoría de las diferencias perceptibles a simple vista tienen a la vez un origen genético y ambiental: es el caso del tamaño o del peso de cada individuo de una especie dada.

En la presente disertación analizaremos solamente los aspectos relacionados con el polimorfismo puramente genético en humanos, aunque se incluirán algunos conceptos sobre su función en relación con la respuesta a factores ambientales.

OBJETIVOS.

Definir el término de Polimorfismo ADN.

Comprender los tipos de polimorfismo en ADN.

Importancia del polimorfismo en la genética.

CONCEPTOS BÁSICOS:

Monomorfismo: El monomorfismo es, como su nombre lo indica, la ausencia de variación en una población dada. Este se presenta, por lo general, en regiones genéticas que codifican para regiones estructurales básicas de las proteínas. Es el caso, por ejemplo, de la mayoría de los segmentos genéticos que codifican para las regiones transmembrana de las proteínas de superficie celular.

Polimorfismo: El polimorfismo molecular consiste la variación que se presenta en individuos de una misma especie, bien sea al nivel genético o al nivel de las proteínas.

Un sinónimo corriente para este concepto es el de alelismo. Polimorfismo en regiones codificantes o exones: El polimorfismo genético se puede presentar en regiones codificantes, lo cual da lugar a mutaciones generalmente visibles en la proteína correspondiente.

Polimorfismo en regiones no codificantes o intrones: Cuando el polimorfismo genético se presenta en regiones no codificantes, éste puede invisible al nivel del fenotipo, dando lugar a las mutaciones silenciosas que son la mayoría. Esto no es sorprendente si consideramos que el genoma tiene una proporción de más del 97% que no es transcrito a proteínas.

Regiones proteicas altamente polimórficas: Fuera del efecto evidente en cambio de estructura de las mutaciones en las regiones codificantes, se presenta en algunos casos una diversidad aumentada e independiente del polimorfismo propiamente genético en proteínas como los anticuerpos o los receptores de los linfocitos T. Este polimorfismo aumentado, o hipervariabilidad, resulta de mecanismos epigenéticos tales como el rearreglo de fragmentos de genes o la inserción nucleotídica

Metodología para el estudio del polimorfismo genético y de proteínas: En términos generales podemos considerar que hoy en día es posible visualizar directa e indirectamente el polimorfismo molecular. Por un lado, al nivel de las proteínas, las reacciones de complementariedad de los antígenos y anticuerpos utilizados in vitro para este fin darán cuenta de las variaciones estructurales que resulten inmunogénicas en modelos animales y humanos. Por otro lado, las reacciones de complementariedad de las secuencias nucleotídica (ADN-ADN o ADN-ARN) permitirán poner en evidencia las diferencias estructurales de genes homólogos. Estas últimas podrán ser mejor definidas gracias a la especificidad de corte de las enzimas de restricción tanto como a la visualización directa de las diferencias en tamaño de los alelos correspondientes.

TIPOS DE POLIMORFISMOS

RFLP: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción. (Restriction Fragment Length Polimorphism)

A finales de la década del 60, el descubrimiento de las endonucleasas de bacterias (enzimas de restricción con muy alta especificidad), las cuales cortaban el ADN en secuencias definidas de usualmente 4-8 pb, conllevó al desarrollo de técnicas para el aislamiento y la manipulación de fragmentos de ADN. Una de las mayores aplicaciones de esta técnica fue el ensamblaje de los mapas genéticos con el polimorfismo en longitud de los fragmentos de restricción.

Esta técnica explota las variaciones en las secuencias del ADN por la creación o abolición de sitios para el corte de las endonucleasas, dadas por los cambios de bases, las adiciones o deleciones de fragmentos de ADN entre y en estos sitios. Además, algunas endonucleasas son incapaces de cortar el ADN si la secuencia de reconocimiento contiene uno o más sitios de citosina metilada, por lo tanto tales enzimas pueden detectar polimorfismo si hay variaciones en los patrones de metilación.

