PORTADA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN …
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PORTADA
UNIVERSIDAD AUTOacuteNOMA DE NUEVO LEOacuteN
FACULTAD DE CIENCIAS QUIacuteMICAS
CONTROL POBLACIONAL Y OSCILATORIO UTILIZANDO EL
Quorum sensing DE Staphylococcus aureus MEDIANTE UN
CIRCUITO GENEacuteTICO DE Escherichia coli
Por
MC DIEGO FRANCISCO BENIacuteTEZ CHAO
Como requisito parcial para obtener el Grado de DOCTOR EN
CIENCIAS con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
2021
ii
iii
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada iv
CONTRAPORTADA
RESUMEN
Diego Francisco Beniacutetez Chao Fecha de graduacioacuten 2021
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
Facultad de Ciencias Quiacutemicas
Tiacutetulo de Estudio Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing
de Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Nuacutemero de paacuteginas 156 Candidato para el Grado de Doctor en Ciencias con
Orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Aacuterea de estudio Microbiologiacutea Aplicada Biologiacutea Sinteacutetica y Bacteriocinas
Propoacutesito y Meacutetodo de Estudio El incremento de infecciones por S aureus
resistentes a meticilina (MRSA) ha ganado importancia en los sistemas de salud
puacuteblicos mundiales en las uacuteltimas deacutecadas Diversos agentes terapeacuteuticos
alternativos a los antibioacuteticos han sido desarrollados para el tratamiento de este
tipo de infecciones Recientemente bajo los principios de la Biologiacutea Sinteacutetica
se han habilitado ceacutelulas enteras que sirvan como biosensores detectando
moleacuteculas producidas por patoacutegenos y que como resultado liberen una
sustancia antimicrobiana que erradique al patoacutegeno como las bacteriocinas
Actualmente los peacuteptidos sentildeales y los peacuteptidos de fusioacuten han sido
ampliamente usados para mejorar la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas
en sistemas recombinantes En este trabajo presentamos el disentildeo in silico que
emula a E coli para que actuacutee como biosensor al detectar moleacuteculas de
Quorum Sensing (QS) de MRSA productoras de sentildeales AIP-II y que en
respuesta produzca Lacticina Q (LnqQ) una bacteriocina con antecedentes
contra ceacutelulas MRSA Adicionalmente experimentamos la capacidad del
peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la produccioacuten
heteroacuteloga de LnqQ en el periplasma y el citoplasma de ceacutelulas de E coli
respectivamente
Contribuciones y Conclusiones En primera instancia se construyeron dos moacutedulos
geneacuteticos biosensor y de bacteriocina ambos moacutedulos fueron ensamblados en
el plaacutesmido Dual Biosensor-Killer Ambos moacutedulos fueron optimizados para su
expresioacuten en E coli para incrementar el rendimiento de produccioacuten de proteiacutenas
recombinantes El anaacutelisis predictivo del vector nos permite intuir que su efecto
en las ceacutelulas E coli las emulariacutea para detectar moleacuteculas de QS producidas
por MRSA productoras de AIP clase II y ademaacutes para producir y excretar LnqQ
en funcioacuten a la concentracioacuten externa al peacuteptido autoinductor de MRSA Los
resultados predictivos abren la posibilidad de disentildear antibioacuteticos terapeacuteuticos
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inteligentes que puedan atacar patoacutegenos de resistencia Con relacioacuten al
peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP observamos que nivel
predictivo ambos eran candidatos potenciales para la produccioacuten periplaacutesmica y
citoplaacutesmica de LnqQ en ceacutelulas de E coli respectivamente Sin embargo
nuestros resultados experimentales demostraron que la bacteriocina LnqQ no
logroacute ser producida ni purificada cuando estuvo acoplada con N-AmyE o SmbP
Estos resultados enriquecen la literatura sobre ambas etiquetas proteicas asiacute
como tambieacuten descubrimos puntos a consideracioacuten que pudieran ser
importantes en afectar la produccioacuten y purificacioacuten cuando LnqQ es acoplada
con diferentes etiquetas proteicas en ceacutelulas de E coli
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PRESENTACIOacuteN
CONTROL POBLACIONAL Y OSCILATORIO UTILIZANDO EL QUORUM
SENSING DE Staphylococcus aureus MEDIANTE UN CIRCUITO GENEacuteTICO
DE Escherichia coli
Presentado por
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
El presente proyecto fue mayormente realizado en las instalaciones del
Laboratorio de Biologiacutea Sinteacutetica y de Sistemas del Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con la asesoriacutea del Dr Joseacute Rubeacuten
Morones Ramiacuterez y en el menor medida en el Laboratorio de Expresioacuten y
Purificacioacuten de Proteiacutenas unidad perteneciente a la Facultad de Ciencias
Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con apoyo del Dr Xristo
Zaacuterate Kalfoacutepulos Este proyecto fue auspiciado por el Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) mediante el apoyo con el Beca Nacional de
Posgrado (nuacutemero de becario 289476)
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AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) por el apoyo
brindado con la Beca Nacional de Posgrado con nuacutemero de becario 289476
(CVU no 516171) para la continuacioacuten de estudios
A la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) y a la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten (UANL) por el apoyo otorgado con la aprobacioacuten de becas y por el
uso directo e indirecto de sus instalaciones materiales y equipos
Al Dr Joseacute Rubeacuten Morones Ramiacuterez mi asesor a quien agradezco por la
oportunidad de colaborar en el equipo de investigacioacuten Nanobiotechnology
Research Group (NBR) Externo mi agradecimiento por las asesoriacuteas y el uso
de instalaciones equipos y materiales en el Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea (CIBYN) asiacute como el financiamiento para la
obtencioacuten de materiales de experimentacioacuten y ejecucioacuten de servicios y el
mejoramiento de mi vida profesional
Al MC Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros y al Dr Angel Leoacuten Buitimea
miembros del NBR y quienes fueron clave en la elaboracioacuten de este proyecto
asiacute como en los artiacuteculos cientiacuteficos redactados durante el proceso doctoral
Al Dr Xristo Zaacuterate Kalfoacutepulos miembro del comiteacute tutorial por su apoyo
teacutecnico y asesoriacutea por el equipo de investigacioacuten del Laboratorio de Expresioacuten y
Produccioacuten de Proteiacutenas (PEP) El agradecimiento se extiende a David Peacuterez
Bryan Santos y Jessica Goacutemez por sus importantes contribuciones
A los demaacutes miembros NBR asiacute como del comiteacute tutorial por sus comentarios
revisiones y asesoriacuteas en la elaboracioacuten de este proyecto
A mis padres Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas y a mi
hermano Angel Alejandro Beniacutetez Chao por su apoyo emocional e
incondicional en el transcurso de este proyecto
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DEDICATORIA
Para Dios iexclGracias por el don de pensar
Para mi mamaacute Lupita y mi papaacute Alejandro
Para mis hermanos Angel Alejandro y Jesuacutes Alejandro (+)
Para mis mejores amigos Esthela Maldonado Ricardo ldquoMankisrdquo Garciacutea Ricardo ldquoCiegordquo
Garciacutea Edgar ldquoBomboacutenrdquo Villareal Gerardo ldquoPepisrdquo Villarreal Mayela ldquoMonkeyrdquo Maldonado
Aniluacute Maldonado Eduardo Mendoza Alejandra Villarreal Isaac ldquoBebordquo Gonzaacutelez Cristy Llanes
Salma Alemaacuten iexclGracias por ser tan importantes para miacute
Para mis colegas del NBR muy en especial para Paco Balderas Angel Leoacuten Javier Garza
Paco ldquoNegrordquo Rodriacuteguez Dago Torres Luis Cepeda Albert Lerma Jordy Lerma Ceacutesar Garza
Alex de la Garza Isabel Caamal Gricelda Mendiola Fatemehalsadat Tabatabaeifar Hossein
Alishaharatobotni Nahid Rafiei y otros maacutes Se extiende la dedicatoria a mis colegas en PEP en
especial para David Peacuterez Jessica Goacutemez Brayan Santos Evelyn Martiacutenez
Para los que fueron mis estudiantes de verano o de servicio social con mencioacuten especial para
Montse Villegas Rauacutel Garciacutea Cinthia Castillo Sarai Fierros Jessica Ojeda y otros maacutes
Para mis colegas de generacioacuten de doctorado en especial para Paco Balderas David Peacuterez y
Gaby Quintanilla
Para el equipo administrativo del CIBYN con menciones especiales para Karla Islas y Mayra
Sandoval asiacute como de todo el equipo de intendencia muy en especial para la Sra Antonia
ldquoTontildeitardquo Sandoval y la Sra Martha Flores asiacute como para el guardia Nehemiacuteas y el chofer
Ernesto
Para el equipo administrativo de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
con mencioacuten especial para Karina Navarro y para la Sra Edmunda de intendencia
Para mis queridos perros muy en especial para Lucky Toby (+) y Pelusa (+)
Para mis ex alumnos de preparatoria del Centro Escolar Gante iexclLo logreacute
Para todos los que han trabajado como meseros y repartidores para continuar con sus estudios
yo sostener una familia iexclUstedes tienen mis maacutes sinceros respetos
Para todos los que han roto rompen y romperaacuten los liacutemites de lo conocido
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Si nos negamos categoacutericamente a reconocer que somos susceptibles de
cometer un error una equivocacioacuten profunda ndash nos acompantildearaacute siempre Pero
si somos capaces de evaluarnos con un poco de coraje por muy lamentables
que sean las reflexiones que podamos engendrarnos nuestras posibilidades
mejoran enormemente
Carl Sagan
El mundo y sus demonios La ciencia como una luz en la obscuridad (1995)
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TABLA DE CONTENIDO
PORTADA I
FIRMAS DE APROBACIOacuteN DE TESIS II
FIRMAS DE REVISIOacuteN DE TESIS III
CONTRAPORTADA IV
RESUMEN IV
PRESENTACIOacuteN VI
AGRADECIMIENTOS VII
DEDICATORIA VIII
TABLA DE CONTENIDO X
LISTA DE FIGURAS XIV
LISTA DE TABLAS XV
LISTA DE ABREVIATURAS XVI
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN 1
11 ERA DE LOS ANTIBIOacuteTICOS 1
12 INFECCIONES RESISTENTES A LOS ANTIBIOacuteTICOS AMENAZA MUNDIAL 2
13 PROBLEMA SANITARIO CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTES 4
14 TRATAMIENTOS ACTUALES PARA EL COMBATE A INFECCIONES RESISTENTES 5
15 TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS A LOS ANTIBIOacuteTICOS 6
CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES 8
21 CONTROL BIOLOacuteGICO POBLACIONAL POR MICROORGANISMOS 8
22 BIOLOGIacuteA SINTEacuteTICA Y SU PAPEL EN PRODUCCIOacuteN DE BACTERIOCINAS 8
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica 8
222 Definicioacuten de los biosensores 9
23 QUORUM SENSING COMUNICACIOacuteN ENTRE CEacuteLULAS 10
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus 11
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD 12
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA 12
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada 12
24 BIOSENSORES DE CEacuteLULAS ENTERAS BASADOS EN DETECCIOacuteN DE QS 13
25 LAS BACTERIOCINAS 15
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas 15
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos 17
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253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes 19
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos 19
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas 20
256 La bacteriocina Lacticina Q 21
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados 22
26 PRODUCCIOacuteN HETEROacuteLOGA DE BACTERIOCINAS 23
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE 24
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP 25
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS 26
31 Justificacioacuten 26
32 Hipoacutetesis 28
33 Objetivo General 28
34 Objetivos Especiacuteficos 28
35 Metas 29
36 Aportacioacuten cientiacutefica 29
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA 30
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 30
42 Cepas bacterianas 30
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina 31
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 33
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas 33
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 34
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 34
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 34
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 35
410 Prediccioacuten de alergenicidad 35
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 35
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 37
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 38
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 38
415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 39
418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 44
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en los geles 48
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CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS 50
51 Materiales y reactivos 50
52 Equipos de laboratorio 51
53 Lugares de experimentacioacuten 53
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos 53
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES 54
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 54
62 Cepas bacterianas 55
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina 55
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 57
65 Optimizacioacuten de los codones nativos 60
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 61
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 64
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 64
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 65
610 Prediccioacuten de alergenicidad 67
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 67
612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 72
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 73
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 73
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 74
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 75
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 78
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 84
619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de proteiacutenas 95
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES 105
ANEXOS 106
Divulgacioacuten de la investigacioacuten 106
Archivos de disentildeo 107
Resumen autobiograacutefico 108
REFERENCIAS 109
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 CONCEPTO DEL BIOSENSOR BASADO EN CEacuteLULAS ENTERAS 30
FIGURA 2 SISTEMA QS PARA DETECCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE S AUREUS 54
FIGURA 3 MOacuteDULOS BIOSENSOR Y DE BACTERIOCINA 55
FIGURA 4 ESTRATEGIA DE CONSTRUCCIOacuteN IN SILICO 58
FIGURA 5 REPRESENTACIOacuteN ESQUEMAacuteTICA DEL VECTOR DUAL BIOSENSOR-KILLER 59
FIGURA 6 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE N-AMYELNQQ 76
FIGURA 7 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE SMBP-LNQQ 76
FIGURA 8 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE N-AMYELNQQ 77
FIGURA 9 PREDICCIOacuteN DE HEacuteLICES TRANSMEMBRANALES PARA N-AMYELNQQ 77
FIGURA 10 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE SMBP-LNQQ 78
FIGURA 11 TRANSFORMACIOacuteN DE E COLI DH5Α Y BL21 (DE3) CON PET30A(+) PETNL Y PSMBP-LNQQ 79
FIGURA 12 GEL DE AGAROSA CON PLAacuteSMIDOS PETNL Y PSMBP-LNQQ 80
FIGURA 13 SIMULACIOacuteN DE PCR PARA VECTORES DE EXPRESIOacuteN 83
FIGURA 14 PCR DE PETNL 84
FIGURA 15 PCR DE PSMBP-LNQQ 84
FIGURA 16 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON PETNL INDUCIDO A 25degC 87
FIGURA 17 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PETNL INDUCIDO A 37degC 88
FIGURA 18 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 91
FIGURA 19 GEL DE E COLI ORIGAMI PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 92
FIGURA 20 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 37degC 93
FIGURA 21 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 25degC 94
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LISTA DE TABLAS
TABLA 1 USO DE CODONES PREVIO Y DESPUEacuteS DE LA OPTIMIZACIOacuteN 61
TABLA 2 PREDICCIOacuteN DE COMUNICACIOacuteN CRUZADA 63
TABLA 3 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD DE PROTEIacuteNAS 64
TABLA 4 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN SUBCELULAR DE PROTEIacuteNAS 65
TABLA 5 PREDICCIOacuteN DE EPIacuteTOPOS DE CEacuteLULAS B EN LNQQ 66
TABLA 6 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE N-AMYELNQQ 69
TABLA 7 SECUENCIAS UTILIZADAS PARA PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE N-AMYELNQQ 70
TABLA 8 PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE PEacutePTIDO SENtildeAL N-AMYE 71
TABLA 9 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE SMBP-LNQQ 73
TABLA 10 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
TABLA 11 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN CELULAR N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
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LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Significado
E coli Escherichia coli
S aureus Staphylococcus aureus
MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina
L lactis Lactococcus lactis
ESKAPE Acroacutenimo de seis especies bacterianas Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
QS Quorum Sensing (Percepcioacuten de Quoacuterum)
LnqQ Lacticina Q
agrBDCA Operoacuten agr de S aureus
agrB Gen que codifica AgrB
agrD Gen que codifica AgrD
HSL Moleacutecula homo serilactonado
AIP Moleacutecula autoinductora
agrC Gen que codifica AgrC
agrA Gen que codifica AgrA
AgrB Transportadora proteasa necesaria para la maduracioacuten de AgrD
AgrD Peacuteptido precursor a la moleacutecula autoinductora
AgrC Receptor transmembranal con actividad histidina quinasa
AgrA Proteiacutena reguladora de unioacuten al DNA de respuesta
AgrA-P AgrA fosforilado
pH Potencial de hidroacutegeno
pI Punto isoeleacutectrico
AMP Peacuteptidos antimicrobianos
kDA Kilo Dalton
MIC Concentracioacuten miacutenima inhibitoria
microM Micromolar
microgml Microgramo por mililitro
lnqRQBCDEF Cluacutester geneacutetico
AmyE Alfa-amilasa
N-AmyE Peacuteptido sentildeal de la AmyE
SmbP Proteiacutena pequentildea de unioacuten a metales
SmbP Regioacuten citoplaacutesmitica de la SmbP (peacuteptido de fusioacuten)
Ala33 Las letras indican el aminoaacutecido y los nuacutemeros la posicioacuten en la cadena
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranoacutesido
SBP Massachussets Institute of Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts
KEGG Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes
FPB FP Base
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PDB Protein Data Bank
nm Nanoacutemetros
DBK Plaacutesmido Dual Biosensor Killer
CAI Caacutelculo de Iacutendice de Adaptacioacuten
CUD Codon Usage Database
BUSCA Bologna Unified Subcellular Component Annotador
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
pET30(+)a Plaacutesmido tipo pET30(+)a sin modificaciones
pETNL Plaacutesmido que contiene N-AmyELnqQ6xHis
pSmPc-LnqQ Plaacutesmido que contiene SmbP-LnqQ
LB Medio de cultivo LB
OD600 Densidad oacuteptica
microl Microlitros
microg Microgramos
degC Grados Celsius
h Hora
ml Mililitro
g Gramo
g Fuerza centriacutefuga relativa
rpm Revoluciones por minuto
min Minuto
dNTPs Trifosfatos de desoxinucleoacutetidos
V Volts
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
pv Peso volumen
NaCl Cloruro de sodio
Tris-HCl Solucioacuten de Tris ajustada con aacutecido clorhiacutedrico (HCl)
M Molar
SDS Dodecil Sulfato Soacutedico
APS Persulfato de amonio
TEMED Tetramethylethylenediamine
X Veces de concentracioacuten de trabajo
mm Miliacutemetros
lnqQ Gen de lacticina Q
P2 Promotor 2 inducible del operoacuten agr de S aureus
gfp Gen de GFP
GFP Proteiacutena verde fluorescente
J23110 Promotor J23110 constitutivo para E coli
AIP-I AIP clase I
AIP-II AIP clase 2
AIP-III AIP clase 3
AIP-IV AIP clase 4
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Ala Alanina (A)
Arg Arginina (R)
Asn Asparagina (N)
Asp Asparato (D)
Cys Cisteiacutena (C)
Gln Glutamina (Q)
Glu Glutamato (E)
Gly Glicina (G)
His Histidina (H)
Ile Isoleucina (I)
Leu Leucina (L)
Lys Lisina (K)
Met Metionina (M)
Phe Fenilalanina (F)
Pro Prolina (P)
Ser Serina (S)
Thr Treonina (T)
Trp Triptoacutefano (W)
Tyr Tirosina (Y)
Val Valina (V)
Pnl Liasa de pectina
AmyE Amilasa E
N-AmyEPnl Liasa de pectina asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
N-AmyEAmyE Amilasa E asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
VpDef Defensina de Venerupis philippinarum
Bin1b Defensina de Rattus norvegicus
LL-37 Catelicidina de humanoschimpanceacutes
SmbP-VpDef VpDef asociado con SmbP
SmbP-Bin1b Bin1b asociado con SmbP
SmbP-LL-37 LL-37 asociado con SmbP
SUMO-LnqQ LnqQ asociado con SUMO
AI Iacutendice alifaacutetico
GRAVY Iacutendice de hidrofobicidad
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN
A lo largo de nuestra historia los humanos hemos desarrollado soluciones a los
problemas del mundo que nos rodea No es extrantildeo que el combate a las
enfermedades sean uno de los temas maacutes recurrentes Existen referencias
histoacutericas entre las diferentes civilizaciones de la antiguumledad como los chinos
(Nicola amp Abagyan 2009) aztecas (Davidson amp De Montellano 1983) y los nubia-
sudaneses (Bassett Keith Armelagos Martin amp Villanueva 1980) del uso
empiacuterico de sustancias para tratar infecciones y enfermedades Hace unos
doscientos antildeos atraacutes se pensoacute que los subproductos de la revolucioacuten industrial
seriacutean tratamiento efectivo contra infecciones y aunque los resultados fueron
alentadores al principios los resultados observados ante otro tipo de infecciones
no tuvieron el mismo eacutexito (Gaynes 2017)
11 Era de los antibioacuteticos
En 1928 Alexander Fleming encontroacute una solucioacuten efectiva para contrarrestar las
infecciones al describir al hongo Penicillium notatum que teniacutea efectos antagoacutenicos
sobre diferentes cepas estafilocoacutecicas (Fleming 1929) inaugurando asiacute la
conocida era dorada en descubrimiento de los antibioacuteticos (Podolsky 2018) Las
virtudes observadas en los antibioacuteticos fueron raacutepidamente puestas en juicio
cuando el mismo Fleming vaticinoacute en su discurso de entrega al premio Nobel que
el abuso y uso excesivo de los antibioacuteticos podriacutea generar brotes de patoacutegenos
resistentes a los antibioacuteticos (Fleming 1945) Cada vez que un nuevo antibioacutetico
era liberado a los sistemas de salud puacuteblicos pronto se reportaba un brote de
resistencia relacionado a antibioacutetico (Clatworthy Pierson amp Hung 2007) Con el
boom de nuevas clases de antibioacuteticos desde los 1940s hasta principios de 1970s
la alerta por resistencia a los antibioacuteticos quedoacute praacutecticamente inadvertida De
hecho entre los 1960s y 1970s existe evidencia que la comunidad cientiacutefica
internacional fue apaacutetica y minimizoacute el hecho de que el abuso de los antibioacuteticos
fuera una causa de resistencia a los faacutermacos en las bacterias patoacutegenas
(Podolsky 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 2
El tema de la resistencia a los antibioacuteticos no tuvo impacto suficiente hasta que
con el paso de las deacutecadas surgieron de brotes de patoacutegenos resistentes de
importancia cliacutenica como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA
por sus siglas en ingleacutes) tanto en Reino Unido (Gardner Oxon Stamp Bowgen amp
Moore 1962) como en Estados Unidos (Barrett McGehee amp Finland 1968) y
ademaacutes las nuevas clases de antibioacuteticos empezaron a escasear desde los 1980s
hasta casi los 2000s Adicionalmente los inversionistas se motivaron a encontrar
nuevas clases antibioacuteticos al observar maacutes ganancias en descubrir compuestos
anticanceriacutegenos (Ventola 2015) los reglamentos sanitarios se volvieron maacutes
estrictos para la liberacioacuten de antibioacuteticos para prevenir la presentacioacuten de
infecciones multirresistentes emergentes (Davies 2006) Todos estos factores
incluyendo otros que tal vez no fueron mencionados allanaron el establecimiento
de poliacuteticas en salud puacuteblica para buscar o sintetizar alguacuten faacutermaco o sustancia
que contrarreste el avance de microorganismos patoacutegenos resistentes de
relevancia cliacutenica (World Health Organization 2017)
12 Infecciones resistentes a los antibioacuteticos amenaza mundial
Cifras de la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) mostraron el peligroso
ascenso de infecciones por bacterias resistentes en las uacuteltimas deacutecadas donde se
calcula un promedio de 700000 muertes anuales para el 2019 (World Health
Organization 2019b) y la advertencia de que si los gobiernos y organizaciones
responsables de la salud puacuteblica a nivel mundial no elaboran poliacuteticas efectivas
para el 2050 tendremos un promedio de 10 millones de muertes al antildeo por
consecuencias de este tipo de infecciones (Dadgostar 2019)
En Meacutexico carecemos de un sistema de recoleccioacuten de datos confiables en este
tipo de infecciones (Amabile-Cuevas 2010) pero en un estudio realizado durante
seis meses del 2019 se recuperaron 23000 cepas resistentes a faacutermacos en 47
centros de salud puacuteblicos de todo el paiacutes siendo algunas de las maacutes comunes E
coli Klebsiella sp Enterobacter sp Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter sp
Enterococcus faecium resistente a vancomicina y Staphylococccus aureus
resistente a meticilina (MRSA) (Vazquez-Rodriguez et al 2018)
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En todas las regiones del mundo las infecciones resistentes han tenido un
peligroso ascenso En Estados Unidos las muertas anuales por infecciones
resistentes pasaron de 23000 muertes en 2013 (Frieden 2013) a 35000 durante
el 2019 (CDC 2019) Por otro lado en Europa las muertes atribuibles a
infecciones resistentes aumentaron de 25000 en 2007 (European Centre for
Disease Prevention and Control 2009) a 33110 en 2015 (Cassini et al 2019) En
42 paiacuteses del continente africano se registraron 54000 casos atribuibles a
tuberculosis multirresistente (MDR multi-resistant) y en ocho paiacuteses se registraron
3200 muertes relacionadas a la variante extremadamente resistente (XDR
extreme resistant) en un periacuteodo del 2004 al 2011 (Ndihokubwayo et al 2013) En
el continente asiaacutetico en China por ejemplo el rango de bacterias aislados que
eran resistentes a los antibioacuteticos pasoacute de 22774 casos a 190610 de 2005 a
2017 respectivamente (Qu Huang amp Lv 2019) en la India un estudio reporta
que el 70 de aislados cliacutenicos tipo Gram negativos son resistentes a los
faacutermacos y entre ellos se podiacutean encontrar cepas de Escherichia coli Klebsiella
pneumoniae Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa (Taneja amp
Sharma 2019)
Las infecciones resistentes son material incluso de intereacutes para el sector
econoacutemico El Banco Mundial ha elaborado dos escenarios para predecir el
impacto econoacutemico de las infecciones resistentes para el 2050 en un escenario
de bajo impacto el Producto Interno Bruto (PIB) mundial podriacutea disminuir hasta un
11 Sin embargo en un escenario de alto impacto el dantildeo al PIB global podriacutea
representar hasta una disminucioacuten de 38 Los costos al sistema de salud
puacuteblico en el mundo podriacutean oscilar entre los $300 mil millones a $1 cuatrilloacuten
presentando incluso un serio riesgo para el sector ganadero ya que en el
escenario de bajo impacto esto representariacutea una disminucioacuten de 26 esperado
a un 75 en un escenario de alto impacto (The World Bank 2016)
Las infecciones resistentes representa un punto de intereacutes incluso para la
Organizacioacuten de la Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
Food and Agriculture Organization) ya que actualmente se presume que en 42
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paiacuteses donde existen datos confiables de consumo de antibioacuteticos en el sector
ganadero y de agricultura se estima que en el 2010 el consumo era de 63000
toneladas de antibioacuteticoantildeo mientras que para el 2030 se estima un consumo
105600 toneladas de antibioacuteticoantildeo representando un incremento de 67 Los
iacutendices de metabolizacioacuten de antibioacuteticos tanto en ganado como en produccioacuten
pesquera presentan una baja metabolizacioacuten ya que entre un 70-80 y un 75-
90 respectivamente son excretados a las fuentes acuiacuteferas La produccioacuten de
cultivos consume entre un 02 a 04 del total de antibioacuteticos en relacioacuten con la
produccioacuten ganadera (FAO sf)
La relevancia sanitaria mundial de S aureus es porque se trata de un miembro del
grupo ESKAPE un grupo de patoacutegenos localizados en infraestructuras
hospitalarias asilos o en equipos e instrumentos meacutedicos como ventiladores y
cateacuteteres y que son habitualmente resistentes a los antibioacuteticos (Rice 2008) Esta
bacteria es la primera causa nosocomial tanto en Latinoameacuterica (26)
Norteameacuterica (260) y la segunda causa nosocomial de Europa (195)
(Biedenbach Moet amp Jones 2004) Se presume que un 30 de la poblacioacuten total
de humanos estaacute colonizado con al menos una subespecie de S aureus
(Wertheim et al 2005) y esto podriacutea ser porque el haacutebitat de esta bacteria en los
humanos es la parte anterior de las fosas nasales (Mulcahy amp McLoughlin 2016)
13 Problema sanitario con Staphylococcus aureus resistentes
S aureus es una bacteria Gram positiva y es considerada una de las principales
causas de enfermedades en piel (Foster 1996) Ademaacutes es capaz de desarrollar
biopeliacuteculas en dispositivos implantados en seres humanos y cateacuteteres causando
infecciones croacutenicas y persistentes (Dunne 2002) La osteomielitis y periodontitis
tambieacuten son producto de la biopeliacutecula este patoacutegeno estaacute involucrado en heridas
croacutenicas en pacientes diabeacuteticos con uacutelceras y estaacute relacionado a infecciones al
endocardio oculares y en casos de rinosinusitis croacutenica (Archer et al 2011) Se
considera que es un patoacutegeno de alto riesgo para pacientes con Fibrosis Quiacutestica
ya que es el maacutes reportado entre personas con 11 a 15 antildeos con esta condicioacuten
(Razvi et al 2009)
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Ahora bien se estima que entre un 13 al 74 del total de infecciones resistentes
en el mundo son causados por una variante resistente de S aureus resistente a la
meticilina la cepa MRSA (Koumlck et al 2010) la cual estaacute es sentildealada desde el
2017 por la OMS como un patoacutegeno de alta prioridad al que debe encontrarse una
solucioacuten pronta y efectiva (World Health Organization 2017) Por ejemplo en
Estados Unidos el total de pacientes por infecciones nosocomiales tipo MRSA
ascendioacute de 24 en 1975 a un 29 en 1991 (Panlilio et al 1992) y hasta casi
57 para el antildeo 2000 (NNIS 2004) En la actualidad el MRSA es considerado
endeacutemico en ese paiacutes ya que se estima que el 2 de la poblacioacuten es acarreador
de este estafilococo (Kavanagh 2019)
En Meacutexico los primeros casos de MRSA asociado a comunidad (CA-MRSA) cepa
USA300 fueron reportados a inicios del 2008 (Mariacutea E Velazquez-Meza et al
2011) y durante el 2010 un estudio anuncioacute que la cepa de MRSA maacutes
frecuentemente aislada en nuestro paiacutes era la New YorkJapan (Rodriacuteguez-
Noriega et al 2010) Tambieacuten se conoce que cepas de MRSA en hospitales
puacuteblicos en nuestro paiacutes fluctuoacute entre un 7 al 30 en pacientes entre las
deacutecadas de 1980s a 2000s (M E Velazquez-Meza et al 2004) mientras que el
Instituto Nacional de Cancerologiacutea determinoacute que 17 de las cepas aisladas de
3000 hemocultivos recuperados entre el 2005 al 2015 de pacientes con caacutencer
correspondiacutean a MRSA (Velaacutezquez-Acosta Cornejo-Juaacuterez amp Volkow-Fernaacutendez
2018)
14 Tratamientos actuales para el combate a infecciones
resistentes
En la actualidad las clases maacutes comunes de antibioacuteticos para combatir
infecciones resistentes a los antibioacuteticos son las penicilinas cefalosporinas
quinolonas macroacutelidos tetraciclinas glucopeacuteptidos y monobactaacutemicos (Taylor
Stapleton amp Paul Luzio 2002) En las uacuteltimas dos deacutecadas se han aprobado una
gran variedad de antibioacuteticos para el tratamiento de infecciones causados por
bacterias tanto Gram positivos como Gram negativos Los antibioacuteticos maacutes
recientemente reportados para el tratamiento de bacterias multirresistentes Gram
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positivas incluyen β-lactaacutemicos (ceftarolina y ceftobiprol) glicopeacuteptidos
(dalbavancin oritavancin y telavancin) oxazolidinonas (tedizolid fosfato)
quinolonas (besifloxacina delafloxacin y ozenoxacina) y tetraciclinas
(omadaciclina) (Koulenti et al 2019) Seguacuten la OMS hasta el 2019 se sabe de 50
agentes antimicrobianos que se encuentran en desarrollo cliacutenico donde 32 son
antibioacuteticos activos contra patoacutegenos de prioridad de la OMS diez son agentes
bioloacutegicos 2 son clasificados como agentes novedosos y dos pertenecen al grupo
de bacterias Gram negativas multirresistentes (World Health Organization 2019a)
15 Tratamientos alternativos a los antibioacuteticos
Los patoacutegenos resisten a los antibioacuteticos bajo tres grandes mecanismos de
resistencia intriacutenseca adaptativa yo adquirida (Arzanlou Chai amp Venter 2017
Blair Webber Baylay Ogbolu amp Piddock 2015 Sandoval-Motta amp Aldana 2016)
Es por ello que urge desarrollar una solucioacuten pronta y efectiva para contrarrestar
las infecciones causadas por patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos los cuales
son uno de los puntos que la OMS ha declarado como prioritarios (OrsquoNeill 2016)
En la guerra contra la resistencia a los antibioacuteticos nuestro grupo de investigacioacuten
ha participado en la creacioacuten de compuestos que puedan combatirlos como
tratamientos mixtos de antibioacuteticos (Montelongo-Peralta Leoacuten-Buitimea Palma-
Nicolaacutes Gonzalez-Christen amp Morones-Ramiacuterez 2019) nanopartiacuteculas de plata
asociados con metales de transicioacuten (Javier A Garza-Cervantes et al 2017)
nanomateriales asociados con nanopartiacuteculas de plata sintetizados con poliacutemeros
sensibles al ambiente (Ruben Morones amp Frey 2007) o producidos de manera
sustentable (Escaacutercega-Gonzaacutelez et al 2018) o a partir de un exopolisacaacuterido
producido por una levadura que actuacutea como agente reductor y que estaacuten
capeados por agentes con actividad antimicrobiana y antibiopeliacutecula (Javier
Alberto Garza-Cervantes et al 2019)
Otros grupos de investigacioacuten tambieacuten han desarrollado otro tipo de armas contra
la resistencia a los antibioacuteticos como el uso de teacutecnicas de decorado en
bacterioacutefagos (phage display) para producir vacunas en la caacutepside de
bacterioacutefagos inhabilitados (Bao et al 2019) o uso de agentes de control bioloacutegico
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contra patoacutegenos de alimentos (Gutieacuterrez Fernaacutendez Rodriacuteguez amp Garciacutea 2019)
o para el tratamiento de aguas residuales (Jassim Limoges amp El-Cheikh 2016)
Los esfuerzos actuales se han focalizado en encontrar yo desarrollar nuevas
clases de antibioacuteticos y agentes antimicrobianos contra bacterias resistentes (Fair
amp Tor 2014) y de prioridad ante la OMS (World Health Organization 2017) Las
corrientes alternativas a los antibioacuteticos maacutes reconocidas en la actualidad estaacuten
clasificadas en dos grandes enfoques el enfoque de prevencioacuten a las
enfermedades donde se desarrollan y se utilizan vacunas probioacuteticos o
prebioacuteticos mientras que en el enfoque por tratamiento a las enfermedades se
utilizan la terapia de fagos la aplicacioacuten directa de endolisinas yo exolisinas el
uso de microorganismos depredadores vivos o el uso directo de bacteriocinas
(Allen Trachsel Looft amp Casey 2014) Tambieacuten la Biologiacutea Sinteacutetica se ha
involucrado en resolver la problemaacutetica de infecciones resistentes a los faacutermacos
al participar en el disentildeo de biosensores basados en ceacutelulas completas que sean
capaces de destruir patoacutegenos mediante la previa de deteccioacuten de moleacuteculas
excretadas por microrganismos de intereacutes (Beniacutetez‐Chao Balderas‐Cisneros
Leoacuten‐Buitimea amp Morones‐Ramiacuterez 2021)
La biosiacutentesis purificacioacuten y aplicacioacuten de bacteriocinas contra patoacutegenos Gram
negativos y Gram positivos ha sido punto central para diversos grupos de
investigacioacuten (Cabral Penumutchu Norris Morones-Ramirez amp Belenky 2018
McAuliffe et al 1998 Rea Ross Cotter amp Hill 2011 Sandiford amp Upton 2012
Wong et al 2015) asiacute como la siacutentesis de nanocompuestos como liposomas
quitosano y nanopartiacuteculas hechos a base de compuestos de plantas (Sidhu amp
Nehra 2017) o de nanofibras (Fahim Khairalla amp El-Gendy 2016) que esteacuten
acomplejados con bacteriocinas Maacutes adelante se describiraacuten detalles sobre las
bacteriocinas y su relacioacuten en el combate a las infecciones resistentes a los
antibioacuteticos
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CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES
21 Control bioloacutegico poblacional por microorganismos
En la Naturaleza todos los seres vivos estaacuten interactuando y compitiendo por
nichos ecoloacutegicos para sobrevivir crecer y reproducirse para una adaptacioacuten
efectiva en el ambiente donde se desarrollan Este fenoacutemeno es universal ya que
pueden encontrarse en estilos de vida unicelulares y multicelulares (Grice et al
2009) Para competir por los nutrientes los microorganismos contienen
compuestos que matan o limitan el crecimiento de otra poblacioacuten Estos
compuestos pueden ser antibioacuteticos peacuteptidos antimicrobianos moleacuteculas de bajo
peso molecular entre otros maacutes (Gonzalez et al 2011 2010)
Cuando microorganismos vivos por sus caracteriacutesticas bioloacutegicas son usados para
suprimir la densidad poblacional de un tipo especiacutefico de organismo hacieacutendolo
menos abundante o dantildeino se le conoce como control bioloacutegico Es importante
mencionar que esta definicioacuten solo incluye a especiacutemenes vivos como
depredadores paraacutesitos nemaacutetodos hongos bacterias protozoarios inclusive
virus Sin embargo genes sin un recipiente bioloacutegico o metabolitos producidos por
un organismo de control sin que eacuteste se encuentre presente durante el control
poblacional son excluidos de esta definicioacuten (Eilenberg Hajek amp Lomer 2001)
Por ejemplo cultivos de Candida albicans (Peters et al 2010) Pseudomonas
aeruginosa (Filkins et al 2015) Bacillus subtilis (Gonzalez et al 2011)
Enterococcus faecium (Viccedilosa et al 2018) Acanthamoeba polyphaga (de Souza
Soares Benitez amp Rott 2017) disminuyeron la expresioacuten de patogenicidad en S
aureus Incluso cultivos de E coli han mostrado actividad fungicida contra cultivos
de C albicans (Cabral et al 2018)
22 Biologiacutea Sinteacutetica y su papel en produccioacuten de bacteriocinas
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica
La Biologiacutea Sinteacutetica consiste en disentildear libreriacuteas de elementos geneacuteticos como
promotores secuencias codificadoras terminadores factores de transcripcioacuten
entre otras maacutes asiacute tambieacuten se enfoca en el ensamblaje de circuitos geneacuteticos
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hasta en el disentildeo y creacioacuten de organismos completos Este campo utiliza datos
cuantitativos para crear modelos bioloacutegicos y matemaacuteticos que permitan predecir
el comportamiento de un sistema bioloacutegico (Cameron Bashor amp Collins 2014
Garciacutea-Granados Lerma-Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2019)
En la publicacioacuten de Brophy y Voigt se revisan los principios baacutesicos para el
disentildeo de circuitos geneacuteticos para que los sistemas bioloacutegicos sean emulados
para cumplir con tareas o puedan fabricar materiales es importante considerar la
correcta eleccioacuten de reguladores asiacute como puntos de control que cuantifiquen el
impacto en el rendimiento (Brophy amp Voigt 2014)
222 Definicioacuten de los biosensores
Un sensor quiacutemico es un dispositivo que transforma en una informacioacuten quiacutemica
en una sentildeal analiacutetica de utilidad y puede detectar desde la concentracioacuten de una
muestra especiacutefica hasta el anaacutelisis total de sus compuestos Este tipo de
sensores contiene dos unidades funcionales baacutesicas un receptor y un transductor
El receptor transforma la informacioacuten quiacutemica de la muestra en una forma de
energiacutea que puede ser medido por un transductor El transductor transforma la
energiacutea en una sentildeal analiacutetica uacutetil (Hulanicki Glab amp Ingman 1991) De esta
manera comprendemos que un biosensor es ldquoun dispositivo que a traveacutes de
reacciones especiacuteficas de enzimas aisladas sistemas inmunes tejidos organelos
o ceacutelulas enteras sirve para detectar compuestosrdquo (IUPAC 1992)
Asiacute en los biosensores basados en ceacutelulas completas un analito de intereacutes
ingresa al interior celular y es reconocido por un factor transcripcional el cual
controla la transcripcioacuten de un gen mediante el reconocimiento de un promotor
especiacutefico Estos biosensores pueden reconocer diferentes analitos como
hidrocarburos metales pesados antibioacuteticos (Garnier-Rocha 2019) Incluso
algunos modelos biosensores se han aprovechado del fenoacutemeno de quorum
sensing para crear sistemas de comunicacioacuten sinteacuteticos con la capacidad de
controlar poblaciones (Balagaddeacute et al 2008)
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23 Quorum Sensing Comunicacioacuten entre ceacutelulas
El concepto QS refiere a que es un mecanismo de comunicacioacuten entre
microorganismos que dependen de sentildeales quiacutemicas (moleacuteculas sentildealizadoras)
que son excretadas al medio extracelular y que dependen la densidad celular
(Fuqua Winans amp Greenberg 1994) Las bacterias similares a organismos de
diferentes dominios se sostienen de mecanismos de comunicacioacuten y se valen de
diferentes moleacuteculas Esta interaccioacuten puede ser intriacutenseca (es decir intracelular o
adentro de la misma ceacutelula) o extriacutenseca (es decir extracelular o afuera de la
ceacutelula) y crea un fenotipo de respuesta en una poblacioacuten especiacutefica del mismo
(Fuqua et al 1994)
Mientras los cultivos productores de QS esteacuten creciendo eacutestos pueden producir
excretar acumular y detectar moleacuteculas de sentildealizacioacuten quiacutemicas externas
conocidas como autoinductores los cuales son producidos a niveles basales pero
que se acumulan en el exterior celular Cuando la densidad celular de bacterias y
la concentracioacuten de moleacuteculas autoinductoras alcanzan un umbral de
concentracioacuten especiacutefico el cultivo experimenta un cambio en su fenotipo (Garg
Manchanda amp Kumar 2014 Rutherford amp Bassler 2012) Esta respuesta variacutea
seguacuten el tipo de sentildeal emitido ya que su forma y composicioacuten quiacutemica es diferente
seguacuten la especie que la produzca (Fuqua et al 1994) siendo las respuestas maacutes
comunes la formulacioacuten de esporulados factores de virulencia asociados a
invasioacuten bioluminiscencia virulencia yo la creacioacuten biopeliacuteculas (Miller amp Bassler
2002)
El fenoacutemeno de QS sucede tanto en bacterias productoras Gram negativas y las
Gram positivas pero las moleacuteculas auto inductoras son de diferente composicioacuten
quiacutemica En las bacterias Gram negativas las moleacuteculas de sentildealizacioacuten son
conocidas como homoserina lactonada aciladas (HSL) mientras que en bacterias
Gram positivas el mecanismo es a traveacutes de peacuteptidos excretados (Miller amp
Bassler 2002)
En el modelo general de QS en Gram positivos en primera instancia el gen que
contiene el precursor de la moleacutecula sentildealizadora (tambieacuten conocido como
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autoinductor inmaduro) es transcrito y traducido y eacutesta es posteriormente
parcialmente hidrolizada para crear un autoinductor maduro Eacuteste uacuteltimo es
enviado al exterior celular por un transportador tipo ABC Cuando la concentracioacuten
del autoinductor maduro alcanza un umbral miacutenimo de activacioacuten una proteiacutena
tipo quinasa sensor de histidina localizada en el exterior celular detecta la
presencia de eacutesta mediante un sistema a dos componentes El sensor quinasa se
auto fosforila en un residuo conservado de histidina (H) Despueacutes este grupo
fosforilo es transferido a una proteiacutena reguladora de respuesta adyacente la cual
es fosforilada en un residuo conservado de aspartato (D) La proteiacutena reguladora
de respuesta fosforilado activa la transcripcioacuten de los genes de intereacutes (Miller amp
Bassler 2002)
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus
En S aureus estaacute gobernado por el operoacuten agr que es de un tamantildeo nucleotiacutedico
de 35 kb y se compone de dos unidades transcriptoacutemicas divergentes conocidos
como RNAII y RNAIII los cuales estaacuten gobernados por los promotores P2 y P3
respectivamente (Le amp Otto 2015) El promotor P2 estaacute involucrado en actividades
del QS mientras que el promotor P3 se encarga de la expresioacuten de factores de
virulencia (Miller amp Bassler 2002) como produccioacuten de hemolisinas proteasas
lipasas e indirectamente participan en la liberacioacuten de biopeliacuteculas (Quave amp
Horswill 2014) A nivel geneacutetico la induccioacuten del operoacuten agr depende
parcialmente por la unioacuten de los productos geacutenicos del operoacuten sar en los dos
promotores disponibles del operoacuten agr (Manna Bayer amp Cheung 1998)
El promotor P2 es el de importancia para el sistema QS debido a que el transcrito
resultante agrBDCA produce cuatro proteiacutenas AgrB AgrD AgrC y AgrA los
cuales son los componentes principales del sistema de QS de S aureus A
manera de resumen podemos en global que AgrC y AgrA participan como
elementos biosensores mientras que AgrB y AgrD son los elementos necesarios
para la biosiacutentesis de AIP El AgrD es un peacuteptido precursor a la moleacutecula
autoinductora (AIP por sus siglas en ingleacutes) y el AgrB funciona transportadora
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como proteasa y estaacute involucrada en la maduracioacuten del AIP (Gomes-Fernandes
et al 2017 Horswill Stoodley Stewart amp Parsek 2007)
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD
El gen que produce AgrD se expresa y se traduce en una versioacuten propeacuteptido de la
moleacutecula AIP que sufre de una modificacioacuten postraduccionalmente para que sea
bioloacutegicamente activo La moleacutecula AIP inmadura se compone de tres secciones
conocidas como regioacuten del peacuteptido liacuteder regioacuten madura del AIP y secuencia de
reconocimiento que corresponden a las regiones N- central y C-terminales
respectivamente (B Wang amp Muir 2016)
El AgrD es inicialmente procesado en la regioacuten N-terminal (se compone de 32
residuos) y sirve de guiacutea Eacuteste es translocado a la cara externa de la membrana
celular Mientras la regioacuten peptidasa de la proteiacutena transmembranal AgrB
reconoce la regioacuten N-terminal del AIP inmaduro
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA
AgrC y AgrA funcionan en conjunto con un sistema claacutesico de dos componentes
Donde la proteiacutena transmembranal tipo receptor con actividad histidina quinasa
AgrC se encarga de que detectar las moleacuteculas AIP liberadas al exterior por S
aureus una vez acoplado el AIP con el receptor eacuteste uacuteltimo causa una
autofosforilacioacuten del dominio citoplasmaacutetico del AgrC seguido de la transferencia
del grupo fosfato de la proteiacutena reguladora de respuesta de unioacuten al DNA AgrA
Una vez que AgrA es fosforilado (AgrA-P) eacuteste se une a la regioacuten intergeacutenica de
los promotores P2 y P3 del operoacuten agr (Gomes-Fernandes et al 2017)
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada
Bioquiacutemicamente el AgrD inmaduro tiene un tamantildeo entre 46 a 47 residuos seguacuten
su clase Despueacutes de procesamiento AgrD maduro tiene un tamantildeo final entre 7 a
8 aminoaacutecidos (que variacutea seguacuten la clase) y contiene un anillo tiolactonado
producto de la condensacioacuten entre un grupo tiol de una cisteiacutena interna ubicada
cuatro aminoaacutecidos antes del uacuteltimo aminoaacutecido y el grupo carboxilo del uacuteltimo
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aminoaacutecido (que puede ser metionina o fenilalanina dependiendo la clase) (B
Wang Zhao Novick amp Muir 2015)
En AgrC el dominio que contiene los elementos para deteccioacuten del receptor de la
moleacutecula AIP produce diferentes formas de propeacuteptidos De esta manera se
deduce que cada moleacutecula de AIP producida depende de su propia proteiacutena
detectora AgrC Por tanto la presencia en el medio de moleacuteculas de AIP que no
estaacuten filogeneacuteticamente relacionadas resultan en la inhibicioacuten de QS Es decir
miembros productores del mismo tipo de AIP pueden inducir el comportamiento
tiacutepico por QS pero si los productores no pertenecen al mismo grupo se puede
inhibir su respuesta Este fenoacutemeno es conocido como comunicacioacuten cruzada
(Rutherford amp Bassler 2012) La regioacuten hipervariable del operoacuten agr estaacute ubicado
en el transcrito gobernado por el promotor P2 entre los genes agrC agrD y agrB
Consensualmente se ha determinado cuatro grandes clases de AIP y permite
clasificar a los tipos de S aureus en base a esta regioacuten (Shopsin et al 2003)
24 Biosensores de ceacutelulas enteras basados en deteccioacuten de QS
A continuacioacuten presentamos una compilacioacuten de publicaciones de diferentes
ceacutelulas que fueron modificadas para actuar como biosensores capaces de detectar
moleacuteculas producidas por organismos productores de sentildeales quiacutemicas tipo QS
algunos de los ejemplos mencionados cuentan con la capacidad de producir yo
liberar sustancias antimicrobianas capaces de destruir al productor de esas
sentildeales
Balagaddeacute y otros disentildearon un sistema de comunicacioacuten sinteacutetico conocido como
depredador y presa en la que dos ceacutelulas modificadas de E coli son capaces de
comunicarse -y matar a una de ellas- a traveacutes del sistema de QS En este modelo
las ceacutelulas asignadas como depredadoras producen y liberar moleacuteculas tipo QS
que se difunden en el medio y al llegar a la ceacutelula presa por sus mecanismos
internos activan la produccioacuten una toxina especiacutefica para la ceacutelula asignada como
presa provocaacutendoles la muerte celular Por otro lado las ceacutelulas presas para
evitar su muerte temprana deben producir constantemente una proteiacutena antitoxina
que anule la actividad de la toxina (Balagaddeacute et al 2008)
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Saeidi y sus colaboradores crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basados en la
deteccioacuten del QS al modificar ceacutelulas de E coli para que detectaran moleacuteculas
3OC12 HSL producidas por P aeruginosa En este sistema las moleacuteculas QS son
difundidas a traveacutes del medio y son reconocidas por un factor de transcripcioacuten en
E coli que activa una unidad transcripcional para producir piocianina un
antibioacutetico especiacutefico con actividad contra P aeruginosa y porina E7 un agente
liacutetico especiacutefico contra E coli a medida que aumenta la concentracioacuten de la
moleacutecula QS incrementa la concentracioacuten del antibioacutetico y de la porina Cuando
se acumula suficiente cantidad de porinas en el interior celular las ceacutelulas de E
coli son lisadas y se libera piocianina para finalmente atacar a las ceacutelulas de P
aeruginosa (Saeidi et al 2011) Dos antildeos maacutes tarde Gupta y sus colaboradores
modificaron este biosensor agregando un moacutedulo de excrecioacuten que libera una
sustancia antimicrobiana al exterior a traveacutes de un peacuteptido sentildeal y atacar
especiacuteficamente a P aeruginosa evitando la muerte de la ceacutelula productora de
antibioacutetico (S Gupta Bram amp Weiss 2013)
Marchand y sus colegas crearon un sistema de comunicacioacuten interespeciacutefico para
la interaccioacuten entre dos bacterias con oriacutegenes evolutivos diferentes Bacillus
megaterium (Gram positiva) y E coli (Gram negativa) utilizando el mecanismo del
operoacuten agr de S aureus En este reporte ceacutelulas de E coli fungieron como
productoras de moleacuteculas de QS al expresar las proteiacutenas AgrD y AgrB que en
condiciones nativas producen moleacuteculas de AIP en S aureus Mientras que
ceacutelulas de B megaterium fungieron como biosensores al producir las proteiacutenas
AgrC y AgrA que en condiciones nativas sirven como un sistema a dos
componentes que detectan la presencia externa de la moleacutecula de AIP y activan a
un factor de transcripcioacuten (Marchand amp Collins 2013)
Zeng y sus colaboradores crearon un modelo biomatemaacutetico a partir de una E coli
que funcionara como un biosensor de moleacuteculas de AIP producidas por S aureus
que seriacutea contrarrestado por accioacuten de la lisostafina una bacteriocina de actividad
contra S aureus La simulacioacuten del modelo indicoacute que una ceacutelula de E coli podriacutea
tardar hasta 25 horas en detectar las primeras moleacuteculas de AIP producidas de S
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aureus al tiempo que generariacutea la suficiente concentracioacuten de bacteriocinas para
matar a ceacutelulas de S aureus (Zeng et al 2013)
Borrero y sus colegas crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basado en la
deteccioacuten de moleacuteculas de QS para poder contrarrestar moleacuteculas de QS
producidos por un patoacutegeno de intereacutes cliacutenico resistente a los antibioacuteticos En este
caso ceacutelulas modificadas de Lactobacillus lactis fueron capaces de detectar las
moleacuteculas producidas por Enterococcus faecalis El lactobacilo modificado mostroacute
alta efectividad de tres bacteriocinas producidas para controlar el crecimiento de
este patoacutegeno incluyendo sus variedades multirresistentes (Borrero Chen Dunny
amp Kaznessis 2015)
Holowko y sus colegas desarrollaron ceacutelulas de E coli capaces de sentir
moleacuteculas de QS producidas por Vibrio cholerae (Holowko Wang Jayaraman amp
Poh 2016) Mientras que Lubkowicz y sus colaboradores modificaron ceacutelulas de
Lactobacillus reuteri con la capacidad para detectar moleacuteculas de AIP clase I
producidas por S aureus en rangos de concentracioacuten desde la escala nanomolar
hasta micromolar (Lubkowicz et al 2018)
25 Las Bacteriocinas
En contexto a la anterior seccioacuten una fraccioacuten del total de biosensores de ceacutelulas
enteras disentildeados son capaces de producir y excretar sustancias antimicrobianas
que afecten el crecimiento de ceacutelulas productoras de moleacuteculas QS Para fines de
este trabajo nos referimos a las bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
que pertenece a un grupo de peacuteptidos con actividad antimicrobiana con origen
evolutivo en bacterias los cuales seraacuten descritos a continuacioacuten
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas
Las bacteriocinas son un grupo de peacuteptidos de bajo peso molecular que son
producidos exclusivamente y excretados por bacterias y que tienen la capacidad
de inhibir el crecimiento de otra bacteria Las bacteriocinas pueden ser producidas
in situ por bacterias probioacuteticas Al ser de origen proteico las bacteriocinas son
sujetos a modificaciones por Ingenieriacutea Geneacutetica (Cotter Ross amp Hill 2013) Las
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bacteriocinas usualmente actuacutean por permeabilizacioacuten por membrana causada por
su naturaleza catioacutenica al interactuar con la membrana Usualmente las
bacteriocinas son de caraacutecter hidrofoacutebico y anfipaacutetico Su estructura quiacutemica son
generalmente peacuteptidos acoplados con glicoproteiacutenas y lipoproteiacutenas Su punto
isoeleacutectrico estaacute habituado a 81 a 101 usualmente son termoestables y tiene un
rango de pH amplio entre 30 a 90 (Heredia-Castro Heacuternaacutendez-Mendoza
Gonzaacutelez-Coacuterdova amp Vallejo-Cordoba 2017) En la Naturaleza cuando las
bacterias comparten el mismo nicho ecoloacutegicos eacutestas deben luchar y defenderse
de otros y las bacteriocinas son uno de los mecanismos bioloacutegicos reconocidos
(Duffy Schouten amp Raaijmakers 2003)
La disponibilidad de datos en bacteriocinas en la Naturaleza es muy amplio ya que
se presume que un 99 del total de bacterias son productoras de al menos un tipo
de bacteriocina y muchos de ellos permanecen auacuten sin ser descubiertos
(Klaenhammer 1988) Hasta la fecha de acuerdo con datos de bases de datos
sobre bacteriocinas de calidad mundial (actualizado hasta la uacuteltima versioacuten 25 de
junio de 2021) indican que el University of Nebraska Medical Centerrsquos
Antimicrobial Peptide Database (ADP por sus siglas en ingleacutes)
(httpswangapd3commainphp) se mantienen registrados un total de 3257
peacuteptidos antimicrobianos de los seis reinos bioloacutegicos existentes de los cuales
181 son peacuteptidos con actividad anti-MRSA (G Wang Li amp Wang 2016) Aunque
Bactibase (httpbactibasehammamilaborgmainphp) es una base de datos de
bacteriocinas que no se ha actualizado desde 2017 sus datos siguen siendo muy
valiosos ya que nos ofrece una realidad en la ciencia de las bacteriocinas puesto
que la mayoriacutea de las bacteriocinas descubiertas han sido aisladas de bacterias
Gram positivas donde 206 pertenecen a este grupo y 19 a las cepas Gram
negativas El geacutenero maacutes reportado para las bacteriocinas de origen en Gram
positivas son los Lactobacillus seguido de Enterococcus Streptococcus
Lactococcus y el geacutenero Bacillus mientras que el geacutenero maacutes reportado para las
bacteriocinas de origen en Gram negativas es Escherichia El tamantildeo promedio de
las bacteriocinas es de 43 residuos (Hammami Zouhir Le Lay Ben Hamida amp
Fliss 2010)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 17
Un buen nuacutemero de bacteriocinas han sido previamente reportadas como agentes
terapeacuteuticos puesto que se han utilizado en dosis hasta cien veces superiores al
valor de concentracioacuten miacutenima inhibitoria reportado sin presentar efectos
citotoacutexicos en liacuteneas celulares eucarioacuteticas (Hols Ledesma-Garciacutea Gabant amp
Mignolet 2019) ni en tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Por
ejemplo la nisina la bacteriocina maacutes famosa en la industria y en el mundo ha
sido declarado por la Administracioacuten de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA por sus siglas en ingleacutes) como sustancia Generalmente Reconocida
como Segura (GRAS por sus siglas en ingleacutes) para su uso como conservador de
alimentos (Cotter Hill amp Ross 2005) Se sabe que la mayoriacutea de las bacteriocinas
han tenido un largo historial de seguridad (Silva Silva amp Ribeiro 2018) Sin
embargo a pesar de la gran disponibilidad de datos de ensayos en bacteriocinas
recientemente se ha manifestado la urgencia de incrementar y explorar su uso en
modelos in vivo para evaluar su eficacia como agentes antimicrobianos y evaluar
los posibles efectos secundarios los cuales son necesarios para asegurar su eacutexito
como candidatos potenciales a agentes terapeacuteuticos en su lucha contra
infecciones resistentes a los antibioacuteticos (Beniacutetez-Chao Leoacuten-Buitimea Lerma-
Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2021)
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos
Los peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos son sustancias de origen
bioloacutegico que cumplen con el mismo papel de defensa lo cierto es que existen
claras diferencias entre ellas que dependen de su origen composicioacuten quiacutemica
entre maacutes factores A continuacioacuten se ofrece una breve explicacioacuten entre los
diferentes tipos de sustancias antimicrobianas
Los Peacuteptidos Antimicrobianos (AMP antimicrobial peptides) tambieacuten conocidos
como peacuteptidos de autodefensa (HDP host defense peptide) son peacuteptidos
producidos por un hospedero y son parte del sistema inmune al conferirles
capacidades defensivas Son de un rango de tamantildeo entre 10 a 60 residuos en
promedio 3326 residuos que estaacuten compuestas mayoritariamente por α-heacutelices
con cargas positivas (catioacutenicas) o anfipaacuteticas (cargas hidrofoacutebicas e hidrofiacutelicas)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 18
tambieacuten existen referentes con carga anioacutenica Los AMP estaacuten clasificados seguacuten
su origen ya que estaacuten ubicuamente presentes en todos los reinos bioloacutegicos
como mamiacuteferos plantas microorganismos acuaacuteticos insectos yo anfibios
seguacuten su actividad ya que pueden ser antibacterianos antifuacutengicos
antiinflamatorios antivirales antiparasitarios yo anticanceriacutegenos seguacuten su
estructura como tipo lineal con estructurales secundarias con α-heacutelices y β-tiras
plegadas y por seguacuten por el tipo dominante de aminoaacutecidos como glicina arginina
prolina histidina y triptoacutefano (Huan Kong Mou amp Yi 2020 Lei et al 2019)
Si el AMP es de origen evolutivo bacteriano se les conoce como bacteriocinas Los
oriacutegenes pueden ser por bacterias Gram positivas como negativas incluyendo
miembros del dominio de las Archaea (Chikindas Weeks Drider Chistyakov amp
Dicks 2018) Sin embargo cuando el AMP es de origen eucarioacutetico existen tres
clasificaciones defensinas (Shafee Lay Hulett amp Anderson 2016) histatinas o
catelicidinas (De Smet amp Contreras 2005) Existen intermediarios evolutivos como
las bacteriocinas tipo defensina que son un grupo de bacteriocinas que comparte
los puentes de disulfuro en las mismas posiciones que podriacutean observarse en las
defensinas (Baindara et al 2016 Sugrue OrsquoConnor Hill Stanton amp Paul Ross
2020)
Tanto las bacteriocinas como los antibioacuteticos comparten funcionalidad bioloacutegica al
ser ambas sustancias que nulifican o matan a otras poblaciones pero existen
diferencias muy marcadas entre ellas puesto que las bacteriocinas son
sintetizadas como metabolitos primarios mientras que los antibioacuteticos son
secundarios El espectro de accioacuten de las bacteriocinas es mucho maacutes reducido
que los antibioacuteticos eacutestos uacuteltimos son muy amplios El grado de actividad es
mucho maacutes intenso entre bacteriocinas ya que su rango de accioacuten se encuentra
en el orden de los nano a micro molar mientras que los antibioacuteticos son rango de
accioacuten estaacute ranqueado entre los micro y milimolar Debido a su origen proteico las
bacteriocinas son altamente propensas a ser degradados por enzimas Sin
embargo las bacteriocinas son maacutes termodinaacutemicamente estables y con una
actividad maacutes amplia de pH que los antibioacuteticos Las bacteriocinas atacan
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 19
generalmente la membrana extracelular generando poros mientras que los
antibioacuteticos pueden atacar la membrana tambieacuten yo atacar blancos intracelulares
Se conoce que las bacteriocinas presentan baja o nula toxicidad en comparacioacuten
con los antibioacuteticos (Perez Zendo amp Sonomoto 2014)
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes
En la actualidad diversos estudios enfocados en bacteriocinas se han enfocado
en su actividad contra cepas de S aureus resistentes a los antibioacuteticos Por
ejemplo la lisostafina fue utilizado el control de S aureus ATCC 29740 (Oldham amp
Daley 1991) mientras que la pentocina JL-1 ha sido efectivo para el control de S
aureus multirresistente (Jiang Zou Cheng Fang amp Huang 2017) La bacteriocina
entianina mostroacute actividad contra MRSA (ATCC 43300) (S W Fuchs et al 2011)
La epidermicina NI01 mostroacute actividad contra MRSA (Sandiford amp Upton 2012)
Asiacute tambieacuten como las enterocinas DD28 y DD93 con actividad anti estafilocoacutecica
contra ceacutelulas MRSA (Al Atya et al 2016)
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos
Las bacteriocinas son un grupo muy bien definido de peacuteptidos antimicrobianos que
tienen su origen evolutivo en bacterias y en algunas arqueobacterias Por sus
caracteriacutesticas proteicas las bacteriocinas son elementos geneacuteticos que pueden
ser faacutecilmente modificados por teacutecnicas de Ingenieriacutea geneacutetica (Cotter et al
2013) Las caracteriacutesticas generales de las bacteriocinas son que su espectro de
accioacuten es actuar tanto en las bacterias Gram positivas como negativas Su modo
de actividad por actividad bactericida o bacteriostaacutetico Su mecanismo de accioacuten
es por permeabilizacioacuten de membrana creando lisis celular Su estructura
bioquiacutemica es muy variada que pueden ser peacuteptidos glicoproteiacutenas y
lipoproteiacutenas Son de peso molecular variable sin embargo las bacteriocinas de
origen en Gram positivas son de tamantildeo pequentildeo Debido a su naturaleza
proteica las bacteriocinas son susceptibles al corte proteoliacutetico y altamente
estables a altas temperaturas (Heredia-Castro et al 2017)
Entre algunas de las bacteriocinas que se han utilizado para el control de
patoacutegenos resistentes estaacute la bacteriocina AS-48 la cual ha sido ampliamente
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 20
utilizado contra cepas de referencia y cliacutenicos para Mycobacterium tuberculosis
(Aguilar-Peacuterez et al 2018) Otro ejemplo es la pentocina JL-1 ha demostrado
tener actividad contra diferentes cepas bacterianas (Jiang et al 2017) Entianina
ha mostrado actividad contra Enterococcus faecalis resistente a vancomicina
(ATCC 51299) (S W Fuchs et al 2011) Las klebcinas poseen actividad contra
especies resistentes y multirresistentes de cepas del geacutenero Klebsiella
(Denkovskienė et al 2019) La lista de bacteriocinas reportadas como efectivas
contra patoacutegenos resistentes de relevancia cliacutenica es muy larga y que puede ser
observada en la literatura correspondiente (Cui et al 2012 Gabrielsen Brede
Nes amp Diep 2014 Newstead Varjonen Nuttall amp Paterson 2020 Perez et al
2014)
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas
Las bacteriocinas pueden ser producidos tanto por microorganismos Gram
positivos como negativos inclusive por miembros del dominio Archaea (Chikindas
et al 2018)
Hasta el diacutea de hoy no hemos encontrado un oacutergano internacional que regule la
clasificacioacuten de las bacteriocinas maacutes que lo propuesto en grupos de investigacioacuten
ligados a la ciencia de las bacteriocinas Las bacteriocinas con origen evolutivo en
organismos Gram positivos estaacuten actualmente clasificados en cuatro grandes
clases la clase I corresponde a bacteriocinas modificadas postraduccionalmente
de muy bajo peso molecular (lt5 kDa) la clase II se refiere a bacteriocinas
termoestables no modificadas de bajo peso molecular (lt10 kDa) la clase III
contiene bacteriocinas termosensibles de alto peso molecular (gt10 kDa) y por
uacuteltimo la clase IV se compone de proteiacutenas acomplejadas con carbohidratos o
liacutepidos (Newstead et al 2020 Perez et al 2014)
Dada la diversidad de bacteriocinas para fines de este trabajo solo nos
enfocaremos en las bacteriocinas tipo II de las Gram positivas ya que se clasifican
en cuatro grandes subclases La clase IIa representa la familia de las
bacteriocinas con actividad antilisteria por su actividad especiacutefica contra cepas de
Listeria monocytogenes y ademaacutes porque se mantiene un dominio conservado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 21
YGNGV conocido como la caja de pediocina y que ubica en extremo N-terminal
Uno de los ejemplos maacutes reconocidos es la enterocina NKR-5-3C La clase IIb
representa a las bacteriocinas compuestas por dos peacuteptidos que en siacute son dos
peacuteptidos diferentes que actuacutean sineacutergicamente para atacar a un blanco como
lactococcin Q que se compone de los peacuteptidos lactococcina Qα y lactococcin Qβ
La clase IIc se relaciona con las bacteriocinas circularizadas que estaacuten unidas de
extremo a extremo como lactociclina Q y leucociclina Q La clase IId se compone
de bacteriocinas sin peacuteptido liacuteder y que se sintetizan sin una secuencia liacuteder en su
extremo N-terminal Algunos ejemplos son la weissllicina Y weissllicina M
leucocina Q leucocina N lacticina Z y lacticina Q (Perez et al 2014)
256 La bacteriocina Lacticina Q
La lacticina Q (LnqQ) es una bacteriocina que fue por vez descubierta por Fujita y
sus colaboradores en el 2007 Esta bacteriocina fue aislada por primera vez por
Lactococcus lactis QU5 una cepa Gram positiva que fue aislada de una muestra
de maiacutez fresco recolectado en campos agriacutecolas de la comunidad de Aso en
Kumamoto Japoacuten La composicioacuten bioquiacutemica de LnqQ es que se trata de peacuteptido
lineal compuesto por 53 residuos y con un peso molecular de 592050 Da (Fujita
et al 2007) La estructura tridimensional descubierta por Acedo y otros revela
que es una proteiacutena globular que se compone de cuatro α-heacutelices cuya superficie
es altamente catioacutenica y su nuacutecleo hidrofoacutebico Esta secuencia presenta una
carga neta +6 y su pI = 108 (Acedo et al 2016)
Esta bacteriocina ha mostrado ser un peacuteptido antimicrobiano con alta efectividad
contra bacterias Gram positivas siendo antagonista de uno los principales
patoacutegenos reportados en cliacutenicas como S aureus Por ejemplo se han registrado
diversos rangos de concentracioacuten miacutenima inhibitoria (MIC) de la LnqQ como 8 microM
contra S aureus ATCC 6538 y 32 microM contra S aureus ATCC 29213 (Acedo et al
2016) Tambieacuten se ha reportado 18 microM (Fujita et al 2007) o 10 microgml (Ma Yu
Han Wang amp Zhang 2012) contra S aureus ATCC 12600
Se conoce que la LnqQ genera alta permeabilidad en la membrana sin necesidad
de anclarse sobre moleacuteculas especiacuteficas como el Liacutepido II (Yoneyama Imura
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 22
Ichimasa et al 2009) Posteriormente se determinoacute que el mecanismo de accioacuten
es a traveacutes de un modelo conocido como Poro Toroidal Enorme (HTP huge
toroidal pore) donde las estructuras α-heacutelices cargadas positivamente y presentes
en la LnqQ se unen covalentemente hacia la membrana celular que estaacute cargada
negativamente y entonces genera un poro en forma de toroide enorme de 46 a
66 nm de diaacutemetro generando una estructura conocida como lipid flip-flop lo que
permite el goteo de moleacuteculas intercelular de manera que la ceacutelula muere La
translocacioacuten del peacuteptido desde el exterior a la cara interna de la ceacutelula ocurre
sincroacutenicamente con la formacioacuten del poro toroidal (Yoneyama Imura Ohno
et al 2009) En un estudio a nivel in vitro se determinoacute que cuando LnqQ es
agregado a niveles MIC sobre cultivos bacterianos sensibles aumenta la
acumulacioacuten de radicales libres tipo hidroxilos y por consecuencia la ceacutelula muere
(Li et al 2013)
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados
Las bacteriocinas son sustancias toacutexicas que pueden atacar a su microorganismo
productor si eacuteste no cuenta con caracteriacutesticas que le permitan resistir (Ishibashi
et al 2014 Iwatani et al 2012 Ladjouzi Lucau-Danila Benachour amp Drider
2020 Mesa-Pereira et al 2017 Nascimento et al 2012) De manera que todos
los operones de las bacteriocinas se componen habitualmente de los siguientes
elementos geneacuteticos promotor gen estructural (bacteriocina) genes de
inmunidad genes de transporte una proteiacutena accesoria y un terminador de la
transcripcioacuten (Mesa-Pereira et al 2017)
La LnqQ no es ninguna excepcioacuten a la regla ya que similar a otras bacteriocinas
la produccioacuten secrecioacuten y autoinmunidad estaacute regulado por el cluacutester geneacutetico
lnqRQBCDEF que se encuentra en Lactococcus lactis QU5 y que descubierto por
Iwatani y otros en el 2012 (Iwatani et al 2012) Al diacutea de hoy auacuten no estaacute del todo
bien determinado la funcionalidad de los elementos que conforman el operoacuten pero
se sabe que el cluacutester lnqQBCDEF es esencial para la completa produccioacuten de
LnqQ mientras que los productos LnqEF son esenciales y los productos LnqBCD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 23
estaacuten parcialmente involucrados en la inmunidad y secrecioacuten de la bacteriocina
(Iwatani Horikiri Zendo Nakayama amp Sonomoto 2013)
26 Produccioacuten heteroacuteloga de bacteriocinas
Entre las virtudes observadas en las bacteriocinas estaacuten en que gozan de una
excelente reputacioacuten en seguridad bioloacutegica (Silva et al 2018) y de una gran
diversidad de bancos de datos sobre bacteriocinas (Hammami et al 2010 G
Wang et al 2016) Estos datos pueden apoyar para el disentildeo y construccioacuten de
bacteriocinas de novo (Fields et al 2020) Sin embargo a la fecha una cantidad
raquiacutetica de bacteriocinas han sido capaces de ser producidos en masa siendo la
nisina y la pediocina PA-1 las uacutenicas bacteriocinas en destacar industrialmente
Una de las hipoacutetesis que maacutes planteada supone que las bacteriocinas no han
destacado en el mercado porque eacutestas deben de producirse en altas cantidades y
con suficiente actividad bioloacutegica y en los organismos nativos este proceso se
considera que es un desgaste energeacutetico significativo ya que el rendimiento
productivo es usualmente bajo (Mesa-Pereira Rea Cotter Hill amp Ross 2018)
Desde la fundacioacuten de la Ingenieriacutea Geneacutetica las proteiacutenas han sido objeto de
muacuteltiples modificaciones para aumentar su produccioacuten y purificacioacuten utilizando
diversos sistemas bioloacutegicos productores desde sistemas procariotas como E coli
hasta sistemas eucariotas como ceacutelulas de levaduras o inclusive en liacuteneas
celulares eucariotas A pesar del avance actual que existen ya en estas teacutecnicas
la produccioacuten de proteiacutenas puede presentar incluso problemas de rutina en
laboratorios dedicados a este campo como la formacioacuten de cuerpos de inclusioacuten
toxicidad o baja produccioacuten de proteiacutenas (Bell Engleka Malik amp Strickler 2013)
En este trabajo nos hemos enfocado en la exploracioacuten de un peacuteptido sentildeal N-
AmyE y un peacuteptido de fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de la bacteriocina
LnqQ tanto en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica de ceacutelulas de E coli Nuestro
objetivo es que la aplicacioacuten de las etiquetas en la produccioacuten de la bacteriocina
permita la produccioacuten y purificacioacuten de LnqQ en ceacutelulas de E coli mientras
mantiene su funcionalidad bioloacutegica bactericida contra cultivos de S aureus En
este capiacutetulo presentaremos antecedentes relacionados al peacuteptido sentildeal N-AmyE
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 24
y al peacuteptido de fusioacuten SmbP asiacute como los disentildeos bioinformaacuteticos utilizados para
la construccioacuten de las etiquetas con la bacteriocina se incluyen ensayos in silico
predictivos para estimar la estructura tridimensional de la bacteriocina con su
etiqueta asiacute como ensayos para estimar el corte
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE es un dominio proteico localizado en la regioacuten N-terminal
de la α-amilasa (AmyE) (Yang Galiii amp Henner 1983) Bioquiacutemicamente la AmyE
es una enzima (1 4-α-D-glucano-glucanohidrolasa EC 3211) cuya funcioacuten es
catalizar la hidroacutelisis de enlaces glicosiacutedicos (α-14) del almidoacuten para producir
glucosa y dextrinas (R Gupta Gigras Mohapatra Goswami amp Chauhan 2003)
La secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica de algunas AmyE fueron reportadas
desde hace varias deacutecadas Por ejemplo en 1983 Yang y sus colaboradores
reportaron la secuencia nucleotiacutedica del AmyE de la cepa Bacillus subtilis 1A289
(Yang et al 1983) Antildeos maacutes tarde en 1988 Emori y sus colegas tambieacuten
reportaron la secuencia nucleotiacutedica completa de la variante producida por la cepa
de B subtilis 2633 (Emori amp Maruo 1988)
La existencia del peacuteptido sentildeal N-AmyE de la α-amilasa fue propuesta por Yang y
sus colaboradores cuando develaron la secuencia nucleotiacutedica completa del
mismo argumentando que el presunto peacuteptido sentildeal debiacutea tener un tamantildeo de 32
aminoaacutecidos Tambieacuten observaron que AmyE podriacutea expresarse en ceacutelulas de
otras especies como E coli manteniendo su actividad bioloacutegica (Yang et al 1983)
La utilidad biotecnoloacutegica del peacuteptido sentildeal N-AmyE es porque se ha reportado
que es funcionalmente activo tanto en Bacillus subtilis como en E coli ya que al
fusionarse eacutesta con la regioacuten N-terminal de una proteiacutena de intereacutes biotecnoloacutegico
estaacute puede ser liberado al medio extracelular Por ejemplo al fusionar el peacuteptido
sentildeal N-AmyE con una β-lactamasa eacutesta es capaz de excretarse al medio
extracelular tanto en ceacutelulas de B subtilis como de E coli Sin embargo el sitio de
reconocimiento para el corte del peacuteptido sentildeal difiere entre ambos tipos de ceacutelulas
(Nakazawa Takano Sohma amp Yamane 1986) Un anaacutelisis multivariado de datos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 25
determinoacute que las secuencias nucleotiacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en su seccioacuten N-terminal tienden a ser excretados en el periplasma y en la
seccioacuten extracelular de E coli (Sjoumlstroumlm Wold Wieslander amp Rilfors 1987)
El mecanismo de corte hidroliacutetico por el que el peacuteptido sentildeal N-AmyE se separa de
la amilasa AmyE es debido a su estructura secundaria y a la presencia de un
dominio rico en alaninas (aminoaacutecido apolar) en el extremo C-terminal de del
peacuteptido N-AmyE Sin embargo el patroacuten de corte enzimaacutetico difiere seguacuten el tipo
organismo donde sea expresado ya que el sitio de corte oacuteptimo de este peacuteptido
se encuentra entre Ala33 y X34 cuando se expresa en B subtilis pero en E coli la
AmyE tiende a cortarse entre Ala31 y un aminoaacutecido cual sea (X) (Sakakibara
Tsutsumi Nakamura amp Yamane 1993)
En el 2005 el peacuteptido sentildeal N-AmyE reportado por Yang y otros fue acoplado en
la regioacuten N-terminal de una liasa de pectina para permitir su expresioacuten en ceacutelulas
de E coli (DE3) en la regioacuten periplaacutesmica Los resultados de ese estudio indicaron
que se logroacute la excrecioacuten efectiva de la liasa de pectina al medio extracelular
espacio periplaacutesmico citoplasma y a nivel membranal de E coli despueacutes de haber
sido inducido por con IPTG (R M Papi Chaitidou Trikka amp Kyriakidis 2005)
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP
La mayoriacutea de peacuteptidos de fusioacuten utilizados para la expresioacuten de proteiacutenas
recombinantes son el Dominio de Unioacuten a Celulosa (CBDcenA) Glutatioacuten-S-
Transferasa (GST) Proteiacutena de Unioacuten a Maltosa (MBP) tiorredoxina (TRX) y las
Proteiacutenas Modificadoras tipo Ubiquitina de Tamantildeo Pequentildeo (SUMO) (Mesa-
Pereira et al 2018) o la regioacuten citoplasmaacutetica del proteiacutena pequentildea de unioacuten a
metales SmbP (Vargas-Cortez Morones-Ramirez Balderas-Renteria amp Zarate
2016) a continuacioacuten ofrecemos maacutes informacioacuten relacionada al uacuteltimo peacuteptido de
fusioacuten
En el 2004 Barney y sus colaboradores describieron a la Proteiacutena Pequentildea de
Unioacuten a Metales en el periplasma de Nitrosomonas europaea Esta proteiacutena posee
un peso molecular de 99 kDa y presenta una inusual cantidad de residuos de
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 26
histidina (17) seguido de alanina (16) glutamato (14) glicina (11) y lisina
(9) los cuales componen el 67 de la composicioacuten total de residuos Esta
proteiacutena carece naturalmente de metionina y de cisteiacutenas Estructuralmente se
trata de una unidad monomeacuterica compuesta por 93 residuos cuya principal
caracteriacutestica es una regioacuten compuesta de 10 repeticiones secuenciales cada una
con motivo de siete aminoaacutecidos donde el cuarto residuo es una histidina
conservada estos motivos permiten la estabilizacioacuten de un nuacutecleo hidrofoacutebico
Como su nombre lo establece esta proteiacutena posee alta afinidad a metales
divalentes como Cu2+ Ni2+ Zn2+ y de otras valencias como Fe3+ (Barney LoBrutto
amp Francisco 2004) Esta proteiacutena ha sido utilizada para la expresioacuten periplaacutesmica
y posterior purificacioacuten de Hormona de Crecimiento Humano (hGH)
bioloacutegicamente activa (Perez-Perez et al 2020)
En 2015 el dominio periplaacutesmico de la SmbP que corresponde a la seccioacuten maacutes
proacutexima al extremo N-terminal en la estructura lineal del mismo fue removido por
Vargas y sus colaboradores manteniendo uacutenicamente el dominio citoplasmaacutetico
de la SmbP citoplasmaacutetica (SmbP) Eacutesta uacuteltima es uacutetil como etiqueta de afinidad
para teacutecnicas de cromatografiacutea de afinidad con iones metaacutelicos inmovilizados
(IMAC por sus siglas en ingleacutes) Esta proteiacutena fue reportada como efectiva para la
expresioacuten citoplaacutesmica de proteiacutenas en E coli como RFP GFP SHY2 NDPK2 y
LovR (Vargas-Cortez et al 2016)
Recientemente la SmbP fue utilizada por primera vez para la produccioacuten del
peacuteptido antimicrobiano Bin1b utilizando E coli como hospedero para la
sobreproduccioacuten El peacuteptido fue sobre producido y purificado mostrando actividad
antimicrobiana contra E coli y S aureus (Montfort-Gardeazabal Balderas-
Renteria Casillas-Vega amp Zarate 2021)
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS
31 Justificacioacuten
La idea de disentildear y utilizar un biosensor de ceacutelula para controlar cultivos de
MRSA es porque las moleacuteculas sentildealizadoras del QS se han reportado como
estiacutemulos quiacutemicos para ser reconocidos como ceacutelulas enteras vivas modificadas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 27
para su reconocimiento Ademaacutes de que ya se han reportado diversos biosensores
completos de ceacutelulas que pueden producir y excretar bacteriocinas capaces de
matar a microorganismos multirresistentes productores de sentildeales QS
La decisioacuten de inclinarnos hacia las bacteriocinas como patoacutegenos es porque
atacan un espectro limitado de bacterias dentro de una comunidad microbioloacutegica
y no ocurre de manera simultaacutenea en un espectro amplio como ocurre
habitualmente con los antibioacuteticos lo que promueve una mayor probabilidad de
seleccioacuten de mutantes que puedan conferir resistencia Ademaacutes las bacteriocinas
estaacuten constantemente evolucionando y permiten a sus productores combatir
contra patoacutegenos de resistencia emergentes (Riley et al 2012)
Las bacteriocinas han mostrado ademaacutes ser potenciales agentes terapeacuteuticos ya
que no afectan tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Incluso las
bacteriocinas se han administrado en concentraciones tan altas como 100 veces
superiores al MIC originalmente reportado con nulos efectos citotoacutexicos en liacuteneas
celulares eucarioacuteticas (Hols et al 2019) Ademaacutes la mayoriacutea de los productores
nativos en bacteriocinas poseen un excelente historial en seguridad (Silva et al
2018)
La propuesta de etiquetar bacteriocinas con un peacuteptido sentildeal es porque durante el
proceso de recuperacioacuten previo a la purificacioacuten es comuacuten encontrar una baja
cantidad de proteiacutenas y ademaacutes proteasas que disminuyen el rendimiento
productivo Con el peacuteptido sentildeal la purificacioacuten de las proteiacutenas se simplifica
porque son faacutecilmente recuperadas de la fraccioacuten periplaacutesmica seguido un choque
osmoacutetico sin la necesidad de lisar toda la ceacutelula (Ramanan et al 2010) mientras
que la decisioacuten de antildeadir peacuteptidos de fusioacuten en los disentildeos geneacuteticos es porque se
trata de etiquetas que se colocan en la regioacuten N-terminal o C-terminal de una
proteiacutena con intereacutes biotecnoloacutegico Estos peacuteptidos representan un meacutetodo
recurrente en la sobreexpresioacuten de bacteriocinas porque ayudan en la purificacioacuten
aumentan la expresioacuten proteica mejoran la solubilidad permiten que la proteiacutena
sea producida en un estado similar al nativo incrementan el rendimiento de
produccioacuten y disminuyen su degradacioacuten (Mesa-Pereira et al 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 28
32 Hipoacutetesis
El disentildeo de un biosensor construido a base de ceacutelulas enteras E coli modificadas
pronostica indica que funcionaraacute como alarma bioloacutegica al detectar moleacuteculas de
QS de S aureus En consecuencia liberaraacute un compuesto antimicrobiano con
actividad especiacutefica contra el organismo blanco El peacuteptido antimicrobiano seraacute
validado experimentalmente a traveacutes del peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de
fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de LnqQ en E coli que seraacute producido
en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica respectivamente
33 Objetivo General
Presentar el disentildeo in silico de un mecanismo biosensor basado en el sistema de
quorum sensing de S aureus para producir Lacticina Q y producir
experimentalmente este peacuteptido antimicrobiano tanto en la regioacuten periplaacutesmica
como citoplaacutesmica de E coli
34 Objetivos Especiacuteficos
1 Disentildear el moacutedulo geneacutetico biosensor para detectar la presencia externa de
moleacuteculas autoinductoras (AIP) producidos por MRSA
2 Disentildear el moacutedulo geneacutetico de bacteriocinas para liberar lacticina Q (LnqQ)
en funcioacuten a la concentracioacuten externa de moleacuteculas AIP producidos por
MRSA
3 Disentildear un vector de expresioacuten que contenga ambos moacutedulos geneacuteticos
tanto biosensor como de bacteriocinas
4 Predecir la especificidad teoacuterica del biosensor completo de ceacutelulas enteras
entre diferentes sentildeales de QS
5 Predecir la solubilidad y localizacioacuten subcelular de cada una de las
proteiacutenas utilizadas para el disentildeo del moacutedulo biosensor y el moacutedulo de
bacteriocina
6 Predecir la existencia de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B y nivel de alergenicidad
en la LnqQ producida en E coli
7 Disentildear el vector de expresioacuten pETNL que contenga el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en conjunto con el LnqQ acoplado con una etiqueta de polihistidina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 29
8 Disentildear el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ que contenga el peacuteptido de
fusioacuten SmbP en conjunto con el LnqQ
9 Construir los vectores de expresioacuten pETNL y pSmbP-LnqQ y transformar
ceacutelulas de E coli
10 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten periplaacutesmica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pETNL
11 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten citoplasmaacutetica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ
35 Metas
En un periacuteodo a tres antildeos nos propusimos alcanzar las siguientes metas
bull Disentildear in silico un sistema biosensor en E coli capaz de sentir moleacuteculas
de Quorum Sensing producidas por S aureus y producir una sustancia
antimicrobiana en funcioacuten a la concentracioacuten externa de las moleacuteculas QS
bull Predecir la capacidad del peacuteptido sentildeal N-AmyE y del peacuteptido de fusioacuten
SmbP para producir bacteriocinas en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica
de E coli respectivamente
bull Presentar los resultados obtenidos en al menos un artiacuteculo de investigacioacuten
con arbitraje internacional
bull Cumplir con eacutexito el examen predoctoral
bull Obtener el grado de Doctor en Ciencias con Orientacioacuten en Microbiologiacutea
36 Aportacioacuten cientiacutefica
Nuestra aportacioacuten consiste en presentar el disentildeo y el trabajo teoacuterico necesario
para la construccioacuten de un biosensor de ceacutelulas enteras basado en quorum
sensing capaz de producir bacteriocinas en funcioacuten a la concentracioacuten disponible
de moleacuteculas tipo QS evitando asiacute la sobreproduccioacuten yo goteo de bacteriocinas
que pueden contribuir a la resistencia en patoacutegenos Asiacute tambieacuten experimentamos
en peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP para validarlos como una
herramienta bioloacutegica para la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas en ceacutelulas
modificadas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 30
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
La idea de disentildear un biosensor basado en ceacutelulas enteras surge al yuxtaponer
dos enfoques usados para tratar enfermedades resistentes a los antibioacuteticos que
es mediante el uso de organismos bioloacutegicamente activos con bacteriocinas (Allen
et al 2014)
En este sentido tenemos dos ceacutelulas independientes que son reconocidas como α
y β respectivamente (Figura 1) las ceacutelulas α que corresponden a un productor
de sentildeales tipo QS liberan moleacuteculas de sentildealizacioacuten al medio externo mientras
que las ceacutelulas β que corresponden al biosensor son emulados para detectar
moleacuteculas de QS de las ceacutelulas α En respuesta a esta deteccioacuten los mecanismos
internos de las ceacutelulas β producen y excretan una toxina especiacutefica contra las
ceacutelulas α y asiacute controlar su crecimiento poblacional
Figura 1 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
Ceacutelulas β fungen como sistema de deteccioacuten y destruccioacuten al reconocer moleacuteculas de reconocimiento tipo QS
producidos por ceacutelulas α y causar su muerte
42 Cepas bacterianas
Nosotros designamos a E coli (BL21) DE3 como chasis bioloacutegico porque ha sido
ampliamente reconocido para la sobreproduccioacuten de bacteriocinas recombinantes
(Mesa-Pereira et al 2018) Para el disentildeo del moacutedulo biosensor optamos por
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 31
utilizar los datos anotados del genoma de la cepa S aureus N315 una cepa
reconocida como MRSA y que ha sido reportado como unas de las principales
causas de infecciones resistentes a meticilina asociado a comunidad (CA-MRSA)
y a hospitales (HA-MRSA) (Kuroda et al 2001) Para el disentildeo del moacutedulo de
bacteriocina utilizamos los datos bioinformaacuteticos del cluacutester de genes lnqQBCDEF
de L lactis QU5 que permiten la produccioacuten y excrecioacuten la LnqQ asiacute como para su
autoinmunidad (Fujita et al 2007 Iwatani et al 2012) Abajo se presentan los
disentildeos de ambos moacutedulos asiacute como la estrategia general para su ensamblado en
un vector de expresioacuten
La cepa de E coli BL21 (DE3) fue seleccionada para ensayos de expresioacuten
proteica con el peacuteptido sentildeal N-AmyE o con el peacuteptido de fusioacuten SmbP La cepa E
coli DH5 fue utilizada para ensayos de clonacioacuten La cepa E coli Origami fue
escogida para produccioacuten de proteiacutenas problemaacuteticas
Un cultivo de E coli BL21 (DE3) fue amablemente donado por el Instituto
Tecnoloacutegico de Monterrey (Monterrey Nuevo Leoacuten) La cepa de E coli DH5α fue
recuperada de un stock de cultivos de nuestro laboratorio en el CIBYN (Apodaca
Nuevo Leoacuten) La cepa E coli Origami fue compartida por el Dr Xristo Zaacuterate de la
UANL (Monterrey Nuevo Leoacuten) Todas las cepas fueron mantenidas y crecidas en
caldo LB o suplementado con agar (2) a 37degC en condiciones aeroacutebicas
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina
Tanto los moacutedulos biosensor como el de bacteriocina fueron disentildeados de la
siguiente manera contienen un promotor un sitio de unioacuten al ribosoma gen
estructural y un terminador doble de transcripcioacuten Los disentildeos fueron elaborados
bajo la herramienta bioinformaacutetica SnapGene 113 en el formato correspondiente
Todos los datos bioinformaacuteticos utilizados para ambos disentildeos fueron recuperados
de alguna de las siguientes bases de datos Massachussets Institute of
Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts (SBP) (httppartsigemorg)
(Galdzicki Rodriguez Chandran Sauro amp Gennari 2011) Kyoto Encyclopedia
Genes and Genomes (KEGG) (httpswwwgenomejpkegg) (Kanehisa amp Goto
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 32
2000) FP Base (FPB) (httpswwwfpbaseorg) (Lambert 2019) y GenBank
(httpswwwncbinlmnihgovgenbank) (Clark Karsch-Mizrachi Lipman Ostell amp
Sayers 2016) y Protein Data Bank (PDB) (httpswwwrcsborg) (Berman et al
2000)
Para el disentildeo del moacutedulo biosensor usamos los datos del promotor constitutivo
de E coli J23110 (SBP no BBa_J23110) como regulador transcripcional de los
genes del operoacuten agrC y agrA Nosotros utilizamos la secuencia nucleotiacutedica y
aminoaciacutedica del agrC (KEGG no SA1843) que se compone de 1116 nucleoacutetidos
y 371 residuos respectivamente y tambieacuten de la informacioacuten disponible para la
agrA (KEGG no SA1844) que se compone de 717 nucleoacutetidos y 238 residuos Los
sitios de unioacuten a ribosoma (SBP no BBa_B0034) fueron colocados entre cada gen
estructural y al final de la unidad transcriptoacutemica se colocoacute un doble terminador de
transcripcioacuten (SBP no BBa_B0015) tanto el moacutedulo biosensor como en moacutedulo
de bacteriocina
Para el disentildeo del moacutedulo de bacteriocina utilizamos los datos del promotor
inducible P2 del MRSA para regular la expresioacuten del cluacutester geneacutetico lnqQBCDEF
y el gen reportero gfp Debido a que la secuencia del promotor P2 no se
encontraba disponible de manera que primero tuvimos que localizar la regioacuten en
el archivo genoacutemico de la MRSA (GenBank no BA0000183) los resultados de
este punto seraacuten explicados maacutes a fondo en la seccioacuten correspondiente
Para la seccioacuten estructural del moacutedulo de bacteriocina buscamos el archivo
bioinformaacutetico que contuviera los genes estructurales secrecioacuten y de auto
inmunidad del cluacutester lnqQBCDEF (GenBank no AB7123931) El archivo original
fue manipulado para seccionar los elementos geneacuteticos que pertenecen al cluacutester
esta informacioacuten seraacute explicada con maacutes detalle
Por uacuteltimo usamos la secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica del gen monomeacuterico
gfp (FPBase no QKFJN) como reportero de Aequorea victoria (Zacharias Violin
Newton amp Tsien 2002) Esta proteiacutena es monomeacuterica posee un peso molecular
en 270 kDa El valor maacuteximo de excitacioacuten es λ = 488 nm mientras que el valor
maacuteximo de emisioacuten es λ = 507 nm El coeficiente de extincioacuten es 56000 M-1cm-1
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 33
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
El plaacutesmido de AddGene (httpswwwaddgeneorg) (AddGene no 116850) fue
utilizado para la construccioacuten in silico de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
dentro de un plaacutesmido al cual nos referiremos a partir de ahora como plaacutesmido
Dual Biosensor Killer (DBK) Este plaacutesmido fue disentildeado en la aplicacioacuten
SnapGene versioacuten 113
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas
Para la optimizacioacuten de los codones de todas las secuencias nucleotiacutedicas se
utilizoacute la herramienta bioinformaacutetica GenSmart Codon Optimization Tool
(httpswwwgenscriptcomtoolsgensmart-codon-optimization) versioacuten Beta 10
Las secuencias nucleotiacutedicas yo aminoaciacutedicas recolectadas para el disentildeo de los
moacutedulos geneacuteticos funcionaron como datos de entrada La aplicacioacuten fue
configurada para ldquoEscherichia colirdquo como organismo para expresioacuten de proteiacutenas
Es importante mencionar que solicitamos la exclusioacuten de sitios de restriccioacuten
habitualmente localizados en la regioacuten muacuteltiple de clonacioacuten del vector de
expresioacuten pET30a(+) como BamHI (GGATCC) BglII (AGATCT) ClaI (ATCGAT)
EcoRI (GAATTC) HindIII (AAGCTT) KpnI (GGTACC) NcoI (CCATGG) NdeI
(CATATG) NheI (GCTAGC) NotI (GCGGCCGC) PstI (CTGCAG) SacI (GAGCTC) SacII
(CCGCGG) SalI (GTCGAC) SmaI (CCCGGG) SpeI (ACTAGT) SphI (GCATGC) XbaI
(TCTAGA) XhoI (CTCGAG) XmaI (CCCGGG)
Una vez optimizadas usamos CAI Tool (httpgenomesurvesCAIcal) para el
Caacutelculo del Iacutendice de Adaptacioacuten (CAI por sus siglas en ingleacutes) para determinar el
iacutendice de adaptacioacuten de las secuencias nucleotiacutedicas antes y despueacutes de la
optimizacioacuten Esta herramienta utiliza la secuencia nucleotiacutedica y el uso de
codones tanto del organismo nativo como el organismo productor heteroacutelogo (u
organismo recipiente) como entradas para la optimizacioacuten De acuerdo a los
autores el iacutendice tiene un rango de respuesta que oscila entre 0 hasta 1 donde el
valor correspondiente 1 indica si la secuencia de entrada usa los codones maacutes
frecuentemente utilizados por el organismo recipiente (Puigbograve Bravo amp Garcia-
Vallve 2008) Para esta aplicacioacuten los iacutendices de uso de codones de cada
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organismo los datos de entrada deben ser descargados y posteriormente deben
ingresarse manualmente Todos los iacutendices fueron descargados de la base de
datos Codon Usage Database (httpswwwkazusaorjpcodon) y se descargaron
para los organismos E coli B (CUD no 413997) S aureus N315 (CUD
no158879) L lactis subsp cremoris (CUD no 1359) and A victoria (CUD no
6100)
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Se realizoacute un alineamiento local entre pares probando de manera independiente
cada una las cuatro clases maacutes comunes de AgrD contra la secuencia
aminoaciacutedica del AgrD del MRSA seleccionada para determinar la especificidad
del biosensor y en consecuencia la existencia de un comportamiento de
comunicacioacuten cruzada El alineamiento se realizoacute en la aplicacioacuten EMBOSS Water
(httpswwwebiacukToolspsaemboss_water) (Madeira et al 2019) Las
secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro clases maacutes representativas de AgrD
fueron descargadas de los datos publicados por Wang y otros (B Wang amp Muir
2016) mientras que la secuencia de AgrD de la cepa MRSA que seleccionamos
fue recuperada de una base de datos (KEGG no SAS066)
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
La solubilidad de las proteiacutenas seleccionadas para su expresioacuten en E coli fue
predicha por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk)
(Hebditch Carballo-Amador Charonis Curtis amp Warwicker 2017) La precisioacuten
general de la herramienta fue estimada en 706 De acuerdo con los autores
cualquier valor de solubilidad superior a 045 se considera que es soluble De esta
manera cualquier proteiacutena con valor inferior a 045 se infiere que no son solubles
Es importante mencionar que esta herramienta no es uacutetil para determinar el iacutendice
de solubilidad en proteiacutenas membranales
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
La herramienta bioinformaacutetica BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo
Martelli Fariselli Profiti amp Casadio 2018) predice la localizacioacuten subcelular de
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una proteiacutena en E coli Esta aplicacioacuten nos permite distinguir entre proteiacutenas
globulares de proteiacutenas membranales Para fines de nuestro proyecto nosotros
configuramos a la aplicacioacuten para identificar ldquoProkarya ndash Gram negativerdquo debido a
que eacuteste es el origen taxonoacutemico de nuestro organismo productor heteroacutelogo
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
410 Prediccioacuten de alergenicidad
La alergenicidad de la LnqQ fue evaluada en la herramienta bioinformaacutetica
AllerCatPro versioacuten 17 (httpsallercatprobiia-staredusg) la cual permite
predecir si el componente es capaz de crear una respuesta aleacutergica tipo I mediada
a la inmunoglobulina tipo E (IgE) basada en el anaacutelisis estructural lineal y
tridimensional de la proteiacutena (Maurer-Stroh et al 2019)
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
4111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica de la amilasa AmyE fue
descargado del cataacutelogo de GenBank (GenBank no V001011) El peacuteptido sentildeal
de este archivo fue manualmente extraiacutedo con la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 113 siguiendo las recomendaciones de la publicacioacuten de Papi y sus
colaboradores (R M Papi et al 2005)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 36
4112 Disentildeo y acoplamiento del peacuteptido sentildeal N-AmyE con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo nucleotiacutedico de la LnqQ (GenBank no AB2352011) El
acoplamiento fue manualmente resuelto utilizando la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 110 agregando sitios de restriccioacuten y algunos nucleoacutetidos tomando
en cuenta las recomendaciones de AddGene de dejar un espacio para asistir en la
clonacioacuten molecular por PCR (httpswwwaddgeneorgprotocolspcr-cloning)
Dos vectores de expresioacuten basados en pET-30a(+) fueron disentildeados in silico
donde uno de los vectores contiene exclusivamente el peacuteptido sentildeal N-AmyE y en
el siguiente estaacute el N-AmyE acoplado con la LnqQ
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pETNL fue
elaborado en SnapGene 113 y guardado en formato dna y enviado a BioBasic
Inc (Canadaacute) a traveacutes del tercero autorizado Productos y Equipos
Biotecnoloacutegicos SA de CV (Probiotek Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
4113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido sentildeal N-AmyE del
conjunto LnqQ con etiqueta de polihistidina fue evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea
SignalP 50 (httpwwwcbsdtudkservicesSignalP) el cual es un servidor que
determina la presencia de peacuteptidos sentildeales y la localizacioacuten de sus sitios de corte
proteoliacutetico en proteiacutenas de origen en Archaea bacterias Gram positivas y
negativas y organismos eucarioacuteticos (Armenteros et al 2019)
Esta herramienta puede distinguir entre tres tipos de peacuteptidos sentildeales tiacutepicos El
primer mecanismo es a traveacutes la viacutea Sec tipo I (SPI) que es conocido como el
mecanismo estaacutendar de excrecioacuten donde los peacuteptidos sentildeales son transportados
por el translocoacuten Sec y son escindidos por accioacuten de la Peptidasa de Sentildeal tipo I
(Lep) El segundo mecanismo corresponde a la viacutea Sec tipo II (SPII) donde los
peacuteptidos sentildeales lipoproteiacutecos son transportados por el translocoacuten Sec y cortados
mediante la Peptidasa de Sentildeal tipo II (Lsp) El uacuteltimo mecanismo corresponde a
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la viacutea Tat donde los peacuteptidos sentildeales son transportados por el translocoacuten Tat tipo
y son escindidos por la Peptidasa de Sentildeal tipo I (Lep) (Armenteros et al 2019)
En la aplicacioacuten se puede elegir entre cuatro grupos de organismos para el
anaacutelisis de corte predictivo los cuales corresponden a organismos eucarioacuteticos
organismos Gram positivos organismos Gram negativos y en tipo Archaea Para
fines de nuestro proyecto dado que esta construccioacuten fue intencionada para ser
producida en ceacutelulas de E coli se eligioacute la opcioacuten para organismos Gram
negativos
Para comparar la probabilidad de corte enzimaacutetico de nuestra construccioacuten in silico
de N-AmyELnqQ6xHis se descargoacute los datos bioinformaacuteticos de seis secuencias
aminoaciacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y cuyo corte proteoliacutetico fue
demostrado experimentalmente
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
4121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica del peacuteptido de fusioacuten SmbP fue
amablemente cedido por el Dr Xristo Zaacuterate de la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten La secuencia nucleotiacutedica del SmbP estaacute contenida en un vector de
expresioacuten tipo pET30a(+) y guardado en formato dna
4122 Disentildeo y acoplamiento de peacuteptido de fusioacuten SmbP con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido de fusioacuten con la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo geneacutetico desde la base de datos biotecnoloacutegicos Este
acoplamiento fue manualmente resulto a traveacutes de SnapGene
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pSmbP-
LnqQ fueron elaborado en SnapGene 113 guardados en formato dna y enviado
a Gene Universal Inc (Estados Unidos) a traveacutes del tercero autorizado
Distribuidora Bakterlab SA de CV (Bakterlab Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 38
4123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP del
conjunto LnqQ evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea PeptideCutter
(httpswebexpasyorgpeptide_cutter) la cual predice sitios potenciales para ser
cortados por proteasas o por sustancias quiacutemicas en una secuencia de proteiacutena
determinada (Gasteiger et al 2005) Esta aplicacioacuten contiene una lista extensa de
reacciones enzimaacuteticas y quiacutemicas Para fines de nuestro proyecto se eligioacute la
opcioacuten de ldquoEnterokinaserdquo ya que nuestra construccioacuten contiene este dominio
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Para descartar que la existencia de alguacuten codoacuten de paro no observado durante la
fase de post disentildeo optamos por analizar la secuencia nucleotiacutedica de la regioacuten
de intereacutes de pETNL y pSmbP-LnqQ en la aplicacioacuten en liacutenea ORF Finder
(httpswwwncbinlmnihgovorffinder) la cual es una aplicacioacuten que encuentra
marcos de lectura abiertos en una secuencia de nucleoacutetidos Los paraacutemetros
seleccionados correspondieron a ldquoATGrdquo exclusivamente como codoacuten de inicio y
como coacutedigo geneacutetico se utilizoacute la opcioacuten 1 correspondiente a ldquoStandardrdquo Esta
aplicacioacuten realiza una traduccioacuten de la secuencia nucleotiacutedica a partir de la
traduccioacuten de seis marcos de lectura y devuelve un graacutefico que indica la ubicacioacuten
donde se encuentra cada marco de lectura identificado (Wheeler et al 2003)
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
El peso molecular estimado de los productos de los vectores pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron estimado a traveacutes de la aplicacioacuten Compute pIMW de ExPasy
(httpswebexpasyorgcompute_pi) la cual permite estimar el punto isoeleacutectrico
(pI) teoacuterico y el peso molecular (MW) teoacuterico a partir de secuencias reportadas o
secuencias de aminoaacutecidos ingresados por el usuario (Gasteiger et al 2005)
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415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
La solubilidad de los productos de los pETNL y pSmbP-LnqQ fueron analizados
por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk) (Hebditch et al
2017) mientras que la localizacioacuten subcelular de las proteiacutenas fue determinada por
la herramienta BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo et al 2018)
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
Phyre2 (httpwwwsbgbioicacukphyre2htmlpagecgiid=index) es una
aplicacioacuten en liacutenea para el anaacutelisis de modelado para estructuras secundarias y
tridimensionales Esta herramienta permite predecir y analizar la estructura de la
proteiacutena asiacute como funciones y mutaciones haciendo maacutes faacutecil la interfaz al usuario
para interpretar la estructura secundaria y terciaria de los modelos asiacute como la
composicioacuten de dominios y la calidad del modelo (Kelley Mezulis Yates Wass amp
Sternberg 2015)
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
4171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Para transformar las ceacutelulas de E coli con el vector de expresioacuten pET30a(+)
pETNL o pSmbP-LnqQ se utilizoacute la teacutecnica de electroporacioacuten (Potter amp Heller
2003) que consiste en la introduccioacuten de DNA exoacutegeno al interior de las ceacutelulas
por meacutetodos fiacutesico-quiacutemicos A continuacioacuten describimos la teacutecnica
Se preparoacute un cultivo overnight de E coli en un tubo con caldo LB esteacuteril y se
incuboacute por 37degC en agitacioacuten constante por 18 h Al diacutea siguiente 20 microl del cultivo
preinoacuteculo fueron retirados y depositados en un microtubo con 1 ml de caldo LB
esteacuteril este proceso se realizoacute en seis tubos donde tres son etiquetados ldquoMuestrardquo
(M) ldquoAntibioacuteticordquo (A) ldquoViabilidadrdquo (V) y tres maacutes fueron reservados para anaacutelisis