El estudio de los polimorfismos de este tipo consiste en el análisis en cuanto a número

y tamaño de los fragmentos de ADN que se originan al digerir con las mencionadas enzimas el material genómico o un fragmento amplificado del genoma, de manera que un sitio de restricción polimórfico o una deleción o inserción entre dos sitios de corte será detectado como un polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción generados a nivel fenotípico. La técnica consta de las siguientes etapas (figura 3): digestión del ADN con enzimas de restricción; separación por electroforesis de los fragmentos resultantes; transferencia de los fragmentos separados a membranas de nitrocelulosa (Southern Blotting) e hibridación con sondas moleculares radiactivas y exposición de la membrana a un filme de rayos X. La identificación del polimorfismo también puede hacerse por PCR. Este método se ha empleado en la caracterización de los genes de algunas de las proteínas lácteas bovinas.

El uso de los RFLP como marcadores para trazar la transmisión de los genes asociados a ellos, es de una utilidad considerable en genética pues tienen como ventajas el no estar influenciados por el ambiente, no depender del estado ontogénico del animal, permitir un análisis de todo el genoma, poder ser detectados en estadios muy tempranos del desarrollo independientemente de la expresión del gen, una vez heredados, y además

poseen la característica de ser codominantes en la expresión fenotípica, es decir, permiten discernir entre el individuo homocigótico dominante y el heterocigótico; son muy comunes y cualquier gen debe tener sitios de restricción polimórficos en una vecindad de varios cientos de pares de bases.

Pero tienen como desventajas que son muy costosos, necesitan de un personal calificado y entrenado para trabajarlo, precisan el uso de radioactividad y además, consumen mucho tiempo. En animales domésticos se ha realizado este tipo de análisis del ADN desde 1985, con numerosos trabajos en una amplia diversidad de especies.

Otras de las aplicaciones de esta tecnología ha sido el desarrollo de detallados mapas de ligamiento en una amplia variedad de organismos. Aunque ésta es la más conocida, el RFLP se ha empleado también en la caracterización del genoma de organelos, en la identificación de líneas o individuos y en las investigaciones sobre el tema de la diversidad genética. La identificación y el mapeo de RFLP han revolucionado la genética humana por el desarrollo del diagnóstico asistido por marcadores y la detección de una amplia variedad de enfermedades hereditarias. A pesar de haber sido ignorados este tipo de marcadores en sus inicios por los genetistas veterinarios, los mismos métodos para el mapeo en humanos son empleados para estudios de diferentes especies animales, respecto a los sitios polimórficos, produciéndose una revolución en el mejoramiento animal por la introducción de la selección asistida por marcadores (Marker Asisted Selection: MAS).

RAPD: Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (Random Amplified Polymorphic DNA)

La técnica RAPD, conocida también como AP-PCR es básicamente una variación del protocolo de la PCR con dos características distintivas: utiliza un cebador único (en lugar de un par de primers) con una secuencia arbitraria, por lo tanto desconocida. Para que ocurra la amplificación, dos secuencias complementarias al cebador arbitrario deben estarlo suficientemente adyacentes (~400pb) y en orientación opuesta que permita la amplificación exponencial por la ADN-polimerasa (Figura 4).

En los RAPD se emplean cebadores cortos (10 pares de bases) que se utilizan de forma individual en reacciones de PCR con un nivel de especificación muy bajos. De esta manera se genera un patrón de bandas sencillos que dependerá de la capacidad de los cebadores para encontrar zonas en el ADN, parcial o totalmente complementario.

Durante la fase de alineamiento de la reacción de PCR-RAPD, el cebador o primer arbitrario se unirá a los sitios de la secuencia complementaria en el ADN molde desnaturalizado. Si dos moléculas se alinean con el molde en cadenas opuestas, con la

orientación apropiada y con una distancia amplificable (menor o igual a 2500 bases) entonces será amplificado un fragmento discreto de ADN. Cada primer es potencialmente capaz de amplificar un número de fragmentos (1-10 o más) de diferentes loci durante la misma reacción de PCR resultando en varias bandas. Los segmentos amplificados pueden ser visualizados en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio o en geles de poliacrilamida de alta resolución visualizados por autorradiografía o teñidos con plata detectándose el polimorfismo como ausencia o presencia de bandas de un fragmento particular.

Los polimorfismos RAPD resultan de la diferencia de secuencias en uno o ambos sitios de unión de los primers, los cuales evitan el alineamiento de la secuencia molde. Otras fuentes de polimorfismo RAPD pueden incluir diferencias de apenas un par de bases (mutaciones puntuales) que son suficientes para causar complementariedad del primer en el sitio de iniciación; deleciones o inserciones adyacentes en el sitio de iniciación de modo que provoquen la acción de la ADN-polimerasa, por lo que los marcadores RAPD tienen naturaleza binaria, el segmento amplificado está presente o no; son marcadores dominantes porque solo se amplifica una variante alélica, aquella que cumple con los requisitos de complementariedad entre el cebador y las cadenas de ADN a una distancia menor o igual a 2Kb.

AFLP: Polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (Amplified fragment length

polymorphisms)

Se basa en la amplificación arbitraria de fragmentos de restricción de ADN ligados a adaptadores: se utilizan cebadores semiespecíficos con secuencia complementaria al adaptador en el extremo 5´. Estos marcadores combinan dos enzimas de restricción,(generalmente la EcoR1 y la Mse1) y dos amplificaciones de PCR usando primeros marcados.

Se generan patrones de bandas complejos en donde es fácil encontrar polimorfismos claramente diferenciales. Consiste en la amplificación de múltiples regiones arbitrarias del genoma.

Involucra cuatro etapas:

digestión con dos enzimas de restricción, una de corte raro (reconoce secuencias de 6pb) y otra de corte frecuente (reconoce secuencias de 4pb);

acoplamiento de adaptadores específicos de doble cadena a los extremos de los fragmentos de restricción;

amplificación selectiva de fragmentos con cebadores específicos. Se lleva a cabo con el uso de iniciadores que contienen una base extra en el extremo 3´ lo que produce un conjunto de fragmentos que además de llevar la secuencia complementaria al primer o iniciador, complementan a la base extra adicional. Hay una segunda amplificación en la cual se conocen iniciadores con dos o tres bases extras. Los fragmentos son complementarios a las extensiones consideradas.

separación de los fragmentos por electroforesis en geles de poliacrilamida. Se pueden utilizar varios métodos para revelar el patrón de bandas: empleo de isótopos radiactivos y la tinción con nitrato de plata.

Mediante la selección del número de nucleótidos selectivos es posible controlar el número de fragmentos a amplificar, en una relación inversamente proporcional. El polimorfismo es detectado por la presencia o ausencia de bandas debido a mutaciones en los sitios de restricción o en secuencias adyacentes a estos, los cuales se complementan o se diferencian de los nucleótidos selectivos añadidos a los cebadores de la PCR, y por inserciones o deleciones dentro del fragmento amplificado.

Tiene como ventajas que se obtiene un alto grado de polimorfismo, un mayor número de marcadores por gel analizado y no requiere del conocimiento de la secuencia de ADN.

Debido a la cantidad de marcadores que pueden ser generados, el mapeo genético puede realizarse con mayor rapidez y más fácilmente. Es una técnica para estudios de biodiversidad. Comparado con RFLP es más rápido, menos laborioso y provee mayor información. Revela fundamentalmente el polimorfismo dominante, que puede ser por la presencia o ausencia del sitio de restricción o por una simple variación de un nucleótido en el genoma.

POLIMORFISMOS DE SECUENCIAS REPETIDAS

Otro tipo de polimorfismos son los de secuencias repetidas, con una mayor aplicación en el diagnóstico genético y son conocidos como VNTR minisatélites y VNTR-microsatélites o STR (del inglés, short tándem repeats). En ambos casos presentan un número variable de repeticiones en tándem (VNTR del inglés, variable number of tándem repeats).