espectrofotomeacutetricos Se incubaron todos los tubos a 37degC durante
aproximadamente 15 h (OD600 entre 04-06) en agitacioacuten constante Todos los
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tubos asignados para anaacutelisis espectrofotomeacutetricos fueron usados para monitoreo
Una vez alcanzado el tiempo establecido los tubos M A y V fueron centrifugados
a 9000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente El sobrenadante de los tubos
fue descartado y las ceacutelulas fueron resuspendidas en 1 ml de agua ultrapura
esteacuteril a temperatura ambiente Los tubos fueron centrifugados a 9000 rpm
durante 2 min a temperatura ambiente Este paso se repitioacute una vez El precipitado
celular en los tubos M A y V fue resuspendido en 35 microl de agua ultrapura esteacuteril y
se agregoacute al menos 2 a 3 microl de plaacutesmido (asymp 500 microg totales) o de agua seguacuten el
caso Finalmente se mezcloacute cuidadosamente con la micropipeta
En el tubo de viabilidad no se agregoacute plaacutesmido y fue sembrado en una placa LB
En el tubo etiquetado como antibioacutetico no se agregoacute plaacutesmido y el precipitado fue
sembrado en una placa de LB suplementado con kanamicina (50 microgml) Al tubo
de control positivo se agregoacute un plaacutesmido resistente a la kanamicina y eacutesta fue
sometida a electroporacioacuten y sembrada en una placa con LB con kanamicina En
la muestra se agregoacute alguno de los siguientes plaacutesmidos pET30a(+) pETNL o
pSmbP-LnqQ y posteriormente fue sometido a electroporacioacuten y sembrado en una
placa de LB con kanamicina
El volumen total de los tubos fue transferido a una celda de electroporacioacuten en el
espacio de 2 mm El equipo de electroporacioacuten (previamente irradiado con luz UV
por 15 min) fue encendido y configurado para electroporar a 2500 V
Posteriormente se agregoacute 1 ml de caldo LB esteacuteril a la celda de electroporacioacuten y
cuidadosamente mezclado (para evitar estresar a la ceacutelula) La mezcla es tomada
con mucho cuidado desde la celda y transferido a un tubo de 15 ml esteacuteril El tubo
fue incubado a 37degC por 1 h en agitacioacuten muy baja Cumplido el tiempo
establecido el tubo fue centrifugado a 9000 rpm durante 2 min Se retiroacute la mayor
parte del sobrenadante (asymp 950 ml) y el restante fue mezclado suavemente con el
precipitado celular hasta suspender la solucioacuten El volumen total resuspendido fue
sembrado en placas de LB agar o LB agar suplementado con kanamicina (50
microgml) dependiendo el caso Las placas fueron incubadas a 37degC en condiciones
de aerobiosis durante 16 h Al terminar las placas fueron revisadas y
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 41
seleccionadas Las ceacutelulas efectivamente transformadas con los plaacutesmidos fueron
resistentes a la accioacuten de la kanamicina mientras que las no transformadas fueron
eliminadas Las ceacutelulas transformadas fueron validadas posteriormente por
teacutecnicas moleculares como extraccioacuten de DNA plasmiacutedico yo identificacioacuten por
producto de PCR punto final
4172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Para la extraccioacuten y purificacioacuten utilizamos el Isolate II Plasmid Mini Kit de
Meridian Biosciencereg (Estados Unidos Cat BIO-52056) Se preparoacute un cultivo
overnight de E coli en un tubo 5 ml de caldo LB esteacuteril y se incuboacute por 37degC en
agitacioacuten constante por no maacutes ni menos de 16 h Al diacutea siguiente previo al
ensayo de extraccioacuten se precalentoacute la solucioacuten de buffer de lavado PW1 a 50degC y
la temperatura se mantuvo a esta temperatura hasta su uso Se verificoacute que el
buffer de lavado PW2 estuviera suplementado con etanol
El cultivo overnight fue centrifugado a 11000 x g por 30 minutos El volumen se
retiroacute y se mantuvo el precipitado celular al cual se agregoacute 250 microl del buffer de
resuspensioacuten P1 y el precipitado se resuspendioacute por completo por voacutertex Es
importante que no quede masa celular adherida en los tubos Posteriormente se
agregaron 250 microl de buffer de lisis P2 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas
6 a 8 veces El tubo fue incubado a temperatura ambiente por 5 min o hasta que el
lisado celular se tornara claro Cumplido el tiempo anterior se adicionaron 300 microl
de buffer de neutralizacioacuten P3 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas 6 a 8
veces Este procedimiento fue para evitar el rompimiento del DNA genoacutemico Los
tubos fueron centrifugados a 11000 x g durante 5 min a temperatura ambiente
Este paso fue repetido hasta que el sobrenadante quedara lo maacutes claro posible
Posteriormente se tomoacute una columna tipo spin y sobre eacutesta se agregoacute un tubo
colector y sobre eacutesta se antildeadioacute el volumen recuperado del paso anterior El tubo
con el volumen fue centrifugado a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Sobre el tubo colector se
agregoacute 500 microl de buffer de lavado PW1 precalentado y se centrifugoacute a 11000 x g
por 5 min a temperatura ambiente El sobrenadante del tubo fue eliminado por
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 42
decantacioacuten Se adicionoacute 600 microl de buffer de lavado PW2 (suplementado con
etanol) y se centrifugoacute a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Centrifugar de nuevo el tubo
colector a 11000 x g por 2 min a temperatura ambiente para remover etanol
residual
Debajo del tubo colector se colocoacute un tubo de 15 ml esteacuteril y se agregoacute 50 microl de
buffer de elucioacuten P directamente sobre la membrana de siacutelice Se incuboacute a
temperatura ambiente y se centrifugoacute a 11000 x g por 2 min a temperatura
ambiente Del tubo con DNA purificado se tomaron 2 microl y se analizaron por nano-
espectrofotometriacutea para el caacutelculo de concentracioacuten y de pureza del DNA
plasmiacutedico
4173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Para comprobar que las ceacutelulas de E coli fueran efectivamente transformadas con
el vector de expresioacuten pET30a(+) pETNL y pSmbP-LnqQ se realizoacute un
experimento de PCR punto final para identificar al plaacutesmido recuperado de las
ceacutelulas de E coli Para ello nos enfocamos en primer lugar a elegir un par de
oligonucleoacutetidos que cumplieran de identificar los vectores de expresioacuten
El par de oligonucleoacutetidos elegidos para el anaacutelisis de las construcciones
corresponden al T7 promoter primer (5rsquo- TAATACGACTCACTATAGGG-3rsquo) y al T7
terminal primer (5rsquo- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3rsquo) los cuales son oligonucleoacutetidos
especiacuteficos para vectores construidos basados en pET30a(+) La secuencia de
ambos oligonucleoacutetidos fue recuperada de una compilacioacuten de AddGene para
ldquoSequencing Primersrdquo (httpswwwaddgeneorgmol-bio-referencesequencing-
primers)
Para determinar la temperatura de fusioacuten oacuteptima del par de oligonucleoacutetidos
utilizamos dos herramientas bioinformaacuteticas en liacutenea La primera aplicacioacuten fue
OligoAnalyzertrade (httpswwwidtdnacomcalcanalyzer) de la compantildeiacutea Integrated
DNA Technologies Inc (Estados Unidos) donde se ajustaron paraacutemetros como la
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 43
concentracioacuten de oligonucleoacutetido las concentraciones de iones monovalentes
(Na+) y divalentes (Mg2+) asiacute como la concentracioacuten de nucleoacutetidos (dNTPs) en la
reaccioacuten para el caacutelculo de formacioacuten de hairpin homodiacutemeros y heterodiacutemeros
La otra aplicacioacuten es Net Primer (httpswwwpremierbiosoftcomnetprimer) de
Premier Biosoft que tambieacuten contiene puntos como la aplicacioacuten anteriormente
mencionada pero contiene opciones como el caacutelculo de rating de eacutexito y
estabilidad en el extremo 3rsquo-terminal
Para realizacioacuten del ensayo de PCR punto final utilizamos el High-Stability PCR
kit (Cat No L00342 Manual No 0285 Versioacuten 08272013) de GenScript Inc
(Estados Unidos) De esta manera ajustamos las condiciones de reaccioacuten de PCR
seguacuten lo determinado por el fabricante para por la DNA polimerasa Green Taq La
reaccioacuten de PCR punto final se ajustoacute a una concentracioacuten de oligonucleoacutetidos de
trabajo para 10 microM concentracioacuten de monovalentes (Na+K+) a 500 mM
concentracioacuten de divalentes (Mg2+) a 15 mM y concentracioacuten de dNTPs a 05 mM
El protocolo general para ensayo de PCR punto final de acuerdo con el fabricante
consistioacute en que por cada 50 microl de volumen de reaccioacuten se agregariacutean 5 microl de 10
X de Reaction Buffer 10 microl de 10 mM de dNTPs 10 microl por el oligonucleoacutetido 5rsquo-
terminal a 20 microM 10 microl por el oligonucleoacutetido 3rsquo-terminal a 20 microM 20 microl de
plaacutesmido (de al menos 100 ngmicrol) 395 microl de agua ultrapura esteacuteril y 05 microl de la
DNA polimerasa Green Taq
4174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Las muestras obtenidas fueron procesadas en un gel de agarosa (1 pv)
adicionada con Eco-Stain ready to use (Cat No DT81413) de BioBasic Inc
(Canadaacute) el cual es una sustancia que tiene un pico de excitacioacuten a λ = 490 nm y
dos picos de emisioacuten λ = 520 nm y λ = 635 nm y esta solucioacuten se agrega al gel en
una relacioacuten de 1 microl por 20 ml de solucioacuten de agarosa Las muestras fueron
corridas durante 1 h a 100 V en caacutemara para electroforesis Al terminar el tiempo
establecido el gel fue retirado e iluminado con luz UV en el transiluminador y se
tomoacute una fotografiacutea como evidencia Todos los geles fueron elaborados con su
respectivos controles positivos negativos y muestras
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 44
418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
4181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Brevemente cultivos con diferentes cepas de E coli transformados con
pET30a(+) pETNL o pSmbP-LnqQ fueron inducidos con IPTG Se realizoacute un
cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado en un matraz con 25 ml de
caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50 microgml) a 37degC en agitacioacuten
constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se registroacute el valor de OD600 del
cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo preinoacuteculo en un matraz
esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina hasta llegar a un valor
inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado a 37degC en agitacioacuten constante
hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de OD600 asymp 04
Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue inoculado con
IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos diferentes
temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue distribuido en
tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten Todos los tubos
usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los tubos fueron
propiamente etiquetados
4182 Extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pETNL
Los cultivos de E coli transformados ya fuera con pET30a(+) pETNL o pSmbP-
LnqQ fueron inducidos por IPTG para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
Brevemente se realizoacute un cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado
en un matraz con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50
microgml) a 37degC en agitacioacuten constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se
registroacute el valor de OD600 del cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo
preinoacuteculo en un matraz esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con
kanamicina hasta llegar a un valor inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado
a 37degC en agitacioacuten constante hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de
OD600 asymp 04 Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue
inoculado con IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 45
diferentes temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue
distribuido en tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten
Todos los tubos usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los
tubos fueron propiamente etiquetados
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten periplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Santos y sus colaboradores (BD Santos et al 2019) que es un
procedimiento en un ensayo de lisozima con choque osmoacutetico Se descongeloacute los
tubos a baja temperatura y posteriormente fueron centrifugados a 8000 times g
durante 15 min a 4degC El sobrenadante de cada tubo fue eliminado y lavado dos
veces con buffer PBS 1X pH 74 (Gibco) friacuteo (8000 times g durante 10 min a 4degC) En
el uacuteltimo lavado los tubos con precipitado celular fueron pesados y sus pesos se
registraron Por uacuteltimo se calculoacute la diferencia entre los tubos con precipitado
celular contra los tubos cuando estaban vaciacuteos A cada uno de los tubos con
precipitado celular se le agregoacute solucioacuten hipertoacutenica friacuteo (sacarosa 20 trizma 20
mM EDTA 2 mM y lisozima 20 mgml pH 80) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten
hipertoacutenica por cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido
de cada tubo fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el
tiempo el cultivo fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC
El sobrenadante fue recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten
periplaacutesmica hipertoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El
precipitado celular es reservado Una vez retirada la fraccioacuten anterior los tubos
con precipitado celular remanentes fueron pesados de nuevo y se agregoacute solucioacuten
hipotoacutenica (agua ultrapura esteacuteril) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten hipotoacutenica por
cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido de cada tubo
fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el tiempo el cultivo
fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC El sobrenadante fue
recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten periplaacutesmica
hipotoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El precipitado celular se
eliminado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 46
4183 Extraccioacuten de proteiacutenas citoplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pSmbP-LnqQ
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten citoplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Vargas y sus colaboradores (Vargas-Cortez et al 2016) junto con
recomendaciones de Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) que es un
procedimiento basado en perlas de vidrio
Se descongelaron los tubos a baja temperatura y posteriormente centrifugados a
8000 times g durante 15 min a 4degC El precipitado celular de los tubos fueron
resuspendidos en buffer de lisis friacuteo (Tris-HCl 50 mM NaCl 500 mM pH 80) y se
agregaron 150 mg de perlas de vidrio limpios de 01 mm Los precipitados
celulares resuspendidos en perlas fueron mezclados por voacutertex durante 1 min Los
tubos fueron centrifugados a maacutexima velocidad por 15 min a 4degC El sobrenadante
fue recuperado con cuidado de cada tubo y fue etiquetado como ldquoFraccioacuten
citoplaacutesmicardquo
4184 Obtencioacuten de fracciones solubles e insolubles para SDS-PAGE
Para obtener las fracciones solubles e insolubles seguimos el protocolo de Santos
(Byran Santos 2017) Para la fraccioacuten soluble a partir del sedimento celular eacutesta
es resuspendida en 120 microl de agua ultrapura esteacuteril y despueacutes se le agregan 40 microl
de solucioacuten amortiguadora de carga SDS-PAGE 4X suplementado con β-
mercaptoetanol para una concentracioacuten final al 1X La solucioacuten fue hervida durante
10 min y posteriormente centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante
fue separado y guardado como ldquoFraccioacuten solublerdquo Luego al sedimento restante
se le agregaron 120 microl de solucioacuten de urea 8 M y se hierve de nuevo durante otros
10 min para solubilizacioacuten de los cuerpos de inclusioacuten Finalmente la solucioacuten fue
centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante fue separado y guardado
como ldquoFraccioacuten insolublerdquo Ambas fracciones fueron visualizadas posteriormente
en los geles de SDS-PAGE
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 47
4185 Preparacioacuten de gel de SDS-PAGE 16
Los geles de SDS-PAGE fueron preparados bajo las siguientes condiciones se
prepararon dos geles en dos tubos nuevos e independientes conocidos como
lower y upper con suficiente capacidad para almacenar el volumen de cada gel
Primero se preparoacute el lower gel y solo hasta haber terminado ese gel se procedioacute
a preparar el upper gel
Para preparar el lower gel a 16 preparamos una reaccioacuten considerando un
volumen de 10 ml Para ello mezclamos 350 ml de agua destilada 400 ml de
solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) 250 ml de lower buffer (para 25 ml Tris
1515 g SDS 01 g pH 68) 200 microl de APS 10 (pv) y TEMED 20 microl Para el
upper gel a 4 estaacute reaccioacuten fue montada con un volumen de 5 ml Para ello
mezclamos 325 ml de agua destilada 050 ml de solucioacuten de BisAcrilamida 40
(291) 125 ml de upper buffer (para 25 ml Tris 454 g SDS 01 g pH 88) 100 microl
de APS 10 (pv) y 20 microl de TEMED
Tanto la solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) del upper buffer y el lower buffer
fueron retirados del refrigerador y atemperados a temperatura ambiente cuando
menos unos 15 min antes de uso La solucioacuten de APS a una relacioacuten de 01 g por
1 ml (10 pv) debioacute prepararse al momento con agua destilada limpia Toda la
cristaleriacutea usada para preparar el gel de poliacrilamida debioacute ser lavada con agua
destilada limpia y secarse con suficiencia evitando rayar los vidrios
Una vez agregado el TEMED a la mezcla la solucioacuten fue inmediatamente vertido
sobre placas de vidrio Fue necesario esperar entre 20 a 30 minutos para que
completar el proceso de polimerizacioacuten En el lower gel se agregaron 200 microl de
isobutanol para el upper gel en la parte superior se agregoacute un molde para
pocillos Terminado el tiempo de polimerizacioacuten se agregaron las muestras de
proteiacutenas en los pocillos del gel de SDS-PAGE Los geles fueron puestos sobre
una caacutemara de electroforesis vertical y sumergidos en un buffer de corrida a 1X
(para 1000 ml Tris 3 g Glicina 144 g y SDS 1 g) El gel fue corrido a 150 V
durante 1 a 15 h dependiendo de la liacutenea de corrida de la solucioacuten
amortiguadora
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 48
4186 Tincioacuten de gel SDS-PAGE
Previo a tentildeir los geles se prepararon dos soluciones Para la solucioacuten de tincioacuten
se pesaron cuidadosamente y con guantes 50 mg de Coomasie Blue R-250 en un
tubo plaacutestico limpio para un volumen de 50 ml Despueacutes se agregaron 25 ml de
metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta
50 ml con agua destilada limpia Mantener a temperatura ambiente y en
condiciones de obscuridad hasta su uso Mientras que para la solucioacuten de
destincioacuten se midieron 75 ml de metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico
absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta 50 ml con agua destilada limpia
Mantener a temperatura ambiente hasta su uso
Cuando terminado el paso de corrida por electroforesis los geles fueron
cuidadosamente separados de los vidrios El gel fue tentildeido con la solucioacuten de
tincioacuten durante toda la noche en agitacioacuten constante a temperatura ambiente y
posteriormente fue destentildeido con la solucioacuten de destincioacuten durante el resto del diacutea
siguiente bajo las mismas condiciones previas El gel fue puesto sobre un fondo
blanco y se fotografioacute como evidencia
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en
los geles
La presente seccioacuten fue desarrollada posterior a la conclusioacuten de la fase
experimental con el objetivo de explicar la ausencia de bandas tanto de N-
AmyELnqQ como de SmbP-LnqQ en los geles de SDS-PAGE Para abordar el
problema exploramos las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas por el
anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle un anaacutelisis de perfil
aminoaciacutedico y finalmente a traveacutes de diferencias por su origen evolutivo
Las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas como el tamantildeo de proteiacutenas
peso molecular punto isoeleacutectrico nuacutemero total de residuos con carga positiva y
negativa iacutendice alifaacutetico (AI) e iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) fueron calculadas
a traveacutes de ProtParam de ExPasy (httpswebexpasyorgprotparamprotparam-
dochtml) (Gasteiger et al 2005) El iacutendice alifaacutetico (AI) estaacute principalmente
afectado por los cuatro aminoaacutecidos con cadena lateral alifaacutetico alanina valina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 49
leucina e isoleucina El incremento del AI es directamente proporcional a la
termoestabilidad en proteiacutenas globulares (Atsushi 1980) El iacutendice de
hidrofobicidad (GRAVY) es el resultado del promedio que representa la suma total
de los valores de hidropatiacutea de cada uno de los residuos dentro de una cadena
lineal de aminoaacutecidos dividido por el tamantildeo del peacuteptidoproteiacutena Una proteiacutena
con valor GRAVY negativo una proteiacutena hidrofiacutelica mientras que una proteiacutena con
valor GRAVY positivo es hidrofoacutebica (Kyte amp Doolittle 1982)
El anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle fue elaborado a
partir de ProtScale de ExPasy (httpswebexpasyorgprotscale) (Gasteiger et al
2005) Esta herramienta permite elaborar un perfil producido por cualquier escala
aminoaciacutedica a partir de una secuencia aminoaciacutedica Existen 57 escalas de
hidrofobicidad yo hidrofilicidad para fines de nuestro experimento utilizamos la
opcioacuten ldquoHphob Kyte amp Doolittlerdquo
El mapa de calor representa el porcentaje de aminoaacutecidos dada en una secuencia
lineal de aminoaacutecidos con el fin de elaborar un perfil aminoaciacutedico entre los
diferentes peacuteptidos antimicrobianos que fueron efectivamente sobreproducidos por
SmbP La graacutefica fue elaborada a traveacutes de Excel con datos descargados desde la
aplicacioacuten ProtParam de ExPasy
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 50
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS
Las actividades del proyecto fueron realizadas en los Laboratorios de Biologiacutea y de
Sistemas del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea y el
Laboratorio de Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas ubicado en la Divisioacuten de
Estudios de Posgrado ambas infraestructuras pertenecientes a la Facultad de
Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
A continuacioacuten se presenta un listado completo de los materiales y equipos
utilizado
51 Materiales y reactivos
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Microtubos de 15 ml 15 ml y 50 ml Distintas marcas No especificado
Cajas Petri de plaacutestico o vidrio Distintas marcas No especificado
Matraces tipo Erlenmeyer Distintas marcas No especificado
Celdas para espectrofotoacutemetro No especificado No especificado
Celdas de electroporacioacuten No especificado No especificado
Micropipetas (varios voluacutemenes) Distintas marcas No especificado
Medio de cultivo LB Difco 244620
Agar bacterioloacutegico MCD-LAB 9011
Agua grado Biologiacutea Molecular Invitrogen 10977-015
Kanamicina sulfato AG Scientific K-1022
Ampicilina soacutedica Sigma Aldrich A0166
Perlas de vidrio 01 mm Biospec 11079101
IPTG Bioline BIO-37036
LDS Sample Buffer 4X GenScript M00676-10
SDS IBI Scientific IB07062
Persulfato de Amonio (APS) BioBasic AB0072
TEMED Merck 110732
Glicina BioBasic GB0235
Bis-Acrilamida 40 (29109) Merck 100641
Coomasie Briliant Blue BioBasic CB0038
2-mercaptoetanol BioBasic MB0338
Isopropanol 100 DEQ No especificado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 51
Aacutecido fosfoacuterico 85 Jalmek A1825-13
Hidroacutexido de sodio DEQ No especificado
Aacutecido clorhiacutedrico DEQ No especificado
Alcohol metiacutelico DEQ No especificado
Aacutecido aceacutetico glacial Jalmek A0925-13
Etanol anhidro Jalmek E5325-18
Urea BioBasic UB0148
Buffer de fosfatos salinos 1X (PBS) Gibco 10010-023
Cloruro de sodio Jalmek S2325-05
Tris BioBasic TB0196
Glicerol DEQ No especificado
Guantes de nitrilo Ambiderm No especificado
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S657-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 7 J T Baker S656-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S655-02
QuickClean II Plasmid Miniprep kit GenScript L00420-100
QuickClean II Gel Extraction Kit GenScript L00418-100
QuickClean II PCR Purification Kit GenScript L00419-50
52 Equipos de laboratorio
USO PERSONAL
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Computadora personal Acer Aspire A515-51
LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA Y DE SISTEMAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Incubadora estaacutetica Lab Companion IB-11E
Incubadora de piso con agitacioacuten Lab Companion IS-971
Incubadora de agitacioacuten (microtubos) Eppendorf ThermoMixer C
Horno de secado Shel Lab SGO 6E
Horno de microondas Everstar P90D23AL-XF
Concentrador Thermo Fisher SpeedVac SPD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 52
Bantildeo de ultrasonido VMR Symphony 97043-996
Contador de colonias Reichert 3327
Agitador orbital Labnet Orbit 1000
Agitador vertical Thermo Scientific Compact Digital Rocket
Termociclador miniPCR Mini8
Termociclador Techne 3Prime
Refrigerador de puertas deslizantes Thermo Scientific MH45PA-GAEE-TS GPR Series
Refrigerador a dos puertas Norlake Scientific LRF 201WW
Congelador de -20 degC MetalFrio Solutions
No especificado
Espectrofotoacutemetro UV-Vis Optizen 2120 UV Plus
Nanoespectrofotoacutemetro BioSpec Shimadzu
Gabinete bioseguridad clase II Labconco Delta Series
Centriacutefuga para microtubos Ohaus Frontier 5515
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
Voacutertex Scientific Industries
Genie 2
Plancha de calentamiento con agitacioacuten magneacutetica
Lab Companion HP-3000L
Microscopio oacuteptico Fisher Scientific Micromaster
Autoclave Lab Companion ST-G Series
Caacutemara profesional Canon EOS M10
Transiluminador Maestro No especificado
Balanza analiacutetica AND GR-200
Balanza semianaliacutetica Ohaus Traveler
Electroporador Eppendorf Eppendorf
Fuente de Poder BioRad PowerPac Basic
Potencioacutemetro Ohaus Starter 5000
LABORATORIO DE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Cromatoacutegrafo GE Life Sciences Aumlktaprime Plus
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 53
53 Lugares de experimentacioacuten
Nuestro proyecto fue elaborado entre Febrero de 2018 a Mayo de 2021 y fue
mayoritariamente realizado en las instalaciones del Laboratorio de Biologiacutea
Sinteacutetica y de Sistemas (LBSS) a cargo del Dr Heacutector Javier Ameacutezquita Garciacutea
encontraacutendose en el interior del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y
Nanotecnologiacutea (CIBYN) dependencia de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
(FCQ) de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten El centro estaacute ubicado en la
autopista al Aeropuerto ldquoMariano Escobedordquo Km 10 Parque de Investigacioacuten e
Innovacioacuten Tecnoloacutegica (PIIT) CP 66628 en Apodaca Nuevo Leoacuten Meacutexico
En menor proporcioacuten nuestro trabajo tambieacuten fue realizado en el Laboratorio de
Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas (PEP) a cargo del Dr Xristo Zaacuterate
Kalfoacutepulos Esta unidad estaacute localizada en el interior de la Divisioacuten de Estudios de
Posgrado (DEP) de Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la Universidad
Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) La ubicacioacuten de la divisioacuten estaacute en la calle
Vicente Guerrero sn Col Trevintildeo CP 64570 en Monterrey Nuevo Leoacuten
Meacutexico
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos
Declaracioacuten de manejo y disposicioacuten de residuos
Todos residuos generados durante la realizacioacuten del proyecto de investigacioacuten
fueron gestionados de acuerdo con las caracteriacutesticas de estos siguiendo los
lineamientos establecidos por el Departamento de Medio Ambiente y Seguridad de
la Facultad de Ciencias Quiacutemicas utilizando los recipientes proporcionados por
este departamento en base a la Norma PR-CLB-SRR-000
Los residuos bioloacutegico-quiacutemicos fueron dispuestos en los contenedores
correspondientes en el interior de los laboratorios
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CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
En esta seccioacuten nos centramos en el disentildeo in silico de ceacutelulas de E coli
configuradas para detectar moleacuteculas de AIP producidos por el sistema nativo de
QS de ceacutelulas de MRSA De acuerdo con nuestro disentildeo (Figura 2) las ceacutelulas α
corresponden a ceacutelulas de S aureus productoras de moleacuteculas AIP mientras que
las ceacutelulas β corresponden a ceacutelulas de E coli que han sido modificadas con un
par de moacutedulos geneacuteticos biosensor y bacteriocina que le permiten detectar
moleacuteculas de AIP y en respuesta destruyen ceacutelulas de S aureus en el medio A
manera de resumen las ceacutelulas de E coli modificadas producen y excretan LnqQ
en funcioacuten de la concentracioacuten externa de moleacuteculas de AIP
Nuestra determinacioacuten por elegir bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
para nuestro sistema biosensor se explica en la siguiente numeracioacuten en primer
lugar consideramos que debido a su origen proteico son susceptibles a
modificaciones geneacuteticas (Cotter et al 2013)
Figura 2 Sistema QS para deteccioacuten y eliminacioacuten de S aureus
El moacutedulo biosensor conformado por agrC y agrA (azul marino y azul celeste respectivamente) estaacute regulado
por el promotor constitutivo J23110 La deteccioacuten del AIP-II (pentaacutegonos naranja) estaacute regulado por AgrC la
cual activa la fosforilacioacuten (ciacuterculos amarillo) de AgrA y activa la expresioacuten del moacutedulo bacteriocina a traveacutes
de la lnqQ lnqBCEDF y gfp (rojo amarillo y verde respectivamente) regulado por el promotor P2 LnqQ
destruye ceacutelulas de S aureus
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62 Cepas bacterianas
La razoacuten de escoger a E coli como chasis bioloacutegico de produccioacuten es porque ya
ha sido reportado previamente como biosensor de ceacutelulas enteras basados en
deteccioacuten del QS (Sedlmayer Hell Muumlller Auslaumlnder amp Fussenegger 2018) y
ademaacutes porque es el organismo de produccioacuten heteroacuteloga maacutes usado en el campo
de las bacteriocinas (Mesa-Pereira et al 2018) Nuestro modelo estaacute disentildeado
para ser aplicado en E coli BL21 (DE3) ya que ha sido efectivamente reportado
para producir y secretar bacteriocinas de las clases IIa y IId eacuteste uacuteltimo es
importante ya que esta es la clase a la que pertenece la bacteriocina LnqQ (Mesa-
Pereira et al 2017)
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
Para determinar el comportamiento in silico de nuestra ceacutelula de E coli fue
necesario disentildear un vector de expresioacuten con dos moacutedulos geneacuteticos y eacutestos
fueron referidos como moacutedulo biosensor y moacutedulo de bacteriocina
respectivamente Ambos moacutedulos fueron disentildeados de la siguiente manera
promotor-RBS-gene(s) estructural(es)-doble terminador (Figura 3)
Figura 3 Moacutedulos biosensor y de bacteriocina
El moacutedulo biosensor es configurado con agrC y agrA y estaacuten regulados transcripcionalmente por el promotor
J23110 (A) El moacutedulo de bacteriocina estaacute armado con los genes lnqQ y gfp y estaacuten regulados
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transcripcionalmente por el promotor P2 (B) Por uacuteltimo se muestra el disentildeo del sistema detectar y destruir
con los promotores divergentes J23110 y P2 (C)
En primera instancia se debioacute localizar el locus geneacutetico del promotor P2 de
nuestra MRSA fue manualmente localizado puesto que no existiacutea informacioacuten
relacionada al mismo De acuerdo con Shao y otros el locus de un promotor se
encuentra evolutivamente conservado entre especies que estaacuten relacionadas
(Shao Price Deutschbauer Romine amp Arkin 2014) De esta manera utilizamos
la anterior premisa para localizar el promotor P2 en un primer enfoque
localizamos la secuencia nucleotiacutedica del agrB en el archivo genoacutemico de la
MRSA (564 nucleoacutetidos KEGG no SA1842) como referencia ya que se conoce
que este gen es conocido que eacutesta es la primera unidad transcripcional ubicada riacuteo
abajo del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Para el segundo
enfoque usamos la informacioacuten disponible del promotor P2 de S aureus NCTC
8325 (Rajasree Fasim amp Gopal 2016 Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) una
cepa catalogada como estaacutendar para estudios bioinformaacuteticos (S Fuchs et al
2017 Herbert et al 2010) Al combinar lo mejor de ambos enfoques logramos
localizar la composicioacuten nucleotiacutedica del promotor P2 y su tamantildeo a traveacutes de la
identificacioacuten de los dominios
A continuacioacuten explicamos el principio del disentildeo de ambos moacutedulos En primer
lugar el moacutedulo designado como biosensor los genes agrC y agrA son
constitutivamente expresados por accioacuten del promotor J23110 Brevemente se
describe el principio del disentildeo donde inicialmente el AgrC anclado a membrana
de E coli detecta la presencia de moleacuteculas de AIP externas (Marchand amp Collins
2013) De esta manera AgrC sufre de un cambio conformacional y fosforila al
factor de transcripcioacuten AgrA Despueacutes el AgrA fosforilado (AgrA) actuacutea como
factor de transcripcioacuten del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Una
vez que AgrA-P se ha acoplado al promotor P2 el moacutedulo de bacteriocina es
expresado incluyendo los genes tipo estructural (lnqQ) excrecioacuten y
autoinmunidad (lnqBCEDF) del operoacuten lnq asiacute como del gen reportero gfp
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Algunos autores han demostrado que mantener intacto el operoacuten nativo de una
bacteriocina cualesquiera (es decir que contenga los elementos geneacuteticos de su
estructura para su secrecioacuten y para autoinmunidad) en E coli eacutesta ceacutelula
modificada es capaz de excretar bacteriocinas Gram positivos al medio
extracelular (Mesa-Pereira et al 2017)
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
Los moacutedulos geneacuteticos fueron disentildeados para operar en el mismo sentido que el
ensamble por tipo BioBrick al yuxtaponer las propiedades del BioBrick (RFC 10) y
el BglBrick (RFC 21) La intencioacuten del disentildeo es que nuestros moacutedulos geneacuteticos
sean faacutecilmente ensamblados o removidos por teacutecnicas como In-Fusion (Sleight
Bartley Lieviant amp Sauro 2010) o ensamblado por clonacioacuten in vivo (Garciacutea-
Nafriacutea Watson amp Greger 2016) dado que los sitios de restriccioacuten actuacutean como
sitios homoacutelogos para la clonacioacuten
Cada moacutedulo estaacute flanqueado por sitios de restriccioacuten para que puedan ser
intercambiados de ser necesario El moacutedulo de promotores estaacute flanqueado por
los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI manteniendo a EcoRI como unidad neutral
para cuando sean necesario el intercambio de piezas Los elementos del moacutedulo
biosensor estaacuten flanqueados por los sitios BglII y BamHI y los elementos del
moacutedulo de bacteriocinas estaacuten rodeados por los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI
(Figura 4)
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Figura 4 Estrategia de construccioacuten in silico
El moacutedulo biosensor (seccioacuten A) estaacute constituido por el BglBrick RFC21 mientras que el moacutedulo bacteriocina
(seccioacuten C) estaacute representado por el BioBrick RFC10 La seccioacuten de promotores (seccioacuten B) fue colocado en
caso de que los promotores fueran cambiados Cada bloque contiene una regioacuten prefija y otra sufija y cada
bloque estaacute flanqueado en ambas direcciones por terminadores dobles de transcripcioacuten (BBa_B0015 ciacuterculos
rojos) La seccioacuten B estaacute bordeada por los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI (G-X) con la regioacuten EcoRI como
neutral La seccioacuten A EcoRI y BglII (E-G) estaacuten anclados como prefijos mientras que BamHI y XhoI (B-X)
estaacuten puestos como sufijos Los sitios de restriccioacuten BglII y BamHI fueron usados para construir el promotor
constitutivo J23110 en conjunto a su parte estructural (RBS-gen) para el moacutedulo de biosensor Por otro lado
para la seccioacuten C el prefijo estaacute compuesto por los sitios EcoRI-XbaI (E-X) y los sitios SpeI-PstI (S-P) son
colocados como prefijos Los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI fueron usados para construir el promotor
inducible P2 y en conjunto a su parte estructural (RBS-gene) para el moacutedulo de bacteriocina
El plaacutesmido pSB1A3 (AddGene no 116850) (Dupin amp Simmel 2019) sirvioacute como
plantilla para la construccioacuten de los moacutedulos geneacuteticos Las secciones prefijo y
sufijo fueron manualmente remplazados por cualquiera de los moacutedulos disentildeados
El replicoacuten y los genes de resistencia a antibioacutetico del plaacutesmido fueron retenidos
pero el terminador de transcripcioacuten fue remplazado por terminadores dobles
Finalmente un par de plaacutesmidos fueron construidos y cada uno contiene
individualmente del moacutedulo de biosensor o de bacteriocina respectivamente
Finalmente ambos plaacutesmidos fueron manualmente mezclados para crear un
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plaacutesmido que contiene un par de moacutedulos que estaacuten en direcciones divergentes
Este vector de expresioacuten fue nombrado Dual Biosensor-Killer (Figura 5)
Figura 5 Representacioacuten esquemaacutetica del vector Dual Biosensor-Killer
El moacutedulo biosensor contiene los genes agrC y agrA y estaacute rodeado por los sitios de restriccioacuten EcoRI BglII y
XhoI mientras que el moacutedulo de bacteriocina contiene los genes del cluacutester lnqQBCDEF y el gen reportero gfp
y estaacute flanqueado por los sitios de restriccioacuten EcoRI XbaI SpeI y PstI Este plaacutesmido contiene un marcador
de resistencia a ampicilina y se compone de un total de 8904 pb
Parte de la estrategia de nuestro disentildeo consistioacute en que los promotores J23110 y
P2 fueran colocadas en sentidos opuestos para regular de manera independiente
la actividad de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina respectivamente La razoacuten
de aislar ambos moacutedulos es para evitar la expresioacuten por goteo que pudiera existir
por efecto de la fuerza de alguno de los promotores al mantenerse en la misma
direccioacuten transcripcional (Lubkowicz et al 2018) Todos los archivos generados
para la elaboracioacuten del vector de expresioacuten Dual Biosensor-Killer fueron
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elaborados por SnapGene y estaacuten disponibles en los archivos anexos de esta
misma tesis
65 Optimizacioacuten de los codones nativos
De acuerdo con las observaciones (Tabla 1) todas las secuencias fueron
optimizadas para ser expresadas en E coli cepa tipo B Noacutetese que los sitios de
restriccioacuten tiacutepicos y los codones de paro de todas las secuencias utilizadas fueron
removidos El iacutendice CAI antes de la optimizacioacuten en AgrC AgrA LnqQ LnqB
LnqC LnqE LnqD y LnqQ era de 0407 0402 0532 0525 0518 0511 0503
and 0521 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores cambiaron a
0770 0766 0675 0735 0771 0773 0777 y 0747 respectivamente El valor
CAI para la GFP no pudo ser determinado por la aplicacioacuten antes de la
optimizacioacuten pero siacute despueacutes de la optimizacioacuten el cual correspondioacute a 0759 En
relacioacuten con el contenido de GC los valores antes de la optimizacioacuten fueron
282 272 333 225 231 305 y 245 respectivamente Despueacutes de
la optimizacioacuten los datos fueron 433 446 469 400 421 410
431 424 y 424 respectivamente El contenido GC para GFP despueacutes de
la optimizacioacuten fue de 491
Nuestros resultados el promedio del valor CAI y el promedio de contenido GC de
todas las secuencias aminoaciacutedicas antes de ser optimizadas era de 049 plusmn 005 y
2690 plusmn 371 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores
promedio fueron 075 plusmn 003 y 4361 plusmn 287 respectivamente Seguacuten las
especificaciones de la aplicacioacuten si el valor CAI es maacutes cercano a 1 eacuteste indica
que la secuencia de nucleoacutetidos utiliza los codones maacutes utilizados por el
organismo productor heteroacutelogo (Puigbograve et al 2008) Seguacuten los resultados los
valores CAI y el contenido GC de todas las proteiacutenas utilizadas como datos de
entrada fue substancialmente mejorados y estaacute optimizada para ser utilizado en E
coli heteroacuteloga La finalidad de optimizar el contenido nucleotiacutedico de las
secuencias utilizadas para disentildeo a las caracteriacutesticas requeridas del hospedero
es para incrementar el rendimiento de produccioacuten (Puigbograve et al 2008)
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Tabla 1 Uso de codones previo y despueacutes de la optimizacioacuten
Paraacutemetros Previo a la optimizacioacuten Despueacutes de la optimizacioacuten
Gen Tamantildeo (pb) CAI GC CAI GC
agrC 1116 0407 282 0770 433
agrA 717 0402 272 0766 446
lnqQ 162 0532 333 0675 469
lnqB 240 0525 225 0735 400
lnqC 480 0518 231 0771 421
lnqE 1299 0511 259 0773 410
lnqD 678 0503 305 0777 431
lnqF 795 0521 245 0747 424
gfp NA NA NA 0759 491
El iacutendice de adaptacioacuten (CAI) y el contenido de guanidina y citosina (GC) La tabla se divide en dos
secciones previo a la optimizacioacuten y despueacutes de la optimizacioacuten La columna de gen representa el nombre del
dato de entrada y el tamantildeo que indica el total de nucleoacutetidos para cada entrada Los resultados en la tabla
representan la adaptabilidad de las secuencias de entrada usando a E coli como hospedero No fue posible
determinar el uso de codones antes de la optimizacioacuten para el gen gfp debido a que no hay suficiente
informacioacuten al computador el iacutendice CAI con esta tabla de referencia NA = No Aplica
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Es conocido que S aureus posee cuatro grandes variantes de clases de
moleacuteculas de AIP (desde I hasta IV) la cual difiere entre uno a dos residuos en la
seccioacuten madura del AIP (Ji et al 2005 B Wang amp Muir 2016) La diferencia
estructural entre las clases de AIP pueden actuar como inhibidores competitivos
del QS cuando interactuacutean con cepas filogeneacuteticamente relacionadas Este
fenoacutemeno bioloacutegico es conocido como comunicacioacuten cruzada (Everett amp
Rumbaugh 2014)
Para predecir la probabilidad de comunicacioacuten cruzada de nuestro biosensor
descargamos las secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro variantes maacutes
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representativas de AgrD junto la informacioacuten anotada del AgrD de la cepa MRSA
estaacutendar Finalmente realizamos un alineamiento local bajo la herramienta
EMBOSS Water entre cada una de las secuencias aminoaciacutedicas representativas
contra la secuencia aminoaciacutedica de nuestra cepa Los resultados revelan (Tabla
2) que el AgrD de nuestro MRSA tuvo un porcentaje de identidad y de similitud con
el AgrD clase I de 478 y 652 respectivamente Para la clase II los
porcentajes fueron 100 y 100 respectivamente mientras que con la clase III
fueron de 326 y 500 respectivamente Finalmente con la clase IV los
porcentajes fueron de 457 y 609 respectivamente Seguacuten los resultados del
alineamiento podemos inferir que nuestro biosensor es uacutetil para detectar
moleacuteculas de QS producidos por S aureus N315 y por otros S aureus que sean
productores de AIP tipo II Al mismo tiempo nuestro sistema estariacutea limitado a no
detectar S aureus productores de AIP clases I III y IV
Bajo la prediccioacuten anterior nuestro biosensor completo de ceacutelulas estariacutea
capacitado para detectar ceacutelulas de S aureus N315 inclusive cepas de S aureus
USA100 las cuales son productoras naturales de moleacuteculas de AIP clase II
(Grundstad et al 2019) y estaacuten sentildealadas como entre las principales cepas tipo
MRSA que circulan a nivel mundial esta cepa es altamente letal y es una causa
de endocarditis infecciosa en la vaacutelvula nativa del corazoacuten A nivel in vitro se
reporta que es una productora de biopeliacuteculas fuertes (King Kulhankova Stach
Vu amp Salgado-Paboacuten 2016) A pesar de ser una cepa principalmente asociada a
infecciones adquiridas en hospitales (Limbago et al 2009 Tenover et al 2008)
tambieacuten se ha encontrado entre individuos que no han recibido cuidados meacutedicos
previos Noacutetese que esta cepa es resistente a vancomicina (Roberts 2013)
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Tabla 2 Prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Clase AIP Alineamiento de proteiacutenas Tamantildeo ID Similitud Gaps Score Ref
I MNTLFNLFFDFITGILKNIGNIAAYSTCDFIMDEVEVPKELTQLHE- 46 478 652 00 1700 1 2
II MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK 47 1000 100 00 24000 1 2
III MKKLLNKVIELLVDFFNSIGYRAAYINCDFLLDEAEVPKELTQLHE- 46 326 500 00 7200 1 2
IV MNTLYKSFFDFITGVLKNIGNVASYSTCYFIMDEVEIPKELTQLHE- 46 457 609 00 10500 2
MRSA MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK - - - - -
El alineamiento de proteiacutenas se realizoacute entre las cuatro clases mayoritarias de AIP contra el MRSA El alineamiento fue realizado en el programa Clustal Omega
mientras que la identificacioacuten (ID) similitud gaps y score fue determinado de la aplicacioacuten EMBOSS Water
1 (B Wang amp Muir 2016)
2 (Ji et al 2005)
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67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
El anaacutelisis de solubilidad y localizacioacuten subcelular entre todas las secuencias
aminoaciacutedicas utilizadas para construir biosensor de ceacutelulas enteras es necesario
para obtener un alto rendimiento productivo (Ghosh et al 2004) Seguacuten los
resultados obtenidos por la aplicacioacuten Protein-Sol (Tabla 3) para prediccioacuten de
solubilidad eacutestos indican que LnqQ LnqF AgrA y GFP son considerados solubles
mientras que los datos obtenidos para LnqB LnqC y LnqE no pudieron ser
considerados ya que la aplicacioacuten los clasificoacute como proteiacutenas de membrana
Tabla 3 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
Gen Iacutendice Solubilidad
AgrC 0366 Invaacutelido
AgrA 0514 Soluble
LnqQ 0655 Soluble
LnqB 0655 Invaacutelido
LnqC 0644 Invaacutelido
LnqD 0388 Invaacutelido
LnqE 0609 Invaacutelido
LnqF 0607 Soluble
GFP 0592 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice superior de 045 es
porque se consideraron proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
De acuerdo con las predicciones de la aplicacioacuten BUSCA (Tabla 4) la localizacioacuten
subcelular de las proteiacutenas AgrA LnqQ LnqE y GFP es en el citoplasma mientras
que AgrC LnqB LnqC LnqD LnqE y LnqF son producidos en la membrana
plasmaacutetica Los caacutelculos predictivos en las proteiacutenas a sobreproducirse en E coli
concuerda con lo observado en la literatura para los elementos geneacuteticos del
moacutedulo biosensor el AgrC actuariacutea como una proteiacutena transmembranal con
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actividad histidina quinasa mientras que AgrA actuariacutea como factor de
transcripcioacuten que se mueve a traveacutes del citoplasma para anclarse al promotor P2
(Gomes-Fernandes et al 2017) En los elementos del moacutedulo de bacteriocina se
espera que la LnqQ actuacutee como una proteiacutena soluble de bajo peso molecular que
es producido y excretado al medio extracelular (Fujita et al 2007) Para los demaacutes
elementos estructurales de este moacutedulo se sabe que LnqB es una proteiacutena
membranal tipo permeasa mientras que LnqC y LnqD son proteiacutenas con dominios
franqueados en membrana asiacute como LnqE y LnqF son proteiacutenas transportadoras
tipo ABC-2 y ABC respectivamente (Iwatani et al 2012) Por uacuteltimo los valores
de predictivos indican que la GFP seraacute producida como una proteiacutena soluble y
monomeacuterica (Zacharias et al 2002)
Tabla 4 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
Gen Valor Localizacioacuten subcelular
AgrC 075 Membrana plasmaacutetica
AgrA 07 Citoplasma
LnqQ 07 Citoplasma
LnqB 09 Membrana plasmaacutetica
LnqC 083 Membrana plasmaacutetica
LnqD 072 Membrana plasmaacutetica
LnqE 086 Membrana plasmaacutetica
LnqF 07 Citoplasma
GFP 07 Citoplasma
De acuerdo con la aplicacioacuten BUSCA las localizaciones subcelulares disponibles son membrana plasmaacutetica y
citoplasma
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
La determinacioacuten de la alergenicidad es un aspecto deseado durante la
construccioacuten del biosensor de ceacutelulas enteras debido a que nuestro sistema seriacutea
presentado en el futuro como un potencial candidato a agente terapeacuteutico Para
demostrar este punto fue necesario demostrar que la estructura tanto primaria
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como secundaria de la LnqQ presentaba epiacutetopos para ceacutelulas tipo B dado que la
alergenicidad estaacute mediada tanto por ceacutelulas De acuerdo con los resultados de la
secuencia aminoaciacutedica de la LnqQ en su estructura en forma lineal (Tabla 5) se
indica que los potenciales residuos epiacutetopos corresponden a E13 S16-V19 y W21-
D31 Mientras tanto los anaacutelisis realizados por la aplicacioacuten Discotope 20 a la
secuencia aminoaciacutedica en su forma tridimensional indican que no se encontraron
residuos potencialmente epiacutetopos para ceacutelulas B ni se determinaron sitios de
alergenicidad
Tabla 5 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas B en LnqQ
Epiacutetopos EEEEEEEEEEEEEEEE
Secuencia lineal MAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIK
Estructura CCHHHHHHHHHHHHCCHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCC
Superficie EEEBEEBBEBBBEBEEEBBEBBBEEEEEBBEBBEBBBBBEBBBEEBEEEEEEE
La prediccioacuten fue resuelta en la aplicacioacuten BediPrep En la seccioacuten de epiacutetopos si la posicioacuten estaacute arriba de
05 entonces es marcado con una letra ldquoErdquo La aplicacioacuten anexa NetsurfP fue usada para la prediccioacuten
estructural a partir de secuencia lineal y se divide en tres categoriacuteas ldquoHrdquo para heacutelice ldquoErdquo para hoja y ldquoCrdquo para
cadena En la seccioacuten de superficie se divide en dos secciones ldquoBrdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el interior de la proteiacutena (burial) mientras que ldquoErdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el exterior de la proteiacutena (exposed)
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 67
610 Prediccioacuten de alergenicidad
De acuerdo con el reporte realizado por la aplicacioacuten AllerCatPro la bacteriocina
LnqQ no posee elementos alergeacutenicos
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
6111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE fue seleccionado porque se ha demostrado que los
primeros 33 residuos de la α-amilasa (AmyE) de B subtilis pueden ser acoplados
a la regioacuten N-terminal a una proteiacutena de intereacutes para su produccioacuten periplaacutesmica
en ceacutelulas de E coli (R M Papi et al 2005)
En primer lugar descargamos la secuencia nucleotiacutedica de la AmyE desde la base
de datos de GenBank Despueacutes utilizamos los dos oligonucleoacutetidos reportados
por Papi y sus colaboradores (R M Papi et al 2005) que estaacuten modificados con
extremos overhangs Cada oligonucleoacutetido estaacute compuesto por un sitio de
restriccioacuten en su extremo 3rsquo-terminal que corresponden a NdeI y BamHI
respectivamente
En la aplicacioacuten SnapGene el archivo geneacutetico del AmyE fue abierto y sobre eacutesta
se incorporaron los dos oligonucleoacutetidos mencionados arriba despueacutes se corrioacute un
ensayo de PCR in silico para extraer el peacuteptido sentildeal N-AmyE de la amilasa El
producto in silico resultante corresponde a un tamantildeo 117 pb que estaacute ordenado
de la siguiente manera 5rsquo-NdeI-(N-AmyE)-BamHI-3rsquo
En la misma aplicacioacuten realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten con
el producto de PCR in silico y el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)dnardquo Desde la
aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten pET-30a(+) y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten NdeI y BamHI
Posteriormente el producto de PCR compuesto con los extremos overhangs fue
cortado tambieacuten con el mismo conjunto de enzimas de restriccioacuten y procedimos a
clonar creando un vector de expresioacuten El vector fue nombrado y guardado como
ldquopET-30a(+)-N-AmyEdnardquo
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6112 Disentildeo y construccioacuten de pETNL
En el extremo del peacuteptido sentildeal N-AmyE se le acoploacute la secuencia nucleotiacutedica de
la LnqQ por teacutecnicas de clonacioacuten molecular in silico Inicialmente el archivo
geneacutetico del gen lnqQ fue descargado (GenBank no AB2352011) y abierto en la
aplicacioacuten de SnapGene
A la secuencia nucleotiacutedica original de la lnqQ en el extremo 5rsquo-terminal
agregamos manualmente una secuencia que contiene el sitio de restriccioacuten BamHI
y riacuteo debajo de eacutesta agregamos un par de nucleoacutetidos (TT) Inmediatamente
despueacutes se colocoacute un codoacuten de inicio (ATG) y se antildeadieron los 52 residuos
restantes para un total de 53 de aminoaacutecidos que representan a LnqQ Justo en el
extremo C-terminal de esta bacteriocina se agregoacute una cola de polihistidina (H89-
H94) y un codoacuten de paro (TAG) En seguida se agregaron otro par de nucleoacutetidos
(TA) y se integroacute un sitio de restriccioacuten SalI Esta seccioacuten correspondioacute a un
fragmento lineal de 193 pb de la secuencia nucleotiacutedica que codifica para
LnqQ6xHis (Tabla 6)
Desde SnapGene realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten entre el