Los minisatélites son loci que corresponden a secuencias de ADN de unas pocas decenas de nucleótidos repetidas en tándem. El número de dichas repeticiones varía de cromosoma a cromosoma, de forma que en un cromosoma el número de repeticiones en tándem puede ser de 10, en otro de 15, en otro de 22, etc. La singularidad más especial de este tipo de polimorfismos está en que cada loci puede presentar muchos alelos distintos (tantos como repeticiones), sin embargo, presentan el inconveniente de que no están

distribuidos por todo el genoma y sólo pueden ser utilizados en el diagnóstico de un número muy reducido de enfermedades. Los VNTR-minisatélites han encontrado su máxima aplicación en la determinación de la paternidad y en los protocolos de identificación genética en el ámbito judicial.

Cuando se habla de huellas dactilares del ADN se está hablando de este tipo de polimorfismo.

Los VNTR-microsatélites son por excelencia los polimorfismos anónimos utilizados en el diagnóstico genético. Corresponden a la repetición en tándem de secuencias de entre 2 y 5 nucleótidos. Los microsatélites presentan dos características que los hacen ideales para su uso. En primer lugar, están distribuidos de forma casi homogénea por todo el genoma y en segundo, presentan un número elevado de alelos con frecuencias similares entre sí, de forma que la probabilidad de que un individuo sea heterocigoto es muy elevada (presentan una alta heterocigosis).

POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO SENCILLO (SNP)

Como se mencionó, los polimorfismos se distinguen terminológicamente de las mutaciones por su frecuencia. Las diferentes formas de los polimorfismos (llamados “alelos”) son más frecuentes que las mutaciones, esto es, en una frecuencia mayor al 1%. La gran mayoría de los SNP’s tienen dos alelos los cuales están representados por una sustitución de base por otra. En las poblaciones, este tipo de alelos se clasifican en alelo principal o “silvestre” y alelo raro o mutante, clasificación basada en la frecuencia observada en las poblaciones. Debido a que los humanos son diploides, un individuo puede tener uno de tres genotipos: homocigoto para el alelo más frecuente, heterocigoto, u homocigoto para el alelo menos frecuente. Actualmente, en el “dbSNP’s” (base pública de datos de PNS, dbSNP’s por sus siglas en inglés) se han catalogado más de 9 millones de variantes en la secuencia de ADN.

Se describe que los SNP’s se presentan uno cada 200 pares de bases en el genoma humano. Basados en ello, se esperaría que existieran aproximadamente 6 millones de SNP’s en el genoma humano, muchos de los cuales ya han sido descritos en el dbSNP.

Los SNP’s pueden estar presentes en regiones codificantes y provocar un cambio en un aminoácido; a este tipo de SNP’s les conoce como “no sinónimos”. Puesto que este tipo de SNP’s afecta directamente la función de la proteína, muchos investigadores han centrado su atención en estudios de asociación genética en este tipo de variaciones.

Asimismo, existen variaciones funcionales que pueden producir alguna enfermedad o susceptibilidad a ésta, pueden estar localizados en la región promotora del gen, influenciando la actividad transcripcional del gen (modulando la unión de factores de transcripción), en intrones (modulando la estabilidad de la proteína), en sitios de “splicing” (sitios donde ocurre la eliminación de intrones y unión de exones) o en regiones intragénicas.

APLICACIONES CLÍNICAS:

Una vez entendido el polimorfismo genético como la variación molecular que se presenta en individuos de una misma especie, podemos pasar a discutir sus aplicaciones en la medicina contemporánea.

Asociación a enfermedades:

Las variaciones genéticas o alelos pueden estar asociados directa o indirectamente con enfermedades específicas. El caso más claro de asociación directa de un alelo a una enfermedad particular es cuando el producto de este alelo es determinante por su función para la patología. Un buen ejemplo sería el de la distrofia muscular de Dúchenme y el gen de la distrofina, el cual, al poseer la mutación deletérea determina la incapacidad muscular.

En cuanto a las asociaciones indirectas de algunos alelos con algunas enfermedades particulares, éstas resultan de la presencia del alelo en la misma región cromosómica de los genes alterados que intervienen en la patología, comportándose de esta manera apenas como un marcador fortuito de la enfermedad. Es el caso, por ejemplo, de las regiones intrónicas repetidas en tándem cortó (STR) o variables (VNTR), que se han regiones intrónicas repetidas en tándem cortos (STR) o variables (VNTR), que se han asociado a algunas enfermedades. También, en el caso de los genes transcritos, es ilustrativo el caso de las moléculas HLA que se asocian a la hiperplasia adrenal congénita, por deficiencia de la 21-hidroxilasa cuyo gen está en la misma región del brazo corto del cromosoma 6 y se transmite con éstas en desequilibrio de ligamiento Susceptibilidad a enfermedades:

No siempre la existencia de un mutante o de un alelo marcador implica necesariamente que el portador va a sufrir la enfermedad correspondiente. Como dijimos, algunas patologías son multifactoriales, y la sola presencia de un alelo deletéreo no condiciona al individuo. Si no se reúnen todos los factores necesarios al desarrollo de la enfermedad,

hablaremos de marcador de susceptibilidad. Una vez más, el sistema HLA resulta un buen ejemplo puesto que, por ejemplo, la existencia del alelo HLA-B27 se ha asociado a lo que se ha denominado un riesgo relativo de desarrollar la espondilitis

Anquilosante. En este caso el riesgo es alto, pues casi el 90% de los pacientes tienen este marcador. En otras enfermedades, asociadas a otros marcadores de susceptibilidad, aunque el riesgo es más bajo, éste resulta muchas veces significativo para su diagnóstico y/o pronóstico.

Estudio de poblaciones humanas: La enorme variación genética que presenta el ser humano ha permitido, como dijimos, redefinir las poblaciones de nuestro planeta en función de los alelos que éstas presentan en sus diferentes cromosomas. La aparente filiación cultural de diferentes comunidades ha podido ser evaluada al nivel genético mostrando a veces resultados sorprendentes por cuanto la vecindad geográfica o aún lingüística no necesariamente se correlacionan con su filiación genética. En estudios sobre poblaciones amerindias colombianas, el doctor Ignacio Briceño, investigador del Instituto de Genética Humana, ha encontrado que etnias distantes están muy relacionadas y podrían tener un ancestro común, mientras etnias muy cercanas son divergentes en su genoma.

Medicina legal:

El resultado práctico del polimorfismo genético individual, ha permitido, como es lógico, afinar enormemente la identificación forense tanto como los estudios de filiación paterna. La huella molecular tiende a reemplazar, de esta manera, a la clásica huella digital.

CONCLUSIONES

El estudio de los polimorfismos genéticos va en aumento. A partir de los datos generados del estudio de los polimorfismos se han logrado entender parcialmente los mecanismos de susceptibilidad a ciertas enfermedades. Con el desarrollo de nuevas metodologías a nivel de ADN y celular, se espera que los estudios de asociación aceleren el entendimiento de enfermedades relacionadas con ciertos genes, y establecer la relevancia de un polimorfismo en el contexto funcional.

En los últimos años se están desarrollando nuevas metodologías para identificar los polimorfismos funcionales que afecten o regulen la expresión genética. Por otra parte, es necesario estudiar el papel del medio ambiente y su influencia en los polimorfismos genéticos. En este contexto, se han demostrado asociaciones de cierto gen con una enfermedad, que son potencializados dependiendo de algunas condiciones ambientales.

Finalmente, es necesario un nuevo entendimiento de la biología de las enfermedades comunes para ligar, de una manera más completa, genotipos individuales a fenotipos complejos. El Proyecto Internacional del HapMap (proyecto que desarrolla un mapa de haplotipos del genoma humano) busca proveer muchas de las herramientas que actualmente son necesarias en el estudio del genoma humano.

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