fragmento lineal de 193 pb con el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)N-AmyEdnardquo
Desde la aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten BamHI y SalI
Posteriormente el fragmento lineal fue cortado tambieacuten con el mismo conjunto de
enzimas de restriccioacuten y procedimos a clonar creando un vector de expresioacuten
nombrado y guardado como ldquopETNLdnardquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pETNL estaacute guardando en formato dna bajo el
nombre ldquopETNLdnardquo En este plaacutesmido se observan por los elementos geneacuteticos
propios de un vector pET30(a)+ en conjunto con los genes necesarios para la
construccioacuten N-AmyELnqQ
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Tabla 6 Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ (5rsquorarr3rsquo) Tamantildeo
pETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQL
LAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIKHH
HHHH
94
Los residuos subrayados representan el peacuteptido sentildeal Los residuos en negritas representan a LnqQ
6113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
Los resultados obtenidos del corte proteoliacutetico en el peacuteptido sentildeal N-AmyE fueron
contrastados con los datos de seis secuencias aminoaciacutedicas (Tabla 7) que teniacutean
el reporte de que este mismo peacuteptido sentildeal N-AmyE era cortado de manera
efectiva en cada una de ellas Tres de las secuencias corresponden a las
secuencias aminoaciacutedicas totales de tres α-amilasas reportadas en diferentes
cepas de B subtilis (Emori amp Maruo 1988 Kunst et al 1997 Yang et al 1983)
Dos de eacutestas corresponden a secuencias que se utilizaron para investigar queacute
aminoaacutecidos eran los necesarios para cortar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en ceacutelulas
de B subtilis o de E coli (Nakazawa et al 1986 Sakakibara et al 1993) La
uacuteltima corresponde a una construccioacuten sinteacutetica donde el peacuteptido sentildeal N-AmyE
fue utilizado para transportar liasa de pectina a la regioacuten periplaacutesmica de E coli (R
M Papi et al 2005)
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Tabla 7 Secuencias utilizadas para prediccioacuten de corte enzimaacutetico de N-
AmyELnqQ
Nombre Secuencia aminoaciacutedica
gtYang1983
(CAA234371)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPDDRRLRMEINSQSEKEIQFGKTYTIML
KGTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPAD
TDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtNakazawa1986
(PTUE33)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAQACPPETLVKVKDAEDQL
gtEmori1988
(CAA306431)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIEIRCNTFFQ
gtSakakibara1993
(PTUBE695)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASACAAPFNGTM
gtKunst1997
(NP_3881862)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPETAFKDGDQFTIGKGDPFGKTYTIMLK
GTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPADT
DTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtPapi2005 MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRIRMSYPESKLTGLTGFALAAKVTGGWAGPVVSITNLDQLKANIG
TVTPQVLVINSNISASSLTKVNMGANKTLIGSFQNRTLENIHLRATAQSQNIILQNLIFKHSANIKANDDIQVYLNY
GSKYWIDHCSFVGHSWSTTDGSEDKLLYIGEKADYATISNCFFGSHKYGLIFGHPADDNNAAFNGYPRLTLCHNRFD
NMEVRAPGLMRYGYFHVYNNYINKFHLGFTLAQNANILSESNYFGEGSQNNGMLDDKGSGTFTDTNSVPPITNQKSP
KAQWTATSNYAYTLKTAAQAKDFTQKNAGAQAAALVFGS
gtpETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWV
VSKIKQILGIKHHHHHH
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En las bacterias existen dos mecanismos generales para la secrecioacuten de
proteiacutenas a traveacutes de la membrana citoplasmaacutetica En la viacutea de Secrecioacuten General
denominada como viacutea Sec las proteiacutenas son translocadas a la membrana en su
forma desnaturalizada y posteriormente son plegados en forma nativa en el lado
transversal de la membrana Mientras tanto en la viacutea de Translocacioacuten de
Gemelos Argininas conocida como viacutea Tat las proteiacutenas son translocadas en su
estado plegado nativo (Natale Bruumlser amp Driessen 2008)
De acuerdo con nuestros resultados (Tabla 8) el valor de calculado de prediccioacuten
de corte de peacuteptido sentildeal de las secuencias aminoaciacutedicas completas de tres α-
amilasas representan 09724 (Yang et al 1983) 09458 (Emori amp Maruo 1988) y
09724 (Kunst et al 1997) respectivamente De las secuencias parciales de
peacuteptidos sentildeales N-AmyE los resultados indican 08722 (Nakazawa et al 1986) y
06092 (Sakakibara et al 1993) Para la secuencia que se utilizoacute para exportar la
liasa de pectina al periplasma de E coli el valor calculado correspondioacute a 08262
(R M Papi et al 2005) en todas estas secuencias el mecanismo de secrecioacuten
general de proteiacutenas es el tipo Sec clase I Para nuestra proteiacutena N-AmyELnqQ
el valor calculado estimado fue de 04063 sin que fuera determinado su
mecanismo de corte predictivo Es decir nuestro valor calculado es mucho menor
a lo observado contra secuencias que habiacutean sido probados experimentalmente
Tabla 8 Prediccioacuten de corte enzimaacutetico de peacuteptido sentildeal N-AmyE
Identificacioacuten Prediccioacuten SecSPI TatSPI SecSPII Otro Pos
gtYang1983 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtNakazawa1986 SP(SecSPI) 08722 00359 00229 0069 33 y 34
gtEmori1988 SP(SecSPI) 09458 00122 0009 0033 33 y 34
gtSakakibara1993 SP(SecSPI) 06092 00428 01377 02103 31 y 32
gtKunst1997 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtPapi2005 SP(SecSPI) 08262 00183 00178 01377 31 y 32
gtpETNL Otro 04063 00249 00134 05554 Otro
SecSPI Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal I (Lep) TatSPI Translocoacuten Tat mediado por
Peptidasa de Sentildeal I (Lep) SecSPII Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal II (Lsp) Pos Sitio de
corte enzimaacutetico dentro de la estructura aminoaciacutedica lineal
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612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
6121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo geneacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP estaacute guardado en formato dna
bajo el nombre ldquopET30a-SmbPdnardquo y estaacute flanqueado en el extremo 5rsquo-terminal
por el sitio de restriccioacuten NdeI y en el extremo 3rsquo-terminal por el sitio de restriccioacuten
NcoI El peacuteptido de fusioacuten estaacute dividido en dos secciones en el extremo N-terminal
estaacute compuesta por la regioacuten citoplasmaacutetica de la SmbP (SmbP) compuesta por
94 residuos seguido de dos residuos G95 y T96 riacuteo abajo inicia el extremo C-
terminal que estaacute compuesta por cinco residuos y representa al sitio de corte por
enteroquinasa (DDDDK)
6122 Disentildeo y construccioacuten de pSmbP-LnqQ
El archivo geneacutetico que contiene la bacteriocina LnqQ fue descargado de la base
de datos (GenBank no AB2352011) Inmediatamente en el extremo C-terminal
del peacuteptido de fusioacuten mediante la aplicacioacuten SnapGene antildeadimos manualmente
un residuo de alanina en la posicioacuten 102 y riacuteo debajo de eacutesta antildeadimos los 53
residuos que conforman el LnqQ iniciando con M103 En direccioacuten al extremo C-
terminal inmediatamente despueacutes del codoacuten de teacutermino (TAA) se agregoacute el sitio
de restriccioacuten XhoI Los elementos que componen la construccioacuten del pSmbP-
LnqQ (Tabla 9) estaacuten representados en el siguiente orden 5rsquo-NdeI-SmbP-DDDDK-
LnqQ-XhoI-3rsquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pSmbP-LnqQ estaacute guardado en formato dna bajo
el nombre ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01dnardquo En este plaacutesmido se observan por los
elementos geneacuteticos propios de un vector pET30(a)+
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Tabla 9 Secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica del producto del vector de
expresioacuten (5rsquorarr3rsquo)
Tamantildeo
pSmbP-LnqQ MSGHTAHVDEAVKHAEEAVAHGKEGHTDQLLEHAKESLTHAKAAS
EAGGNTHVGHGIKHLEDAIKHGEEGHVGVATKHAQEAIEHLRASE
HKSHGTDDDDKAMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWL
NAGQAIDWVVSKIKQILGIK
155
Los residuos subrayados representan el peacuteptido de fusioacuten Los residuos resaltados representan el sitio de
corte de enteroquinasa Los residuos en negritas representan a LnqQ
6123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten de PeptideCutter se detectoacute un
uacutenico sitio de corte en la proteiacutena SmbP-LnqQ para la enzima enteroquinasa que
se encuentra ubicado en el residuo K101 lo cual coincide con lo esperado
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Los resultados sobre la identificacioacuten de codones de paro post disentildeo en la
construccioacuten de pETNL y pSmbP-LnqQ indicaron que no existe evidencia de
codones de paro ya que la aplicacioacuten en liacutenea logroacute identificar un marco de lectura
abierto con un tamantildeo de 285 pb que codifican para 94 aminoaacutecidos cuya
secuencia coincide con exactitud con la secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
para el caso de pETNL Mientras tanto un marco de lectura compuesto por un
tamantildeo molecular de 488 pb que se traducen para 155 aminoaacutecidos y cuya
secuencia coincide en su totalidad con la secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
De acuerdo con los resultados calculados por la aplicacioacuten de Compute pIMw tool
de ExPasy el peso molecular teoacuterico estimado del producto N-AmyELnqQ de
pETNL es de 1053468 Da con un punto isoeleacutectrico pi = 1063 mientras que para
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el producto SmbP-LnqQ de pSmbP-LnqQ el peso estimado es de 1669771 Da
con punto isoeleacutectrico pI = 645
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
Seguacuten los resultados los iacutendices de solubilizacioacuten (Tabla 10) de N-AmyELnqQ y
del SmbP-LnqQ es de 0575 y 0865 respectivamente La aplicacioacuten sin embargo
clasifica a los productos del vector pETNL como invaacutelidos mientras que los
productos de pSmbP-LnqQ fueron considerados como solubles La razoacuten porque
la N-AmyELnqQ es considerado como invaacutelido se debe a que fue identificado
como proteiacutena de membrana En el caso de localizacioacuten celular (Tabla 11) los
pronoacutesticos indican que los productos producidos por pETNL y pSmbP-LnqQ se
encontraraacuten en membrana plasmaacutetica y en el citoplasma respectivamente
Tabla 10 Prediccioacuten de solubilidad N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Iacutendice Solubilidad
N-AmyELnqQ 0575 Invaacutelido
SmbP-LnqQ 0865 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice de solubilidad superior
a 045 es porque son considerados proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
Tabla 11 Prediccioacuten de localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Valor Localizacioacuten subcelular
N-AmyELnqQ 085 Membrana plasmaacutetica
SmbP-LnqQ 07 Citoplasma
Esto coincide con lo observado en los antecedentes ya que indican que las
proteiacutenas expresadas en E coli con el peacuteptido sentildeal N-AmyE en su regioacuten N-
terminal a menudo se localizan en el periplasma (Nakazawa et al 1986 R M
Papi et al 2005) Mientras que las proteiacutenas acopladas con el peacuteptido de fusioacuten
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 75
SmbP son reportadas para encontrarse en la regioacuten citoplasmaacutetica debido a que la
seccioacuten aminoaciacutedica que las orienta al periplasma fue removida de la secuencia
original de residuos quedaacutendose por tanto en el citoplasma celular de E coli
(Vargas-Cortez et al 2016)
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
El modelo estructural tanto en su forma secundaria (Figura 6) como tridimensional
(Figura 8) para N-AmyELnqQ asiacute como la presunta estructura secundaria (Figura
7) y tridimensional (Figura 10) para SmbP-LnqQ fueron revelados en este
documento En la estructura secundaria prevista para N-AmyELnqQ se espera
que el 96 de la secuencia esteacute compuesta por estructuras tipo α-heacutelices y se
estima que el 17 de la secuencia aminoaciacutedica total esteacuten embebidas en la
regioacuten transmembranal La evidencia predictiva de la N-AmyELnqQ (Figura 9) a
traveacutes de la aplicacioacuten Phyre2 indicoacute que los primeros 12 residuos del extremo N-
terminal estariacutean orientados en la regioacuten extracelular mientras que los residuos 15
al 30 estariacutean ubicados en regioacuten intermembranal entre el espacio extracelular y la
citoplasmaacutetica El resto de los residuos del extremo C-terminal estariacutean orientados
en la cara citoplasmaacutetica de la ceacutelula de E coli Mientras tanto la estructura
secundaria putativa para SmbP-LnqQ indica que el 85 de secuencia total estaacute
compuesta por α-heacutelices
En las estructuras tridimensionales putativas tanto para N-AmyELnqQ como en la
SmbP-LnqQ prevalece la formacioacuten de cuatro α-heacutelices Estos motivos
estructurales tipo α-heacutelices son comuacutenmente observados en bacteriocinas
similares a LnqQ (Lynch et al 2019) de manera que podemos predecir que la
estructura secundaria y tridimensional de la LnqQ no se ve afectada cuando estaacuten
acopladas tanto por N-AmyE como con SmbP
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 76
Figura 6 Prediccioacuten de la estructura secundaria de N-AmyELnqQ
La estructura secundaria predicha del N-AmyELnqQ en Phyre2
Figura 7 Prediccioacuten de la estructura secundaria de SmbP-LnqQ
La estructura secundaria putativa del SmbP-LnqQ en Phyre2
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Figura 8 Prediccioacuten de estructura tridimensional de N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de N-
AmyELnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones
propuestas por modelo son de (Å) X29824 Y24988 Z25496
Figura 9 Prediccioacuten de heacutelices transmembranales para N-AmyELnqQ
La imagen es resultado de la prediccioacuten propuesta por Phyre2 para heacutelices transmembranales de N-
AmyELnqQ
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Figura 10 Prediccioacuten de estructura tridimensional de SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de SmbP-
LnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones propuestas
por modelo son de (Å) X32655 Y24988 Z25496
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
6171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Las ceacutelulas presuntamente transformadas fueron seleccionadas con kanamicina
De acuerdo con la evidencia presentada (Figura 11) los controles experimentales
cumplieron con su objetivo ya que no se registroacute crecimiento en placas de LB agar
esteacuteriles en el control negativo (Figura 11 a) en cuanto al control de viabilidad
eacuteste demostroacute que la electroporacioacuten no fue un factor significativo que causara la
muerte de ceacutelulas de E coli DH5α como BL21 (DE3) (Figura 11 b c) Por uacuteltimo
los controles con antibioacutetico demostraron que la kanamicina (50 microgml) era lo
suficientemente potente para seleccionar ceacutelulas (Figura 11 d e) Por uacuteltimo
demostramos bajo la teacutecnica de electroporacioacuten que las cepas de ceacutelulas de E
coli tanto BL21 (DE3) como DH5α fueron correctamente transformadas con los
vectores de expresioacuten pETNL (Figura 11 f g) pET30(a)+ (Figura 11 h j) y
pSmbP-LnqQ (Figura 11 i k) Los ensayos fueron realizados por triplicado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 79
Figura 11 Transformacioacuten de E coli DH5α y BL21 (DE3) con pET30a(+)
pETNL y pSmbP-LnqQ
Roacutetulo Descripcioacuten
a Control negativo
b Control viabilidad DH5α
c Control viabilidad BL21 (DE3)
d Control kanamicina + DH5α
e Control kanamicina + BL21 (DE3)
f DH5α + pETNL
g BL21 (DE3) + pETNL
h DH5α + pET30a(+)
i DH5α + pSmbP-LnqQ
j BL21 (DE3) + pET30a(+)
k BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ
Las placas rotuladas del a-c son placas LB con agar mientras que las placas d-k son placas LB
con agar suplementadas con kanamicina (50 microgml concentracioacuten final)
80
6172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Los ensayos para la extraccioacuten y purificacioacuten de los plaacutesmidos pET30(a)+ pETNL
y pSmbP-LnqQ de ceacutelulas de E coli que fueron observados en un gel de agarosa
1 (pv) Seguacuten la evidencia (Figura 12) nuestros controles demuestran que
tanto el plaacutesmido pETNL como el vector pSmbP-LnqQ se encontraban presentes
Los iacutendices de concentracioacuten y calidad de cada uno de los vectores fueron para
pET30(a)+ de 911 ngmicrol con A260A280 en 195 para el vector pETNL de 532 ngmicrol
con A260A280 en 194 y para el vector pSmbP-LnqQ de 2861 ngmicrol con A260A280 en
188 Seguacuten la literatura los iacutendices para considerar a un DNA plasmiacutedico como
puro deben tener valores espectrofotomeacutetricos de A260A280 entre 18-20 donde un
valor menor a 18 se considera como contaminacioacuten con proteiacutenas y un valor de
superior a 20 se considera contaminacioacuten por RNA (Koetsier Cantor amp Biolabs
sf) Podemos inferir que los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron recuperados en buena cantidad con un buen iacutendice de pureza
Figura 12 Gel de agarosa con plaacutesmidos
pETNL y pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer
TBE 1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Plaacutesmido pETNL
3 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
4 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli
BL21 (DE3) transformados con los vectores
de expresioacuten pETNL o pSmbP-LnqQ
El marcador de peso molecular corresponde
a 100-5000bp DNA Marker Plus Ready to
Use (Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
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6173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Seguacuten los resultados obtenidos por OligoAnalyzer Tool tras ajustar las
condiciones de los oligonucleoacutetidos a las especificaciones del fabricante del kit de
la polimerasa el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 promoter primer es de
20 pb con un contenido GC a 40 y un valor Tm = 591degC con un hairpin de -036
kcalmol a una Tm de 316degC y un valor homodiacutemero de -416 kcalmol Mientras
tanto el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 terminal primer es de 19 pb con
un contenido GC a 526 y un valor Tm = 61degC con un hairpin de 002 kcalmol a
una Tm de 248degC y un valor homodiacutemero de -474 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten NetPrimer el oligonucleoacutetido T7
promoter primer tiene un rating de eacutexito en 860 y presenta un valor de estabilidad
en su extremo 3rsquo-terminal de -87 kcalmol y no se identificoacute al hairpin el valor
homodiacutemero se registroacute en -759 kcalmol En el caso del oligonucleoacutetido T7
terminal primer este presenta un rating de eacutexito en 870 con un valor de
estabilidad en su extremo 3rsquo-terminal de -1142 kcalmol y tampoco se identificaron
hairpins el valor homodiacutemero se registroacute en -574 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los criterios habituales para seleccioacuten de oligonucleoacutetidos ambos
se mantuvieron en los estaacutendares ya que presentaron un tamantildeo entre 18 a 25 pb
con un hairpin cuyo valor de Tm fue menor a la Tm reportado para el
oligonucleoacutetido y los valores tanto de los homodiacutemeros y heterodiacutemeros nunca
fueron maacutes negativo o iguales a -9 kcalmol
En cuanto al caacutelculo de la Ta para ambos oligonucleoacutetidos utilizamos la regla
general de sustraer 5degC al Tm calculado para en ambos oligonucleoacutetidos Para el
caacutelculo de la Ta oacuteptimo para un par de oligonucleoacutetidos para un blanco en
particular se utilizoacute la siguiente foacutermula matemaacutetica TaOpt = 03 times (Tm de oligo) +
07 times (Tm producto) minus 149 donde el valor de Tm del oligonucleoacutetido es la
temperatura de fusioacuten del oligonucleoacutetido menos estable y la Tm es el valor del
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 82
temperatura de fusioacuten del producto de PCR (Rychlik Spencer amp Rhoads 1990)
De esta manera promediamos el valor de la Tm de ambos oligonucleoacutetidos y el
resultado fue 60degC A este valor le sustrajimos 5degC para un Ta ajustado en 55degC
en los ensayos de PCR punto final para la identificacioacuten de los plaacutesmidos
Por uacuteltimo calculamos el total de ciclos y el tiempo de extensioacuten para los ensayos
de PCR punto final De acuerdo con las especificaciones del fabricante se debe
agregar 1 minuto por cada kb por sintetizar en los ensayos De esta manera
calculamos en primera instancia el tamantildeo molecular de los productos de los
ensayos de PCR de los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
para determinar el tiempo de extensioacuten Para lograr este objetivo realizamos una
reaccioacuten in silico de PCR punto final entre los dos oligonucleoacutetidos T7 con cada
uno de los vectores de expresioacuten utilizados
Los archivos geneacuteticos de los tres vectores de expresioacuten fueron abiertos desde la
aplicacioacuten de SnapGene y ejecutamos una PCR punto final in silico
Posteriormente corrimos una simulacioacuten de gel de agarosa al 1 De acuerdo con
los resultados de nuestra simulacioacuten (Figura 13) las bandas esperadas de los
productos lineales de PCR de los vectores de pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
se encontrariacutean entre 367 pb 488 pb y 651 pb respectivamente Con esto
confirmamos que ninguno de los productos de PCR esperados tendriacutea un tamantildeo
superior al 1 kb y procedimos a configurar la reaccioacuten para el ensayo de PCR
punto final
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 83
Figura 13 Simulacioacuten de PCR para
vectores de expresioacuten
Gel de agarosa 10 generado desde
SnapGene
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Producto PCR de pET-30a(+)
2 Producto PCR de pETNL
3 Producto PCR de pSmbP-LnqQ
Las bandas corresponden a productos lineales
de PCR
El marcador de peso molecular in silico
corresponde a PCR DNA Ladder de GenScript
(Cat En desuso Estados Unidos) y fue tomado
desde la aplicacioacuten de SnapGene versioacuten 113
Asiacute pues configuramos las condiciones de corrida en el termociclador las cuales
fueron registradas de la siguiente manera una desnaturalizacioacuten inicial a 94degC por
180 s despueacutes 30 ciclos de desnaturalizacioacuten alineamiento y extensioacuten con
temperaturas en 94degC 55degC y 72degC respectivamente y sus respectivos tiempos de
reaccioacuten a 30 s 45 s y 30 s Finalmente se agregoacute una etapa de extensioacuten final
con una temperatura a 72degC por 420 s
6174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Despueacutes de realizar la teacutecnica de PCR punto final y una posterior corrida en un gel
de agarosa al 1 con buffer TBE 1X observamos una banda con tamantildeo de 367
pb para el producto de PCR obtenida del vector pET30(a)+ al tiempo que
recolectamos una banda de 488 pb para el producto de PCR del vector pETNL
(Figura 14) y finalmente encontramos una banda de 651 pb para el producto de
PCR del vector pSmbP-LnqQ (Figura 15) Dado que los valores predichos en la
simulacioacuten coinciden con los observado experimentalmente confirmamos que
nuestras cepas de E coli estaban efectivamente transformadas con su respectivo
vector de expresioacuten
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 84
Figura 14 PCR de pETNL
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 PCR de pET30(a) virgen
3 PCR de pETNL
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
Figura 15 PCR de pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Control positivo pET30(a) vaciacuteo
3 Control positivo pETNL
4 Control negativo PCR pUC57-DPQ
5 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
6 Control negativo PCR pUC57-DPQ
7 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
Para los anaacutelisis de expresioacuten de proteiacutenas utilizamos algunos vectores de
expresioacuten que han sido exitosos en la produccioacuten de proteiacutenas Los vectores
pET30a-SmbP_LL-37 y pET30a-SmbP_MP1106 fueron amablemente compartidos
por David Antonio Peacuterez miembro del grupo de investigacioacuten PEP con sede en la
Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la UANL
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 85
(Monterrey Nuevo Leoacuten) Similarmente el vector pET30NP-Hoc fue compartido
por Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros miembro del grupo de investigacioacuten
NBR con sede en el CIBYN (Apodaca Nuevo Leoacuten)
Dado que la informacioacuten de los tres plaacutesmidos se encuentra o se encontraba en
estado de revisioacuten al momento de redactar este documento por sus respectivos
comiteacutes de revisioacuten solo podemos limitarnos a mencionar los pesos moleculares
de los productos de cada vector de expresioacuten Para los dos vectores de David
Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) el peso molecular estimado de
ambos productos es 15 kDa mientras que el vector de Francisco Balderas el peso
molecular de su producto es de 95 kDa (F Balderas comunicacioacuten personal
2021)
6181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Para la induccioacuten por IPTG seguimos los protocolos preestablecidos para la
induccioacuten de proteiacutenas heteroacutelogas en ceacutelulas de E coli En nuestro ensayo la
concentracioacuten de IPTG elegida para la induccioacuten de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
correspondioacute a 01 mM Nosotros utilizamos esta concentracioacuten debido a que los
reportes indican que esta concentracioacuten es lo suficiente para saturar la reaccioacuten
bioloacutegica evitando la toxicidad celular por este compuesto (Malakar amp Venkatesh
2012) Los valores tiacutepicos de IPTG maacutes utilizados para la induccioacuten usualmente se
encuentran entre 05 mM y 10 mM (Mesa-Pereira et al 2018)
En nuestros cultivos el IPTG fue antildeadido en la fase exponencial tardiacutea (OD600 =
04-06) dado que el costo energeacutetico es maacutes alto durante la fase exponencial
temprana que en la tardiacutea (Malakar amp Venkatesh 2012) Ademaacutes se presume que
en esta fase el total de proteiacutenas producidas pueden alcanzar rendimientos
productivos superiores a 350 (Larentis et al 2014) Para nuestros ensayos
utilizamos dos temperaturas para inducir 37degC y 25degC y la razoacuten de utilizar una
temperatura maacutes baja es porque es un meacutetodo habitual para incrementar la
solubilidad de proteiacutenas recombinantes en E coli (Schein 1989)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 86
6182 SDS-PAGE de proteiacutenas periplaacutesmicas de E coli modificadas
con pETNL
Nuestros estudios preliminares bioinformaacuteticos indicaban que la proteiacutena N-
AmyELnqQ seriacutea insoluble (Tabla 10) y que tanto por sus antecedentes
(Nakazawa et al 1986 R M Papi et al 2005 Sjoumlstroumlm et al 1987) por sus
caracteriacutesticas moleculares estariacutea presuntamente ubicada en la regioacuten
periplaacutesmica de E coli (Tabla 11) Sin embargo nuestros resultados por ensayos
de SDS-PAGE indicaron que la induccioacuten por IPTG en ceacutelulas de E coli BL21
(DE3) transformados con el vector pETNL para la produccioacuten de N-AmyELnqQ
tanto en la fraccioacuten soluble como insoluble de proteiacutenas a una temperatura de
induccioacuten 25degC (Figura 16) como a 37degC (Figura 17) en la fraccioacuten periplaacutesmica
no fue posible en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) esta manifestacioacuten fue reportado
en muacuteltiples ocasiones De acuerdo con nuestros resultados no logramos
determinar la presencia de bandas de proteiacutenas en la regioacuten esperada que seguacuten
los anaacutelisis predictivos la proteiacutena N-AmyELnqQ debiacutea tener un peso molecular
cercano a 105 kDa
Es de mencionar que el valor de prediccioacuten de corte de peacuteptido sentildeal de la
proteiacutena N-AmyELnqQ fue muy inferior a los valores de prediccioacuten observados en
secuencias que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y que habiacutean sido previamente
validados experimentalmente (Tabla 8) Otro aspecto para considerar es que los
residuos reconocidos para el corte enzimaacutetico difieren entre los diferentes tipos de
bacterias (Nakazawa et al 1986) Esto quedoacute demostrado cuando observamos
que los residuos utilizados para el corte de este peacuteptido sentildeal podiacutean diferir
inclusive en el mismo tipo de bacteria Por ejemplo en la secuencia total de
aminoaacutecidos de la α-amilasa reportada por Yang y otros (Yang et al 1983) Emori
y otros (Emori amp Maruo 1988) y Kunst y otros (Kunst et al 1997) los residuos
observados corresponden al 33 y 34 mientras que para las secuencias de
aminoaacutecidos a los que se les fue acoplado el peacuteptido sentildeal en su regioacuten N-terminal
como las reportadas por Sakakibara y otros (Sakakibara et al 1993) y Papi y
otros (R M Papi et al 2005) los residuos de corte se ubicaron en la posicioacuten 31 y
32
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 87
Figura 16 Gel de E coli BL21 (DE3) con pETNL inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 88
Figura 17 Gel de E coli BL21 (DE3) pETNL inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 89
6183 SDS-PAGE de proteiacutenas citoplaacutesmicas de E coli modificadas
con pSmbP-LnqQ
Los estudios preliminares predictivos para la produccioacuten heteroacuteloga de SmbP-
LnqQ en E coli indicaban que la presencia del peacuteptido de fusioacuten SmbP
aumentariacutea la solubilidad de la proteiacutena recombinante solubilidad (Tabla 10) y que
ademaacutes seriacutea localizado en el citoplasma celular (Tabla 11) con un peso
molecular aproximado de 167 kDa Nuestros resultados por ensayos de SDS-
PAGE indicaron que no hubo produccioacuten citoplasmaacutetica de una banda esperada
de 15 kDa tras inducir con IPTG a ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) transformados
con el vector pSmbP-LnqQ para la produccioacuten del peacuteptido SmbP-LnqQ tanto a
25degC como 37degC (Figura 18) Estos ensayos fueron realizados por triplicado
Esto nos orilloacute a plantearnos dos posibilidades con relacioacuten a la proteiacutena SmbP-
LnqQ la primera era que pudiera presentar problemas por plegamiento durante su
produccioacuten en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) y que la segunda fuera problemas
internos relacionados al IPTG Para demostrar la primera hipoacutetesis transformamos
ceacutelulas de E coli Origami con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ y utilizamos el
vector pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo este vector seguacuten su autor
produce una proteiacutena de un tamantildeo de 15 kDa en ceacutelulas de E coli Origami
debido a que es una proteiacutena problemaacutetica (datos no publicados) Nuestra
evidencia (Figura 19) sentildeala que el IPTG no es causa probable de la nula
produccioacuten debido a que se observoacute una banda muy definida en la regioacuten de los
15 kDa para las bacterias transformadas con el vector terminacioacuten MP1106 que
habiacutean sido inducidas por IPTG tanto a 25degC como 37degC Tampoco se observoacute
que la cepa Origami contuviera un factor bioloacutegico no considerado en la cepa
BL21 (DE3) que pudiera agilizar la produccioacuten de la proteiacutena SmbP-LnqQ ya que
no encontramos ninguna banda de un tamantildeo de 15 kDa en las ceacutelulas Origami
transformados
Ante los resultados previos consideramos posibilidad de que el problema se
encontrara especiacuteficamente en la cepa de E coli (DE3) presente en nuestro
laboratorio Para demostrar este punto procedimos a transformarla la cepa con el
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 90
vector de expresioacuten pET30NP-Hoc para fines de control positivo para nuestro
experimento Seguacuten su autor este vector de expresioacuten produce una proteiacutena lineal
de 95 kDa al inducirse por IPTG a 1 mM (datos no publicados) Nuestros
resultados en el gel SDS-PAGE muestran una banda de proteiacutenas extraiacutedas de E
coli transformados pET30NP-Hoc en la seccioacuten de 95 kDa y es producido tanto a
37degC (Figura 20) como a 25degC (Figura 21) Sin embargo no pudimos observar
ninguna banda sobre expresada de 10 kDa para las BL21 (DE3) transformadas
con pETNL ni una banda tampoco de 15 kDa para las bacterias transformadas con
pSmbP-LnqQ De esta manera descartamos la idea que existiera un problema
bioloacutegico procedente en la cepa de E coli BL21 (DE3) mantenida en nuestro
laboratorio
Se conoce que la bacteriocina LnqQ ya ha sido sujeta a modificaciones geneacuteticas
para incrementar su produccioacuten al ser clonada y expresada con eacutexito con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) registraacutendose
rendimientos hasta de 130 mg por litro de cultivo bacteriano (Ma et al 2012) Ante
la ausencia de una banda de proteiacutenas en la regioacuten de 15 kDa en nuestro vector
de expresioacuten con peacuteptido de fusioacuten SmbP-LnqQ se ha comentado que no existen
razones para suponer que todas las etiquetas de fusioacuten son aptas para todo tipo
de necesidades ya que es casi imposible determinar cuaacutel es el peacuteptido de fusioacuten
oacuteptimo para la produccioacuten Sin embargo una de las ventajas de utilizar peacuteptidos
de fusioacuten reconocidos es que son reconocidos sus ventajas y desventajas ya que
en algunos casos algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la solubilidad
de las proteiacutenas tales como TRX MBP NusA etc pero otros peacuteptidos sentildeales no
incrementan la solubilidad de la proteiacutena de intereacutes como GST BAP etc Incluso
algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la carga metaboacutelica en la ceacutelula
como GST MBP y NusA (Waugh 2005)
A pesar del buen registro experimental disponible sobre construcciones que
contienen el peacuteptido de fusioacuten SmbP (Vargas-Cortez et al 2016) suponemos en
nuestro caso en particular que dada las limitaciones de su corto historial
experimental auacuten no existe informacioacuten que determine las ventajas y desventajas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 91
pertinente al peacuteptido de fusioacuten SmbP para observar si son viables para la
produccioacuten solubilidad yo purificacioacuten de maacutes tipos de bacteriocinas
Figura 18 Gel de E coli BL21 (DE3) pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3)+ pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3) transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 92
Figura 19 Gel de E coli Origami pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli Origami transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 93
Figura 20 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 37degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 37degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 37degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 37degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 37degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 37degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 37degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 37degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 94
Figura 21 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 25degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 25degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 25degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 25degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 25degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 25degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 25degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 25degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 95
619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de
proteiacutenas
Seguacuten el anaacutelisis fisicoquiacutemico de las secuencias aminoaciacutedicas que fueron
utilizadas en las construcciones para N-AmyE (Tabla 12) todas son de gran
tamantildeo y de alto peso molecular este peacuteptido se ha reportado para la
sobreexpresioacuten de AmyE en E coli (Nakazawa et al 1986) Asiacute como para la
sobreexpresioacuten de una regioacuten de 39 kDa que codifica para una regioacuten N-terminal
de una liasa de pectina (Pnl) en E coli (R Papi amp Kyriakidis 2003) a la fecha no
hemos visto alguacuten reporte de que este peacuteptido sentildeal haya sido utilizado para
producir proteiacutenas de bajo peso molecular
Por otro lado las secuencias que fueron exitosamente producidos con peacuteptido de
fusioacuten SmbP (Tabla 14) tambieacuten han mostrado ser uacutetil para producir proteiacutenas de
alto peso molecular o peacuteptidos de bajo peso molecular con actividad
antimicrobiana como VpDef (Montfort-Gardeazabal Claudio Casillas-Vega amp
Zarate 2020) Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al 2021) y muy recientemente LL-
37 (Perez-Perez et al 2021) el peacuteptido de fusioacuten tambieacuten ha demostrado ser
exitoso para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas de alto peso molecular como GFP y
RFP (Vargas-Cortez et al 2016) De esta manera consideramos que tanto el
tamantildeo como el peso molecular no son factores que intervengan durante el
proceso sobreproduccioacuten mediado tanto N-AmyE como con SmbP El punto
isoeleacutectrico tampoco parece ser un factor importante ya que el valor de AmyE es
aacutecido (561) mientras que Pnl es baacutesico (877) Situacioacuten similar sucede entre los
peacuteptidos microbianos puesto que VpDef es ligeramente aacutecido (686) en cambio el
resto de los peacuteptidos (Bin1b 949 LL-37 1061) son baacutesicos similar a LnqQ
Sin embargo observamos que tanto el iacutendice alifaacutetico (AI) como los valores del
iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) siacute son diferentes entre los distintos tipos de
peacuteptidos antimicrobianos Individualmente el valor AI de LnqQ es de 12115
(Tabla 12) y es superior al resto de los demaacutes peacuteptidos antimicrobianos con una
media de 5363 plusmn 3321) El valor AI para N-AmyELnqQ es de 11947 (Tabla 13) y
para SmbP-LnqQ es de 8323 (Tabla 15) respectivamente
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 96
Tabla 12 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con N-AmyE
ID AmyE Pnl LnqQ
L 627 316 53
MW 6929711 3448665 589810
pI 561 877 1010
R(-) 69 21 2
R(+) 55 25 8
AI 6694 7636 12115
GRAVY -0648 -0291 +0300
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 13 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con N-AmyE
ID N-AmyEAmyE N-AmyEPnl N-AmyELnqQ
L 660 360 94
MW 7279942 3947961 1053468
pI 588 922 1063
R(-) 69 22 2
R(+) 58 30 12
AI 6982 8061 11947
GRAVY -0553 -0205 +0426
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 97
Tabla 14 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID VpDef Bin1b LL-37
L 49 45 37
MW 543498 520906 449332
pI 686 949 1061
R(-) 6 3 5
R(+) 6 9 11
AI 2388 4756 8946
GRAVY -0996 -0571 -0724
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 15 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID SmbP-VpDef SmbP-Bin1b SmbP-LL-37 SmbP-LnqQ
L 152 148 140 155
MW 1630268 1607675 1536102 1669471
pI 594 648 645 645
R(-) 26 23 25 22
R(+) 16 19 21 18
AI 5086 5878 1828 8323
GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 98
En cuanto al iacutendice de hidrofobicidad LnqQ mostroacute un valor GRAVY positivo
(+0300) mientras que el resto de los peacuteptidos antimicrobianos donde el valor
GRAVY promedio era de -073 plusmn 019 No es de sorprender que las bacteriocinas
del subgrupo de la familia de las aureocinas similares a A53 como LnqQ
aureocina A53 lacticina Z epidermicina NI01 lactolisterina BU y BHT-B tengan
valores GRAVY positivos (Perez Zendo amp Sonomoto 2018) Sin embargo cuando
LnqQ estaacute acoplado a N-AmyE el valor GRAVY se vuelve auacuten maacutes positivo con
+0426 (Tabla 13) y cuando estaacute fusionado con SmbP el valor GRAVY cambia a -
0514 (Tabla 15)
La literatura menciona que un peacuteptido o proteiacutena presenta un valor GRAVY
positivo debe considerarse como hidrofoacutebica mientras que un valor GRAVY
negativo significa que la proteiacutena es hidrofiacutelica (Kyte amp Doolittle 1982) De manera
que proteiacutenas con valores GRAVY negativos indican que la proteiacutena presenta una
estructura globular (hidrofiacutelicos) mientras que proteiacutenas con valores GRAVY
positivos indican la posibilidad que la proteiacutena guarde alguna relacioacuten con la
membrana (hidrofoacutebicos) (Enany 2014)
El valor GRAVY es considerado como el factor que maacutes influye en la movilidad de
las proteiacutenas en los geles de SDS-PAGE una proteiacutena con un valor GRAVY
negativo tiende a migrar maacutes lento que las proteiacutenas con valores positivos en los
geles para proteiacutenas (Shirai et al 2008) Las unioacuten de las moleacuteculas de SDS con
las proteiacutenas se produce a traveacutes de los aminoaacutecidos hidrofoacutebicos (Robinson amp
Tanford 2002) algunas estructuras hidrofoacutebicas son capaces de unir moleacuteculas
SDS hasta en un rango desde 34 a 10 g de SDS por 1 g de proteiacutena lo que
influiriacutea en una migracioacuten electroforeacutetica anoacutemala en los geles de SDS-PAGE
(Rath Glibowicka Nadeau Chen amp Deber 2009) LnqQ es una proteiacutena globular
(Acedo et al 2016) que utiliza la membrana especiacuteficamente para atacar
(Yoneyama Imura Ohno et al 2009) con lo que suponemos que el iacutendice de
hidrofobicidad pudiera estar afectando en el comportamiento electroforeacutetico de las
proteiacutenas Sin embargo tambieacuten la literatura sugiere que el comportamiento
anoacutemalo en las proteiacutenas de membrana en los geles de SDS-PAGE pudiera no
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 99
necesariamente relacionado a la carga neta de la proteiacutena ni a su iacutendice de
hidrofobicidad (Rath amp Deber 2013)
Al evaluar individualmente a LnqQ a traveacutes la escala Kyte-Doolittle observamos
que el peacuteptido posee dos secciones hidrofoacutebicas que se encuentran
aproximadamente entre los extremos del peacuteptido (entre residuos 5 al 15 y del 31 al
49) representando el 60 del total de la secuencia de LnqQ es hidrofoacutebica
(Figura 22) Si LnqQ estaacute acoplada con N-AmyE se observan las dos regiones
hidrofoacutebicas (entre residuos 9-50 y 66-85) que representa que el 6860 del total
de la secuencia sea hidrofoacutebica (Figura 23) Mientras tanto SmbP retiene sus dos
regiones hidrofoacutebicas que se ubican hacia la regioacuten C-terminal entre los residuos
103-117 y 133-151 componiendo el 2313 de total de la secuencia (Figura 24)
Dado que existe un reporte de produccioacuten exitosa entre la LnqQ acoplada con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO (Ma et al 2012) decidimos evaluar su valor AI GRAVY
y su escala Kyte-Doolittle Seguacuten los resultados de ProtParam para SUMO-LnqQ
los valores AI y GRAVY son de 8337 y -0516 respectivamente los cuales son
similares a lo reportado para SmbP-LnqQ Por otro lado seguacuten la escala Kyte-
Doolittle cinco regiones hidrofoacutebicas fueron descritas a lo largo de toda la
construccioacuten y estaacuten aproximadamente repartidas en toda la estructura lineal
entre los residuos 16-18 53-70 87-91 119-134 y 150-168 lo que representa el
28 del total de la secuencia (Figura 25) El valor GRAVY positivo y el alto
porcentaje de residuos hidrofoacutebicos para N-AmyELnqQ nos permite suponer que
estaacute proteiacutena se encontrariacutea anclada en la membrana celular lo que dificultariacutea su
solubilizacioacuten en los geles de proteiacutenas
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Figura 22 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la LnqQ
Figura 23 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de N-AmyELnqQ
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 10 20 30 40 50 60
Valo
r
Posicioacuten
LnqQ
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
N-AmyELnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 101
Figura 24 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SmbP-LnqQ
Figura 25 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SUMO-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SUMO-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Va
lor
Posicioacuten
SmbP-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Va
lor
Posicioacuten
SUMO-LnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 102
Ante la ausencia de una respuesta objetiva que explique la ausencia de bandas de
SmbP-LnqQ en los ensayos analizamos el perfil de aminoaacutecidos y detectamos
que la presencia de cisteiacutenas entre los peacuteptidos antimicrobianos tampoco fue un
factor determinante durante la sobreproduccioacuten con la SmbP ya que tanto VpDef
como Bin1b (que se caracterizan por ser abundantes en cisteiacutenas) como LL-37
(que no tiene cisteiacutenas) fueron exitosamente producidos El mapa de calor (Figura
26) sentildealoacute un alto porcentaje de Trp en LnqQ en comparacioacuten con los demaacutes
peacuteptidos antimicrobianos De acuerdo con la escala Kyte-Doolittle Trp es
considerado un residuo hidrofiacutelico (Kyte amp Doolittle 1982) cuando en realidad es
hidrofoacutebico por sus caracteriacutesticas uacutenicas (Mishra Choi Moon amp Baek 2018)
Este residuo funge como estabilizador de las proteiacutenas en la membranas anclaje
y orientacioacuten hacia el lado hidrofiacutelico de la bicapa lipiacutedica (Khemaissa Sagan amp
Walrant 2021) por eso son de alta importancia en proteiacutenas de membrana porque
apoyan en la estabilidad proteiacutena en la interfaz lipiacutedica por su forma riacutegida y plana
(Yau Wimley Gawrisch amp White 1998) Se presume que Trp permite que
peacuteptidos antimicrobianos similares a la aureocina A53 se mantengan unidos a la
membrana (Netz Bastos amp Sahl 2002) Sin embargo al analizar el porcentaje de
Trp entre N-AmyELnqQ SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ descubrimos que los
valores son muy similares 11 26 y 23 Por lo que Trp no seriacutea un factor
clave para que LnqQ sea producido en E coli
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
VpDef
Bin1b
LL37
LnqQ
Figura 26 Perfil aminoaciacutedico de los peacuteptidos antes de acoplarse con SmbPc
El mapa de calor representa la distribucioacuten de los residuos entre los peacuteptidos La intensidad del color negro
representa el porcentaje de residuos entre los peacuteptidos antes de ser acoplados con SmbP
Dada la similitud fisicoquiacutemica entre SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ abordamos el
problema desde el punto de vista analiacutetico otros autores demostraron que
proteiacutenas de peso molecular alto como N-AmyEPnl (R Papi amp Kyriakidis 2003) o
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 103
de peso molecular pequentildeo como SmbP-Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al
2021) SmbP-VpDef (Montfort-Gardeazabal et al 2020) SmbP-LL-37 (Perez-
Perez et al 2021) eran faacutecilmente observables mediante la teacutecnica de SDS-
PAGE hechos que utilizamos para la visualizacioacuten preliminar tanto N-AmyELnqQ
como de SmbP-LnqQ en los ensayos electroforeacuteticos Sin embargo en el reporte
de sobreproduccioacuten por SUMO-LnqQ los ensayos electroforeacuteticos preliminares
fueron realizados bajo la teacutecnica SDS-PAGE con Tricina (Ma et al 2012) Esta
variante es utilizada para resolver proteiacutenas con pesos moleculares pequentildeos que
oscilan entre 1 a 30 kDa (Haider Reid amp Sharp 2012) pero tambieacuten es uacutetil para
analizar proteiacutenas hidrofoacutebicas (Schaumlgger 2006) lo cual seriacutea un candidato ad
hoc a las caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas observadas de la LnqQ
Por uacuteltimo y no menos importante es tambieacuten de mencionar todas las
secuencias aminoaciacutedicas donde los peacuteptidos antimicrobianos tuvieron eacutexito con la
SmbP tienen su origen evolutivo en sistemas eucarioacuteticos las defensinas VpDef
(Zhang et al 2015) y Bin1b (Guo et al 2009) provienen del invertebrado
Venerupis philippinarum y del epidiacutedimo de la rata Rattus norvegicus
respectivamente mientras que la catelicidina LL-37 proviene del sistema inmune
de chimpanceacutes y humanos (Agerberth et al 1995) nuestra LnqQ posee un origen
procariota a traveacutes de Lactococcus lactis QU5 (Fujita et al 2007) Las defensinas
estaacuten compuestas por estructuras tipo beta plegadas mediadas por cisteiacutenas
conservadas mientras que los dominios antimicrobianos de las catelicidinas son
estructuralmente lineales carentes de puentes disulfuro y estaacuten compuestas por
varias heacutelices (Dorin McHugh Cox amp Davidson 2014) LnqQ es una estructura
lineal compuesta por dos heacutelices anfipaacuteticas (Perez et al 2014) por lo que el
factor estructural tampoco seriacutea un factor clave salvo por el hecho de que
provienen de oriacutegenes evolutivos distintos
A manera de conclusioacuten de acuerdo con la evidencia recolectada tanto a nivel
bioinformaacutetico como experimental encontramos que el marco de lectura de los
vectores para la produccioacuten de N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ estaban
correctamente orientados y dispuestos en sus marcos de lecturas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 104
correspondientes los geles de poliacrilamida siacute fueron efectivos para detectar
proteiacutenas con un peso similar (lisozima 144 kDa) a los peacuteptidos de nuestras
construcciones (N-AmyELnqQ= 1053 kDa y SmbP-LnqQ= 1669 kDa)
Confirmamos que el IPTG siacute es capaz de inducir la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
de control tanto en cepas de E coli BL21 (DE3) como de Origami tanto a 25degC
como a 37degC De manera que tanto N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ suponemos
que siacute son producidas pero por caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas propias de la LnqQ
es posible que 1) dado su alta hidrofobicidad es posible que N-AmyELnqQ se
mantenga acoplada en la membrana celular lo que dificultariacutea su solubilizacioacuten en
los geles de SDS-PAGE 2) desde el punto de vista analiacutetico es posible que SDS-
PAGE no sea la teacutecnica oacuteptima para la visualizacioacuten de las proteiacutenas hidrofoacutebicas
3) no existe informacioacuten conclusiva que respalde soacutelidamente porqueacute SmbP-LnqQ
no logroacute ser sobreproducida utilizando E coli como organismo heteroacutelogo
productor
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 105
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES
El biosensor disentildeado de ceacutelulas de E coli basado en la deteccioacuten de moleacuteculas
de QS es capaz de producir LnqQ en base a la concentracioacuten externa de AIP
excretada por MRSA La capacidad del biosensor estaacute mediada por un vector de
expresioacuten disentildeado que lleva por nombre Dual Biosensor-Killer Este plaacutesmido
ademaacutes puede ser utilizado para la construccioacuten de otros biosensores que
compartan el objetivo de detectar y destruir otros patoacutegenos productores de
sentildeales tipo QS Seguacuten nuestros anaacutelisis bioinformaacuteticos in silico nuestro
biosensor estaacute capacitado para detectar y destruir cepas de S aureus que sean
productoras de moleacuteculas de sentildealizacioacuten tipo AIP clase II De acuerdo con
nuestros pronoacutesticos nuestra cepa modificada seriacutea capaz de producir secretar y
ser capaz de ser resistente a la produccioacuten de LnqQ debido a que la maquinaria
geneacutetica se mantuvo intacto Nuestros resultados revelan indican que la LnqQ
seraacute lo suficientemente soluble cuando sea sobreexpresado Por uacuteltimo
determinamos que no existen epiacutetopos para ceacutelulas tipo B ni riesgo de
alergenicidad De esta manera la LnqQ producida por este sistema bioloacutegico es
aparentemente seguro para ser utilizado como un potencial candidato a agente
terapeacuteutico Los resultados in silico motivan al desarrollo y disentildeo de nuevos
agentes antimicrobianos a traveacutes de biosensores de ceacutelulas enteras para eliminar
patoacutegenos tanto sensibles como resistentes a los antibioacuteticos A pesar de los
favorables resultados reportados en publicaciones anteriores y la evidencia
predictiva sobre el peacuteptido sentildeal N-AmyE y con el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la
produccioacuten de proteiacutenas recombinantes como la bacteriocina LnqQ dichas
observaciones no pueden ser aplicadas para la produccioacuten expresioacuten y
purificacioacuten desde ceacutelulas de E coli BL21 (DE3)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 106
ANEXOS
Divulgacioacuten de la investigacioacuten
Publicaciones
Beniacutetez-Chao DF Balderas-Cisneros FDJ Leoacuten-Buitimea A and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Design and in silico analysis of a whole-cell biosensor able to
kill methicillin-resistant Staphylococcus aureus Biotechnol Appl Biochem
httpsdoiorg101002bab2210
Beniacutetez-Chao DF Leoacuten-Buitimea A Lerma-Escalera JA and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Bacteriocins An Overview of Antimicrobial Toxicity and
Biosafety Assessment by in vivo Models Front Microbiol
httpsdoiorg103389fmicb2021630695
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 107
Archivos de disentildeo
Todos los archivos gestionados para los disentildeos estaacuten guardados en su formato
correspondiente adentro de la carpeta de ldquoDoctoral ndash Anexosrdquo la cual fue anexada
propiamente en el disco compacto
Se elaboroacute una carpeta nombrada ldquoBioBricks and Modulesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 61 hasta 610 y estaacute subdivida
en cuatro subcarpetas nombradas como ldquoBioBricks (secuencias originales)rdquo
ldquoModulesrdquo ldquoPlasmidsrdquo ldquoTemplatesrdquo y el ldquoDual Biosensor Killerdnardquo Estos archivos
fueron elaborados a traveacutes de la aplicacioacuten de SnapGene 113 y estaacuten guardados
en formato dna Tambieacuten entregamos dos documentos en formato PDF que
contienen la secuencia nucleotiacutedica optimizada de todos genes usados para el
moacutedulo de biosensor y para el moacutedulo de bacteriocina
Se creoacute una carpeta nombrada ldquoSignal and fusion peptidesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 611 hasta 618 y en esta se
encontraraacute la subcarpeta ldquoMapa Geneacutetico de vectores de expresioacuten de expresioacuten
pETNL y pSmbP-LnqQrdquo Ademaacutes se entregaron tres archivos PDF donde dos de
eacutestos archivos contienen datos predictivos de la estructura secundaria y terciaria
de los productos de pETNL ldquoPhyre2 pETNLpdfrdquo y de pSmbP-LnqQ ldquoPhyre2
pSmbP-LnqQrdquo a traveacutes de la aplicacioacuten en liacutenea Phyre2 y el otro archivo PDF
ldquoSimulacioacuten agarosa 1pdfrdquo que contiene una simulacioacuten en gel de agarosa 1
(pv) de los productos lineales de los vectores de expresioacuten pET30a(+) pETNL y
pSmbP-LnqQ En la carpeta de este capiacutetulo tambieacuten se entregaron cinco archivos
en formato dna que contienen la informacioacuten nucleotiacutedica de la construccioacuten de
los vectores de expresioacuten cuyos nombres son ldquopET30(a)-NAmyE-LnqQ
pETNLpdfrdquo ldquopET-30a(+)pdfrdquo ldquopET-30a(+)-N-AmyEpdfrdquo ldquopET30a-SmbPpdfrdquo y
ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01pdfrdquo Todos los archivos estaacuten marcados con sus
respectivas caracteriacutesticas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 108
Resumen autobiograacutefico
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
Candidato para el grado de
Doctor en Ciencias con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Tesis Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing de
Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Edad 31 antildeos
Campo de estudio Desarrollo de agentes terapeacuteuticos y biologiacutea sinteacutetica
Biografiacutea Nacido en Monterrey Nuevo Leoacuten el diacutea 24 de julio de 1990 hijo de
Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas
Educacioacuten Egresado de Licenciado en Biotecnologiacutea Genoacutemica (UANL) en el
2013 y Maestro en Ciencias con Acentuacioacuten en Microbiologiacutea (UANL) en 2015
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 109
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UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 138
ii
iii
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada iv
CONTRAPORTADA
RESUMEN
Diego Francisco Beniacutetez Chao Fecha de graduacioacuten 2021
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
Facultad de Ciencias Quiacutemicas
Tiacutetulo de Estudio Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing
de Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Nuacutemero de paacuteginas 156 Candidato para el Grado de Doctor en Ciencias con
Orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Aacuterea de estudio Microbiologiacutea Aplicada Biologiacutea Sinteacutetica y Bacteriocinas
Propoacutesito y Meacutetodo de Estudio El incremento de infecciones por S aureus
resistentes a meticilina (MRSA) ha ganado importancia en los sistemas de salud
puacuteblicos mundiales en las uacuteltimas deacutecadas Diversos agentes terapeacuteuticos
alternativos a los antibioacuteticos han sido desarrollados para el tratamiento de este
tipo de infecciones Recientemente bajo los principios de la Biologiacutea Sinteacutetica
se han habilitado ceacutelulas enteras que sirvan como biosensores detectando
moleacuteculas producidas por patoacutegenos y que como resultado liberen una
sustancia antimicrobiana que erradique al patoacutegeno como las bacteriocinas
Actualmente los peacuteptidos sentildeales y los peacuteptidos de fusioacuten han sido
ampliamente usados para mejorar la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas
en sistemas recombinantes En este trabajo presentamos el disentildeo in silico que
emula a E coli para que actuacutee como biosensor al detectar moleacuteculas de
Quorum Sensing (QS) de MRSA productoras de sentildeales AIP-II y que en
respuesta produzca Lacticina Q (LnqQ) una bacteriocina con antecedentes
contra ceacutelulas MRSA Adicionalmente experimentamos la capacidad del
peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la produccioacuten
heteroacuteloga de LnqQ en el periplasma y el citoplasma de ceacutelulas de E coli
respectivamente
Contribuciones y Conclusiones En primera instancia se construyeron dos moacutedulos
geneacuteticos biosensor y de bacteriocina ambos moacutedulos fueron ensamblados en
el plaacutesmido Dual Biosensor-Killer Ambos moacutedulos fueron optimizados para su
expresioacuten en E coli para incrementar el rendimiento de produccioacuten de proteiacutenas
recombinantes El anaacutelisis predictivo del vector nos permite intuir que su efecto
en las ceacutelulas E coli las emulariacutea para detectar moleacuteculas de QS producidas
por MRSA productoras de AIP clase II y ademaacutes para producir y excretar LnqQ
en funcioacuten a la concentracioacuten externa al peacuteptido autoinductor de MRSA Los
resultados predictivos abren la posibilidad de disentildear antibioacuteticos terapeacuteuticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada v
inteligentes que puedan atacar patoacutegenos de resistencia Con relacioacuten al
peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP observamos que nivel
predictivo ambos eran candidatos potenciales para la produccioacuten periplaacutesmica y
citoplaacutesmica de LnqQ en ceacutelulas de E coli respectivamente Sin embargo
nuestros resultados experimentales demostraron que la bacteriocina LnqQ no
logroacute ser producida ni purificada cuando estuvo acoplada con N-AmyE o SmbP
Estos resultados enriquecen la literatura sobre ambas etiquetas proteicas asiacute
como tambieacuten descubrimos puntos a consideracioacuten que pudieran ser
importantes en afectar la produccioacuten y purificacioacuten cuando LnqQ es acoplada
con diferentes etiquetas proteicas en ceacutelulas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vi
PRESENTACIOacuteN
CONTROL POBLACIONAL Y OSCILATORIO UTILIZANDO EL QUORUM
SENSING DE Staphylococcus aureus MEDIANTE UN CIRCUITO GENEacuteTICO
DE Escherichia coli
Presentado por
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
El presente proyecto fue mayormente realizado en las instalaciones del
Laboratorio de Biologiacutea Sinteacutetica y de Sistemas del Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con la asesoriacutea del Dr Joseacute Rubeacuten
Morones Ramiacuterez y en el menor medida en el Laboratorio de Expresioacuten y
Purificacioacuten de Proteiacutenas unidad perteneciente a la Facultad de Ciencias
Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con apoyo del Dr Xristo
Zaacuterate Kalfoacutepulos Este proyecto fue auspiciado por el Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) mediante el apoyo con el Beca Nacional de
Posgrado (nuacutemero de becario 289476)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vii
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) por el apoyo
brindado con la Beca Nacional de Posgrado con nuacutemero de becario 289476
(CVU no 516171) para la continuacioacuten de estudios
A la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) y a la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten (UANL) por el apoyo otorgado con la aprobacioacuten de becas y por el
uso directo e indirecto de sus instalaciones materiales y equipos
Al Dr Joseacute Rubeacuten Morones Ramiacuterez mi asesor a quien agradezco por la
oportunidad de colaborar en el equipo de investigacioacuten Nanobiotechnology
Research Group (NBR) Externo mi agradecimiento por las asesoriacuteas y el uso
de instalaciones equipos y materiales en el Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea (CIBYN) asiacute como el financiamiento para la
obtencioacuten de materiales de experimentacioacuten y ejecucioacuten de servicios y el
mejoramiento de mi vida profesional
Al MC Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros y al Dr Angel Leoacuten Buitimea
miembros del NBR y quienes fueron clave en la elaboracioacuten de este proyecto
asiacute como en los artiacuteculos cientiacuteficos redactados durante el proceso doctoral
Al Dr Xristo Zaacuterate Kalfoacutepulos miembro del comiteacute tutorial por su apoyo
teacutecnico y asesoriacutea por el equipo de investigacioacuten del Laboratorio de Expresioacuten y
Produccioacuten de Proteiacutenas (PEP) El agradecimiento se extiende a David Peacuterez
Bryan Santos y Jessica Goacutemez por sus importantes contribuciones
A los demaacutes miembros NBR asiacute como del comiteacute tutorial por sus comentarios
revisiones y asesoriacuteas en la elaboracioacuten de este proyecto
A mis padres Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas y a mi
hermano Angel Alejandro Beniacutetez Chao por su apoyo emocional e
incondicional en el transcurso de este proyecto
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada viii
DEDICATORIA
Para Dios iexclGracias por el don de pensar
Para mi mamaacute Lupita y mi papaacute Alejandro
Para mis hermanos Angel Alejandro y Jesuacutes Alejandro (+)
Para mis mejores amigos Esthela Maldonado Ricardo ldquoMankisrdquo Garciacutea Ricardo ldquoCiegordquo
Garciacutea Edgar ldquoBomboacutenrdquo Villareal Gerardo ldquoPepisrdquo Villarreal Mayela ldquoMonkeyrdquo Maldonado
Aniluacute Maldonado Eduardo Mendoza Alejandra Villarreal Isaac ldquoBebordquo Gonzaacutelez Cristy Llanes
Salma Alemaacuten iexclGracias por ser tan importantes para miacute
Para mis colegas del NBR muy en especial para Paco Balderas Angel Leoacuten Javier Garza
Paco ldquoNegrordquo Rodriacuteguez Dago Torres Luis Cepeda Albert Lerma Jordy Lerma Ceacutesar Garza
Alex de la Garza Isabel Caamal Gricelda Mendiola Fatemehalsadat Tabatabaeifar Hossein
Alishaharatobotni Nahid Rafiei y otros maacutes Se extiende la dedicatoria a mis colegas en PEP en
especial para David Peacuterez Jessica Goacutemez Brayan Santos Evelyn Martiacutenez
Para los que fueron mis estudiantes de verano o de servicio social con mencioacuten especial para
Montse Villegas Rauacutel Garciacutea Cinthia Castillo Sarai Fierros Jessica Ojeda y otros maacutes
Para mis colegas de generacioacuten de doctorado en especial para Paco Balderas David Peacuterez y
Gaby Quintanilla
Para el equipo administrativo del CIBYN con menciones especiales para Karla Islas y Mayra
Sandoval asiacute como de todo el equipo de intendencia muy en especial para la Sra Antonia
ldquoTontildeitardquo Sandoval y la Sra Martha Flores asiacute como para el guardia Nehemiacuteas y el chofer
Ernesto
Para el equipo administrativo de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
con mencioacuten especial para Karina Navarro y para la Sra Edmunda de intendencia
Para mis queridos perros muy en especial para Lucky Toby (+) y Pelusa (+)
Para mis ex alumnos de preparatoria del Centro Escolar Gante iexclLo logreacute
Para todos los que han trabajado como meseros y repartidores para continuar con sus estudios
yo sostener una familia iexclUstedes tienen mis maacutes sinceros respetos
Para todos los que han roto rompen y romperaacuten los liacutemites de lo conocido
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada ix
Si nos negamos categoacutericamente a reconocer que somos susceptibles de
cometer un error una equivocacioacuten profunda ndash nos acompantildearaacute siempre Pero
si somos capaces de evaluarnos con un poco de coraje por muy lamentables
que sean las reflexiones que podamos engendrarnos nuestras posibilidades
mejoran enormemente
Carl Sagan
El mundo y sus demonios La ciencia como una luz en la obscuridad (1995)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada x
TABLA DE CONTENIDO
PORTADA I
FIRMAS DE APROBACIOacuteN DE TESIS II
FIRMAS DE REVISIOacuteN DE TESIS III
CONTRAPORTADA IV
RESUMEN IV
PRESENTACIOacuteN VI
AGRADECIMIENTOS VII
DEDICATORIA VIII
TABLA DE CONTENIDO X
LISTA DE FIGURAS XIV
LISTA DE TABLAS XV
LISTA DE ABREVIATURAS XVI
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN 1
11 ERA DE LOS ANTIBIOacuteTICOS 1
12 INFECCIONES RESISTENTES A LOS ANTIBIOacuteTICOS AMENAZA MUNDIAL 2
13 PROBLEMA SANITARIO CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTES 4
14 TRATAMIENTOS ACTUALES PARA EL COMBATE A INFECCIONES RESISTENTES 5
15 TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS A LOS ANTIBIOacuteTICOS 6
CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES 8
21 CONTROL BIOLOacuteGICO POBLACIONAL POR MICROORGANISMOS 8
22 BIOLOGIacuteA SINTEacuteTICA Y SU PAPEL EN PRODUCCIOacuteN DE BACTERIOCINAS 8
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica 8
222 Definicioacuten de los biosensores 9
23 QUORUM SENSING COMUNICACIOacuteN ENTRE CEacuteLULAS 10
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus 11
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD 12
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA 12
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada 12
24 BIOSENSORES DE CEacuteLULAS ENTERAS BASADOS EN DETECCIOacuteN DE QS 13
25 LAS BACTERIOCINAS 15
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas 15
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos 17
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xi
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes 19
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos 19
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas 20
256 La bacteriocina Lacticina Q 21
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados 22
26 PRODUCCIOacuteN HETEROacuteLOGA DE BACTERIOCINAS 23
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE 24
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP 25
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS 26
31 Justificacioacuten 26
32 Hipoacutetesis 28
33 Objetivo General 28
34 Objetivos Especiacuteficos 28
35 Metas 29
36 Aportacioacuten cientiacutefica 29
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA 30
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 30
42 Cepas bacterianas 30
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina 31
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 33
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas 33
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 34
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 34
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 34
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 35
410 Prediccioacuten de alergenicidad 35
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 35
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 37
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 38
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 38
415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 39
418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 44
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en los geles 48
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CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS 50
51 Materiales y reactivos 50
52 Equipos de laboratorio 51
53 Lugares de experimentacioacuten 53
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos 53
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES 54
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 54
62 Cepas bacterianas 55
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina 55
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 57
65 Optimizacioacuten de los codones nativos 60
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 61
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 64
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 64
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 65
610 Prediccioacuten de alergenicidad 67
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 67
612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 72
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 73
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 73
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 74
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 75
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 78
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 84
619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de proteiacutenas 95
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES 105
ANEXOS 106
Divulgacioacuten de la investigacioacuten 106
Archivos de disentildeo 107
Resumen autobiograacutefico 108
REFERENCIAS 109
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiii
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 CONCEPTO DEL BIOSENSOR BASADO EN CEacuteLULAS ENTERAS 30
FIGURA 2 SISTEMA QS PARA DETECCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE S AUREUS 54
FIGURA 3 MOacuteDULOS BIOSENSOR Y DE BACTERIOCINA 55
FIGURA 4 ESTRATEGIA DE CONSTRUCCIOacuteN IN SILICO 58
FIGURA 5 REPRESENTACIOacuteN ESQUEMAacuteTICA DEL VECTOR DUAL BIOSENSOR-KILLER 59
FIGURA 6 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE N-AMYELNQQ 76
FIGURA 7 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE SMBP-LNQQ 76
FIGURA 8 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE N-AMYELNQQ 77
FIGURA 9 PREDICCIOacuteN DE HEacuteLICES TRANSMEMBRANALES PARA N-AMYELNQQ 77
FIGURA 10 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE SMBP-LNQQ 78
FIGURA 11 TRANSFORMACIOacuteN DE E COLI DH5Α Y BL21 (DE3) CON PET30A(+) PETNL Y PSMBP-LNQQ 79
FIGURA 12 GEL DE AGAROSA CON PLAacuteSMIDOS PETNL Y PSMBP-LNQQ 80
FIGURA 13 SIMULACIOacuteN DE PCR PARA VECTORES DE EXPRESIOacuteN 83
FIGURA 14 PCR DE PETNL 84
FIGURA 15 PCR DE PSMBP-LNQQ 84
FIGURA 16 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON PETNL INDUCIDO A 25degC 87
FIGURA 17 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PETNL INDUCIDO A 37degC 88
FIGURA 18 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 91
FIGURA 19 GEL DE E COLI ORIGAMI PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 92
FIGURA 20 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 37degC 93
FIGURA 21 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 25degC 94
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xv
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 USO DE CODONES PREVIO Y DESPUEacuteS DE LA OPTIMIZACIOacuteN 61
TABLA 2 PREDICCIOacuteN DE COMUNICACIOacuteN CRUZADA 63
TABLA 3 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD DE PROTEIacuteNAS 64
TABLA 4 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN SUBCELULAR DE PROTEIacuteNAS 65
TABLA 5 PREDICCIOacuteN DE EPIacuteTOPOS DE CEacuteLULAS B EN LNQQ 66
TABLA 6 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE N-AMYELNQQ 69
TABLA 7 SECUENCIAS UTILIZADAS PARA PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE N-AMYELNQQ 70
TABLA 8 PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE PEacutePTIDO SENtildeAL N-AMYE 71
TABLA 9 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE SMBP-LNQQ 73
TABLA 10 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
TABLA 11 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN CELULAR N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
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LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Significado
E coli Escherichia coli
S aureus Staphylococcus aureus
MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina
L lactis Lactococcus lactis
ESKAPE Acroacutenimo de seis especies bacterianas Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
QS Quorum Sensing (Percepcioacuten de Quoacuterum)
LnqQ Lacticina Q
agrBDCA Operoacuten agr de S aureus
agrB Gen que codifica AgrB
agrD Gen que codifica AgrD
HSL Moleacutecula homo serilactonado
AIP Moleacutecula autoinductora
agrC Gen que codifica AgrC
agrA Gen que codifica AgrA
AgrB Transportadora proteasa necesaria para la maduracioacuten de AgrD
AgrD Peacuteptido precursor a la moleacutecula autoinductora
AgrC Receptor transmembranal con actividad histidina quinasa
AgrA Proteiacutena reguladora de unioacuten al DNA de respuesta
AgrA-P AgrA fosforilado
pH Potencial de hidroacutegeno
pI Punto isoeleacutectrico
AMP Peacuteptidos antimicrobianos
kDA Kilo Dalton
MIC Concentracioacuten miacutenima inhibitoria
microM Micromolar
microgml Microgramo por mililitro
lnqRQBCDEF Cluacutester geneacutetico
AmyE Alfa-amilasa
N-AmyE Peacuteptido sentildeal de la AmyE
SmbP Proteiacutena pequentildea de unioacuten a metales
SmbP Regioacuten citoplaacutesmitica de la SmbP (peacuteptido de fusioacuten)
Ala33 Las letras indican el aminoaacutecido y los nuacutemeros la posicioacuten en la cadena
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranoacutesido
SBP Massachussets Institute of Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts
KEGG Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes
FPB FP Base
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PDB Protein Data Bank
nm Nanoacutemetros
DBK Plaacutesmido Dual Biosensor Killer
CAI Caacutelculo de Iacutendice de Adaptacioacuten
CUD Codon Usage Database
BUSCA Bologna Unified Subcellular Component Annotador
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
pET30(+)a Plaacutesmido tipo pET30(+)a sin modificaciones
pETNL Plaacutesmido que contiene N-AmyELnqQ6xHis
pSmPc-LnqQ Plaacutesmido que contiene SmbP-LnqQ
LB Medio de cultivo LB
OD600 Densidad oacuteptica
microl Microlitros
microg Microgramos
degC Grados Celsius
h Hora
ml Mililitro
g Gramo
g Fuerza centriacutefuga relativa
rpm Revoluciones por minuto
min Minuto
dNTPs Trifosfatos de desoxinucleoacutetidos
V Volts
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
pv Peso volumen
NaCl Cloruro de sodio
Tris-HCl Solucioacuten de Tris ajustada con aacutecido clorhiacutedrico (HCl)
M Molar
SDS Dodecil Sulfato Soacutedico
APS Persulfato de amonio
TEMED Tetramethylethylenediamine
X Veces de concentracioacuten de trabajo
mm Miliacutemetros
lnqQ Gen de lacticina Q
P2 Promotor 2 inducible del operoacuten agr de S aureus
gfp Gen de GFP
GFP Proteiacutena verde fluorescente
J23110 Promotor J23110 constitutivo para E coli
AIP-I AIP clase I
AIP-II AIP clase 2
AIP-III AIP clase 3
AIP-IV AIP clase 4
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xviii
Ala Alanina (A)
Arg Arginina (R)
Asn Asparagina (N)
Asp Asparato (D)
Cys Cisteiacutena (C)
Gln Glutamina (Q)
Glu Glutamato (E)
Gly Glicina (G)
His Histidina (H)
Ile Isoleucina (I)
Leu Leucina (L)
Lys Lisina (K)
Met Metionina (M)
Phe Fenilalanina (F)
Pro Prolina (P)
Ser Serina (S)
Thr Treonina (T)
Trp Triptoacutefano (W)
Tyr Tirosina (Y)
Val Valina (V)
Pnl Liasa de pectina
AmyE Amilasa E
N-AmyEPnl Liasa de pectina asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
N-AmyEAmyE Amilasa E asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
VpDef Defensina de Venerupis philippinarum
Bin1b Defensina de Rattus norvegicus
LL-37 Catelicidina de humanoschimpanceacutes
SmbP-VpDef VpDef asociado con SmbP
SmbP-Bin1b Bin1b asociado con SmbP
SmbP-LL-37 LL-37 asociado con SmbP
SUMO-LnqQ LnqQ asociado con SUMO
AI Iacutendice alifaacutetico
GRAVY Iacutendice de hidrofobicidad
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN
A lo largo de nuestra historia los humanos hemos desarrollado soluciones a los
problemas del mundo que nos rodea No es extrantildeo que el combate a las
enfermedades sean uno de los temas maacutes recurrentes Existen referencias
histoacutericas entre las diferentes civilizaciones de la antiguumledad como los chinos
(Nicola amp Abagyan 2009) aztecas (Davidson amp De Montellano 1983) y los nubia-
sudaneses (Bassett Keith Armelagos Martin amp Villanueva 1980) del uso
empiacuterico de sustancias para tratar infecciones y enfermedades Hace unos
doscientos antildeos atraacutes se pensoacute que los subproductos de la revolucioacuten industrial
seriacutean tratamiento efectivo contra infecciones y aunque los resultados fueron
alentadores al principios los resultados observados ante otro tipo de infecciones
no tuvieron el mismo eacutexito (Gaynes 2017)
11 Era de los antibioacuteticos
En 1928 Alexander Fleming encontroacute una solucioacuten efectiva para contrarrestar las
infecciones al describir al hongo Penicillium notatum que teniacutea efectos antagoacutenicos
sobre diferentes cepas estafilocoacutecicas (Fleming 1929) inaugurando asiacute la
conocida era dorada en descubrimiento de los antibioacuteticos (Podolsky 2018) Las
virtudes observadas en los antibioacuteticos fueron raacutepidamente puestas en juicio
cuando el mismo Fleming vaticinoacute en su discurso de entrega al premio Nobel que
el abuso y uso excesivo de los antibioacuteticos podriacutea generar brotes de patoacutegenos
resistentes a los antibioacuteticos (Fleming 1945) Cada vez que un nuevo antibioacutetico
era liberado a los sistemas de salud puacuteblicos pronto se reportaba un brote de
resistencia relacionado a antibioacutetico (Clatworthy Pierson amp Hung 2007) Con el
boom de nuevas clases de antibioacuteticos desde los 1940s hasta principios de 1970s
la alerta por resistencia a los antibioacuteticos quedoacute praacutecticamente inadvertida De
hecho entre los 1960s y 1970s existe evidencia que la comunidad cientiacutefica
internacional fue apaacutetica y minimizoacute el hecho de que el abuso de los antibioacuteticos
fuera una causa de resistencia a los faacutermacos en las bacterias patoacutegenas
(Podolsky 2018)
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El tema de la resistencia a los antibioacuteticos no tuvo impacto suficiente hasta que
con el paso de las deacutecadas surgieron de brotes de patoacutegenos resistentes de
importancia cliacutenica como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA
por sus siglas en ingleacutes) tanto en Reino Unido (Gardner Oxon Stamp Bowgen amp
Moore 1962) como en Estados Unidos (Barrett McGehee amp Finland 1968) y
ademaacutes las nuevas clases de antibioacuteticos empezaron a escasear desde los 1980s
hasta casi los 2000s Adicionalmente los inversionistas se motivaron a encontrar
nuevas clases antibioacuteticos al observar maacutes ganancias en descubrir compuestos
anticanceriacutegenos (Ventola 2015) los reglamentos sanitarios se volvieron maacutes
estrictos para la liberacioacuten de antibioacuteticos para prevenir la presentacioacuten de
infecciones multirresistentes emergentes (Davies 2006) Todos estos factores
incluyendo otros que tal vez no fueron mencionados allanaron el establecimiento
de poliacuteticas en salud puacuteblica para buscar o sintetizar alguacuten faacutermaco o sustancia
que contrarreste el avance de microorganismos patoacutegenos resistentes de
relevancia cliacutenica (World Health Organization 2017)
12 Infecciones resistentes a los antibioacuteticos amenaza mundial
Cifras de la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) mostraron el peligroso
ascenso de infecciones por bacterias resistentes en las uacuteltimas deacutecadas donde se
calcula un promedio de 700000 muertes anuales para el 2019 (World Health
Organization 2019b) y la advertencia de que si los gobiernos y organizaciones
responsables de la salud puacuteblica a nivel mundial no elaboran poliacuteticas efectivas
para el 2050 tendremos un promedio de 10 millones de muertes al antildeo por
consecuencias de este tipo de infecciones (Dadgostar 2019)
En Meacutexico carecemos de un sistema de recoleccioacuten de datos confiables en este
tipo de infecciones (Amabile-Cuevas 2010) pero en un estudio realizado durante
seis meses del 2019 se recuperaron 23000 cepas resistentes a faacutermacos en 47
centros de salud puacuteblicos de todo el paiacutes siendo algunas de las maacutes comunes E
coli Klebsiella sp Enterobacter sp Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter sp
Enterococcus faecium resistente a vancomicina y Staphylococccus aureus
resistente a meticilina (MRSA) (Vazquez-Rodriguez et al 2018)
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En todas las regiones del mundo las infecciones resistentes han tenido un
peligroso ascenso En Estados Unidos las muertas anuales por infecciones
resistentes pasaron de 23000 muertes en 2013 (Frieden 2013) a 35000 durante
el 2019 (CDC 2019) Por otro lado en Europa las muertes atribuibles a
infecciones resistentes aumentaron de 25000 en 2007 (European Centre for
Disease Prevention and Control 2009) a 33110 en 2015 (Cassini et al 2019) En
42 paiacuteses del continente africano se registraron 54000 casos atribuibles a
tuberculosis multirresistente (MDR multi-resistant) y en ocho paiacuteses se registraron
3200 muertes relacionadas a la variante extremadamente resistente (XDR
extreme resistant) en un periacuteodo del 2004 al 2011 (Ndihokubwayo et al 2013) En
el continente asiaacutetico en China por ejemplo el rango de bacterias aislados que
eran resistentes a los antibioacuteticos pasoacute de 22774 casos a 190610 de 2005 a
2017 respectivamente (Qu Huang amp Lv 2019) en la India un estudio reporta
que el 70 de aislados cliacutenicos tipo Gram negativos son resistentes a los
faacutermacos y entre ellos se podiacutean encontrar cepas de Escherichia coli Klebsiella
pneumoniae Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa (Taneja amp
Sharma 2019)
Las infecciones resistentes son material incluso de intereacutes para el sector
econoacutemico El Banco Mundial ha elaborado dos escenarios para predecir el
impacto econoacutemico de las infecciones resistentes para el 2050 en un escenario
de bajo impacto el Producto Interno Bruto (PIB) mundial podriacutea disminuir hasta un
11 Sin embargo en un escenario de alto impacto el dantildeo al PIB global podriacutea
representar hasta una disminucioacuten de 38 Los costos al sistema de salud
puacuteblico en el mundo podriacutean oscilar entre los $300 mil millones a $1 cuatrilloacuten
presentando incluso un serio riesgo para el sector ganadero ya que en el
escenario de bajo impacto esto representariacutea una disminucioacuten de 26 esperado
a un 75 en un escenario de alto impacto (The World Bank 2016)
Las infecciones resistentes representa un punto de intereacutes incluso para la
Organizacioacuten de la Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
Food and Agriculture Organization) ya que actualmente se presume que en 42
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paiacuteses donde existen datos confiables de consumo de antibioacuteticos en el sector
ganadero y de agricultura se estima que en el 2010 el consumo era de 63000
toneladas de antibioacuteticoantildeo mientras que para el 2030 se estima un consumo
105600 toneladas de antibioacuteticoantildeo representando un incremento de 67 Los
iacutendices de metabolizacioacuten de antibioacuteticos tanto en ganado como en produccioacuten
pesquera presentan una baja metabolizacioacuten ya que entre un 70-80 y un 75-
90 respectivamente son excretados a las fuentes acuiacuteferas La produccioacuten de
cultivos consume entre un 02 a 04 del total de antibioacuteticos en relacioacuten con la
produccioacuten ganadera (FAO sf)
La relevancia sanitaria mundial de S aureus es porque se trata de un miembro del
grupo ESKAPE un grupo de patoacutegenos localizados en infraestructuras
hospitalarias asilos o en equipos e instrumentos meacutedicos como ventiladores y
cateacuteteres y que son habitualmente resistentes a los antibioacuteticos (Rice 2008) Esta
bacteria es la primera causa nosocomial tanto en Latinoameacuterica (26)
Norteameacuterica (260) y la segunda causa nosocomial de Europa (195)
(Biedenbach Moet amp Jones 2004) Se presume que un 30 de la poblacioacuten total
de humanos estaacute colonizado con al menos una subespecie de S aureus
(Wertheim et al 2005) y esto podriacutea ser porque el haacutebitat de esta bacteria en los
humanos es la parte anterior de las fosas nasales (Mulcahy amp McLoughlin 2016)
13 Problema sanitario con Staphylococcus aureus resistentes
S aureus es una bacteria Gram positiva y es considerada una de las principales
causas de enfermedades en piel (Foster 1996) Ademaacutes es capaz de desarrollar
biopeliacuteculas en dispositivos implantados en seres humanos y cateacuteteres causando
infecciones croacutenicas y persistentes (Dunne 2002) La osteomielitis y periodontitis
tambieacuten son producto de la biopeliacutecula este patoacutegeno estaacute involucrado en heridas
croacutenicas en pacientes diabeacuteticos con uacutelceras y estaacute relacionado a infecciones al
endocardio oculares y en casos de rinosinusitis croacutenica (Archer et al 2011) Se
considera que es un patoacutegeno de alto riesgo para pacientes con Fibrosis Quiacutestica
ya que es el maacutes reportado entre personas con 11 a 15 antildeos con esta condicioacuten
(Razvi et al 2009)
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Ahora bien se estima que entre un 13 al 74 del total de infecciones resistentes
en el mundo son causados por una variante resistente de S aureus resistente a la
meticilina la cepa MRSA (Koumlck et al 2010) la cual estaacute es sentildealada desde el
2017 por la OMS como un patoacutegeno de alta prioridad al que debe encontrarse una
solucioacuten pronta y efectiva (World Health Organization 2017) Por ejemplo en
Estados Unidos el total de pacientes por infecciones nosocomiales tipo MRSA
ascendioacute de 24 en 1975 a un 29 en 1991 (Panlilio et al 1992) y hasta casi
57 para el antildeo 2000 (NNIS 2004) En la actualidad el MRSA es considerado
endeacutemico en ese paiacutes ya que se estima que el 2 de la poblacioacuten es acarreador
de este estafilococo (Kavanagh 2019)
En Meacutexico los primeros casos de MRSA asociado a comunidad (CA-MRSA) cepa
USA300 fueron reportados a inicios del 2008 (Mariacutea E Velazquez-Meza et al
2011) y durante el 2010 un estudio anuncioacute que la cepa de MRSA maacutes
frecuentemente aislada en nuestro paiacutes era la New YorkJapan (Rodriacuteguez-
Noriega et al 2010) Tambieacuten se conoce que cepas de MRSA en hospitales
puacuteblicos en nuestro paiacutes fluctuoacute entre un 7 al 30 en pacientes entre las
deacutecadas de 1980s a 2000s (M E Velazquez-Meza et al 2004) mientras que el
Instituto Nacional de Cancerologiacutea determinoacute que 17 de las cepas aisladas de
3000 hemocultivos recuperados entre el 2005 al 2015 de pacientes con caacutencer
correspondiacutean a MRSA (Velaacutezquez-Acosta Cornejo-Juaacuterez amp Volkow-Fernaacutendez
2018)
14 Tratamientos actuales para el combate a infecciones
resistentes
En la actualidad las clases maacutes comunes de antibioacuteticos para combatir
infecciones resistentes a los antibioacuteticos son las penicilinas cefalosporinas
quinolonas macroacutelidos tetraciclinas glucopeacuteptidos y monobactaacutemicos (Taylor
Stapleton amp Paul Luzio 2002) En las uacuteltimas dos deacutecadas se han aprobado una
gran variedad de antibioacuteticos para el tratamiento de infecciones causados por
bacterias tanto Gram positivos como Gram negativos Los antibioacuteticos maacutes
recientemente reportados para el tratamiento de bacterias multirresistentes Gram
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positivas incluyen β-lactaacutemicos (ceftarolina y ceftobiprol) glicopeacuteptidos
(dalbavancin oritavancin y telavancin) oxazolidinonas (tedizolid fosfato)
quinolonas (besifloxacina delafloxacin y ozenoxacina) y tetraciclinas
(omadaciclina) (Koulenti et al 2019) Seguacuten la OMS hasta el 2019 se sabe de 50
agentes antimicrobianos que se encuentran en desarrollo cliacutenico donde 32 son
antibioacuteticos activos contra patoacutegenos de prioridad de la OMS diez son agentes
bioloacutegicos 2 son clasificados como agentes novedosos y dos pertenecen al grupo
de bacterias Gram negativas multirresistentes (World Health Organization 2019a)
15 Tratamientos alternativos a los antibioacuteticos
Los patoacutegenos resisten a los antibioacuteticos bajo tres grandes mecanismos de
resistencia intriacutenseca adaptativa yo adquirida (Arzanlou Chai amp Venter 2017
Blair Webber Baylay Ogbolu amp Piddock 2015 Sandoval-Motta amp Aldana 2016)
Es por ello que urge desarrollar una solucioacuten pronta y efectiva para contrarrestar
las infecciones causadas por patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos los cuales
son uno de los puntos que la OMS ha declarado como prioritarios (OrsquoNeill 2016)
En la guerra contra la resistencia a los antibioacuteticos nuestro grupo de investigacioacuten
ha participado en la creacioacuten de compuestos que puedan combatirlos como
tratamientos mixtos de antibioacuteticos (Montelongo-Peralta Leoacuten-Buitimea Palma-
Nicolaacutes Gonzalez-Christen amp Morones-Ramiacuterez 2019) nanopartiacuteculas de plata
asociados con metales de transicioacuten (Javier A Garza-Cervantes et al 2017)
nanomateriales asociados con nanopartiacuteculas de plata sintetizados con poliacutemeros
sensibles al ambiente (Ruben Morones amp Frey 2007) o producidos de manera
sustentable (Escaacutercega-Gonzaacutelez et al 2018) o a partir de un exopolisacaacuterido
producido por una levadura que actuacutea como agente reductor y que estaacuten
capeados por agentes con actividad antimicrobiana y antibiopeliacutecula (Javier
Alberto Garza-Cervantes et al 2019)
Otros grupos de investigacioacuten tambieacuten han desarrollado otro tipo de armas contra
la resistencia a los antibioacuteticos como el uso de teacutecnicas de decorado en
bacterioacutefagos (phage display) para producir vacunas en la caacutepside de
bacterioacutefagos inhabilitados (Bao et al 2019) o uso de agentes de control bioloacutegico
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contra patoacutegenos de alimentos (Gutieacuterrez Fernaacutendez Rodriacuteguez amp Garciacutea 2019)
o para el tratamiento de aguas residuales (Jassim Limoges amp El-Cheikh 2016)
Los esfuerzos actuales se han focalizado en encontrar yo desarrollar nuevas
clases de antibioacuteticos y agentes antimicrobianos contra bacterias resistentes (Fair
amp Tor 2014) y de prioridad ante la OMS (World Health Organization 2017) Las
corrientes alternativas a los antibioacuteticos maacutes reconocidas en la actualidad estaacuten
clasificadas en dos grandes enfoques el enfoque de prevencioacuten a las
enfermedades donde se desarrollan y se utilizan vacunas probioacuteticos o
prebioacuteticos mientras que en el enfoque por tratamiento a las enfermedades se
utilizan la terapia de fagos la aplicacioacuten directa de endolisinas yo exolisinas el
uso de microorganismos depredadores vivos o el uso directo de bacteriocinas
(Allen Trachsel Looft amp Casey 2014) Tambieacuten la Biologiacutea Sinteacutetica se ha
involucrado en resolver la problemaacutetica de infecciones resistentes a los faacutermacos
al participar en el disentildeo de biosensores basados en ceacutelulas completas que sean
capaces de destruir patoacutegenos mediante la previa de deteccioacuten de moleacuteculas
excretadas por microrganismos de intereacutes (Beniacutetez‐Chao Balderas‐Cisneros
Leoacuten‐Buitimea amp Morones‐Ramiacuterez 2021)
La biosiacutentesis purificacioacuten y aplicacioacuten de bacteriocinas contra patoacutegenos Gram
negativos y Gram positivos ha sido punto central para diversos grupos de
investigacioacuten (Cabral Penumutchu Norris Morones-Ramirez amp Belenky 2018
McAuliffe et al 1998 Rea Ross Cotter amp Hill 2011 Sandiford amp Upton 2012
Wong et al 2015) asiacute como la siacutentesis de nanocompuestos como liposomas
quitosano y nanopartiacuteculas hechos a base de compuestos de plantas (Sidhu amp
Nehra 2017) o de nanofibras (Fahim Khairalla amp El-Gendy 2016) que esteacuten
acomplejados con bacteriocinas Maacutes adelante se describiraacuten detalles sobre las
bacteriocinas y su relacioacuten en el combate a las infecciones resistentes a los
antibioacuteticos
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CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES
21 Control bioloacutegico poblacional por microorganismos
En la Naturaleza todos los seres vivos estaacuten interactuando y compitiendo por
nichos ecoloacutegicos para sobrevivir crecer y reproducirse para una adaptacioacuten
efectiva en el ambiente donde se desarrollan Este fenoacutemeno es universal ya que
pueden encontrarse en estilos de vida unicelulares y multicelulares (Grice et al
2009) Para competir por los nutrientes los microorganismos contienen
compuestos que matan o limitan el crecimiento de otra poblacioacuten Estos
compuestos pueden ser antibioacuteticos peacuteptidos antimicrobianos moleacuteculas de bajo
peso molecular entre otros maacutes (Gonzalez et al 2011 2010)
Cuando microorganismos vivos por sus caracteriacutesticas bioloacutegicas son usados para
suprimir la densidad poblacional de un tipo especiacutefico de organismo hacieacutendolo
menos abundante o dantildeino se le conoce como control bioloacutegico Es importante
mencionar que esta definicioacuten solo incluye a especiacutemenes vivos como
depredadores paraacutesitos nemaacutetodos hongos bacterias protozoarios inclusive
virus Sin embargo genes sin un recipiente bioloacutegico o metabolitos producidos por
un organismo de control sin que eacuteste se encuentre presente durante el control
poblacional son excluidos de esta definicioacuten (Eilenberg Hajek amp Lomer 2001)
Por ejemplo cultivos de Candida albicans (Peters et al 2010) Pseudomonas
aeruginosa (Filkins et al 2015) Bacillus subtilis (Gonzalez et al 2011)
Enterococcus faecium (Viccedilosa et al 2018) Acanthamoeba polyphaga (de Souza
Soares Benitez amp Rott 2017) disminuyeron la expresioacuten de patogenicidad en S
aureus Incluso cultivos de E coli han mostrado actividad fungicida contra cultivos
de C albicans (Cabral et al 2018)
22 Biologiacutea Sinteacutetica y su papel en produccioacuten de bacteriocinas
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica
La Biologiacutea Sinteacutetica consiste en disentildear libreriacuteas de elementos geneacuteticos como
promotores secuencias codificadoras terminadores factores de transcripcioacuten
entre otras maacutes asiacute tambieacuten se enfoca en el ensamblaje de circuitos geneacuteticos
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hasta en el disentildeo y creacioacuten de organismos completos Este campo utiliza datos
cuantitativos para crear modelos bioloacutegicos y matemaacuteticos que permitan predecir
el comportamiento de un sistema bioloacutegico (Cameron Bashor amp Collins 2014
Garciacutea-Granados Lerma-Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2019)
En la publicacioacuten de Brophy y Voigt se revisan los principios baacutesicos para el
disentildeo de circuitos geneacuteticos para que los sistemas bioloacutegicos sean emulados
para cumplir con tareas o puedan fabricar materiales es importante considerar la
correcta eleccioacuten de reguladores asiacute como puntos de control que cuantifiquen el
impacto en el rendimiento (Brophy amp Voigt 2014)
222 Definicioacuten de los biosensores
Un sensor quiacutemico es un dispositivo que transforma en una informacioacuten quiacutemica
en una sentildeal analiacutetica de utilidad y puede detectar desde la concentracioacuten de una
muestra especiacutefica hasta el anaacutelisis total de sus compuestos Este tipo de
sensores contiene dos unidades funcionales baacutesicas un receptor y un transductor
El receptor transforma la informacioacuten quiacutemica de la muestra en una forma de
energiacutea que puede ser medido por un transductor El transductor transforma la
energiacutea en una sentildeal analiacutetica uacutetil (Hulanicki Glab amp Ingman 1991) De esta
manera comprendemos que un biosensor es ldquoun dispositivo que a traveacutes de
reacciones especiacuteficas de enzimas aisladas sistemas inmunes tejidos organelos
o ceacutelulas enteras sirve para detectar compuestosrdquo (IUPAC 1992)
Asiacute en los biosensores basados en ceacutelulas completas un analito de intereacutes
ingresa al interior celular y es reconocido por un factor transcripcional el cual
controla la transcripcioacuten de un gen mediante el reconocimiento de un promotor
especiacutefico Estos biosensores pueden reconocer diferentes analitos como
hidrocarburos metales pesados antibioacuteticos (Garnier-Rocha 2019) Incluso
algunos modelos biosensores se han aprovechado del fenoacutemeno de quorum
sensing para crear sistemas de comunicacioacuten sinteacuteticos con la capacidad de
controlar poblaciones (Balagaddeacute et al 2008)
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23 Quorum Sensing Comunicacioacuten entre ceacutelulas
El concepto QS refiere a que es un mecanismo de comunicacioacuten entre
microorganismos que dependen de sentildeales quiacutemicas (moleacuteculas sentildealizadoras)
que son excretadas al medio extracelular y que dependen la densidad celular
(Fuqua Winans amp Greenberg 1994) Las bacterias similares a organismos de
diferentes dominios se sostienen de mecanismos de comunicacioacuten y se valen de
diferentes moleacuteculas Esta interaccioacuten puede ser intriacutenseca (es decir intracelular o
adentro de la misma ceacutelula) o extriacutenseca (es decir extracelular o afuera de la
ceacutelula) y crea un fenotipo de respuesta en una poblacioacuten especiacutefica del mismo
(Fuqua et al 1994)
Mientras los cultivos productores de QS esteacuten creciendo eacutestos pueden producir
excretar acumular y detectar moleacuteculas de sentildealizacioacuten quiacutemicas externas
conocidas como autoinductores los cuales son producidos a niveles basales pero
que se acumulan en el exterior celular Cuando la densidad celular de bacterias y
la concentracioacuten de moleacuteculas autoinductoras alcanzan un umbral de
concentracioacuten especiacutefico el cultivo experimenta un cambio en su fenotipo (Garg
Manchanda amp Kumar 2014 Rutherford amp Bassler 2012) Esta respuesta variacutea
seguacuten el tipo de sentildeal emitido ya que su forma y composicioacuten quiacutemica es diferente
seguacuten la especie que la produzca (Fuqua et al 1994) siendo las respuestas maacutes
comunes la formulacioacuten de esporulados factores de virulencia asociados a
invasioacuten bioluminiscencia virulencia yo la creacioacuten biopeliacuteculas (Miller amp Bassler
2002)
El fenoacutemeno de QS sucede tanto en bacterias productoras Gram negativas y las
Gram positivas pero las moleacuteculas auto inductoras son de diferente composicioacuten
quiacutemica En las bacterias Gram negativas las moleacuteculas de sentildealizacioacuten son
conocidas como homoserina lactonada aciladas (HSL) mientras que en bacterias
Gram positivas el mecanismo es a traveacutes de peacuteptidos excretados (Miller amp
Bassler 2002)
En el modelo general de QS en Gram positivos en primera instancia el gen que
contiene el precursor de la moleacutecula sentildealizadora (tambieacuten conocido como
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autoinductor inmaduro) es transcrito y traducido y eacutesta es posteriormente
parcialmente hidrolizada para crear un autoinductor maduro Eacuteste uacuteltimo es
enviado al exterior celular por un transportador tipo ABC Cuando la concentracioacuten
del autoinductor maduro alcanza un umbral miacutenimo de activacioacuten una proteiacutena
tipo quinasa sensor de histidina localizada en el exterior celular detecta la
presencia de eacutesta mediante un sistema a dos componentes El sensor quinasa se
auto fosforila en un residuo conservado de histidina (H) Despueacutes este grupo
fosforilo es transferido a una proteiacutena reguladora de respuesta adyacente la cual
es fosforilada en un residuo conservado de aspartato (D) La proteiacutena reguladora
de respuesta fosforilado activa la transcripcioacuten de los genes de intereacutes (Miller amp
Bassler 2002)
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus
En S aureus estaacute gobernado por el operoacuten agr que es de un tamantildeo nucleotiacutedico
de 35 kb y se compone de dos unidades transcriptoacutemicas divergentes conocidos
como RNAII y RNAIII los cuales estaacuten gobernados por los promotores P2 y P3
respectivamente (Le amp Otto 2015) El promotor P2 estaacute involucrado en actividades
del QS mientras que el promotor P3 se encarga de la expresioacuten de factores de
virulencia (Miller amp Bassler 2002) como produccioacuten de hemolisinas proteasas
lipasas e indirectamente participan en la liberacioacuten de biopeliacuteculas (Quave amp
Horswill 2014) A nivel geneacutetico la induccioacuten del operoacuten agr depende
parcialmente por la unioacuten de los productos geacutenicos del operoacuten sar en los dos
promotores disponibles del operoacuten agr (Manna Bayer amp Cheung 1998)
El promotor P2 es el de importancia para el sistema QS debido a que el transcrito
resultante agrBDCA produce cuatro proteiacutenas AgrB AgrD AgrC y AgrA los
cuales son los componentes principales del sistema de QS de S aureus A
manera de resumen podemos en global que AgrC y AgrA participan como
elementos biosensores mientras que AgrB y AgrD son los elementos necesarios
para la biosiacutentesis de AIP El AgrD es un peacuteptido precursor a la moleacutecula
autoinductora (AIP por sus siglas en ingleacutes) y el AgrB funciona transportadora
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como proteasa y estaacute involucrada en la maduracioacuten del AIP (Gomes-Fernandes
et al 2017 Horswill Stoodley Stewart amp Parsek 2007)
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD
El gen que produce AgrD se expresa y se traduce en una versioacuten propeacuteptido de la
moleacutecula AIP que sufre de una modificacioacuten postraduccionalmente para que sea
bioloacutegicamente activo La moleacutecula AIP inmadura se compone de tres secciones
conocidas como regioacuten del peacuteptido liacuteder regioacuten madura del AIP y secuencia de
reconocimiento que corresponden a las regiones N- central y C-terminales
respectivamente (B Wang amp Muir 2016)
El AgrD es inicialmente procesado en la regioacuten N-terminal (se compone de 32
residuos) y sirve de guiacutea Eacuteste es translocado a la cara externa de la membrana
celular Mientras la regioacuten peptidasa de la proteiacutena transmembranal AgrB
reconoce la regioacuten N-terminal del AIP inmaduro
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA
AgrC y AgrA funcionan en conjunto con un sistema claacutesico de dos componentes
Donde la proteiacutena transmembranal tipo receptor con actividad histidina quinasa
AgrC se encarga de que detectar las moleacuteculas AIP liberadas al exterior por S
aureus una vez acoplado el AIP con el receptor eacuteste uacuteltimo causa una
autofosforilacioacuten del dominio citoplasmaacutetico del AgrC seguido de la transferencia
del grupo fosfato de la proteiacutena reguladora de respuesta de unioacuten al DNA AgrA
Una vez que AgrA es fosforilado (AgrA-P) eacuteste se une a la regioacuten intergeacutenica de
los promotores P2 y P3 del operoacuten agr (Gomes-Fernandes et al 2017)
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada
Bioquiacutemicamente el AgrD inmaduro tiene un tamantildeo entre 46 a 47 residuos seguacuten
su clase Despueacutes de procesamiento AgrD maduro tiene un tamantildeo final entre 7 a
8 aminoaacutecidos (que variacutea seguacuten la clase) y contiene un anillo tiolactonado
producto de la condensacioacuten entre un grupo tiol de una cisteiacutena interna ubicada
cuatro aminoaacutecidos antes del uacuteltimo aminoaacutecido y el grupo carboxilo del uacuteltimo
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aminoaacutecido (que puede ser metionina o fenilalanina dependiendo la clase) (B
Wang Zhao Novick amp Muir 2015)
En AgrC el dominio que contiene los elementos para deteccioacuten del receptor de la
moleacutecula AIP produce diferentes formas de propeacuteptidos De esta manera se
deduce que cada moleacutecula de AIP producida depende de su propia proteiacutena
detectora AgrC Por tanto la presencia en el medio de moleacuteculas de AIP que no
estaacuten filogeneacuteticamente relacionadas resultan en la inhibicioacuten de QS Es decir
miembros productores del mismo tipo de AIP pueden inducir el comportamiento
tiacutepico por QS pero si los productores no pertenecen al mismo grupo se puede
inhibir su respuesta Este fenoacutemeno es conocido como comunicacioacuten cruzada
(Rutherford amp Bassler 2012) La regioacuten hipervariable del operoacuten agr estaacute ubicado
en el transcrito gobernado por el promotor P2 entre los genes agrC agrD y agrB
Consensualmente se ha determinado cuatro grandes clases de AIP y permite
clasificar a los tipos de S aureus en base a esta regioacuten (Shopsin et al 2003)
24 Biosensores de ceacutelulas enteras basados en deteccioacuten de QS
A continuacioacuten presentamos una compilacioacuten de publicaciones de diferentes
ceacutelulas que fueron modificadas para actuar como biosensores capaces de detectar
moleacuteculas producidas por organismos productores de sentildeales quiacutemicas tipo QS
algunos de los ejemplos mencionados cuentan con la capacidad de producir yo
liberar sustancias antimicrobianas capaces de destruir al productor de esas
sentildeales
Balagaddeacute y otros disentildearon un sistema de comunicacioacuten sinteacutetico conocido como
depredador y presa en la que dos ceacutelulas modificadas de E coli son capaces de
comunicarse -y matar a una de ellas- a traveacutes del sistema de QS En este modelo
las ceacutelulas asignadas como depredadoras producen y liberar moleacuteculas tipo QS
que se difunden en el medio y al llegar a la ceacutelula presa por sus mecanismos
internos activan la produccioacuten una toxina especiacutefica para la ceacutelula asignada como
presa provocaacutendoles la muerte celular Por otro lado las ceacutelulas presas para
evitar su muerte temprana deben producir constantemente una proteiacutena antitoxina
que anule la actividad de la toxina (Balagaddeacute et al 2008)
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Saeidi y sus colaboradores crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basados en la
deteccioacuten del QS al modificar ceacutelulas de E coli para que detectaran moleacuteculas
3OC12 HSL producidas por P aeruginosa En este sistema las moleacuteculas QS son
difundidas a traveacutes del medio y son reconocidas por un factor de transcripcioacuten en
E coli que activa una unidad transcripcional para producir piocianina un
antibioacutetico especiacutefico con actividad contra P aeruginosa y porina E7 un agente
liacutetico especiacutefico contra E coli a medida que aumenta la concentracioacuten de la
moleacutecula QS incrementa la concentracioacuten del antibioacutetico y de la porina Cuando
se acumula suficiente cantidad de porinas en el interior celular las ceacutelulas de E
coli son lisadas y se libera piocianina para finalmente atacar a las ceacutelulas de P
aeruginosa (Saeidi et al 2011) Dos antildeos maacutes tarde Gupta y sus colaboradores
modificaron este biosensor agregando un moacutedulo de excrecioacuten que libera una
sustancia antimicrobiana al exterior a traveacutes de un peacuteptido sentildeal y atacar
especiacuteficamente a P aeruginosa evitando la muerte de la ceacutelula productora de
antibioacutetico (S Gupta Bram amp Weiss 2013)
Marchand y sus colegas crearon un sistema de comunicacioacuten interespeciacutefico para
la interaccioacuten entre dos bacterias con oriacutegenes evolutivos diferentes Bacillus
megaterium (Gram positiva) y E coli (Gram negativa) utilizando el mecanismo del
operoacuten agr de S aureus En este reporte ceacutelulas de E coli fungieron como
productoras de moleacuteculas de QS al expresar las proteiacutenas AgrD y AgrB que en
condiciones nativas producen moleacuteculas de AIP en S aureus Mientras que
ceacutelulas de B megaterium fungieron como biosensores al producir las proteiacutenas
AgrC y AgrA que en condiciones nativas sirven como un sistema a dos
componentes que detectan la presencia externa de la moleacutecula de AIP y activan a
un factor de transcripcioacuten (Marchand amp Collins 2013)
Zeng y sus colaboradores crearon un modelo biomatemaacutetico a partir de una E coli
que funcionara como un biosensor de moleacuteculas de AIP producidas por S aureus
que seriacutea contrarrestado por accioacuten de la lisostafina una bacteriocina de actividad
contra S aureus La simulacioacuten del modelo indicoacute que una ceacutelula de E coli podriacutea
tardar hasta 25 horas en detectar las primeras moleacuteculas de AIP producidas de S
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 15
aureus al tiempo que generariacutea la suficiente concentracioacuten de bacteriocinas para
matar a ceacutelulas de S aureus (Zeng et al 2013)
Borrero y sus colegas crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basado en la
deteccioacuten de moleacuteculas de QS para poder contrarrestar moleacuteculas de QS
producidos por un patoacutegeno de intereacutes cliacutenico resistente a los antibioacuteticos En este
caso ceacutelulas modificadas de Lactobacillus lactis fueron capaces de detectar las
moleacuteculas producidas por Enterococcus faecalis El lactobacilo modificado mostroacute
alta efectividad de tres bacteriocinas producidas para controlar el crecimiento de
este patoacutegeno incluyendo sus variedades multirresistentes (Borrero Chen Dunny
amp Kaznessis 2015)
Holowko y sus colegas desarrollaron ceacutelulas de E coli capaces de sentir
moleacuteculas de QS producidas por Vibrio cholerae (Holowko Wang Jayaraman amp
Poh 2016) Mientras que Lubkowicz y sus colaboradores modificaron ceacutelulas de
Lactobacillus reuteri con la capacidad para detectar moleacuteculas de AIP clase I
producidas por S aureus en rangos de concentracioacuten desde la escala nanomolar
hasta micromolar (Lubkowicz et al 2018)
25 Las Bacteriocinas
En contexto a la anterior seccioacuten una fraccioacuten del total de biosensores de ceacutelulas
enteras disentildeados son capaces de producir y excretar sustancias antimicrobianas
que afecten el crecimiento de ceacutelulas productoras de moleacuteculas QS Para fines de
este trabajo nos referimos a las bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
que pertenece a un grupo de peacuteptidos con actividad antimicrobiana con origen
evolutivo en bacterias los cuales seraacuten descritos a continuacioacuten
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas
Las bacteriocinas son un grupo de peacuteptidos de bajo peso molecular que son
producidos exclusivamente y excretados por bacterias y que tienen la capacidad
de inhibir el crecimiento de otra bacteria Las bacteriocinas pueden ser producidas
in situ por bacterias probioacuteticas Al ser de origen proteico las bacteriocinas son
sujetos a modificaciones por Ingenieriacutea Geneacutetica (Cotter Ross amp Hill 2013) Las
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bacteriocinas usualmente actuacutean por permeabilizacioacuten por membrana causada por
su naturaleza catioacutenica al interactuar con la membrana Usualmente las
bacteriocinas son de caraacutecter hidrofoacutebico y anfipaacutetico Su estructura quiacutemica son
generalmente peacuteptidos acoplados con glicoproteiacutenas y lipoproteiacutenas Su punto
isoeleacutectrico estaacute habituado a 81 a 101 usualmente son termoestables y tiene un
rango de pH amplio entre 30 a 90 (Heredia-Castro Heacuternaacutendez-Mendoza
Gonzaacutelez-Coacuterdova amp Vallejo-Cordoba 2017) En la Naturaleza cuando las
bacterias comparten el mismo nicho ecoloacutegicos eacutestas deben luchar y defenderse
de otros y las bacteriocinas son uno de los mecanismos bioloacutegicos reconocidos
(Duffy Schouten amp Raaijmakers 2003)
La disponibilidad de datos en bacteriocinas en la Naturaleza es muy amplio ya que
se presume que un 99 del total de bacterias son productoras de al menos un tipo
de bacteriocina y muchos de ellos permanecen auacuten sin ser descubiertos
(Klaenhammer 1988) Hasta la fecha de acuerdo con datos de bases de datos
sobre bacteriocinas de calidad mundial (actualizado hasta la uacuteltima versioacuten 25 de
junio de 2021) indican que el University of Nebraska Medical Centerrsquos
Antimicrobial Peptide Database (ADP por sus siglas en ingleacutes)
(httpswangapd3commainphp) se mantienen registrados un total de 3257
peacuteptidos antimicrobianos de los seis reinos bioloacutegicos existentes de los cuales
181 son peacuteptidos con actividad anti-MRSA (G Wang Li amp Wang 2016) Aunque
Bactibase (httpbactibasehammamilaborgmainphp) es una base de datos de
bacteriocinas que no se ha actualizado desde 2017 sus datos siguen siendo muy
valiosos ya que nos ofrece una realidad en la ciencia de las bacteriocinas puesto
que la mayoriacutea de las bacteriocinas descubiertas han sido aisladas de bacterias
Gram positivas donde 206 pertenecen a este grupo y 19 a las cepas Gram
negativas El geacutenero maacutes reportado para las bacteriocinas de origen en Gram
positivas son los Lactobacillus seguido de Enterococcus Streptococcus
Lactococcus y el geacutenero Bacillus mientras que el geacutenero maacutes reportado para las
bacteriocinas de origen en Gram negativas es Escherichia El tamantildeo promedio de
las bacteriocinas es de 43 residuos (Hammami Zouhir Le Lay Ben Hamida amp
Fliss 2010)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 17
Un buen nuacutemero de bacteriocinas han sido previamente reportadas como agentes
terapeacuteuticos puesto que se han utilizado en dosis hasta cien veces superiores al
valor de concentracioacuten miacutenima inhibitoria reportado sin presentar efectos
citotoacutexicos en liacuteneas celulares eucarioacuteticas (Hols Ledesma-Garciacutea Gabant amp
Mignolet 2019) ni en tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Por
ejemplo la nisina la bacteriocina maacutes famosa en la industria y en el mundo ha
sido declarado por la Administracioacuten de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA por sus siglas en ingleacutes) como sustancia Generalmente Reconocida
como Segura (GRAS por sus siglas en ingleacutes) para su uso como conservador de
alimentos (Cotter Hill amp Ross 2005) Se sabe que la mayoriacutea de las bacteriocinas
han tenido un largo historial de seguridad (Silva Silva amp Ribeiro 2018) Sin
embargo a pesar de la gran disponibilidad de datos de ensayos en bacteriocinas
recientemente se ha manifestado la urgencia de incrementar y explorar su uso en
modelos in vivo para evaluar su eficacia como agentes antimicrobianos y evaluar
los posibles efectos secundarios los cuales son necesarios para asegurar su eacutexito
como candidatos potenciales a agentes terapeacuteuticos en su lucha contra
infecciones resistentes a los antibioacuteticos (Beniacutetez-Chao Leoacuten-Buitimea Lerma-
Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2021)
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos
Los peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos son sustancias de origen
bioloacutegico que cumplen con el mismo papel de defensa lo cierto es que existen
claras diferencias entre ellas que dependen de su origen composicioacuten quiacutemica
entre maacutes factores A continuacioacuten se ofrece una breve explicacioacuten entre los
diferentes tipos de sustancias antimicrobianas
Los Peacuteptidos Antimicrobianos (AMP antimicrobial peptides) tambieacuten conocidos
como peacuteptidos de autodefensa (HDP host defense peptide) son peacuteptidos
producidos por un hospedero y son parte del sistema inmune al conferirles
capacidades defensivas Son de un rango de tamantildeo entre 10 a 60 residuos en
promedio 3326 residuos que estaacuten compuestas mayoritariamente por α-heacutelices
con cargas positivas (catioacutenicas) o anfipaacuteticas (cargas hidrofoacutebicas e hidrofiacutelicas)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 18
tambieacuten existen referentes con carga anioacutenica Los AMP estaacuten clasificados seguacuten
su origen ya que estaacuten ubicuamente presentes en todos los reinos bioloacutegicos
como mamiacuteferos plantas microorganismos acuaacuteticos insectos yo anfibios
seguacuten su actividad ya que pueden ser antibacterianos antifuacutengicos
antiinflamatorios antivirales antiparasitarios yo anticanceriacutegenos seguacuten su
estructura como tipo lineal con estructurales secundarias con α-heacutelices y β-tiras
plegadas y por seguacuten por el tipo dominante de aminoaacutecidos como glicina arginina
prolina histidina y triptoacutefano (Huan Kong Mou amp Yi 2020 Lei et al 2019)
Si el AMP es de origen evolutivo bacteriano se les conoce como bacteriocinas Los
oriacutegenes pueden ser por bacterias Gram positivas como negativas incluyendo
miembros del dominio de las Archaea (Chikindas Weeks Drider Chistyakov amp
Dicks 2018) Sin embargo cuando el AMP es de origen eucarioacutetico existen tres
clasificaciones defensinas (Shafee Lay Hulett amp Anderson 2016) histatinas o
catelicidinas (De Smet amp Contreras 2005) Existen intermediarios evolutivos como
las bacteriocinas tipo defensina que son un grupo de bacteriocinas que comparte
los puentes de disulfuro en las mismas posiciones que podriacutean observarse en las
defensinas (Baindara et al 2016 Sugrue OrsquoConnor Hill Stanton amp Paul Ross
2020)
Tanto las bacteriocinas como los antibioacuteticos comparten funcionalidad bioloacutegica al
ser ambas sustancias que nulifican o matan a otras poblaciones pero existen
diferencias muy marcadas entre ellas puesto que las bacteriocinas son
sintetizadas como metabolitos primarios mientras que los antibioacuteticos son
secundarios El espectro de accioacuten de las bacteriocinas es mucho maacutes reducido
que los antibioacuteticos eacutestos uacuteltimos son muy amplios El grado de actividad es
mucho maacutes intenso entre bacteriocinas ya que su rango de accioacuten se encuentra
en el orden de los nano a micro molar mientras que los antibioacuteticos son rango de
accioacuten estaacute ranqueado entre los micro y milimolar Debido a su origen proteico las
bacteriocinas son altamente propensas a ser degradados por enzimas Sin
embargo las bacteriocinas son maacutes termodinaacutemicamente estables y con una
actividad maacutes amplia de pH que los antibioacuteticos Las bacteriocinas atacan
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 19
generalmente la membrana extracelular generando poros mientras que los
antibioacuteticos pueden atacar la membrana tambieacuten yo atacar blancos intracelulares
Se conoce que las bacteriocinas presentan baja o nula toxicidad en comparacioacuten
con los antibioacuteticos (Perez Zendo amp Sonomoto 2014)
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes
En la actualidad diversos estudios enfocados en bacteriocinas se han enfocado
en su actividad contra cepas de S aureus resistentes a los antibioacuteticos Por
ejemplo la lisostafina fue utilizado el control de S aureus ATCC 29740 (Oldham amp
Daley 1991) mientras que la pentocina JL-1 ha sido efectivo para el control de S
aureus multirresistente (Jiang Zou Cheng Fang amp Huang 2017) La bacteriocina
entianina mostroacute actividad contra MRSA (ATCC 43300) (S W Fuchs et al 2011)
La epidermicina NI01 mostroacute actividad contra MRSA (Sandiford amp Upton 2012)
Asiacute tambieacuten como las enterocinas DD28 y DD93 con actividad anti estafilocoacutecica
contra ceacutelulas MRSA (Al Atya et al 2016)
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos
Las bacteriocinas son un grupo muy bien definido de peacuteptidos antimicrobianos que
tienen su origen evolutivo en bacterias y en algunas arqueobacterias Por sus
caracteriacutesticas proteicas las bacteriocinas son elementos geneacuteticos que pueden
ser faacutecilmente modificados por teacutecnicas de Ingenieriacutea geneacutetica (Cotter et al
2013) Las caracteriacutesticas generales de las bacteriocinas son que su espectro de
accioacuten es actuar tanto en las bacterias Gram positivas como negativas Su modo
de actividad por actividad bactericida o bacteriostaacutetico Su mecanismo de accioacuten
es por permeabilizacioacuten de membrana creando lisis celular Su estructura
bioquiacutemica es muy variada que pueden ser peacuteptidos glicoproteiacutenas y
lipoproteiacutenas Son de peso molecular variable sin embargo las bacteriocinas de
origen en Gram positivas son de tamantildeo pequentildeo Debido a su naturaleza
proteica las bacteriocinas son susceptibles al corte proteoliacutetico y altamente
estables a altas temperaturas (Heredia-Castro et al 2017)
Entre algunas de las bacteriocinas que se han utilizado para el control de
patoacutegenos resistentes estaacute la bacteriocina AS-48 la cual ha sido ampliamente
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 20
utilizado contra cepas de referencia y cliacutenicos para Mycobacterium tuberculosis
(Aguilar-Peacuterez et al 2018) Otro ejemplo es la pentocina JL-1 ha demostrado
tener actividad contra diferentes cepas bacterianas (Jiang et al 2017) Entianina
ha mostrado actividad contra Enterococcus faecalis resistente a vancomicina
(ATCC 51299) (S W Fuchs et al 2011) Las klebcinas poseen actividad contra
especies resistentes y multirresistentes de cepas del geacutenero Klebsiella
(Denkovskienė et al 2019) La lista de bacteriocinas reportadas como efectivas
contra patoacutegenos resistentes de relevancia cliacutenica es muy larga y que puede ser
observada en la literatura correspondiente (Cui et al 2012 Gabrielsen Brede
Nes amp Diep 2014 Newstead Varjonen Nuttall amp Paterson 2020 Perez et al
2014)
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas
Las bacteriocinas pueden ser producidos tanto por microorganismos Gram
positivos como negativos inclusive por miembros del dominio Archaea (Chikindas
et al 2018)
Hasta el diacutea de hoy no hemos encontrado un oacutergano internacional que regule la
clasificacioacuten de las bacteriocinas maacutes que lo propuesto en grupos de investigacioacuten
ligados a la ciencia de las bacteriocinas Las bacteriocinas con origen evolutivo en
organismos Gram positivos estaacuten actualmente clasificados en cuatro grandes
clases la clase I corresponde a bacteriocinas modificadas postraduccionalmente
de muy bajo peso molecular (lt5 kDa) la clase II se refiere a bacteriocinas
termoestables no modificadas de bajo peso molecular (lt10 kDa) la clase III
contiene bacteriocinas termosensibles de alto peso molecular (gt10 kDa) y por
uacuteltimo la clase IV se compone de proteiacutenas acomplejadas con carbohidratos o
liacutepidos (Newstead et al 2020 Perez et al 2014)
Dada la diversidad de bacteriocinas para fines de este trabajo solo nos
enfocaremos en las bacteriocinas tipo II de las Gram positivas ya que se clasifican
en cuatro grandes subclases La clase IIa representa la familia de las
bacteriocinas con actividad antilisteria por su actividad especiacutefica contra cepas de
Listeria monocytogenes y ademaacutes porque se mantiene un dominio conservado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 21
YGNGV conocido como la caja de pediocina y que ubica en extremo N-terminal
Uno de los ejemplos maacutes reconocidos es la enterocina NKR-5-3C La clase IIb
representa a las bacteriocinas compuestas por dos peacuteptidos que en siacute son dos
peacuteptidos diferentes que actuacutean sineacutergicamente para atacar a un blanco como
lactococcin Q que se compone de los peacuteptidos lactococcina Qα y lactococcin Qβ
La clase IIc se relaciona con las bacteriocinas circularizadas que estaacuten unidas de
extremo a extremo como lactociclina Q y leucociclina Q La clase IId se compone
de bacteriocinas sin peacuteptido liacuteder y que se sintetizan sin una secuencia liacuteder en su
extremo N-terminal Algunos ejemplos son la weissllicina Y weissllicina M
leucocina Q leucocina N lacticina Z y lacticina Q (Perez et al 2014)
256 La bacteriocina Lacticina Q
La lacticina Q (LnqQ) es una bacteriocina que fue por vez descubierta por Fujita y
sus colaboradores en el 2007 Esta bacteriocina fue aislada por primera vez por
Lactococcus lactis QU5 una cepa Gram positiva que fue aislada de una muestra
de maiacutez fresco recolectado en campos agriacutecolas de la comunidad de Aso en
Kumamoto Japoacuten La composicioacuten bioquiacutemica de LnqQ es que se trata de peacuteptido
lineal compuesto por 53 residuos y con un peso molecular de 592050 Da (Fujita
et al 2007) La estructura tridimensional descubierta por Acedo y otros revela
que es una proteiacutena globular que se compone de cuatro α-heacutelices cuya superficie
es altamente catioacutenica y su nuacutecleo hidrofoacutebico Esta secuencia presenta una
carga neta +6 y su pI = 108 (Acedo et al 2016)
Esta bacteriocina ha mostrado ser un peacuteptido antimicrobiano con alta efectividad
contra bacterias Gram positivas siendo antagonista de uno los principales
patoacutegenos reportados en cliacutenicas como S aureus Por ejemplo se han registrado
diversos rangos de concentracioacuten miacutenima inhibitoria (MIC) de la LnqQ como 8 microM
contra S aureus ATCC 6538 y 32 microM contra S aureus ATCC 29213 (Acedo et al
2016) Tambieacuten se ha reportado 18 microM (Fujita et al 2007) o 10 microgml (Ma Yu
Han Wang amp Zhang 2012) contra S aureus ATCC 12600
Se conoce que la LnqQ genera alta permeabilidad en la membrana sin necesidad
de anclarse sobre moleacuteculas especiacuteficas como el Liacutepido II (Yoneyama Imura
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 22
Ichimasa et al 2009) Posteriormente se determinoacute que el mecanismo de accioacuten
es a traveacutes de un modelo conocido como Poro Toroidal Enorme (HTP huge
toroidal pore) donde las estructuras α-heacutelices cargadas positivamente y presentes
en la LnqQ se unen covalentemente hacia la membrana celular que estaacute cargada
negativamente y entonces genera un poro en forma de toroide enorme de 46 a
66 nm de diaacutemetro generando una estructura conocida como lipid flip-flop lo que
permite el goteo de moleacuteculas intercelular de manera que la ceacutelula muere La
translocacioacuten del peacuteptido desde el exterior a la cara interna de la ceacutelula ocurre
sincroacutenicamente con la formacioacuten del poro toroidal (Yoneyama Imura Ohno
et al 2009) En un estudio a nivel in vitro se determinoacute que cuando LnqQ es
agregado a niveles MIC sobre cultivos bacterianos sensibles aumenta la
acumulacioacuten de radicales libres tipo hidroxilos y por consecuencia la ceacutelula muere
(Li et al 2013)
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados
Las bacteriocinas son sustancias toacutexicas que pueden atacar a su microorganismo
productor si eacuteste no cuenta con caracteriacutesticas que le permitan resistir (Ishibashi
et al 2014 Iwatani et al 2012 Ladjouzi Lucau-Danila Benachour amp Drider
2020 Mesa-Pereira et al 2017 Nascimento et al 2012) De manera que todos
los operones de las bacteriocinas se componen habitualmente de los siguientes
elementos geneacuteticos promotor gen estructural (bacteriocina) genes de
inmunidad genes de transporte una proteiacutena accesoria y un terminador de la
transcripcioacuten (Mesa-Pereira et al 2017)
La LnqQ no es ninguna excepcioacuten a la regla ya que similar a otras bacteriocinas
la produccioacuten secrecioacuten y autoinmunidad estaacute regulado por el cluacutester geneacutetico
lnqRQBCDEF que se encuentra en Lactococcus lactis QU5 y que descubierto por
Iwatani y otros en el 2012 (Iwatani et al 2012) Al diacutea de hoy auacuten no estaacute del todo
bien determinado la funcionalidad de los elementos que conforman el operoacuten pero
se sabe que el cluacutester lnqQBCDEF es esencial para la completa produccioacuten de
LnqQ mientras que los productos LnqEF son esenciales y los productos LnqBCD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 23
estaacuten parcialmente involucrados en la inmunidad y secrecioacuten de la bacteriocina
(Iwatani Horikiri Zendo Nakayama amp Sonomoto 2013)
26 Produccioacuten heteroacuteloga de bacteriocinas
Entre las virtudes observadas en las bacteriocinas estaacuten en que gozan de una
excelente reputacioacuten en seguridad bioloacutegica (Silva et al 2018) y de una gran
diversidad de bancos de datos sobre bacteriocinas (Hammami et al 2010 G
Wang et al 2016) Estos datos pueden apoyar para el disentildeo y construccioacuten de
bacteriocinas de novo (Fields et al 2020) Sin embargo a la fecha una cantidad
raquiacutetica de bacteriocinas han sido capaces de ser producidos en masa siendo la
nisina y la pediocina PA-1 las uacutenicas bacteriocinas en destacar industrialmente
Una de las hipoacutetesis que maacutes planteada supone que las bacteriocinas no han
destacado en el mercado porque eacutestas deben de producirse en altas cantidades y
con suficiente actividad bioloacutegica y en los organismos nativos este proceso se
considera que es un desgaste energeacutetico significativo ya que el rendimiento
productivo es usualmente bajo (Mesa-Pereira Rea Cotter Hill amp Ross 2018)
Desde la fundacioacuten de la Ingenieriacutea Geneacutetica las proteiacutenas han sido objeto de
muacuteltiples modificaciones para aumentar su produccioacuten y purificacioacuten utilizando
diversos sistemas bioloacutegicos productores desde sistemas procariotas como E coli
hasta sistemas eucariotas como ceacutelulas de levaduras o inclusive en liacuteneas
celulares eucariotas A pesar del avance actual que existen ya en estas teacutecnicas
la produccioacuten de proteiacutenas puede presentar incluso problemas de rutina en
laboratorios dedicados a este campo como la formacioacuten de cuerpos de inclusioacuten
toxicidad o baja produccioacuten de proteiacutenas (Bell Engleka Malik amp Strickler 2013)
En este trabajo nos hemos enfocado en la exploracioacuten de un peacuteptido sentildeal N-
AmyE y un peacuteptido de fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de la bacteriocina
LnqQ tanto en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica de ceacutelulas de E coli Nuestro
objetivo es que la aplicacioacuten de las etiquetas en la produccioacuten de la bacteriocina
permita la produccioacuten y purificacioacuten de LnqQ en ceacutelulas de E coli mientras
mantiene su funcionalidad bioloacutegica bactericida contra cultivos de S aureus En
este capiacutetulo presentaremos antecedentes relacionados al peacuteptido sentildeal N-AmyE
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 24
y al peacuteptido de fusioacuten SmbP asiacute como los disentildeos bioinformaacuteticos utilizados para
la construccioacuten de las etiquetas con la bacteriocina se incluyen ensayos in silico
predictivos para estimar la estructura tridimensional de la bacteriocina con su
etiqueta asiacute como ensayos para estimar el corte
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE es un dominio proteico localizado en la regioacuten N-terminal
de la α-amilasa (AmyE) (Yang Galiii amp Henner 1983) Bioquiacutemicamente la AmyE
es una enzima (1 4-α-D-glucano-glucanohidrolasa EC 3211) cuya funcioacuten es
catalizar la hidroacutelisis de enlaces glicosiacutedicos (α-14) del almidoacuten para producir
glucosa y dextrinas (R Gupta Gigras Mohapatra Goswami amp Chauhan 2003)
La secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica de algunas AmyE fueron reportadas
desde hace varias deacutecadas Por ejemplo en 1983 Yang y sus colaboradores
reportaron la secuencia nucleotiacutedica del AmyE de la cepa Bacillus subtilis 1A289
(Yang et al 1983) Antildeos maacutes tarde en 1988 Emori y sus colegas tambieacuten
reportaron la secuencia nucleotiacutedica completa de la variante producida por la cepa
de B subtilis 2633 (Emori amp Maruo 1988)
La existencia del peacuteptido sentildeal N-AmyE de la α-amilasa fue propuesta por Yang y
sus colaboradores cuando develaron la secuencia nucleotiacutedica completa del
mismo argumentando que el presunto peacuteptido sentildeal debiacutea tener un tamantildeo de 32
aminoaacutecidos Tambieacuten observaron que AmyE podriacutea expresarse en ceacutelulas de
otras especies como E coli manteniendo su actividad bioloacutegica (Yang et al 1983)
La utilidad biotecnoloacutegica del peacuteptido sentildeal N-AmyE es porque se ha reportado
que es funcionalmente activo tanto en Bacillus subtilis como en E coli ya que al
fusionarse eacutesta con la regioacuten N-terminal de una proteiacutena de intereacutes biotecnoloacutegico
estaacute puede ser liberado al medio extracelular Por ejemplo al fusionar el peacuteptido
sentildeal N-AmyE con una β-lactamasa eacutesta es capaz de excretarse al medio
extracelular tanto en ceacutelulas de B subtilis como de E coli Sin embargo el sitio de
reconocimiento para el corte del peacuteptido sentildeal difiere entre ambos tipos de ceacutelulas
(Nakazawa Takano Sohma amp Yamane 1986) Un anaacutelisis multivariado de datos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 25
determinoacute que las secuencias nucleotiacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en su seccioacuten N-terminal tienden a ser excretados en el periplasma y en la
seccioacuten extracelular de E coli (Sjoumlstroumlm Wold Wieslander amp Rilfors 1987)
El mecanismo de corte hidroliacutetico por el que el peacuteptido sentildeal N-AmyE se separa de
la amilasa AmyE es debido a su estructura secundaria y a la presencia de un
dominio rico en alaninas (aminoaacutecido apolar) en el extremo C-terminal de del
peacuteptido N-AmyE Sin embargo el patroacuten de corte enzimaacutetico difiere seguacuten el tipo
organismo donde sea expresado ya que el sitio de corte oacuteptimo de este peacuteptido
se encuentra entre Ala33 y X34 cuando se expresa en B subtilis pero en E coli la
AmyE tiende a cortarse entre Ala31 y un aminoaacutecido cual sea (X) (Sakakibara
Tsutsumi Nakamura amp Yamane 1993)
En el 2005 el peacuteptido sentildeal N-AmyE reportado por Yang y otros fue acoplado en
la regioacuten N-terminal de una liasa de pectina para permitir su expresioacuten en ceacutelulas
de E coli (DE3) en la regioacuten periplaacutesmica Los resultados de ese estudio indicaron
que se logroacute la excrecioacuten efectiva de la liasa de pectina al medio extracelular
espacio periplaacutesmico citoplasma y a nivel membranal de E coli despueacutes de haber
sido inducido por con IPTG (R M Papi Chaitidou Trikka amp Kyriakidis 2005)
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP
La mayoriacutea de peacuteptidos de fusioacuten utilizados para la expresioacuten de proteiacutenas
recombinantes son el Dominio de Unioacuten a Celulosa (CBDcenA) Glutatioacuten-S-
Transferasa (GST) Proteiacutena de Unioacuten a Maltosa (MBP) tiorredoxina (TRX) y las
Proteiacutenas Modificadoras tipo Ubiquitina de Tamantildeo Pequentildeo (SUMO) (Mesa-
Pereira et al 2018) o la regioacuten citoplasmaacutetica del proteiacutena pequentildea de unioacuten a
metales SmbP (Vargas-Cortez Morones-Ramirez Balderas-Renteria amp Zarate
2016) a continuacioacuten ofrecemos maacutes informacioacuten relacionada al uacuteltimo peacuteptido de
fusioacuten
En el 2004 Barney y sus colaboradores describieron a la Proteiacutena Pequentildea de
Unioacuten a Metales en el periplasma de Nitrosomonas europaea Esta proteiacutena posee
un peso molecular de 99 kDa y presenta una inusual cantidad de residuos de
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 26
histidina (17) seguido de alanina (16) glutamato (14) glicina (11) y lisina
(9) los cuales componen el 67 de la composicioacuten total de residuos Esta
proteiacutena carece naturalmente de metionina y de cisteiacutenas Estructuralmente se
trata de una unidad monomeacuterica compuesta por 93 residuos cuya principal
caracteriacutestica es una regioacuten compuesta de 10 repeticiones secuenciales cada una
con motivo de siete aminoaacutecidos donde el cuarto residuo es una histidina
conservada estos motivos permiten la estabilizacioacuten de un nuacutecleo hidrofoacutebico
Como su nombre lo establece esta proteiacutena posee alta afinidad a metales
divalentes como Cu2+ Ni2+ Zn2+ y de otras valencias como Fe3+ (Barney LoBrutto
amp Francisco 2004) Esta proteiacutena ha sido utilizada para la expresioacuten periplaacutesmica
y posterior purificacioacuten de Hormona de Crecimiento Humano (hGH)
bioloacutegicamente activa (Perez-Perez et al 2020)
En 2015 el dominio periplaacutesmico de la SmbP que corresponde a la seccioacuten maacutes
proacutexima al extremo N-terminal en la estructura lineal del mismo fue removido por
Vargas y sus colaboradores manteniendo uacutenicamente el dominio citoplasmaacutetico
de la SmbP citoplasmaacutetica (SmbP) Eacutesta uacuteltima es uacutetil como etiqueta de afinidad
para teacutecnicas de cromatografiacutea de afinidad con iones metaacutelicos inmovilizados
(IMAC por sus siglas en ingleacutes) Esta proteiacutena fue reportada como efectiva para la
expresioacuten citoplaacutesmica de proteiacutenas en E coli como RFP GFP SHY2 NDPK2 y
LovR (Vargas-Cortez et al 2016)
Recientemente la SmbP fue utilizada por primera vez para la produccioacuten del
peacuteptido antimicrobiano Bin1b utilizando E coli como hospedero para la
sobreproduccioacuten El peacuteptido fue sobre producido y purificado mostrando actividad
antimicrobiana contra E coli y S aureus (Montfort-Gardeazabal Balderas-
Renteria Casillas-Vega amp Zarate 2021)
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS
31 Justificacioacuten
La idea de disentildear y utilizar un biosensor de ceacutelula para controlar cultivos de
MRSA es porque las moleacuteculas sentildealizadoras del QS se han reportado como
estiacutemulos quiacutemicos para ser reconocidos como ceacutelulas enteras vivas modificadas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 27
para su reconocimiento Ademaacutes de que ya se han reportado diversos biosensores
completos de ceacutelulas que pueden producir y excretar bacteriocinas capaces de
matar a microorganismos multirresistentes productores de sentildeales QS
La decisioacuten de inclinarnos hacia las bacteriocinas como patoacutegenos es porque
atacan un espectro limitado de bacterias dentro de una comunidad microbioloacutegica
y no ocurre de manera simultaacutenea en un espectro amplio como ocurre
habitualmente con los antibioacuteticos lo que promueve una mayor probabilidad de
seleccioacuten de mutantes que puedan conferir resistencia Ademaacutes las bacteriocinas
estaacuten constantemente evolucionando y permiten a sus productores combatir
contra patoacutegenos de resistencia emergentes (Riley et al 2012)
Las bacteriocinas han mostrado ademaacutes ser potenciales agentes terapeacuteuticos ya
que no afectan tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Incluso las
bacteriocinas se han administrado en concentraciones tan altas como 100 veces
superiores al MIC originalmente reportado con nulos efectos citotoacutexicos en liacuteneas
celulares eucarioacuteticas (Hols et al 2019) Ademaacutes la mayoriacutea de los productores
nativos en bacteriocinas poseen un excelente historial en seguridad (Silva et al
2018)
La propuesta de etiquetar bacteriocinas con un peacuteptido sentildeal es porque durante el
proceso de recuperacioacuten previo a la purificacioacuten es comuacuten encontrar una baja
cantidad de proteiacutenas y ademaacutes proteasas que disminuyen el rendimiento
productivo Con el peacuteptido sentildeal la purificacioacuten de las proteiacutenas se simplifica
porque son faacutecilmente recuperadas de la fraccioacuten periplaacutesmica seguido un choque
osmoacutetico sin la necesidad de lisar toda la ceacutelula (Ramanan et al 2010) mientras
que la decisioacuten de antildeadir peacuteptidos de fusioacuten en los disentildeos geneacuteticos es porque se
trata de etiquetas que se colocan en la regioacuten N-terminal o C-terminal de una
proteiacutena con intereacutes biotecnoloacutegico Estos peacuteptidos representan un meacutetodo
recurrente en la sobreexpresioacuten de bacteriocinas porque ayudan en la purificacioacuten
aumentan la expresioacuten proteica mejoran la solubilidad permiten que la proteiacutena
sea producida en un estado similar al nativo incrementan el rendimiento de
produccioacuten y disminuyen su degradacioacuten (Mesa-Pereira et al 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 28
32 Hipoacutetesis
El disentildeo de un biosensor construido a base de ceacutelulas enteras E coli modificadas
pronostica indica que funcionaraacute como alarma bioloacutegica al detectar moleacuteculas de
QS de S aureus En consecuencia liberaraacute un compuesto antimicrobiano con
actividad especiacutefica contra el organismo blanco El peacuteptido antimicrobiano seraacute
validado experimentalmente a traveacutes del peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de
fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de LnqQ en E coli que seraacute producido
en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica respectivamente
33 Objetivo General
Presentar el disentildeo in silico de un mecanismo biosensor basado en el sistema de
quorum sensing de S aureus para producir Lacticina Q y producir
experimentalmente este peacuteptido antimicrobiano tanto en la regioacuten periplaacutesmica
como citoplaacutesmica de E coli
34 Objetivos Especiacuteficos
1 Disentildear el moacutedulo geneacutetico biosensor para detectar la presencia externa de
moleacuteculas autoinductoras (AIP) producidos por MRSA
2 Disentildear el moacutedulo geneacutetico de bacteriocinas para liberar lacticina Q (LnqQ)
en funcioacuten a la concentracioacuten externa de moleacuteculas AIP producidos por
MRSA
3 Disentildear un vector de expresioacuten que contenga ambos moacutedulos geneacuteticos
tanto biosensor como de bacteriocinas
4 Predecir la especificidad teoacuterica del biosensor completo de ceacutelulas enteras
entre diferentes sentildeales de QS
5 Predecir la solubilidad y localizacioacuten subcelular de cada una de las
proteiacutenas utilizadas para el disentildeo del moacutedulo biosensor y el moacutedulo de
bacteriocina
6 Predecir la existencia de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B y nivel de alergenicidad
en la LnqQ producida en E coli
7 Disentildear el vector de expresioacuten pETNL que contenga el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en conjunto con el LnqQ acoplado con una etiqueta de polihistidina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 29
8 Disentildear el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ que contenga el peacuteptido de
fusioacuten SmbP en conjunto con el LnqQ
9 Construir los vectores de expresioacuten pETNL y pSmbP-LnqQ y transformar
ceacutelulas de E coli
10 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten periplaacutesmica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pETNL
11 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten citoplasmaacutetica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ
35 Metas
En un periacuteodo a tres antildeos nos propusimos alcanzar las siguientes metas
bull Disentildear in silico un sistema biosensor en E coli capaz de sentir moleacuteculas
de Quorum Sensing producidas por S aureus y producir una sustancia
antimicrobiana en funcioacuten a la concentracioacuten externa de las moleacuteculas QS
bull Predecir la capacidad del peacuteptido sentildeal N-AmyE y del peacuteptido de fusioacuten
SmbP para producir bacteriocinas en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica
de E coli respectivamente
bull Presentar los resultados obtenidos en al menos un artiacuteculo de investigacioacuten
con arbitraje internacional
bull Cumplir con eacutexito el examen predoctoral
bull Obtener el grado de Doctor en Ciencias con Orientacioacuten en Microbiologiacutea
36 Aportacioacuten cientiacutefica
Nuestra aportacioacuten consiste en presentar el disentildeo y el trabajo teoacuterico necesario
para la construccioacuten de un biosensor de ceacutelulas enteras basado en quorum
sensing capaz de producir bacteriocinas en funcioacuten a la concentracioacuten disponible
de moleacuteculas tipo QS evitando asiacute la sobreproduccioacuten yo goteo de bacteriocinas
que pueden contribuir a la resistencia en patoacutegenos Asiacute tambieacuten experimentamos
en peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP para validarlos como una
herramienta bioloacutegica para la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas en ceacutelulas
modificadas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 30
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
La idea de disentildear un biosensor basado en ceacutelulas enteras surge al yuxtaponer
dos enfoques usados para tratar enfermedades resistentes a los antibioacuteticos que
es mediante el uso de organismos bioloacutegicamente activos con bacteriocinas (Allen
et al 2014)
En este sentido tenemos dos ceacutelulas independientes que son reconocidas como α
y β respectivamente (Figura 1) las ceacutelulas α que corresponden a un productor
de sentildeales tipo QS liberan moleacuteculas de sentildealizacioacuten al medio externo mientras
que las ceacutelulas β que corresponden al biosensor son emulados para detectar
moleacuteculas de QS de las ceacutelulas α En respuesta a esta deteccioacuten los mecanismos
internos de las ceacutelulas β producen y excretan una toxina especiacutefica contra las
ceacutelulas α y asiacute controlar su crecimiento poblacional
Figura 1 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
Ceacutelulas β fungen como sistema de deteccioacuten y destruccioacuten al reconocer moleacuteculas de reconocimiento tipo QS
producidos por ceacutelulas α y causar su muerte
42 Cepas bacterianas
Nosotros designamos a E coli (BL21) DE3 como chasis bioloacutegico porque ha sido
ampliamente reconocido para la sobreproduccioacuten de bacteriocinas recombinantes
(Mesa-Pereira et al 2018) Para el disentildeo del moacutedulo biosensor optamos por
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 31
utilizar los datos anotados del genoma de la cepa S aureus N315 una cepa
reconocida como MRSA y que ha sido reportado como unas de las principales
causas de infecciones resistentes a meticilina asociado a comunidad (CA-MRSA)
y a hospitales (HA-MRSA) (Kuroda et al 2001) Para el disentildeo del moacutedulo de
bacteriocina utilizamos los datos bioinformaacuteticos del cluacutester de genes lnqQBCDEF
de L lactis QU5 que permiten la produccioacuten y excrecioacuten la LnqQ asiacute como para su
autoinmunidad (Fujita et al 2007 Iwatani et al 2012) Abajo se presentan los
disentildeos de ambos moacutedulos asiacute como la estrategia general para su ensamblado en
un vector de expresioacuten
La cepa de E coli BL21 (DE3) fue seleccionada para ensayos de expresioacuten
proteica con el peacuteptido sentildeal N-AmyE o con el peacuteptido de fusioacuten SmbP La cepa E
coli DH5 fue utilizada para ensayos de clonacioacuten La cepa E coli Origami fue
escogida para produccioacuten de proteiacutenas problemaacuteticas
Un cultivo de E coli BL21 (DE3) fue amablemente donado por el Instituto
Tecnoloacutegico de Monterrey (Monterrey Nuevo Leoacuten) La cepa de E coli DH5α fue
recuperada de un stock de cultivos de nuestro laboratorio en el CIBYN (Apodaca
Nuevo Leoacuten) La cepa E coli Origami fue compartida por el Dr Xristo Zaacuterate de la
UANL (Monterrey Nuevo Leoacuten) Todas las cepas fueron mantenidas y crecidas en
caldo LB o suplementado con agar (2) a 37degC en condiciones aeroacutebicas
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina
Tanto los moacutedulos biosensor como el de bacteriocina fueron disentildeados de la
siguiente manera contienen un promotor un sitio de unioacuten al ribosoma gen
estructural y un terminador doble de transcripcioacuten Los disentildeos fueron elaborados
bajo la herramienta bioinformaacutetica SnapGene 113 en el formato correspondiente
Todos los datos bioinformaacuteticos utilizados para ambos disentildeos fueron recuperados
de alguna de las siguientes bases de datos Massachussets Institute of
Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts (SBP) (httppartsigemorg)
(Galdzicki Rodriguez Chandran Sauro amp Gennari 2011) Kyoto Encyclopedia
Genes and Genomes (KEGG) (httpswwwgenomejpkegg) (Kanehisa amp Goto
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 32
2000) FP Base (FPB) (httpswwwfpbaseorg) (Lambert 2019) y GenBank
(httpswwwncbinlmnihgovgenbank) (Clark Karsch-Mizrachi Lipman Ostell amp
Sayers 2016) y Protein Data Bank (PDB) (httpswwwrcsborg) (Berman et al
2000)
Para el disentildeo del moacutedulo biosensor usamos los datos del promotor constitutivo
de E coli J23110 (SBP no BBa_J23110) como regulador transcripcional de los
genes del operoacuten agrC y agrA Nosotros utilizamos la secuencia nucleotiacutedica y
aminoaciacutedica del agrC (KEGG no SA1843) que se compone de 1116 nucleoacutetidos
y 371 residuos respectivamente y tambieacuten de la informacioacuten disponible para la
agrA (KEGG no SA1844) que se compone de 717 nucleoacutetidos y 238 residuos Los
sitios de unioacuten a ribosoma (SBP no BBa_B0034) fueron colocados entre cada gen
estructural y al final de la unidad transcriptoacutemica se colocoacute un doble terminador de
transcripcioacuten (SBP no BBa_B0015) tanto el moacutedulo biosensor como en moacutedulo
de bacteriocina
Para el disentildeo del moacutedulo de bacteriocina utilizamos los datos del promotor
inducible P2 del MRSA para regular la expresioacuten del cluacutester geneacutetico lnqQBCDEF
y el gen reportero gfp Debido a que la secuencia del promotor P2 no se
encontraba disponible de manera que primero tuvimos que localizar la regioacuten en
el archivo genoacutemico de la MRSA (GenBank no BA0000183) los resultados de
este punto seraacuten explicados maacutes a fondo en la seccioacuten correspondiente
Para la seccioacuten estructural del moacutedulo de bacteriocina buscamos el archivo
bioinformaacutetico que contuviera los genes estructurales secrecioacuten y de auto
inmunidad del cluacutester lnqQBCDEF (GenBank no AB7123931) El archivo original
fue manipulado para seccionar los elementos geneacuteticos que pertenecen al cluacutester
esta informacioacuten seraacute explicada con maacutes detalle
Por uacuteltimo usamos la secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica del gen monomeacuterico
gfp (FPBase no QKFJN) como reportero de Aequorea victoria (Zacharias Violin
Newton amp Tsien 2002) Esta proteiacutena es monomeacuterica posee un peso molecular
en 270 kDa El valor maacuteximo de excitacioacuten es λ = 488 nm mientras que el valor
maacuteximo de emisioacuten es λ = 507 nm El coeficiente de extincioacuten es 56000 M-1cm-1
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 33
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
El plaacutesmido de AddGene (httpswwwaddgeneorg) (AddGene no 116850) fue
utilizado para la construccioacuten in silico de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
dentro de un plaacutesmido al cual nos referiremos a partir de ahora como plaacutesmido
Dual Biosensor Killer (DBK) Este plaacutesmido fue disentildeado en la aplicacioacuten
SnapGene versioacuten 113
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas
Para la optimizacioacuten de los codones de todas las secuencias nucleotiacutedicas se
utilizoacute la herramienta bioinformaacutetica GenSmart Codon Optimization Tool
(httpswwwgenscriptcomtoolsgensmart-codon-optimization) versioacuten Beta 10
Las secuencias nucleotiacutedicas yo aminoaciacutedicas recolectadas para el disentildeo de los
moacutedulos geneacuteticos funcionaron como datos de entrada La aplicacioacuten fue
configurada para ldquoEscherichia colirdquo como organismo para expresioacuten de proteiacutenas
Es importante mencionar que solicitamos la exclusioacuten de sitios de restriccioacuten
habitualmente localizados en la regioacuten muacuteltiple de clonacioacuten del vector de
expresioacuten pET30a(+) como BamHI (GGATCC) BglII (AGATCT) ClaI (ATCGAT)
EcoRI (GAATTC) HindIII (AAGCTT) KpnI (GGTACC) NcoI (CCATGG) NdeI
(CATATG) NheI (GCTAGC) NotI (GCGGCCGC) PstI (CTGCAG) SacI (GAGCTC) SacII
(CCGCGG) SalI (GTCGAC) SmaI (CCCGGG) SpeI (ACTAGT) SphI (GCATGC) XbaI
(TCTAGA) XhoI (CTCGAG) XmaI (CCCGGG)
Una vez optimizadas usamos CAI Tool (httpgenomesurvesCAIcal) para el
Caacutelculo del Iacutendice de Adaptacioacuten (CAI por sus siglas en ingleacutes) para determinar el
iacutendice de adaptacioacuten de las secuencias nucleotiacutedicas antes y despueacutes de la
optimizacioacuten Esta herramienta utiliza la secuencia nucleotiacutedica y el uso de
codones tanto del organismo nativo como el organismo productor heteroacutelogo (u
organismo recipiente) como entradas para la optimizacioacuten De acuerdo a los
autores el iacutendice tiene un rango de respuesta que oscila entre 0 hasta 1 donde el
valor correspondiente 1 indica si la secuencia de entrada usa los codones maacutes
frecuentemente utilizados por el organismo recipiente (Puigbograve Bravo amp Garcia-
Vallve 2008) Para esta aplicacioacuten los iacutendices de uso de codones de cada
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organismo los datos de entrada deben ser descargados y posteriormente deben
ingresarse manualmente Todos los iacutendices fueron descargados de la base de
datos Codon Usage Database (httpswwwkazusaorjpcodon) y se descargaron
para los organismos E coli B (CUD no 413997) S aureus N315 (CUD
no158879) L lactis subsp cremoris (CUD no 1359) and A victoria (CUD no
6100)
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Se realizoacute un alineamiento local entre pares probando de manera independiente
cada una las cuatro clases maacutes comunes de AgrD contra la secuencia
aminoaciacutedica del AgrD del MRSA seleccionada para determinar la especificidad
del biosensor y en consecuencia la existencia de un comportamiento de
comunicacioacuten cruzada El alineamiento se realizoacute en la aplicacioacuten EMBOSS Water
(httpswwwebiacukToolspsaemboss_water) (Madeira et al 2019) Las
secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro clases maacutes representativas de AgrD
fueron descargadas de los datos publicados por Wang y otros (B Wang amp Muir
2016) mientras que la secuencia de AgrD de la cepa MRSA que seleccionamos
fue recuperada de una base de datos (KEGG no SAS066)
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
La solubilidad de las proteiacutenas seleccionadas para su expresioacuten en E coli fue
predicha por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk)
(Hebditch Carballo-Amador Charonis Curtis amp Warwicker 2017) La precisioacuten
general de la herramienta fue estimada en 706 De acuerdo con los autores
cualquier valor de solubilidad superior a 045 se considera que es soluble De esta
manera cualquier proteiacutena con valor inferior a 045 se infiere que no son solubles
Es importante mencionar que esta herramienta no es uacutetil para determinar el iacutendice
de solubilidad en proteiacutenas membranales
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
La herramienta bioinformaacutetica BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo
Martelli Fariselli Profiti amp Casadio 2018) predice la localizacioacuten subcelular de
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una proteiacutena en E coli Esta aplicacioacuten nos permite distinguir entre proteiacutenas
globulares de proteiacutenas membranales Para fines de nuestro proyecto nosotros
configuramos a la aplicacioacuten para identificar ldquoProkarya ndash Gram negativerdquo debido a
que eacuteste es el origen taxonoacutemico de nuestro organismo productor heteroacutelogo
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
410 Prediccioacuten de alergenicidad
La alergenicidad de la LnqQ fue evaluada en la herramienta bioinformaacutetica
AllerCatPro versioacuten 17 (httpsallercatprobiia-staredusg) la cual permite
predecir si el componente es capaz de crear una respuesta aleacutergica tipo I mediada
a la inmunoglobulina tipo E (IgE) basada en el anaacutelisis estructural lineal y
tridimensional de la proteiacutena (Maurer-Stroh et al 2019)
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
4111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica de la amilasa AmyE fue
descargado del cataacutelogo de GenBank (GenBank no V001011) El peacuteptido sentildeal
de este archivo fue manualmente extraiacutedo con la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 113 siguiendo las recomendaciones de la publicacioacuten de Papi y sus
colaboradores (R M Papi et al 2005)
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4112 Disentildeo y acoplamiento del peacuteptido sentildeal N-AmyE con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo nucleotiacutedico de la LnqQ (GenBank no AB2352011) El
acoplamiento fue manualmente resuelto utilizando la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 110 agregando sitios de restriccioacuten y algunos nucleoacutetidos tomando
en cuenta las recomendaciones de AddGene de dejar un espacio para asistir en la
clonacioacuten molecular por PCR (httpswwwaddgeneorgprotocolspcr-cloning)
Dos vectores de expresioacuten basados en pET-30a(+) fueron disentildeados in silico
donde uno de los vectores contiene exclusivamente el peacuteptido sentildeal N-AmyE y en
el siguiente estaacute el N-AmyE acoplado con la LnqQ
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pETNL fue
elaborado en SnapGene 113 y guardado en formato dna y enviado a BioBasic
Inc (Canadaacute) a traveacutes del tercero autorizado Productos y Equipos
Biotecnoloacutegicos SA de CV (Probiotek Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
4113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido sentildeal N-AmyE del
conjunto LnqQ con etiqueta de polihistidina fue evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea
SignalP 50 (httpwwwcbsdtudkservicesSignalP) el cual es un servidor que
determina la presencia de peacuteptidos sentildeales y la localizacioacuten de sus sitios de corte
proteoliacutetico en proteiacutenas de origen en Archaea bacterias Gram positivas y
negativas y organismos eucarioacuteticos (Armenteros et al 2019)
Esta herramienta puede distinguir entre tres tipos de peacuteptidos sentildeales tiacutepicos El
primer mecanismo es a traveacutes la viacutea Sec tipo I (SPI) que es conocido como el
mecanismo estaacutendar de excrecioacuten donde los peacuteptidos sentildeales son transportados
por el translocoacuten Sec y son escindidos por accioacuten de la Peptidasa de Sentildeal tipo I
(Lep) El segundo mecanismo corresponde a la viacutea Sec tipo II (SPII) donde los
peacuteptidos sentildeales lipoproteiacutecos son transportados por el translocoacuten Sec y cortados
mediante la Peptidasa de Sentildeal tipo II (Lsp) El uacuteltimo mecanismo corresponde a
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 37
la viacutea Tat donde los peacuteptidos sentildeales son transportados por el translocoacuten Tat tipo
y son escindidos por la Peptidasa de Sentildeal tipo I (Lep) (Armenteros et al 2019)
En la aplicacioacuten se puede elegir entre cuatro grupos de organismos para el
anaacutelisis de corte predictivo los cuales corresponden a organismos eucarioacuteticos
organismos Gram positivos organismos Gram negativos y en tipo Archaea Para
fines de nuestro proyecto dado que esta construccioacuten fue intencionada para ser
producida en ceacutelulas de E coli se eligioacute la opcioacuten para organismos Gram
negativos
Para comparar la probabilidad de corte enzimaacutetico de nuestra construccioacuten in silico
de N-AmyELnqQ6xHis se descargoacute los datos bioinformaacuteticos de seis secuencias
aminoaciacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y cuyo corte proteoliacutetico fue
demostrado experimentalmente
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
4121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica del peacuteptido de fusioacuten SmbP fue
amablemente cedido por el Dr Xristo Zaacuterate de la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten La secuencia nucleotiacutedica del SmbP estaacute contenida en un vector de
expresioacuten tipo pET30a(+) y guardado en formato dna
4122 Disentildeo y acoplamiento de peacuteptido de fusioacuten SmbP con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido de fusioacuten con la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo geneacutetico desde la base de datos biotecnoloacutegicos Este
acoplamiento fue manualmente resulto a traveacutes de SnapGene
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pSmbP-
LnqQ fueron elaborado en SnapGene 113 guardados en formato dna y enviado
a Gene Universal Inc (Estados Unidos) a traveacutes del tercero autorizado
Distribuidora Bakterlab SA de CV (Bakterlab Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
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4123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP del
conjunto LnqQ evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea PeptideCutter
(httpswebexpasyorgpeptide_cutter) la cual predice sitios potenciales para ser
cortados por proteasas o por sustancias quiacutemicas en una secuencia de proteiacutena
determinada (Gasteiger et al 2005) Esta aplicacioacuten contiene una lista extensa de
reacciones enzimaacuteticas y quiacutemicas Para fines de nuestro proyecto se eligioacute la
opcioacuten de ldquoEnterokinaserdquo ya que nuestra construccioacuten contiene este dominio
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Para descartar que la existencia de alguacuten codoacuten de paro no observado durante la
fase de post disentildeo optamos por analizar la secuencia nucleotiacutedica de la regioacuten
de intereacutes de pETNL y pSmbP-LnqQ en la aplicacioacuten en liacutenea ORF Finder
(httpswwwncbinlmnihgovorffinder) la cual es una aplicacioacuten que encuentra
marcos de lectura abiertos en una secuencia de nucleoacutetidos Los paraacutemetros
seleccionados correspondieron a ldquoATGrdquo exclusivamente como codoacuten de inicio y
como coacutedigo geneacutetico se utilizoacute la opcioacuten 1 correspondiente a ldquoStandardrdquo Esta
aplicacioacuten realiza una traduccioacuten de la secuencia nucleotiacutedica a partir de la
traduccioacuten de seis marcos de lectura y devuelve un graacutefico que indica la ubicacioacuten
donde se encuentra cada marco de lectura identificado (Wheeler et al 2003)
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
El peso molecular estimado de los productos de los vectores pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron estimado a traveacutes de la aplicacioacuten Compute pIMW de ExPasy
(httpswebexpasyorgcompute_pi) la cual permite estimar el punto isoeleacutectrico
(pI) teoacuterico y el peso molecular (MW) teoacuterico a partir de secuencias reportadas o
secuencias de aminoaacutecidos ingresados por el usuario (Gasteiger et al 2005)
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415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
La solubilidad de los productos de los pETNL y pSmbP-LnqQ fueron analizados
por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk) (Hebditch et al
2017) mientras que la localizacioacuten subcelular de las proteiacutenas fue determinada por
la herramienta BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo et al 2018)
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
Phyre2 (httpwwwsbgbioicacukphyre2htmlpagecgiid=index) es una
aplicacioacuten en liacutenea para el anaacutelisis de modelado para estructuras secundarias y
tridimensionales Esta herramienta permite predecir y analizar la estructura de la
proteiacutena asiacute como funciones y mutaciones haciendo maacutes faacutecil la interfaz al usuario
para interpretar la estructura secundaria y terciaria de los modelos asiacute como la
composicioacuten de dominios y la calidad del modelo (Kelley Mezulis Yates Wass amp
Sternberg 2015)
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
4171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Para transformar las ceacutelulas de E coli con el vector de expresioacuten pET30a(+)
pETNL o pSmbP-LnqQ se utilizoacute la teacutecnica de electroporacioacuten (Potter amp Heller
2003) que consiste en la introduccioacuten de DNA exoacutegeno al interior de las ceacutelulas
por meacutetodos fiacutesico-quiacutemicos A continuacioacuten describimos la teacutecnica
Se preparoacute un cultivo overnight de E coli en un tubo con caldo LB esteacuteril y se
incuboacute por 37degC en agitacioacuten constante por 18 h Al diacutea siguiente 20 microl del cultivo
preinoacuteculo fueron retirados y depositados en un microtubo con 1 ml de caldo LB
esteacuteril este proceso se realizoacute en seis tubos donde tres son etiquetados ldquoMuestrardquo
(M) ldquoAntibioacuteticordquo (A) ldquoViabilidadrdquo (V) y tres maacutes fueron reservados para anaacutelisis
espectrofotomeacutetricos Se incubaron todos los tubos a 37degC durante
aproximadamente 15 h (OD600 entre 04-06) en agitacioacuten constante Todos los
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 40
tubos asignados para anaacutelisis espectrofotomeacutetricos fueron usados para monitoreo
Una vez alcanzado el tiempo establecido los tubos M A y V fueron centrifugados
a 9000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente El sobrenadante de los tubos
fue descartado y las ceacutelulas fueron resuspendidas en 1 ml de agua ultrapura
esteacuteril a temperatura ambiente Los tubos fueron centrifugados a 9000 rpm
durante 2 min a temperatura ambiente Este paso se repitioacute una vez El precipitado
celular en los tubos M A y V fue resuspendido en 35 microl de agua ultrapura esteacuteril y
se agregoacute al menos 2 a 3 microl de plaacutesmido (asymp 500 microg totales) o de agua seguacuten el
caso Finalmente se mezcloacute cuidadosamente con la micropipeta
En el tubo de viabilidad no se agregoacute plaacutesmido y fue sembrado en una placa LB
En el tubo etiquetado como antibioacutetico no se agregoacute plaacutesmido y el precipitado fue
sembrado en una placa de LB suplementado con kanamicina (50 microgml) Al tubo
de control positivo se agregoacute un plaacutesmido resistente a la kanamicina y eacutesta fue
sometida a electroporacioacuten y sembrada en una placa con LB con kanamicina En
la muestra se agregoacute alguno de los siguientes plaacutesmidos pET30a(+) pETNL o
pSmbP-LnqQ y posteriormente fue sometido a electroporacioacuten y sembrado en una
placa de LB con kanamicina
El volumen total de los tubos fue transferido a una celda de electroporacioacuten en el
espacio de 2 mm El equipo de electroporacioacuten (previamente irradiado con luz UV
por 15 min) fue encendido y configurado para electroporar a 2500 V
Posteriormente se agregoacute 1 ml de caldo LB esteacuteril a la celda de electroporacioacuten y
cuidadosamente mezclado (para evitar estresar a la ceacutelula) La mezcla es tomada
con mucho cuidado desde la celda y transferido a un tubo de 15 ml esteacuteril El tubo
fue incubado a 37degC por 1 h en agitacioacuten muy baja Cumplido el tiempo
establecido el tubo fue centrifugado a 9000 rpm durante 2 min Se retiroacute la mayor
parte del sobrenadante (asymp 950 ml) y el restante fue mezclado suavemente con el
precipitado celular hasta suspender la solucioacuten El volumen total resuspendido fue
sembrado en placas de LB agar o LB agar suplementado con kanamicina (50
microgml) dependiendo el caso Las placas fueron incubadas a 37degC en condiciones
de aerobiosis durante 16 h Al terminar las placas fueron revisadas y
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 41
seleccionadas Las ceacutelulas efectivamente transformadas con los plaacutesmidos fueron
resistentes a la accioacuten de la kanamicina mientras que las no transformadas fueron
eliminadas Las ceacutelulas transformadas fueron validadas posteriormente por
teacutecnicas moleculares como extraccioacuten de DNA plasmiacutedico yo identificacioacuten por
producto de PCR punto final
4172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Para la extraccioacuten y purificacioacuten utilizamos el Isolate II Plasmid Mini Kit de
Meridian Biosciencereg (Estados Unidos Cat BIO-52056) Se preparoacute un cultivo
overnight de E coli en un tubo 5 ml de caldo LB esteacuteril y se incuboacute por 37degC en
agitacioacuten constante por no maacutes ni menos de 16 h Al diacutea siguiente previo al
ensayo de extraccioacuten se precalentoacute la solucioacuten de buffer de lavado PW1 a 50degC y
la temperatura se mantuvo a esta temperatura hasta su uso Se verificoacute que el
buffer de lavado PW2 estuviera suplementado con etanol
El cultivo overnight fue centrifugado a 11000 x g por 30 minutos El volumen se
retiroacute y se mantuvo el precipitado celular al cual se agregoacute 250 microl del buffer de
resuspensioacuten P1 y el precipitado se resuspendioacute por completo por voacutertex Es
importante que no quede masa celular adherida en los tubos Posteriormente se
agregaron 250 microl de buffer de lisis P2 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas
6 a 8 veces El tubo fue incubado a temperatura ambiente por 5 min o hasta que el
lisado celular se tornara claro Cumplido el tiempo anterior se adicionaron 300 microl
de buffer de neutralizacioacuten P3 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas 6 a 8
veces Este procedimiento fue para evitar el rompimiento del DNA genoacutemico Los
tubos fueron centrifugados a 11000 x g durante 5 min a temperatura ambiente
Este paso fue repetido hasta que el sobrenadante quedara lo maacutes claro posible
Posteriormente se tomoacute una columna tipo spin y sobre eacutesta se agregoacute un tubo
colector y sobre eacutesta se antildeadioacute el volumen recuperado del paso anterior El tubo
con el volumen fue centrifugado a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Sobre el tubo colector se
agregoacute 500 microl de buffer de lavado PW1 precalentado y se centrifugoacute a 11000 x g
por 5 min a temperatura ambiente El sobrenadante del tubo fue eliminado por
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 42
decantacioacuten Se adicionoacute 600 microl de buffer de lavado PW2 (suplementado con
etanol) y se centrifugoacute a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Centrifugar de nuevo el tubo
colector a 11000 x g por 2 min a temperatura ambiente para remover etanol
residual
Debajo del tubo colector se colocoacute un tubo de 15 ml esteacuteril y se agregoacute 50 microl de
buffer de elucioacuten P directamente sobre la membrana de siacutelice Se incuboacute a
temperatura ambiente y se centrifugoacute a 11000 x g por 2 min a temperatura
ambiente Del tubo con DNA purificado se tomaron 2 microl y se analizaron por nano-
espectrofotometriacutea para el caacutelculo de concentracioacuten y de pureza del DNA
plasmiacutedico
4173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Para comprobar que las ceacutelulas de E coli fueran efectivamente transformadas con
el vector de expresioacuten pET30a(+) pETNL y pSmbP-LnqQ se realizoacute un
experimento de PCR punto final para identificar al plaacutesmido recuperado de las
ceacutelulas de E coli Para ello nos enfocamos en primer lugar a elegir un par de
oligonucleoacutetidos que cumplieran de identificar los vectores de expresioacuten
El par de oligonucleoacutetidos elegidos para el anaacutelisis de las construcciones
corresponden al T7 promoter primer (5rsquo- TAATACGACTCACTATAGGG-3rsquo) y al T7
terminal primer (5rsquo- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3rsquo) los cuales son oligonucleoacutetidos
especiacuteficos para vectores construidos basados en pET30a(+) La secuencia de
ambos oligonucleoacutetidos fue recuperada de una compilacioacuten de AddGene para
ldquoSequencing Primersrdquo (httpswwwaddgeneorgmol-bio-referencesequencing-
primers)
Para determinar la temperatura de fusioacuten oacuteptima del par de oligonucleoacutetidos
utilizamos dos herramientas bioinformaacuteticas en liacutenea La primera aplicacioacuten fue
OligoAnalyzertrade (httpswwwidtdnacomcalcanalyzer) de la compantildeiacutea Integrated
DNA Technologies Inc (Estados Unidos) donde se ajustaron paraacutemetros como la
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 43
concentracioacuten de oligonucleoacutetido las concentraciones de iones monovalentes
(Na+) y divalentes (Mg2+) asiacute como la concentracioacuten de nucleoacutetidos (dNTPs) en la
reaccioacuten para el caacutelculo de formacioacuten de hairpin homodiacutemeros y heterodiacutemeros
La otra aplicacioacuten es Net Primer (httpswwwpremierbiosoftcomnetprimer) de
Premier Biosoft que tambieacuten contiene puntos como la aplicacioacuten anteriormente
mencionada pero contiene opciones como el caacutelculo de rating de eacutexito y
estabilidad en el extremo 3rsquo-terminal
Para realizacioacuten del ensayo de PCR punto final utilizamos el High-Stability PCR
kit (Cat No L00342 Manual No 0285 Versioacuten 08272013) de GenScript Inc
(Estados Unidos) De esta manera ajustamos las condiciones de reaccioacuten de PCR
seguacuten lo determinado por el fabricante para por la DNA polimerasa Green Taq La
reaccioacuten de PCR punto final se ajustoacute a una concentracioacuten de oligonucleoacutetidos de
trabajo para 10 microM concentracioacuten de monovalentes (Na+K+) a 500 mM
concentracioacuten de divalentes (Mg2+) a 15 mM y concentracioacuten de dNTPs a 05 mM
El protocolo general para ensayo de PCR punto final de acuerdo con el fabricante
consistioacute en que por cada 50 microl de volumen de reaccioacuten se agregariacutean 5 microl de 10
X de Reaction Buffer 10 microl de 10 mM de dNTPs 10 microl por el oligonucleoacutetido 5rsquo-
terminal a 20 microM 10 microl por el oligonucleoacutetido 3rsquo-terminal a 20 microM 20 microl de
plaacutesmido (de al menos 100 ngmicrol) 395 microl de agua ultrapura esteacuteril y 05 microl de la
DNA polimerasa Green Taq
4174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Las muestras obtenidas fueron procesadas en un gel de agarosa (1 pv)
adicionada con Eco-Stain ready to use (Cat No DT81413) de BioBasic Inc
(Canadaacute) el cual es una sustancia que tiene un pico de excitacioacuten a λ = 490 nm y
dos picos de emisioacuten λ = 520 nm y λ = 635 nm y esta solucioacuten se agrega al gel en
una relacioacuten de 1 microl por 20 ml de solucioacuten de agarosa Las muestras fueron
corridas durante 1 h a 100 V en caacutemara para electroforesis Al terminar el tiempo
establecido el gel fue retirado e iluminado con luz UV en el transiluminador y se
tomoacute una fotografiacutea como evidencia Todos los geles fueron elaborados con su
respectivos controles positivos negativos y muestras
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 44
418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
4181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Brevemente cultivos con diferentes cepas de E coli transformados con
pET30a(+) pETNL o pSmbP-LnqQ fueron inducidos con IPTG Se realizoacute un
cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado en un matraz con 25 ml de
caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50 microgml) a 37degC en agitacioacuten
constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se registroacute el valor de OD600 del
cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo preinoacuteculo en un matraz
esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina hasta llegar a un valor
inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado a 37degC en agitacioacuten constante
hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de OD600 asymp 04
Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue inoculado con
IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos diferentes
temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue distribuido en
tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten Todos los tubos
usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los tubos fueron
propiamente etiquetados
4182 Extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pETNL
Los cultivos de E coli transformados ya fuera con pET30a(+) pETNL o pSmbP-
LnqQ fueron inducidos por IPTG para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
Brevemente se realizoacute un cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado
en un matraz con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50
microgml) a 37degC en agitacioacuten constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se
registroacute el valor de OD600 del cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo
preinoacuteculo en un matraz esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con
kanamicina hasta llegar a un valor inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado
a 37degC en agitacioacuten constante hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de
OD600 asymp 04 Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue
inoculado con IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 45
diferentes temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue
distribuido en tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten
Todos los tubos usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los
tubos fueron propiamente etiquetados
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten periplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Santos y sus colaboradores (BD Santos et al 2019) que es un
procedimiento en un ensayo de lisozima con choque osmoacutetico Se descongeloacute los
tubos a baja temperatura y posteriormente fueron centrifugados a 8000 times g
durante 15 min a 4degC El sobrenadante de cada tubo fue eliminado y lavado dos
veces con buffer PBS 1X pH 74 (Gibco) friacuteo (8000 times g durante 10 min a 4degC) En
el uacuteltimo lavado los tubos con precipitado celular fueron pesados y sus pesos se
registraron Por uacuteltimo se calculoacute la diferencia entre los tubos con precipitado
celular contra los tubos cuando estaban vaciacuteos A cada uno de los tubos con
precipitado celular se le agregoacute solucioacuten hipertoacutenica friacuteo (sacarosa 20 trizma 20
mM EDTA 2 mM y lisozima 20 mgml pH 80) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten
hipertoacutenica por cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido
de cada tubo fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el
tiempo el cultivo fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC
El sobrenadante fue recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten
periplaacutesmica hipertoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El
precipitado celular es reservado Una vez retirada la fraccioacuten anterior los tubos
con precipitado celular remanentes fueron pesados de nuevo y se agregoacute solucioacuten
hipotoacutenica (agua ultrapura esteacuteril) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten hipotoacutenica por
cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido de cada tubo
fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el tiempo el cultivo
fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC El sobrenadante fue
recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten periplaacutesmica
hipotoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El precipitado celular se
eliminado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 46
4183 Extraccioacuten de proteiacutenas citoplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pSmbP-LnqQ
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten citoplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Vargas y sus colaboradores (Vargas-Cortez et al 2016) junto con
recomendaciones de Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) que es un
procedimiento basado en perlas de vidrio
Se descongelaron los tubos a baja temperatura y posteriormente centrifugados a
8000 times g durante 15 min a 4degC El precipitado celular de los tubos fueron
resuspendidos en buffer de lisis friacuteo (Tris-HCl 50 mM NaCl 500 mM pH 80) y se
agregaron 150 mg de perlas de vidrio limpios de 01 mm Los precipitados
celulares resuspendidos en perlas fueron mezclados por voacutertex durante 1 min Los
tubos fueron centrifugados a maacutexima velocidad por 15 min a 4degC El sobrenadante
fue recuperado con cuidado de cada tubo y fue etiquetado como ldquoFraccioacuten
citoplaacutesmicardquo
4184 Obtencioacuten de fracciones solubles e insolubles para SDS-PAGE
Para obtener las fracciones solubles e insolubles seguimos el protocolo de Santos
(Byran Santos 2017) Para la fraccioacuten soluble a partir del sedimento celular eacutesta
es resuspendida en 120 microl de agua ultrapura esteacuteril y despueacutes se le agregan 40 microl
de solucioacuten amortiguadora de carga SDS-PAGE 4X suplementado con β-
mercaptoetanol para una concentracioacuten final al 1X La solucioacuten fue hervida durante
10 min y posteriormente centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante
fue separado y guardado como ldquoFraccioacuten solublerdquo Luego al sedimento restante
se le agregaron 120 microl de solucioacuten de urea 8 M y se hierve de nuevo durante otros
10 min para solubilizacioacuten de los cuerpos de inclusioacuten Finalmente la solucioacuten fue
centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante fue separado y guardado
como ldquoFraccioacuten insolublerdquo Ambas fracciones fueron visualizadas posteriormente
en los geles de SDS-PAGE
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 47
4185 Preparacioacuten de gel de SDS-PAGE 16
Los geles de SDS-PAGE fueron preparados bajo las siguientes condiciones se
prepararon dos geles en dos tubos nuevos e independientes conocidos como
lower y upper con suficiente capacidad para almacenar el volumen de cada gel
Primero se preparoacute el lower gel y solo hasta haber terminado ese gel se procedioacute
a preparar el upper gel
Para preparar el lower gel a 16 preparamos una reaccioacuten considerando un
volumen de 10 ml Para ello mezclamos 350 ml de agua destilada 400 ml de
solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) 250 ml de lower buffer (para 25 ml Tris
1515 g SDS 01 g pH 68) 200 microl de APS 10 (pv) y TEMED 20 microl Para el
upper gel a 4 estaacute reaccioacuten fue montada con un volumen de 5 ml Para ello
mezclamos 325 ml de agua destilada 050 ml de solucioacuten de BisAcrilamida 40
(291) 125 ml de upper buffer (para 25 ml Tris 454 g SDS 01 g pH 88) 100 microl
de APS 10 (pv) y 20 microl de TEMED
Tanto la solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) del upper buffer y el lower buffer
fueron retirados del refrigerador y atemperados a temperatura ambiente cuando
menos unos 15 min antes de uso La solucioacuten de APS a una relacioacuten de 01 g por
1 ml (10 pv) debioacute prepararse al momento con agua destilada limpia Toda la
cristaleriacutea usada para preparar el gel de poliacrilamida debioacute ser lavada con agua
destilada limpia y secarse con suficiencia evitando rayar los vidrios
Una vez agregado el TEMED a la mezcla la solucioacuten fue inmediatamente vertido
sobre placas de vidrio Fue necesario esperar entre 20 a 30 minutos para que
completar el proceso de polimerizacioacuten En el lower gel se agregaron 200 microl de
isobutanol para el upper gel en la parte superior se agregoacute un molde para
pocillos Terminado el tiempo de polimerizacioacuten se agregaron las muestras de
proteiacutenas en los pocillos del gel de SDS-PAGE Los geles fueron puestos sobre
una caacutemara de electroforesis vertical y sumergidos en un buffer de corrida a 1X
(para 1000 ml Tris 3 g Glicina 144 g y SDS 1 g) El gel fue corrido a 150 V
durante 1 a 15 h dependiendo de la liacutenea de corrida de la solucioacuten
amortiguadora
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 48
4186 Tincioacuten de gel SDS-PAGE
Previo a tentildeir los geles se prepararon dos soluciones Para la solucioacuten de tincioacuten
se pesaron cuidadosamente y con guantes 50 mg de Coomasie Blue R-250 en un
tubo plaacutestico limpio para un volumen de 50 ml Despueacutes se agregaron 25 ml de
metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta
50 ml con agua destilada limpia Mantener a temperatura ambiente y en
condiciones de obscuridad hasta su uso Mientras que para la solucioacuten de
destincioacuten se midieron 75 ml de metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico
absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta 50 ml con agua destilada limpia
Mantener a temperatura ambiente hasta su uso
Cuando terminado el paso de corrida por electroforesis los geles fueron
cuidadosamente separados de los vidrios El gel fue tentildeido con la solucioacuten de
tincioacuten durante toda la noche en agitacioacuten constante a temperatura ambiente y
posteriormente fue destentildeido con la solucioacuten de destincioacuten durante el resto del diacutea
siguiente bajo las mismas condiciones previas El gel fue puesto sobre un fondo
blanco y se fotografioacute como evidencia
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en
los geles
La presente seccioacuten fue desarrollada posterior a la conclusioacuten de la fase
experimental con el objetivo de explicar la ausencia de bandas tanto de N-
AmyELnqQ como de SmbP-LnqQ en los geles de SDS-PAGE Para abordar el
problema exploramos las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas por el
anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle un anaacutelisis de perfil
aminoaciacutedico y finalmente a traveacutes de diferencias por su origen evolutivo
Las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas como el tamantildeo de proteiacutenas
peso molecular punto isoeleacutectrico nuacutemero total de residuos con carga positiva y
negativa iacutendice alifaacutetico (AI) e iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) fueron calculadas
a traveacutes de ProtParam de ExPasy (httpswebexpasyorgprotparamprotparam-
dochtml) (Gasteiger et al 2005) El iacutendice alifaacutetico (AI) estaacute principalmente
afectado por los cuatro aminoaacutecidos con cadena lateral alifaacutetico alanina valina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 49
leucina e isoleucina El incremento del AI es directamente proporcional a la
termoestabilidad en proteiacutenas globulares (Atsushi 1980) El iacutendice de
hidrofobicidad (GRAVY) es el resultado del promedio que representa la suma total
de los valores de hidropatiacutea de cada uno de los residuos dentro de una cadena
lineal de aminoaacutecidos dividido por el tamantildeo del peacuteptidoproteiacutena Una proteiacutena
con valor GRAVY negativo una proteiacutena hidrofiacutelica mientras que una proteiacutena con
valor GRAVY positivo es hidrofoacutebica (Kyte amp Doolittle 1982)
El anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle fue elaborado a
partir de ProtScale de ExPasy (httpswebexpasyorgprotscale) (Gasteiger et al
2005) Esta herramienta permite elaborar un perfil producido por cualquier escala
aminoaciacutedica a partir de una secuencia aminoaciacutedica Existen 57 escalas de
hidrofobicidad yo hidrofilicidad para fines de nuestro experimento utilizamos la
opcioacuten ldquoHphob Kyte amp Doolittlerdquo
El mapa de calor representa el porcentaje de aminoaacutecidos dada en una secuencia
lineal de aminoaacutecidos con el fin de elaborar un perfil aminoaciacutedico entre los
diferentes peacuteptidos antimicrobianos que fueron efectivamente sobreproducidos por
SmbP La graacutefica fue elaborada a traveacutes de Excel con datos descargados desde la
aplicacioacuten ProtParam de ExPasy
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 50
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS
Las actividades del proyecto fueron realizadas en los Laboratorios de Biologiacutea y de
Sistemas del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea y el
Laboratorio de Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas ubicado en la Divisioacuten de
Estudios de Posgrado ambas infraestructuras pertenecientes a la Facultad de
Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
A continuacioacuten se presenta un listado completo de los materiales y equipos
utilizado
51 Materiales y reactivos
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Microtubos de 15 ml 15 ml y 50 ml Distintas marcas No especificado
Cajas Petri de plaacutestico o vidrio Distintas marcas No especificado
Matraces tipo Erlenmeyer Distintas marcas No especificado
Celdas para espectrofotoacutemetro No especificado No especificado
Celdas de electroporacioacuten No especificado No especificado
Micropipetas (varios voluacutemenes) Distintas marcas No especificado
Medio de cultivo LB Difco 244620
Agar bacterioloacutegico MCD-LAB 9011
Agua grado Biologiacutea Molecular Invitrogen 10977-015
Kanamicina sulfato AG Scientific K-1022
Ampicilina soacutedica Sigma Aldrich A0166
Perlas de vidrio 01 mm Biospec 11079101
IPTG Bioline BIO-37036
LDS Sample Buffer 4X GenScript M00676-10
SDS IBI Scientific IB07062
Persulfato de Amonio (APS) BioBasic AB0072
TEMED Merck 110732
Glicina BioBasic GB0235
Bis-Acrilamida 40 (29109) Merck 100641
Coomasie Briliant Blue BioBasic CB0038
2-mercaptoetanol BioBasic MB0338
Isopropanol 100 DEQ No especificado
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Aacutecido fosfoacuterico 85 Jalmek A1825-13
Hidroacutexido de sodio DEQ No especificado
Aacutecido clorhiacutedrico DEQ No especificado
Alcohol metiacutelico DEQ No especificado
Aacutecido aceacutetico glacial Jalmek A0925-13
Etanol anhidro Jalmek E5325-18
Urea BioBasic UB0148
Buffer de fosfatos salinos 1X (PBS) Gibco 10010-023
Cloruro de sodio Jalmek S2325-05
Tris BioBasic TB0196
Glicerol DEQ No especificado
Guantes de nitrilo Ambiderm No especificado
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S657-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 7 J T Baker S656-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S655-02
QuickClean II Plasmid Miniprep kit GenScript L00420-100
QuickClean II Gel Extraction Kit GenScript L00418-100
QuickClean II PCR Purification Kit GenScript L00419-50
52 Equipos de laboratorio
USO PERSONAL
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Computadora personal Acer Aspire A515-51
LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA Y DE SISTEMAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Incubadora estaacutetica Lab Companion IB-11E
Incubadora de piso con agitacioacuten Lab Companion IS-971
Incubadora de agitacioacuten (microtubos) Eppendorf ThermoMixer C
Horno de secado Shel Lab SGO 6E
Horno de microondas Everstar P90D23AL-XF
Concentrador Thermo Fisher SpeedVac SPD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 52
Bantildeo de ultrasonido VMR Symphony 97043-996
Contador de colonias Reichert 3327
Agitador orbital Labnet Orbit 1000
Agitador vertical Thermo Scientific Compact Digital Rocket
Termociclador miniPCR Mini8
Termociclador Techne 3Prime
Refrigerador de puertas deslizantes Thermo Scientific MH45PA-GAEE-TS GPR Series
Refrigerador a dos puertas Norlake Scientific LRF 201WW
Congelador de -20 degC MetalFrio Solutions
No especificado
Espectrofotoacutemetro UV-Vis Optizen 2120 UV Plus
Nanoespectrofotoacutemetro BioSpec Shimadzu
Gabinete bioseguridad clase II Labconco Delta Series
Centriacutefuga para microtubos Ohaus Frontier 5515
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
Voacutertex Scientific Industries
Genie 2
Plancha de calentamiento con agitacioacuten magneacutetica
Lab Companion HP-3000L
Microscopio oacuteptico Fisher Scientific Micromaster
Autoclave Lab Companion ST-G Series
Caacutemara profesional Canon EOS M10
Transiluminador Maestro No especificado
Balanza analiacutetica AND GR-200
Balanza semianaliacutetica Ohaus Traveler
Electroporador Eppendorf Eppendorf
Fuente de Poder BioRad PowerPac Basic
Potencioacutemetro Ohaus Starter 5000
LABORATORIO DE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Cromatoacutegrafo GE Life Sciences Aumlktaprime Plus
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 53
53 Lugares de experimentacioacuten
Nuestro proyecto fue elaborado entre Febrero de 2018 a Mayo de 2021 y fue
mayoritariamente realizado en las instalaciones del Laboratorio de Biologiacutea
Sinteacutetica y de Sistemas (LBSS) a cargo del Dr Heacutector Javier Ameacutezquita Garciacutea
encontraacutendose en el interior del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y
Nanotecnologiacutea (CIBYN) dependencia de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
(FCQ) de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten El centro estaacute ubicado en la
autopista al Aeropuerto ldquoMariano Escobedordquo Km 10 Parque de Investigacioacuten e
Innovacioacuten Tecnoloacutegica (PIIT) CP 66628 en Apodaca Nuevo Leoacuten Meacutexico
En menor proporcioacuten nuestro trabajo tambieacuten fue realizado en el Laboratorio de
Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas (PEP) a cargo del Dr Xristo Zaacuterate
Kalfoacutepulos Esta unidad estaacute localizada en el interior de la Divisioacuten de Estudios de
Posgrado (DEP) de Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la Universidad
Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) La ubicacioacuten de la divisioacuten estaacute en la calle
Vicente Guerrero sn Col Trevintildeo CP 64570 en Monterrey Nuevo Leoacuten
Meacutexico
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos
Declaracioacuten de manejo y disposicioacuten de residuos
Todos residuos generados durante la realizacioacuten del proyecto de investigacioacuten
fueron gestionados de acuerdo con las caracteriacutesticas de estos siguiendo los
lineamientos establecidos por el Departamento de Medio Ambiente y Seguridad de
la Facultad de Ciencias Quiacutemicas utilizando los recipientes proporcionados por
este departamento en base a la Norma PR-CLB-SRR-000
Los residuos bioloacutegico-quiacutemicos fueron dispuestos en los contenedores
correspondientes en el interior de los laboratorios
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 54
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
En esta seccioacuten nos centramos en el disentildeo in silico de ceacutelulas de E coli
configuradas para detectar moleacuteculas de AIP producidos por el sistema nativo de
QS de ceacutelulas de MRSA De acuerdo con nuestro disentildeo (Figura 2) las ceacutelulas α
corresponden a ceacutelulas de S aureus productoras de moleacuteculas AIP mientras que
las ceacutelulas β corresponden a ceacutelulas de E coli que han sido modificadas con un
par de moacutedulos geneacuteticos biosensor y bacteriocina que le permiten detectar
moleacuteculas de AIP y en respuesta destruyen ceacutelulas de S aureus en el medio A
manera de resumen las ceacutelulas de E coli modificadas producen y excretan LnqQ
en funcioacuten de la concentracioacuten externa de moleacuteculas de AIP
Nuestra determinacioacuten por elegir bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
para nuestro sistema biosensor se explica en la siguiente numeracioacuten en primer
lugar consideramos que debido a su origen proteico son susceptibles a
modificaciones geneacuteticas (Cotter et al 2013)
Figura 2 Sistema QS para deteccioacuten y eliminacioacuten de S aureus
El moacutedulo biosensor conformado por agrC y agrA (azul marino y azul celeste respectivamente) estaacute regulado
por el promotor constitutivo J23110 La deteccioacuten del AIP-II (pentaacutegonos naranja) estaacute regulado por AgrC la
cual activa la fosforilacioacuten (ciacuterculos amarillo) de AgrA y activa la expresioacuten del moacutedulo bacteriocina a traveacutes
de la lnqQ lnqBCEDF y gfp (rojo amarillo y verde respectivamente) regulado por el promotor P2 LnqQ
destruye ceacutelulas de S aureus
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 55
62 Cepas bacterianas
La razoacuten de escoger a E coli como chasis bioloacutegico de produccioacuten es porque ya
ha sido reportado previamente como biosensor de ceacutelulas enteras basados en
deteccioacuten del QS (Sedlmayer Hell Muumlller Auslaumlnder amp Fussenegger 2018) y
ademaacutes porque es el organismo de produccioacuten heteroacuteloga maacutes usado en el campo
de las bacteriocinas (Mesa-Pereira et al 2018) Nuestro modelo estaacute disentildeado
para ser aplicado en E coli BL21 (DE3) ya que ha sido efectivamente reportado
para producir y secretar bacteriocinas de las clases IIa y IId eacuteste uacuteltimo es
importante ya que esta es la clase a la que pertenece la bacteriocina LnqQ (Mesa-
Pereira et al 2017)
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
Para determinar el comportamiento in silico de nuestra ceacutelula de E coli fue
necesario disentildear un vector de expresioacuten con dos moacutedulos geneacuteticos y eacutestos
fueron referidos como moacutedulo biosensor y moacutedulo de bacteriocina
respectivamente Ambos moacutedulos fueron disentildeados de la siguiente manera
promotor-RBS-gene(s) estructural(es)-doble terminador (Figura 3)
Figura 3 Moacutedulos biosensor y de bacteriocina
El moacutedulo biosensor es configurado con agrC y agrA y estaacuten regulados transcripcionalmente por el promotor
J23110 (A) El moacutedulo de bacteriocina estaacute armado con los genes lnqQ y gfp y estaacuten regulados
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 56
transcripcionalmente por el promotor P2 (B) Por uacuteltimo se muestra el disentildeo del sistema detectar y destruir
con los promotores divergentes J23110 y P2 (C)
En primera instancia se debioacute localizar el locus geneacutetico del promotor P2 de
nuestra MRSA fue manualmente localizado puesto que no existiacutea informacioacuten
relacionada al mismo De acuerdo con Shao y otros el locus de un promotor se
encuentra evolutivamente conservado entre especies que estaacuten relacionadas
(Shao Price Deutschbauer Romine amp Arkin 2014) De esta manera utilizamos
la anterior premisa para localizar el promotor P2 en un primer enfoque
localizamos la secuencia nucleotiacutedica del agrB en el archivo genoacutemico de la
MRSA (564 nucleoacutetidos KEGG no SA1842) como referencia ya que se conoce
que este gen es conocido que eacutesta es la primera unidad transcripcional ubicada riacuteo
abajo del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Para el segundo
enfoque usamos la informacioacuten disponible del promotor P2 de S aureus NCTC
8325 (Rajasree Fasim amp Gopal 2016 Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) una
cepa catalogada como estaacutendar para estudios bioinformaacuteticos (S Fuchs et al
2017 Herbert et al 2010) Al combinar lo mejor de ambos enfoques logramos
localizar la composicioacuten nucleotiacutedica del promotor P2 y su tamantildeo a traveacutes de la
identificacioacuten de los dominios
A continuacioacuten explicamos el principio del disentildeo de ambos moacutedulos En primer
lugar el moacutedulo designado como biosensor los genes agrC y agrA son
constitutivamente expresados por accioacuten del promotor J23110 Brevemente se
describe el principio del disentildeo donde inicialmente el AgrC anclado a membrana
de E coli detecta la presencia de moleacuteculas de AIP externas (Marchand amp Collins
2013) De esta manera AgrC sufre de un cambio conformacional y fosforila al
factor de transcripcioacuten AgrA Despueacutes el AgrA fosforilado (AgrA) actuacutea como
factor de transcripcioacuten del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Una
vez que AgrA-P se ha acoplado al promotor P2 el moacutedulo de bacteriocina es
expresado incluyendo los genes tipo estructural (lnqQ) excrecioacuten y
autoinmunidad (lnqBCEDF) del operoacuten lnq asiacute como del gen reportero gfp
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 57
Algunos autores han demostrado que mantener intacto el operoacuten nativo de una
bacteriocina cualesquiera (es decir que contenga los elementos geneacuteticos de su
estructura para su secrecioacuten y para autoinmunidad) en E coli eacutesta ceacutelula
modificada es capaz de excretar bacteriocinas Gram positivos al medio
extracelular (Mesa-Pereira et al 2017)
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
Los moacutedulos geneacuteticos fueron disentildeados para operar en el mismo sentido que el
ensamble por tipo BioBrick al yuxtaponer las propiedades del BioBrick (RFC 10) y
el BglBrick (RFC 21) La intencioacuten del disentildeo es que nuestros moacutedulos geneacuteticos
sean faacutecilmente ensamblados o removidos por teacutecnicas como In-Fusion (Sleight
Bartley Lieviant amp Sauro 2010) o ensamblado por clonacioacuten in vivo (Garciacutea-
Nafriacutea Watson amp Greger 2016) dado que los sitios de restriccioacuten actuacutean como
sitios homoacutelogos para la clonacioacuten
Cada moacutedulo estaacute flanqueado por sitios de restriccioacuten para que puedan ser
intercambiados de ser necesario El moacutedulo de promotores estaacute flanqueado por
los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI manteniendo a EcoRI como unidad neutral
para cuando sean necesario el intercambio de piezas Los elementos del moacutedulo
biosensor estaacuten flanqueados por los sitios BglII y BamHI y los elementos del
moacutedulo de bacteriocinas estaacuten rodeados por los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI
(Figura 4)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 58
Figura 4 Estrategia de construccioacuten in silico
El moacutedulo biosensor (seccioacuten A) estaacute constituido por el BglBrick RFC21 mientras que el moacutedulo bacteriocina
(seccioacuten C) estaacute representado por el BioBrick RFC10 La seccioacuten de promotores (seccioacuten B) fue colocado en
caso de que los promotores fueran cambiados Cada bloque contiene una regioacuten prefija y otra sufija y cada
bloque estaacute flanqueado en ambas direcciones por terminadores dobles de transcripcioacuten (BBa_B0015 ciacuterculos
rojos) La seccioacuten B estaacute bordeada por los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI (G-X) con la regioacuten EcoRI como
neutral La seccioacuten A EcoRI y BglII (E-G) estaacuten anclados como prefijos mientras que BamHI y XhoI (B-X)
estaacuten puestos como sufijos Los sitios de restriccioacuten BglII y BamHI fueron usados para construir el promotor
constitutivo J23110 en conjunto a su parte estructural (RBS-gen) para el moacutedulo de biosensor Por otro lado
para la seccioacuten C el prefijo estaacute compuesto por los sitios EcoRI-XbaI (E-X) y los sitios SpeI-PstI (S-P) son
colocados como prefijos Los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI fueron usados para construir el promotor
inducible P2 y en conjunto a su parte estructural (RBS-gene) para el moacutedulo de bacteriocina
El plaacutesmido pSB1A3 (AddGene no 116850) (Dupin amp Simmel 2019) sirvioacute como
plantilla para la construccioacuten de los moacutedulos geneacuteticos Las secciones prefijo y
sufijo fueron manualmente remplazados por cualquiera de los moacutedulos disentildeados
El replicoacuten y los genes de resistencia a antibioacutetico del plaacutesmido fueron retenidos
pero el terminador de transcripcioacuten fue remplazado por terminadores dobles
Finalmente un par de plaacutesmidos fueron construidos y cada uno contiene
individualmente del moacutedulo de biosensor o de bacteriocina respectivamente
Finalmente ambos plaacutesmidos fueron manualmente mezclados para crear un
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 59
plaacutesmido que contiene un par de moacutedulos que estaacuten en direcciones divergentes
Este vector de expresioacuten fue nombrado Dual Biosensor-Killer (Figura 5)
Figura 5 Representacioacuten esquemaacutetica del vector Dual Biosensor-Killer
El moacutedulo biosensor contiene los genes agrC y agrA y estaacute rodeado por los sitios de restriccioacuten EcoRI BglII y
XhoI mientras que el moacutedulo de bacteriocina contiene los genes del cluacutester lnqQBCDEF y el gen reportero gfp
y estaacute flanqueado por los sitios de restriccioacuten EcoRI XbaI SpeI y PstI Este plaacutesmido contiene un marcador
de resistencia a ampicilina y se compone de un total de 8904 pb
Parte de la estrategia de nuestro disentildeo consistioacute en que los promotores J23110 y
P2 fueran colocadas en sentidos opuestos para regular de manera independiente
la actividad de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina respectivamente La razoacuten
de aislar ambos moacutedulos es para evitar la expresioacuten por goteo que pudiera existir
por efecto de la fuerza de alguno de los promotores al mantenerse en la misma
direccioacuten transcripcional (Lubkowicz et al 2018) Todos los archivos generados
para la elaboracioacuten del vector de expresioacuten Dual Biosensor-Killer fueron
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 60
elaborados por SnapGene y estaacuten disponibles en los archivos anexos de esta
misma tesis
65 Optimizacioacuten de los codones nativos
De acuerdo con las observaciones (Tabla 1) todas las secuencias fueron
optimizadas para ser expresadas en E coli cepa tipo B Noacutetese que los sitios de
restriccioacuten tiacutepicos y los codones de paro de todas las secuencias utilizadas fueron
removidos El iacutendice CAI antes de la optimizacioacuten en AgrC AgrA LnqQ LnqB
LnqC LnqE LnqD y LnqQ era de 0407 0402 0532 0525 0518 0511 0503
and 0521 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores cambiaron a
0770 0766 0675 0735 0771 0773 0777 y 0747 respectivamente El valor
CAI para la GFP no pudo ser determinado por la aplicacioacuten antes de la
optimizacioacuten pero siacute despueacutes de la optimizacioacuten el cual correspondioacute a 0759 En
relacioacuten con el contenido de GC los valores antes de la optimizacioacuten fueron
282 272 333 225 231 305 y 245 respectivamente Despueacutes de
la optimizacioacuten los datos fueron 433 446 469 400 421 410
431 424 y 424 respectivamente El contenido GC para GFP despueacutes de
la optimizacioacuten fue de 491
Nuestros resultados el promedio del valor CAI y el promedio de contenido GC de
todas las secuencias aminoaciacutedicas antes de ser optimizadas era de 049 plusmn 005 y
2690 plusmn 371 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores
promedio fueron 075 plusmn 003 y 4361 plusmn 287 respectivamente Seguacuten las
especificaciones de la aplicacioacuten si el valor CAI es maacutes cercano a 1 eacuteste indica
que la secuencia de nucleoacutetidos utiliza los codones maacutes utilizados por el
organismo productor heteroacutelogo (Puigbograve et al 2008) Seguacuten los resultados los
valores CAI y el contenido GC de todas las proteiacutenas utilizadas como datos de
entrada fue substancialmente mejorados y estaacute optimizada para ser utilizado en E
coli heteroacuteloga La finalidad de optimizar el contenido nucleotiacutedico de las
secuencias utilizadas para disentildeo a las caracteriacutesticas requeridas del hospedero
es para incrementar el rendimiento de produccioacuten (Puigbograve et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 61
Tabla 1 Uso de codones previo y despueacutes de la optimizacioacuten
Paraacutemetros Previo a la optimizacioacuten Despueacutes de la optimizacioacuten
Gen Tamantildeo (pb) CAI GC CAI GC
agrC 1116 0407 282 0770 433
agrA 717 0402 272 0766 446
lnqQ 162 0532 333 0675 469
lnqB 240 0525 225 0735 400
lnqC 480 0518 231 0771 421
lnqE 1299 0511 259 0773 410
lnqD 678 0503 305 0777 431
lnqF 795 0521 245 0747 424
gfp NA NA NA 0759 491
El iacutendice de adaptacioacuten (CAI) y el contenido de guanidina y citosina (GC) La tabla se divide en dos
secciones previo a la optimizacioacuten y despueacutes de la optimizacioacuten La columna de gen representa el nombre del
dato de entrada y el tamantildeo que indica el total de nucleoacutetidos para cada entrada Los resultados en la tabla
representan la adaptabilidad de las secuencias de entrada usando a E coli como hospedero No fue posible
determinar el uso de codones antes de la optimizacioacuten para el gen gfp debido a que no hay suficiente
informacioacuten al computador el iacutendice CAI con esta tabla de referencia NA = No Aplica
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Es conocido que S aureus posee cuatro grandes variantes de clases de
moleacuteculas de AIP (desde I hasta IV) la cual difiere entre uno a dos residuos en la
seccioacuten madura del AIP (Ji et al 2005 B Wang amp Muir 2016) La diferencia
estructural entre las clases de AIP pueden actuar como inhibidores competitivos
del QS cuando interactuacutean con cepas filogeneacuteticamente relacionadas Este
fenoacutemeno bioloacutegico es conocido como comunicacioacuten cruzada (Everett amp
Rumbaugh 2014)
Para predecir la probabilidad de comunicacioacuten cruzada de nuestro biosensor
descargamos las secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro variantes maacutes
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 62
representativas de AgrD junto la informacioacuten anotada del AgrD de la cepa MRSA
estaacutendar Finalmente realizamos un alineamiento local bajo la herramienta
EMBOSS Water entre cada una de las secuencias aminoaciacutedicas representativas
contra la secuencia aminoaciacutedica de nuestra cepa Los resultados revelan (Tabla
2) que el AgrD de nuestro MRSA tuvo un porcentaje de identidad y de similitud con
el AgrD clase I de 478 y 652 respectivamente Para la clase II los
porcentajes fueron 100 y 100 respectivamente mientras que con la clase III
fueron de 326 y 500 respectivamente Finalmente con la clase IV los
porcentajes fueron de 457 y 609 respectivamente Seguacuten los resultados del
alineamiento podemos inferir que nuestro biosensor es uacutetil para detectar
moleacuteculas de QS producidos por S aureus N315 y por otros S aureus que sean
productores de AIP tipo II Al mismo tiempo nuestro sistema estariacutea limitado a no
detectar S aureus productores de AIP clases I III y IV
Bajo la prediccioacuten anterior nuestro biosensor completo de ceacutelulas estariacutea
capacitado para detectar ceacutelulas de S aureus N315 inclusive cepas de S aureus
USA100 las cuales son productoras naturales de moleacuteculas de AIP clase II
(Grundstad et al 2019) y estaacuten sentildealadas como entre las principales cepas tipo
MRSA que circulan a nivel mundial esta cepa es altamente letal y es una causa
de endocarditis infecciosa en la vaacutelvula nativa del corazoacuten A nivel in vitro se
reporta que es una productora de biopeliacuteculas fuertes (King Kulhankova Stach
Vu amp Salgado-Paboacuten 2016) A pesar de ser una cepa principalmente asociada a
infecciones adquiridas en hospitales (Limbago et al 2009 Tenover et al 2008)
tambieacuten se ha encontrado entre individuos que no han recibido cuidados meacutedicos
previos Noacutetese que esta cepa es resistente a vancomicina (Roberts 2013)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 63
Tabla 2 Prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Clase AIP Alineamiento de proteiacutenas Tamantildeo ID Similitud Gaps Score Ref
I MNTLFNLFFDFITGILKNIGNIAAYSTCDFIMDEVEVPKELTQLHE- 46 478 652 00 1700 1 2
II MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK 47 1000 100 00 24000 1 2
III MKKLLNKVIELLVDFFNSIGYRAAYINCDFLLDEAEVPKELTQLHE- 46 326 500 00 7200 1 2
IV MNTLYKSFFDFITGVLKNIGNVASYSTCYFIMDEVEIPKELTQLHE- 46 457 609 00 10500 2
MRSA MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK - - - - -
El alineamiento de proteiacutenas se realizoacute entre las cuatro clases mayoritarias de AIP contra el MRSA El alineamiento fue realizado en el programa Clustal Omega
mientras que la identificacioacuten (ID) similitud gaps y score fue determinado de la aplicacioacuten EMBOSS Water
1 (B Wang amp Muir 2016)
2 (Ji et al 2005)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 64
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
El anaacutelisis de solubilidad y localizacioacuten subcelular entre todas las secuencias
aminoaciacutedicas utilizadas para construir biosensor de ceacutelulas enteras es necesario
para obtener un alto rendimiento productivo (Ghosh et al 2004) Seguacuten los
resultados obtenidos por la aplicacioacuten Protein-Sol (Tabla 3) para prediccioacuten de
solubilidad eacutestos indican que LnqQ LnqF AgrA y GFP son considerados solubles
mientras que los datos obtenidos para LnqB LnqC y LnqE no pudieron ser
considerados ya que la aplicacioacuten los clasificoacute como proteiacutenas de membrana
Tabla 3 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
Gen Iacutendice Solubilidad
AgrC 0366 Invaacutelido
AgrA 0514 Soluble
LnqQ 0655 Soluble
LnqB 0655 Invaacutelido
LnqC 0644 Invaacutelido
LnqD 0388 Invaacutelido
LnqE 0609 Invaacutelido
LnqF 0607 Soluble
GFP 0592 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice superior de 045 es
porque se consideraron proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
De acuerdo con las predicciones de la aplicacioacuten BUSCA (Tabla 4) la localizacioacuten
subcelular de las proteiacutenas AgrA LnqQ LnqE y GFP es en el citoplasma mientras
que AgrC LnqB LnqC LnqD LnqE y LnqF son producidos en la membrana
plasmaacutetica Los caacutelculos predictivos en las proteiacutenas a sobreproducirse en E coli
concuerda con lo observado en la literatura para los elementos geneacuteticos del
moacutedulo biosensor el AgrC actuariacutea como una proteiacutena transmembranal con
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 65
actividad histidina quinasa mientras que AgrA actuariacutea como factor de
transcripcioacuten que se mueve a traveacutes del citoplasma para anclarse al promotor P2
(Gomes-Fernandes et al 2017) En los elementos del moacutedulo de bacteriocina se
espera que la LnqQ actuacutee como una proteiacutena soluble de bajo peso molecular que
es producido y excretado al medio extracelular (Fujita et al 2007) Para los demaacutes
elementos estructurales de este moacutedulo se sabe que LnqB es una proteiacutena
membranal tipo permeasa mientras que LnqC y LnqD son proteiacutenas con dominios
franqueados en membrana asiacute como LnqE y LnqF son proteiacutenas transportadoras
tipo ABC-2 y ABC respectivamente (Iwatani et al 2012) Por uacuteltimo los valores
de predictivos indican que la GFP seraacute producida como una proteiacutena soluble y
monomeacuterica (Zacharias et al 2002)
Tabla 4 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
Gen Valor Localizacioacuten subcelular
AgrC 075 Membrana plasmaacutetica
AgrA 07 Citoplasma
LnqQ 07 Citoplasma
LnqB 09 Membrana plasmaacutetica
LnqC 083 Membrana plasmaacutetica
LnqD 072 Membrana plasmaacutetica
LnqE 086 Membrana plasmaacutetica
LnqF 07 Citoplasma
GFP 07 Citoplasma
De acuerdo con la aplicacioacuten BUSCA las localizaciones subcelulares disponibles son membrana plasmaacutetica y
citoplasma
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
La determinacioacuten de la alergenicidad es un aspecto deseado durante la
construccioacuten del biosensor de ceacutelulas enteras debido a que nuestro sistema seriacutea
presentado en el futuro como un potencial candidato a agente terapeacuteutico Para
demostrar este punto fue necesario demostrar que la estructura tanto primaria
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 66
como secundaria de la LnqQ presentaba epiacutetopos para ceacutelulas tipo B dado que la
alergenicidad estaacute mediada tanto por ceacutelulas De acuerdo con los resultados de la
secuencia aminoaciacutedica de la LnqQ en su estructura en forma lineal (Tabla 5) se
indica que los potenciales residuos epiacutetopos corresponden a E13 S16-V19 y W21-
D31 Mientras tanto los anaacutelisis realizados por la aplicacioacuten Discotope 20 a la
secuencia aminoaciacutedica en su forma tridimensional indican que no se encontraron
residuos potencialmente epiacutetopos para ceacutelulas B ni se determinaron sitios de
alergenicidad
Tabla 5 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas B en LnqQ
Epiacutetopos EEEEEEEEEEEEEEEE
Secuencia lineal MAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIK
Estructura CCHHHHHHHHHHHHCCHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCC
Superficie EEEBEEBBEBBBEBEEEBBEBBBEEEEEBBEBBEBBBBBEBBBEEBEEEEEEE
La prediccioacuten fue resuelta en la aplicacioacuten BediPrep En la seccioacuten de epiacutetopos si la posicioacuten estaacute arriba de
05 entonces es marcado con una letra ldquoErdquo La aplicacioacuten anexa NetsurfP fue usada para la prediccioacuten
estructural a partir de secuencia lineal y se divide en tres categoriacuteas ldquoHrdquo para heacutelice ldquoErdquo para hoja y ldquoCrdquo para
cadena En la seccioacuten de superficie se divide en dos secciones ldquoBrdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el interior de la proteiacutena (burial) mientras que ldquoErdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el exterior de la proteiacutena (exposed)
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 67
610 Prediccioacuten de alergenicidad
De acuerdo con el reporte realizado por la aplicacioacuten AllerCatPro la bacteriocina
LnqQ no posee elementos alergeacutenicos
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
6111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE fue seleccionado porque se ha demostrado que los
primeros 33 residuos de la α-amilasa (AmyE) de B subtilis pueden ser acoplados
a la regioacuten N-terminal a una proteiacutena de intereacutes para su produccioacuten periplaacutesmica
en ceacutelulas de E coli (R M Papi et al 2005)
En primer lugar descargamos la secuencia nucleotiacutedica de la AmyE desde la base
de datos de GenBank Despueacutes utilizamos los dos oligonucleoacutetidos reportados
por Papi y sus colaboradores (R M Papi et al 2005) que estaacuten modificados con
extremos overhangs Cada oligonucleoacutetido estaacute compuesto por un sitio de
restriccioacuten en su extremo 3rsquo-terminal que corresponden a NdeI y BamHI
respectivamente
En la aplicacioacuten SnapGene el archivo geneacutetico del AmyE fue abierto y sobre eacutesta
se incorporaron los dos oligonucleoacutetidos mencionados arriba despueacutes se corrioacute un
ensayo de PCR in silico para extraer el peacuteptido sentildeal N-AmyE de la amilasa El
producto in silico resultante corresponde a un tamantildeo 117 pb que estaacute ordenado
de la siguiente manera 5rsquo-NdeI-(N-AmyE)-BamHI-3rsquo
En la misma aplicacioacuten realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten con
el producto de PCR in silico y el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)dnardquo Desde la
aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten pET-30a(+) y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten NdeI y BamHI
Posteriormente el producto de PCR compuesto con los extremos overhangs fue
cortado tambieacuten con el mismo conjunto de enzimas de restriccioacuten y procedimos a
clonar creando un vector de expresioacuten El vector fue nombrado y guardado como
ldquopET-30a(+)-N-AmyEdnardquo
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 68
6112 Disentildeo y construccioacuten de pETNL
En el extremo del peacuteptido sentildeal N-AmyE se le acoploacute la secuencia nucleotiacutedica de
la LnqQ por teacutecnicas de clonacioacuten molecular in silico Inicialmente el archivo
geneacutetico del gen lnqQ fue descargado (GenBank no AB2352011) y abierto en la
aplicacioacuten de SnapGene
A la secuencia nucleotiacutedica original de la lnqQ en el extremo 5rsquo-terminal
agregamos manualmente una secuencia que contiene el sitio de restriccioacuten BamHI
y riacuteo debajo de eacutesta agregamos un par de nucleoacutetidos (TT) Inmediatamente
despueacutes se colocoacute un codoacuten de inicio (ATG) y se antildeadieron los 52 residuos
restantes para un total de 53 de aminoaacutecidos que representan a LnqQ Justo en el
extremo C-terminal de esta bacteriocina se agregoacute una cola de polihistidina (H89-
H94) y un codoacuten de paro (TAG) En seguida se agregaron otro par de nucleoacutetidos
(TA) y se integroacute un sitio de restriccioacuten SalI Esta seccioacuten correspondioacute a un
fragmento lineal de 193 pb de la secuencia nucleotiacutedica que codifica para
LnqQ6xHis (Tabla 6)
Desde SnapGene realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten entre el
fragmento lineal de 193 pb con el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)N-AmyEdnardquo
Desde la aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten BamHI y SalI
Posteriormente el fragmento lineal fue cortado tambieacuten con el mismo conjunto de
enzimas de restriccioacuten y procedimos a clonar creando un vector de expresioacuten
nombrado y guardado como ldquopETNLdnardquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pETNL estaacute guardando en formato dna bajo el
nombre ldquopETNLdnardquo En este plaacutesmido se observan por los elementos geneacuteticos
propios de un vector pET30(a)+ en conjunto con los genes necesarios para la
construccioacuten N-AmyELnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 69
Tabla 6 Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ (5rsquorarr3rsquo) Tamantildeo
pETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQL
LAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIKHH
HHHH
94
Los residuos subrayados representan el peacuteptido sentildeal Los residuos en negritas representan a LnqQ
6113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
Los resultados obtenidos del corte proteoliacutetico en el peacuteptido sentildeal N-AmyE fueron
contrastados con los datos de seis secuencias aminoaciacutedicas (Tabla 7) que teniacutean
el reporte de que este mismo peacuteptido sentildeal N-AmyE era cortado de manera
efectiva en cada una de ellas Tres de las secuencias corresponden a las
secuencias aminoaciacutedicas totales de tres α-amilasas reportadas en diferentes
cepas de B subtilis (Emori amp Maruo 1988 Kunst et al 1997 Yang et al 1983)
Dos de eacutestas corresponden a secuencias que se utilizaron para investigar queacute
aminoaacutecidos eran los necesarios para cortar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en ceacutelulas
de B subtilis o de E coli (Nakazawa et al 1986 Sakakibara et al 1993) La
uacuteltima corresponde a una construccioacuten sinteacutetica donde el peacuteptido sentildeal N-AmyE
fue utilizado para transportar liasa de pectina a la regioacuten periplaacutesmica de E coli (R
M Papi et al 2005)
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Tabla 7 Secuencias utilizadas para prediccioacuten de corte enzimaacutetico de N-
AmyELnqQ
Nombre Secuencia aminoaciacutedica
gtYang1983
(CAA234371)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPDDRRLRMEINSQSEKEIQFGKTYTIML
KGTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPAD
TDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtNakazawa1986
(PTUE33)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAQACPPETLVKVKDAEDQL
gtEmori1988
(CAA306431)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIEIRCNTFFQ
gtSakakibara1993
(PTUBE695)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASACAAPFNGTM
gtKunst1997
(NP_3881862)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPETAFKDGDQFTIGKGDPFGKTYTIMLK
GTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPADT
DTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtPapi2005 MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRIRMSYPESKLTGLTGFALAAKVTGGWAGPVVSITNLDQLKANIG
TVTPQVLVINSNISASSLTKVNMGANKTLIGSFQNRTLENIHLRATAQSQNIILQNLIFKHSANIKANDDIQVYLNY
GSKYWIDHCSFVGHSWSTTDGSEDKLLYIGEKADYATISNCFFGSHKYGLIFGHPADDNNAAFNGYPRLTLCHNRFD
NMEVRAPGLMRYGYFHVYNNYINKFHLGFTLAQNANILSESNYFGEGSQNNGMLDDKGSGTFTDTNSVPPITNQKSP
KAQWTATSNYAYTLKTAAQAKDFTQKNAGAQAAALVFGS
gtpETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWV
VSKIKQILGIKHHHHHH
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 71
En las bacterias existen dos mecanismos generales para la secrecioacuten de
proteiacutenas a traveacutes de la membrana citoplasmaacutetica En la viacutea de Secrecioacuten General
denominada como viacutea Sec las proteiacutenas son translocadas a la membrana en su
forma desnaturalizada y posteriormente son plegados en forma nativa en el lado
transversal de la membrana Mientras tanto en la viacutea de Translocacioacuten de
Gemelos Argininas conocida como viacutea Tat las proteiacutenas son translocadas en su
estado plegado nativo (Natale Bruumlser amp Driessen 2008)
De acuerdo con nuestros resultados (Tabla 8) el valor de calculado de prediccioacuten
de corte de peacuteptido sentildeal de las secuencias aminoaciacutedicas completas de tres α-
amilasas representan 09724 (Yang et al 1983) 09458 (Emori amp Maruo 1988) y
09724 (Kunst et al 1997) respectivamente De las secuencias parciales de
peacuteptidos sentildeales N-AmyE los resultados indican 08722 (Nakazawa et al 1986) y
06092 (Sakakibara et al 1993) Para la secuencia que se utilizoacute para exportar la
liasa de pectina al periplasma de E coli el valor calculado correspondioacute a 08262
(R M Papi et al 2005) en todas estas secuencias el mecanismo de secrecioacuten
general de proteiacutenas es el tipo Sec clase I Para nuestra proteiacutena N-AmyELnqQ
el valor calculado estimado fue de 04063 sin que fuera determinado su
mecanismo de corte predictivo Es decir nuestro valor calculado es mucho menor
a lo observado contra secuencias que habiacutean sido probados experimentalmente
Tabla 8 Prediccioacuten de corte enzimaacutetico de peacuteptido sentildeal N-AmyE
Identificacioacuten Prediccioacuten SecSPI TatSPI SecSPII Otro Pos
gtYang1983 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtNakazawa1986 SP(SecSPI) 08722 00359 00229 0069 33 y 34
gtEmori1988 SP(SecSPI) 09458 00122 0009 0033 33 y 34
gtSakakibara1993 SP(SecSPI) 06092 00428 01377 02103 31 y 32
gtKunst1997 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtPapi2005 SP(SecSPI) 08262 00183 00178 01377 31 y 32
gtpETNL Otro 04063 00249 00134 05554 Otro
SecSPI Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal I (Lep) TatSPI Translocoacuten Tat mediado por
Peptidasa de Sentildeal I (Lep) SecSPII Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal II (Lsp) Pos Sitio de
corte enzimaacutetico dentro de la estructura aminoaciacutedica lineal
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612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
6121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo geneacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP estaacute guardado en formato dna
bajo el nombre ldquopET30a-SmbPdnardquo y estaacute flanqueado en el extremo 5rsquo-terminal
por el sitio de restriccioacuten NdeI y en el extremo 3rsquo-terminal por el sitio de restriccioacuten
NcoI El peacuteptido de fusioacuten estaacute dividido en dos secciones en el extremo N-terminal
estaacute compuesta por la regioacuten citoplasmaacutetica de la SmbP (SmbP) compuesta por
94 residuos seguido de dos residuos G95 y T96 riacuteo abajo inicia el extremo C-
terminal que estaacute compuesta por cinco residuos y representa al sitio de corte por
enteroquinasa (DDDDK)
6122 Disentildeo y construccioacuten de pSmbP-LnqQ
El archivo geneacutetico que contiene la bacteriocina LnqQ fue descargado de la base
de datos (GenBank no AB2352011) Inmediatamente en el extremo C-terminal
del peacuteptido de fusioacuten mediante la aplicacioacuten SnapGene antildeadimos manualmente
un residuo de alanina en la posicioacuten 102 y riacuteo debajo de eacutesta antildeadimos los 53
residuos que conforman el LnqQ iniciando con M103 En direccioacuten al extremo C-
terminal inmediatamente despueacutes del codoacuten de teacutermino (TAA) se agregoacute el sitio
de restriccioacuten XhoI Los elementos que componen la construccioacuten del pSmbP-
LnqQ (Tabla 9) estaacuten representados en el siguiente orden 5rsquo-NdeI-SmbP-DDDDK-
LnqQ-XhoI-3rsquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pSmbP-LnqQ estaacute guardado en formato dna bajo
el nombre ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01dnardquo En este plaacutesmido se observan por los
elementos geneacuteticos propios de un vector pET30(a)+
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Tabla 9 Secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica del producto del vector de
expresioacuten (5rsquorarr3rsquo)
Tamantildeo
pSmbP-LnqQ MSGHTAHVDEAVKHAEEAVAHGKEGHTDQLLEHAKESLTHAKAAS
EAGGNTHVGHGIKHLEDAIKHGEEGHVGVATKHAQEAIEHLRASE
HKSHGTDDDDKAMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWL
NAGQAIDWVVSKIKQILGIK
155
Los residuos subrayados representan el peacuteptido de fusioacuten Los residuos resaltados representan el sitio de
corte de enteroquinasa Los residuos en negritas representan a LnqQ
6123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten de PeptideCutter se detectoacute un
uacutenico sitio de corte en la proteiacutena SmbP-LnqQ para la enzima enteroquinasa que
se encuentra ubicado en el residuo K101 lo cual coincide con lo esperado
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Los resultados sobre la identificacioacuten de codones de paro post disentildeo en la
construccioacuten de pETNL y pSmbP-LnqQ indicaron que no existe evidencia de
codones de paro ya que la aplicacioacuten en liacutenea logroacute identificar un marco de lectura
abierto con un tamantildeo de 285 pb que codifican para 94 aminoaacutecidos cuya
secuencia coincide con exactitud con la secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
para el caso de pETNL Mientras tanto un marco de lectura compuesto por un
tamantildeo molecular de 488 pb que se traducen para 155 aminoaacutecidos y cuya
secuencia coincide en su totalidad con la secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
De acuerdo con los resultados calculados por la aplicacioacuten de Compute pIMw tool
de ExPasy el peso molecular teoacuterico estimado del producto N-AmyELnqQ de
pETNL es de 1053468 Da con un punto isoeleacutectrico pi = 1063 mientras que para
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el producto SmbP-LnqQ de pSmbP-LnqQ el peso estimado es de 1669771 Da
con punto isoeleacutectrico pI = 645
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
Seguacuten los resultados los iacutendices de solubilizacioacuten (Tabla 10) de N-AmyELnqQ y
del SmbP-LnqQ es de 0575 y 0865 respectivamente La aplicacioacuten sin embargo
clasifica a los productos del vector pETNL como invaacutelidos mientras que los
productos de pSmbP-LnqQ fueron considerados como solubles La razoacuten porque
la N-AmyELnqQ es considerado como invaacutelido se debe a que fue identificado
como proteiacutena de membrana En el caso de localizacioacuten celular (Tabla 11) los
pronoacutesticos indican que los productos producidos por pETNL y pSmbP-LnqQ se
encontraraacuten en membrana plasmaacutetica y en el citoplasma respectivamente
Tabla 10 Prediccioacuten de solubilidad N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Iacutendice Solubilidad
N-AmyELnqQ 0575 Invaacutelido
SmbP-LnqQ 0865 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice de solubilidad superior
a 045 es porque son considerados proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
Tabla 11 Prediccioacuten de localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Valor Localizacioacuten subcelular
N-AmyELnqQ 085 Membrana plasmaacutetica
SmbP-LnqQ 07 Citoplasma
Esto coincide con lo observado en los antecedentes ya que indican que las
proteiacutenas expresadas en E coli con el peacuteptido sentildeal N-AmyE en su regioacuten N-
terminal a menudo se localizan en el periplasma (Nakazawa et al 1986 R M
Papi et al 2005) Mientras que las proteiacutenas acopladas con el peacuteptido de fusioacuten
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 75
SmbP son reportadas para encontrarse en la regioacuten citoplasmaacutetica debido a que la
seccioacuten aminoaciacutedica que las orienta al periplasma fue removida de la secuencia
original de residuos quedaacutendose por tanto en el citoplasma celular de E coli
(Vargas-Cortez et al 2016)
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
El modelo estructural tanto en su forma secundaria (Figura 6) como tridimensional
(Figura 8) para N-AmyELnqQ asiacute como la presunta estructura secundaria (Figura
7) y tridimensional (Figura 10) para SmbP-LnqQ fueron revelados en este
documento En la estructura secundaria prevista para N-AmyELnqQ se espera
que el 96 de la secuencia esteacute compuesta por estructuras tipo α-heacutelices y se
estima que el 17 de la secuencia aminoaciacutedica total esteacuten embebidas en la
regioacuten transmembranal La evidencia predictiva de la N-AmyELnqQ (Figura 9) a
traveacutes de la aplicacioacuten Phyre2 indicoacute que los primeros 12 residuos del extremo N-
terminal estariacutean orientados en la regioacuten extracelular mientras que los residuos 15
al 30 estariacutean ubicados en regioacuten intermembranal entre el espacio extracelular y la
citoplasmaacutetica El resto de los residuos del extremo C-terminal estariacutean orientados
en la cara citoplasmaacutetica de la ceacutelula de E coli Mientras tanto la estructura
secundaria putativa para SmbP-LnqQ indica que el 85 de secuencia total estaacute
compuesta por α-heacutelices
En las estructuras tridimensionales putativas tanto para N-AmyELnqQ como en la
SmbP-LnqQ prevalece la formacioacuten de cuatro α-heacutelices Estos motivos
estructurales tipo α-heacutelices son comuacutenmente observados en bacteriocinas
similares a LnqQ (Lynch et al 2019) de manera que podemos predecir que la
estructura secundaria y tridimensional de la LnqQ no se ve afectada cuando estaacuten
acopladas tanto por N-AmyE como con SmbP
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 76
Figura 6 Prediccioacuten de la estructura secundaria de N-AmyELnqQ
La estructura secundaria predicha del N-AmyELnqQ en Phyre2
Figura 7 Prediccioacuten de la estructura secundaria de SmbP-LnqQ
La estructura secundaria putativa del SmbP-LnqQ en Phyre2
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Figura 8 Prediccioacuten de estructura tridimensional de N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de N-
AmyELnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones
propuestas por modelo son de (Å) X29824 Y24988 Z25496
Figura 9 Prediccioacuten de heacutelices transmembranales para N-AmyELnqQ
La imagen es resultado de la prediccioacuten propuesta por Phyre2 para heacutelices transmembranales de N-
AmyELnqQ
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Figura 10 Prediccioacuten de estructura tridimensional de SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de SmbP-
LnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones propuestas
por modelo son de (Å) X32655 Y24988 Z25496
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
6171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Las ceacutelulas presuntamente transformadas fueron seleccionadas con kanamicina
De acuerdo con la evidencia presentada (Figura 11) los controles experimentales
cumplieron con su objetivo ya que no se registroacute crecimiento en placas de LB agar
esteacuteriles en el control negativo (Figura 11 a) en cuanto al control de viabilidad
eacuteste demostroacute que la electroporacioacuten no fue un factor significativo que causara la
muerte de ceacutelulas de E coli DH5α como BL21 (DE3) (Figura 11 b c) Por uacuteltimo
los controles con antibioacutetico demostraron que la kanamicina (50 microgml) era lo
suficientemente potente para seleccionar ceacutelulas (Figura 11 d e) Por uacuteltimo
demostramos bajo la teacutecnica de electroporacioacuten que las cepas de ceacutelulas de E
coli tanto BL21 (DE3) como DH5α fueron correctamente transformadas con los
vectores de expresioacuten pETNL (Figura 11 f g) pET30(a)+ (Figura 11 h j) y
pSmbP-LnqQ (Figura 11 i k) Los ensayos fueron realizados por triplicado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 79
Figura 11 Transformacioacuten de E coli DH5α y BL21 (DE3) con pET30a(+)
pETNL y pSmbP-LnqQ
Roacutetulo Descripcioacuten
a Control negativo
b Control viabilidad DH5α
c Control viabilidad BL21 (DE3)
d Control kanamicina + DH5α
e Control kanamicina + BL21 (DE3)
f DH5α + pETNL
g BL21 (DE3) + pETNL
h DH5α + pET30a(+)
i DH5α + pSmbP-LnqQ
j BL21 (DE3) + pET30a(+)
k BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ
Las placas rotuladas del a-c son placas LB con agar mientras que las placas d-k son placas LB
con agar suplementadas con kanamicina (50 microgml concentracioacuten final)
80
6172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Los ensayos para la extraccioacuten y purificacioacuten de los plaacutesmidos pET30(a)+ pETNL
y pSmbP-LnqQ de ceacutelulas de E coli que fueron observados en un gel de agarosa
1 (pv) Seguacuten la evidencia (Figura 12) nuestros controles demuestran que
tanto el plaacutesmido pETNL como el vector pSmbP-LnqQ se encontraban presentes
Los iacutendices de concentracioacuten y calidad de cada uno de los vectores fueron para
pET30(a)+ de 911 ngmicrol con A260A280 en 195 para el vector pETNL de 532 ngmicrol
con A260A280 en 194 y para el vector pSmbP-LnqQ de 2861 ngmicrol con A260A280 en
188 Seguacuten la literatura los iacutendices para considerar a un DNA plasmiacutedico como
puro deben tener valores espectrofotomeacutetricos de A260A280 entre 18-20 donde un
valor menor a 18 se considera como contaminacioacuten con proteiacutenas y un valor de
superior a 20 se considera contaminacioacuten por RNA (Koetsier Cantor amp Biolabs
sf) Podemos inferir que los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron recuperados en buena cantidad con un buen iacutendice de pureza
Figura 12 Gel de agarosa con plaacutesmidos
pETNL y pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer
TBE 1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Plaacutesmido pETNL
3 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
4 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli
BL21 (DE3) transformados con los vectores
de expresioacuten pETNL o pSmbP-LnqQ
El marcador de peso molecular corresponde
a 100-5000bp DNA Marker Plus Ready to
Use (Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 81
6173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Seguacuten los resultados obtenidos por OligoAnalyzer Tool tras ajustar las
condiciones de los oligonucleoacutetidos a las especificaciones del fabricante del kit de
la polimerasa el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 promoter primer es de
20 pb con un contenido GC a 40 y un valor Tm = 591degC con un hairpin de -036
kcalmol a una Tm de 316degC y un valor homodiacutemero de -416 kcalmol Mientras
tanto el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 terminal primer es de 19 pb con
un contenido GC a 526 y un valor Tm = 61degC con un hairpin de 002 kcalmol a
una Tm de 248degC y un valor homodiacutemero de -474 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten NetPrimer el oligonucleoacutetido T7
promoter primer tiene un rating de eacutexito en 860 y presenta un valor de estabilidad
en su extremo 3rsquo-terminal de -87 kcalmol y no se identificoacute al hairpin el valor
homodiacutemero se registroacute en -759 kcalmol En el caso del oligonucleoacutetido T7
terminal primer este presenta un rating de eacutexito en 870 con un valor de
estabilidad en su extremo 3rsquo-terminal de -1142 kcalmol y tampoco se identificaron
hairpins el valor homodiacutemero se registroacute en -574 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los criterios habituales para seleccioacuten de oligonucleoacutetidos ambos
se mantuvieron en los estaacutendares ya que presentaron un tamantildeo entre 18 a 25 pb
con un hairpin cuyo valor de Tm fue menor a la Tm reportado para el
oligonucleoacutetido y los valores tanto de los homodiacutemeros y heterodiacutemeros nunca
fueron maacutes negativo o iguales a -9 kcalmol
En cuanto al caacutelculo de la Ta para ambos oligonucleoacutetidos utilizamos la regla
general de sustraer 5degC al Tm calculado para en ambos oligonucleoacutetidos Para el
caacutelculo de la Ta oacuteptimo para un par de oligonucleoacutetidos para un blanco en
particular se utilizoacute la siguiente foacutermula matemaacutetica TaOpt = 03 times (Tm de oligo) +
07 times (Tm producto) minus 149 donde el valor de Tm del oligonucleoacutetido es la
temperatura de fusioacuten del oligonucleoacutetido menos estable y la Tm es el valor del
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 82
temperatura de fusioacuten del producto de PCR (Rychlik Spencer amp Rhoads 1990)
De esta manera promediamos el valor de la Tm de ambos oligonucleoacutetidos y el
resultado fue 60degC A este valor le sustrajimos 5degC para un Ta ajustado en 55degC
en los ensayos de PCR punto final para la identificacioacuten de los plaacutesmidos
Por uacuteltimo calculamos el total de ciclos y el tiempo de extensioacuten para los ensayos
de PCR punto final De acuerdo con las especificaciones del fabricante se debe
agregar 1 minuto por cada kb por sintetizar en los ensayos De esta manera
calculamos en primera instancia el tamantildeo molecular de los productos de los
ensayos de PCR de los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
para determinar el tiempo de extensioacuten Para lograr este objetivo realizamos una
reaccioacuten in silico de PCR punto final entre los dos oligonucleoacutetidos T7 con cada
uno de los vectores de expresioacuten utilizados
Los archivos geneacuteticos de los tres vectores de expresioacuten fueron abiertos desde la
aplicacioacuten de SnapGene y ejecutamos una PCR punto final in silico
Posteriormente corrimos una simulacioacuten de gel de agarosa al 1 De acuerdo con
los resultados de nuestra simulacioacuten (Figura 13) las bandas esperadas de los
productos lineales de PCR de los vectores de pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
se encontrariacutean entre 367 pb 488 pb y 651 pb respectivamente Con esto
confirmamos que ninguno de los productos de PCR esperados tendriacutea un tamantildeo
superior al 1 kb y procedimos a configurar la reaccioacuten para el ensayo de PCR
punto final
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 83
Figura 13 Simulacioacuten de PCR para
vectores de expresioacuten
Gel de agarosa 10 generado desde
SnapGene
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Producto PCR de pET-30a(+)
2 Producto PCR de pETNL
3 Producto PCR de pSmbP-LnqQ
Las bandas corresponden a productos lineales
de PCR
El marcador de peso molecular in silico
corresponde a PCR DNA Ladder de GenScript
(Cat En desuso Estados Unidos) y fue tomado
desde la aplicacioacuten de SnapGene versioacuten 113
Asiacute pues configuramos las condiciones de corrida en el termociclador las cuales
fueron registradas de la siguiente manera una desnaturalizacioacuten inicial a 94degC por
180 s despueacutes 30 ciclos de desnaturalizacioacuten alineamiento y extensioacuten con
temperaturas en 94degC 55degC y 72degC respectivamente y sus respectivos tiempos de
reaccioacuten a 30 s 45 s y 30 s Finalmente se agregoacute una etapa de extensioacuten final
con una temperatura a 72degC por 420 s
6174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Despueacutes de realizar la teacutecnica de PCR punto final y una posterior corrida en un gel
de agarosa al 1 con buffer TBE 1X observamos una banda con tamantildeo de 367
pb para el producto de PCR obtenida del vector pET30(a)+ al tiempo que
recolectamos una banda de 488 pb para el producto de PCR del vector pETNL
(Figura 14) y finalmente encontramos una banda de 651 pb para el producto de
PCR del vector pSmbP-LnqQ (Figura 15) Dado que los valores predichos en la
simulacioacuten coinciden con los observado experimentalmente confirmamos que
nuestras cepas de E coli estaban efectivamente transformadas con su respectivo
vector de expresioacuten
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 84
Figura 14 PCR de pETNL
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 PCR de pET30(a) virgen
3 PCR de pETNL
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
Figura 15 PCR de pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Control positivo pET30(a) vaciacuteo
3 Control positivo pETNL
4 Control negativo PCR pUC57-DPQ
5 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
6 Control negativo PCR pUC57-DPQ
7 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
Para los anaacutelisis de expresioacuten de proteiacutenas utilizamos algunos vectores de
expresioacuten que han sido exitosos en la produccioacuten de proteiacutenas Los vectores
pET30a-SmbP_LL-37 y pET30a-SmbP_MP1106 fueron amablemente compartidos
por David Antonio Peacuterez miembro del grupo de investigacioacuten PEP con sede en la
Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la UANL
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 85
(Monterrey Nuevo Leoacuten) Similarmente el vector pET30NP-Hoc fue compartido
por Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros miembro del grupo de investigacioacuten
NBR con sede en el CIBYN (Apodaca Nuevo Leoacuten)
Dado que la informacioacuten de los tres plaacutesmidos se encuentra o se encontraba en
estado de revisioacuten al momento de redactar este documento por sus respectivos
comiteacutes de revisioacuten solo podemos limitarnos a mencionar los pesos moleculares
de los productos de cada vector de expresioacuten Para los dos vectores de David
Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) el peso molecular estimado de
ambos productos es 15 kDa mientras que el vector de Francisco Balderas el peso
molecular de su producto es de 95 kDa (F Balderas comunicacioacuten personal
2021)
6181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Para la induccioacuten por IPTG seguimos los protocolos preestablecidos para la
induccioacuten de proteiacutenas heteroacutelogas en ceacutelulas de E coli En nuestro ensayo la
concentracioacuten de IPTG elegida para la induccioacuten de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
correspondioacute a 01 mM Nosotros utilizamos esta concentracioacuten debido a que los
reportes indican que esta concentracioacuten es lo suficiente para saturar la reaccioacuten
bioloacutegica evitando la toxicidad celular por este compuesto (Malakar amp Venkatesh
2012) Los valores tiacutepicos de IPTG maacutes utilizados para la induccioacuten usualmente se
encuentran entre 05 mM y 10 mM (Mesa-Pereira et al 2018)
En nuestros cultivos el IPTG fue antildeadido en la fase exponencial tardiacutea (OD600 =
04-06) dado que el costo energeacutetico es maacutes alto durante la fase exponencial
temprana que en la tardiacutea (Malakar amp Venkatesh 2012) Ademaacutes se presume que
en esta fase el total de proteiacutenas producidas pueden alcanzar rendimientos
productivos superiores a 350 (Larentis et al 2014) Para nuestros ensayos
utilizamos dos temperaturas para inducir 37degC y 25degC y la razoacuten de utilizar una
temperatura maacutes baja es porque es un meacutetodo habitual para incrementar la
solubilidad de proteiacutenas recombinantes en E coli (Schein 1989)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 86
6182 SDS-PAGE de proteiacutenas periplaacutesmicas de E coli modificadas
con pETNL
Nuestros estudios preliminares bioinformaacuteticos indicaban que la proteiacutena N-
AmyELnqQ seriacutea insoluble (Tabla 10) y que tanto por sus antecedentes
(Nakazawa et al 1986 R M Papi et al 2005 Sjoumlstroumlm et al 1987) por sus
caracteriacutesticas moleculares estariacutea presuntamente ubicada en la regioacuten
periplaacutesmica de E coli (Tabla 11) Sin embargo nuestros resultados por ensayos
de SDS-PAGE indicaron que la induccioacuten por IPTG en ceacutelulas de E coli BL21
(DE3) transformados con el vector pETNL para la produccioacuten de N-AmyELnqQ
tanto en la fraccioacuten soluble como insoluble de proteiacutenas a una temperatura de
induccioacuten 25degC (Figura 16) como a 37degC (Figura 17) en la fraccioacuten periplaacutesmica
no fue posible en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) esta manifestacioacuten fue reportado
en muacuteltiples ocasiones De acuerdo con nuestros resultados no logramos
determinar la presencia de bandas de proteiacutenas en la regioacuten esperada que seguacuten
los anaacutelisis predictivos la proteiacutena N-AmyELnqQ debiacutea tener un peso molecular
cercano a 105 kDa
Es de mencionar que el valor de prediccioacuten de corte de peacuteptido sentildeal de la
proteiacutena N-AmyELnqQ fue muy inferior a los valores de prediccioacuten observados en
secuencias que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y que habiacutean sido previamente
validados experimentalmente (Tabla 8) Otro aspecto para considerar es que los
residuos reconocidos para el corte enzimaacutetico difieren entre los diferentes tipos de
bacterias (Nakazawa et al 1986) Esto quedoacute demostrado cuando observamos
que los residuos utilizados para el corte de este peacuteptido sentildeal podiacutean diferir
inclusive en el mismo tipo de bacteria Por ejemplo en la secuencia total de
aminoaacutecidos de la α-amilasa reportada por Yang y otros (Yang et al 1983) Emori
y otros (Emori amp Maruo 1988) y Kunst y otros (Kunst et al 1997) los residuos
observados corresponden al 33 y 34 mientras que para las secuencias de
aminoaacutecidos a los que se les fue acoplado el peacuteptido sentildeal en su regioacuten N-terminal
como las reportadas por Sakakibara y otros (Sakakibara et al 1993) y Papi y
otros (R M Papi et al 2005) los residuos de corte se ubicaron en la posicioacuten 31 y
32
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 87
Figura 16 Gel de E coli BL21 (DE3) con pETNL inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 88
Figura 17 Gel de E coli BL21 (DE3) pETNL inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 89
6183 SDS-PAGE de proteiacutenas citoplaacutesmicas de E coli modificadas
con pSmbP-LnqQ
Los estudios preliminares predictivos para la produccioacuten heteroacuteloga de SmbP-
LnqQ en E coli indicaban que la presencia del peacuteptido de fusioacuten SmbP
aumentariacutea la solubilidad de la proteiacutena recombinante solubilidad (Tabla 10) y que
ademaacutes seriacutea localizado en el citoplasma celular (Tabla 11) con un peso
molecular aproximado de 167 kDa Nuestros resultados por ensayos de SDS-
PAGE indicaron que no hubo produccioacuten citoplasmaacutetica de una banda esperada
de 15 kDa tras inducir con IPTG a ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) transformados
con el vector pSmbP-LnqQ para la produccioacuten del peacuteptido SmbP-LnqQ tanto a
25degC como 37degC (Figura 18) Estos ensayos fueron realizados por triplicado
Esto nos orilloacute a plantearnos dos posibilidades con relacioacuten a la proteiacutena SmbP-
LnqQ la primera era que pudiera presentar problemas por plegamiento durante su
produccioacuten en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) y que la segunda fuera problemas
internos relacionados al IPTG Para demostrar la primera hipoacutetesis transformamos
ceacutelulas de E coli Origami con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ y utilizamos el
vector pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo este vector seguacuten su autor
produce una proteiacutena de un tamantildeo de 15 kDa en ceacutelulas de E coli Origami
debido a que es una proteiacutena problemaacutetica (datos no publicados) Nuestra
evidencia (Figura 19) sentildeala que el IPTG no es causa probable de la nula
produccioacuten debido a que se observoacute una banda muy definida en la regioacuten de los
15 kDa para las bacterias transformadas con el vector terminacioacuten MP1106 que
habiacutean sido inducidas por IPTG tanto a 25degC como 37degC Tampoco se observoacute
que la cepa Origami contuviera un factor bioloacutegico no considerado en la cepa
BL21 (DE3) que pudiera agilizar la produccioacuten de la proteiacutena SmbP-LnqQ ya que
no encontramos ninguna banda de un tamantildeo de 15 kDa en las ceacutelulas Origami
transformados
Ante los resultados previos consideramos posibilidad de que el problema se
encontrara especiacuteficamente en la cepa de E coli (DE3) presente en nuestro
laboratorio Para demostrar este punto procedimos a transformarla la cepa con el
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 90
vector de expresioacuten pET30NP-Hoc para fines de control positivo para nuestro
experimento Seguacuten su autor este vector de expresioacuten produce una proteiacutena lineal
de 95 kDa al inducirse por IPTG a 1 mM (datos no publicados) Nuestros
resultados en el gel SDS-PAGE muestran una banda de proteiacutenas extraiacutedas de E
coli transformados pET30NP-Hoc en la seccioacuten de 95 kDa y es producido tanto a
37degC (Figura 20) como a 25degC (Figura 21) Sin embargo no pudimos observar
ninguna banda sobre expresada de 10 kDa para las BL21 (DE3) transformadas
con pETNL ni una banda tampoco de 15 kDa para las bacterias transformadas con
pSmbP-LnqQ De esta manera descartamos la idea que existiera un problema
bioloacutegico procedente en la cepa de E coli BL21 (DE3) mantenida en nuestro
laboratorio
Se conoce que la bacteriocina LnqQ ya ha sido sujeta a modificaciones geneacuteticas
para incrementar su produccioacuten al ser clonada y expresada con eacutexito con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) registraacutendose
rendimientos hasta de 130 mg por litro de cultivo bacteriano (Ma et al 2012) Ante
la ausencia de una banda de proteiacutenas en la regioacuten de 15 kDa en nuestro vector
de expresioacuten con peacuteptido de fusioacuten SmbP-LnqQ se ha comentado que no existen
razones para suponer que todas las etiquetas de fusioacuten son aptas para todo tipo
de necesidades ya que es casi imposible determinar cuaacutel es el peacuteptido de fusioacuten
oacuteptimo para la produccioacuten Sin embargo una de las ventajas de utilizar peacuteptidos
de fusioacuten reconocidos es que son reconocidos sus ventajas y desventajas ya que
en algunos casos algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la solubilidad
de las proteiacutenas tales como TRX MBP NusA etc pero otros peacuteptidos sentildeales no
incrementan la solubilidad de la proteiacutena de intereacutes como GST BAP etc Incluso
algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la carga metaboacutelica en la ceacutelula
como GST MBP y NusA (Waugh 2005)
A pesar del buen registro experimental disponible sobre construcciones que
contienen el peacuteptido de fusioacuten SmbP (Vargas-Cortez et al 2016) suponemos en
nuestro caso en particular que dada las limitaciones de su corto historial
experimental auacuten no existe informacioacuten que determine las ventajas y desventajas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 91
pertinente al peacuteptido de fusioacuten SmbP para observar si son viables para la
produccioacuten solubilidad yo purificacioacuten de maacutes tipos de bacteriocinas
Figura 18 Gel de E coli BL21 (DE3) pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3)+ pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3) transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 92
Figura 19 Gel de E coli Origami pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli Origami transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 93
Figura 20 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 37degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 37degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 37degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 37degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 37degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 37degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 37degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 37degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 94
Figura 21 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 25degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 25degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 25degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 25degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 25degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 25degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 25degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 25degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 95
619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de
proteiacutenas
Seguacuten el anaacutelisis fisicoquiacutemico de las secuencias aminoaciacutedicas que fueron
utilizadas en las construcciones para N-AmyE (Tabla 12) todas son de gran
tamantildeo y de alto peso molecular este peacuteptido se ha reportado para la
sobreexpresioacuten de AmyE en E coli (Nakazawa et al 1986) Asiacute como para la
sobreexpresioacuten de una regioacuten de 39 kDa que codifica para una regioacuten N-terminal
de una liasa de pectina (Pnl) en E coli (R Papi amp Kyriakidis 2003) a la fecha no
hemos visto alguacuten reporte de que este peacuteptido sentildeal haya sido utilizado para
producir proteiacutenas de bajo peso molecular
Por otro lado las secuencias que fueron exitosamente producidos con peacuteptido de
fusioacuten SmbP (Tabla 14) tambieacuten han mostrado ser uacutetil para producir proteiacutenas de
alto peso molecular o peacuteptidos de bajo peso molecular con actividad
antimicrobiana como VpDef (Montfort-Gardeazabal Claudio Casillas-Vega amp
Zarate 2020) Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al 2021) y muy recientemente LL-
37 (Perez-Perez et al 2021) el peacuteptido de fusioacuten tambieacuten ha demostrado ser
exitoso para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas de alto peso molecular como GFP y
RFP (Vargas-Cortez et al 2016) De esta manera consideramos que tanto el
tamantildeo como el peso molecular no son factores que intervengan durante el
proceso sobreproduccioacuten mediado tanto N-AmyE como con SmbP El punto
isoeleacutectrico tampoco parece ser un factor importante ya que el valor de AmyE es
aacutecido (561) mientras que Pnl es baacutesico (877) Situacioacuten similar sucede entre los
peacuteptidos microbianos puesto que VpDef es ligeramente aacutecido (686) en cambio el
resto de los peacuteptidos (Bin1b 949 LL-37 1061) son baacutesicos similar a LnqQ
Sin embargo observamos que tanto el iacutendice alifaacutetico (AI) como los valores del
iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) siacute son diferentes entre los distintos tipos de
peacuteptidos antimicrobianos Individualmente el valor AI de LnqQ es de 12115
(Tabla 12) y es superior al resto de los demaacutes peacuteptidos antimicrobianos con una
media de 5363 plusmn 3321) El valor AI para N-AmyELnqQ es de 11947 (Tabla 13) y
para SmbP-LnqQ es de 8323 (Tabla 15) respectivamente
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Tabla 12 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con N-AmyE
ID AmyE Pnl LnqQ
L 627 316 53
MW 6929711 3448665 589810
pI 561 877 1010
R(-) 69 21 2
R(+) 55 25 8
AI 6694 7636 12115
GRAVY -0648 -0291 +0300
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 13 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con N-AmyE
ID N-AmyEAmyE N-AmyEPnl N-AmyELnqQ
L 660 360 94
MW 7279942 3947961 1053468
pI 588 922 1063
R(-) 69 22 2
R(+) 58 30 12
AI 6982 8061 11947
GRAVY -0553 -0205 +0426
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 97
Tabla 14 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID VpDef Bin1b LL-37
L 49 45 37
MW 543498 520906 449332
pI 686 949 1061
R(-) 6 3 5
R(+) 6 9 11
AI 2388 4756 8946
GRAVY -0996 -0571 -0724
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 15 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID SmbP-VpDef SmbP-Bin1b SmbP-LL-37 SmbP-LnqQ
L 152 148 140 155
MW 1630268 1607675 1536102 1669471
pI 594 648 645 645
R(-) 26 23 25 22
R(+) 16 19 21 18
AI 5086 5878 1828 8323
GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 98
En cuanto al iacutendice de hidrofobicidad LnqQ mostroacute un valor GRAVY positivo
(+0300) mientras que el resto de los peacuteptidos antimicrobianos donde el valor
GRAVY promedio era de -073 plusmn 019 No es de sorprender que las bacteriocinas
del subgrupo de la familia de las aureocinas similares a A53 como LnqQ
aureocina A53 lacticina Z epidermicina NI01 lactolisterina BU y BHT-B tengan
valores GRAVY positivos (Perez Zendo amp Sonomoto 2018) Sin embargo cuando
LnqQ estaacute acoplado a N-AmyE el valor GRAVY se vuelve auacuten maacutes positivo con
+0426 (Tabla 13) y cuando estaacute fusionado con SmbP el valor GRAVY cambia a -
0514 (Tabla 15)
La literatura menciona que un peacuteptido o proteiacutena presenta un valor GRAVY
positivo debe considerarse como hidrofoacutebica mientras que un valor GRAVY
negativo significa que la proteiacutena es hidrofiacutelica (Kyte amp Doolittle 1982) De manera
que proteiacutenas con valores GRAVY negativos indican que la proteiacutena presenta una
estructura globular (hidrofiacutelicos) mientras que proteiacutenas con valores GRAVY
positivos indican la posibilidad que la proteiacutena guarde alguna relacioacuten con la
membrana (hidrofoacutebicos) (Enany 2014)
El valor GRAVY es considerado como el factor que maacutes influye en la movilidad de
las proteiacutenas en los geles de SDS-PAGE una proteiacutena con un valor GRAVY
negativo tiende a migrar maacutes lento que las proteiacutenas con valores positivos en los
geles para proteiacutenas (Shirai et al 2008) Las unioacuten de las moleacuteculas de SDS con
las proteiacutenas se produce a traveacutes de los aminoaacutecidos hidrofoacutebicos (Robinson amp
Tanford 2002) algunas estructuras hidrofoacutebicas son capaces de unir moleacuteculas
SDS hasta en un rango desde 34 a 10 g de SDS por 1 g de proteiacutena lo que
influiriacutea en una migracioacuten electroforeacutetica anoacutemala en los geles de SDS-PAGE
(Rath Glibowicka Nadeau Chen amp Deber 2009) LnqQ es una proteiacutena globular
(Acedo et al 2016) que utiliza la membrana especiacuteficamente para atacar
(Yoneyama Imura Ohno et al 2009) con lo que suponemos que el iacutendice de
hidrofobicidad pudiera estar afectando en el comportamiento electroforeacutetico de las
proteiacutenas Sin embargo tambieacuten la literatura sugiere que el comportamiento
anoacutemalo en las proteiacutenas de membrana en los geles de SDS-PAGE pudiera no
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 99
necesariamente relacionado a la carga neta de la proteiacutena ni a su iacutendice de
hidrofobicidad (Rath amp Deber 2013)
Al evaluar individualmente a LnqQ a traveacutes la escala Kyte-Doolittle observamos
que el peacuteptido posee dos secciones hidrofoacutebicas que se encuentran
aproximadamente entre los extremos del peacuteptido (entre residuos 5 al 15 y del 31 al
49) representando el 60 del total de la secuencia de LnqQ es hidrofoacutebica
(Figura 22) Si LnqQ estaacute acoplada con N-AmyE se observan las dos regiones
hidrofoacutebicas (entre residuos 9-50 y 66-85) que representa que el 6860 del total
de la secuencia sea hidrofoacutebica (Figura 23) Mientras tanto SmbP retiene sus dos
regiones hidrofoacutebicas que se ubican hacia la regioacuten C-terminal entre los residuos
103-117 y 133-151 componiendo el 2313 de total de la secuencia (Figura 24)
Dado que existe un reporte de produccioacuten exitosa entre la LnqQ acoplada con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO (Ma et al 2012) decidimos evaluar su valor AI GRAVY
y su escala Kyte-Doolittle Seguacuten los resultados de ProtParam para SUMO-LnqQ
los valores AI y GRAVY son de 8337 y -0516 respectivamente los cuales son
similares a lo reportado para SmbP-LnqQ Por otro lado seguacuten la escala Kyte-
Doolittle cinco regiones hidrofoacutebicas fueron descritas a lo largo de toda la
construccioacuten y estaacuten aproximadamente repartidas en toda la estructura lineal
entre los residuos 16-18 53-70 87-91 119-134 y 150-168 lo que representa el
28 del total de la secuencia (Figura 25) El valor GRAVY positivo y el alto
porcentaje de residuos hidrofoacutebicos para N-AmyELnqQ nos permite suponer que
estaacute proteiacutena se encontrariacutea anclada en la membrana celular lo que dificultariacutea su
solubilizacioacuten en los geles de proteiacutenas
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Figura 22 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la LnqQ
Figura 23 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de N-AmyELnqQ
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 10 20 30 40 50 60
Valo
r
Posicioacuten
LnqQ
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
N-AmyELnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 101
Figura 24 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SmbP-LnqQ
Figura 25 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SUMO-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SUMO-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Va
lor
Posicioacuten
SmbP-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Va
lor
Posicioacuten
SUMO-LnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 102
Ante la ausencia de una respuesta objetiva que explique la ausencia de bandas de
SmbP-LnqQ en los ensayos analizamos el perfil de aminoaacutecidos y detectamos
que la presencia de cisteiacutenas entre los peacuteptidos antimicrobianos tampoco fue un
factor determinante durante la sobreproduccioacuten con la SmbP ya que tanto VpDef
como Bin1b (que se caracterizan por ser abundantes en cisteiacutenas) como LL-37
(que no tiene cisteiacutenas) fueron exitosamente producidos El mapa de calor (Figura
26) sentildealoacute un alto porcentaje de Trp en LnqQ en comparacioacuten con los demaacutes
peacuteptidos antimicrobianos De acuerdo con la escala Kyte-Doolittle Trp es
considerado un residuo hidrofiacutelico (Kyte amp Doolittle 1982) cuando en realidad es
hidrofoacutebico por sus caracteriacutesticas uacutenicas (Mishra Choi Moon amp Baek 2018)
Este residuo funge como estabilizador de las proteiacutenas en la membranas anclaje
y orientacioacuten hacia el lado hidrofiacutelico de la bicapa lipiacutedica (Khemaissa Sagan amp
Walrant 2021) por eso son de alta importancia en proteiacutenas de membrana porque
apoyan en la estabilidad proteiacutena en la interfaz lipiacutedica por su forma riacutegida y plana
(Yau Wimley Gawrisch amp White 1998) Se presume que Trp permite que
peacuteptidos antimicrobianos similares a la aureocina A53 se mantengan unidos a la
membrana (Netz Bastos amp Sahl 2002) Sin embargo al analizar el porcentaje de
Trp entre N-AmyELnqQ SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ descubrimos que los
valores son muy similares 11 26 y 23 Por lo que Trp no seriacutea un factor
clave para que LnqQ sea producido en E coli
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
VpDef
Bin1b
LL37
LnqQ
Figura 26 Perfil aminoaciacutedico de los peacuteptidos antes de acoplarse con SmbPc
El mapa de calor representa la distribucioacuten de los residuos entre los peacuteptidos La intensidad del color negro
representa el porcentaje de residuos entre los peacuteptidos antes de ser acoplados con SmbP
Dada la similitud fisicoquiacutemica entre SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ abordamos el
problema desde el punto de vista analiacutetico otros autores demostraron que
proteiacutenas de peso molecular alto como N-AmyEPnl (R Papi amp Kyriakidis 2003) o
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 103
de peso molecular pequentildeo como SmbP-Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al
2021) SmbP-VpDef (Montfort-Gardeazabal et al 2020) SmbP-LL-37 (Perez-
Perez et al 2021) eran faacutecilmente observables mediante la teacutecnica de SDS-
PAGE hechos que utilizamos para la visualizacioacuten preliminar tanto N-AmyELnqQ
como de SmbP-LnqQ en los ensayos electroforeacuteticos Sin embargo en el reporte
de sobreproduccioacuten por SUMO-LnqQ los ensayos electroforeacuteticos preliminares
fueron realizados bajo la teacutecnica SDS-PAGE con Tricina (Ma et al 2012) Esta
variante es utilizada para resolver proteiacutenas con pesos moleculares pequentildeos que
oscilan entre 1 a 30 kDa (Haider Reid amp Sharp 2012) pero tambieacuten es uacutetil para
analizar proteiacutenas hidrofoacutebicas (Schaumlgger 2006) lo cual seriacutea un candidato ad
hoc a las caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas observadas de la LnqQ
Por uacuteltimo y no menos importante es tambieacuten de mencionar todas las
secuencias aminoaciacutedicas donde los peacuteptidos antimicrobianos tuvieron eacutexito con la
SmbP tienen su origen evolutivo en sistemas eucarioacuteticos las defensinas VpDef
(Zhang et al 2015) y Bin1b (Guo et al 2009) provienen del invertebrado
Venerupis philippinarum y del epidiacutedimo de la rata Rattus norvegicus
respectivamente mientras que la catelicidina LL-37 proviene del sistema inmune
de chimpanceacutes y humanos (Agerberth et al 1995) nuestra LnqQ posee un origen
procariota a traveacutes de Lactococcus lactis QU5 (Fujita et al 2007) Las defensinas
estaacuten compuestas por estructuras tipo beta plegadas mediadas por cisteiacutenas
conservadas mientras que los dominios antimicrobianos de las catelicidinas son
estructuralmente lineales carentes de puentes disulfuro y estaacuten compuestas por
varias heacutelices (Dorin McHugh Cox amp Davidson 2014) LnqQ es una estructura
lineal compuesta por dos heacutelices anfipaacuteticas (Perez et al 2014) por lo que el
factor estructural tampoco seriacutea un factor clave salvo por el hecho de que
provienen de oriacutegenes evolutivos distintos
A manera de conclusioacuten de acuerdo con la evidencia recolectada tanto a nivel
bioinformaacutetico como experimental encontramos que el marco de lectura de los
vectores para la produccioacuten de N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ estaban
correctamente orientados y dispuestos en sus marcos de lecturas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 104
correspondientes los geles de poliacrilamida siacute fueron efectivos para detectar
proteiacutenas con un peso similar (lisozima 144 kDa) a los peacuteptidos de nuestras
construcciones (N-AmyELnqQ= 1053 kDa y SmbP-LnqQ= 1669 kDa)
Confirmamos que el IPTG siacute es capaz de inducir la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
de control tanto en cepas de E coli BL21 (DE3) como de Origami tanto a 25degC
como a 37degC De manera que tanto N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ suponemos
que siacute son producidas pero por caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas propias de la LnqQ
es posible que 1) dado su alta hidrofobicidad es posible que N-AmyELnqQ se
mantenga acoplada en la membrana celular lo que dificultariacutea su solubilizacioacuten en
los geles de SDS-PAGE 2) desde el punto de vista analiacutetico es posible que SDS-
PAGE no sea la teacutecnica oacuteptima para la visualizacioacuten de las proteiacutenas hidrofoacutebicas
3) no existe informacioacuten conclusiva que respalde soacutelidamente porqueacute SmbP-LnqQ
no logroacute ser sobreproducida utilizando E coli como organismo heteroacutelogo
productor
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 105
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES
El biosensor disentildeado de ceacutelulas de E coli basado en la deteccioacuten de moleacuteculas
de QS es capaz de producir LnqQ en base a la concentracioacuten externa de AIP
excretada por MRSA La capacidad del biosensor estaacute mediada por un vector de
expresioacuten disentildeado que lleva por nombre Dual Biosensor-Killer Este plaacutesmido
ademaacutes puede ser utilizado para la construccioacuten de otros biosensores que
compartan el objetivo de detectar y destruir otros patoacutegenos productores de
sentildeales tipo QS Seguacuten nuestros anaacutelisis bioinformaacuteticos in silico nuestro
biosensor estaacute capacitado para detectar y destruir cepas de S aureus que sean
productoras de moleacuteculas de sentildealizacioacuten tipo AIP clase II De acuerdo con
nuestros pronoacutesticos nuestra cepa modificada seriacutea capaz de producir secretar y
ser capaz de ser resistente a la produccioacuten de LnqQ debido a que la maquinaria
geneacutetica se mantuvo intacto Nuestros resultados revelan indican que la LnqQ
seraacute lo suficientemente soluble cuando sea sobreexpresado Por uacuteltimo
determinamos que no existen epiacutetopos para ceacutelulas tipo B ni riesgo de
alergenicidad De esta manera la LnqQ producida por este sistema bioloacutegico es
aparentemente seguro para ser utilizado como un potencial candidato a agente
terapeacuteutico Los resultados in silico motivan al desarrollo y disentildeo de nuevos
agentes antimicrobianos a traveacutes de biosensores de ceacutelulas enteras para eliminar
patoacutegenos tanto sensibles como resistentes a los antibioacuteticos A pesar de los
favorables resultados reportados en publicaciones anteriores y la evidencia
predictiva sobre el peacuteptido sentildeal N-AmyE y con el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la
produccioacuten de proteiacutenas recombinantes como la bacteriocina LnqQ dichas
observaciones no pueden ser aplicadas para la produccioacuten expresioacuten y
purificacioacuten desde ceacutelulas de E coli BL21 (DE3)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 106
ANEXOS
Divulgacioacuten de la investigacioacuten
Publicaciones
Beniacutetez-Chao DF Balderas-Cisneros FDJ Leoacuten-Buitimea A and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Design and in silico analysis of a whole-cell biosensor able to
kill methicillin-resistant Staphylococcus aureus Biotechnol Appl Biochem
httpsdoiorg101002bab2210
Beniacutetez-Chao DF Leoacuten-Buitimea A Lerma-Escalera JA and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Bacteriocins An Overview of Antimicrobial Toxicity and
Biosafety Assessment by in vivo Models Front Microbiol
httpsdoiorg103389fmicb2021630695
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 107
Archivos de disentildeo
Todos los archivos gestionados para los disentildeos estaacuten guardados en su formato
correspondiente adentro de la carpeta de ldquoDoctoral ndash Anexosrdquo la cual fue anexada
propiamente en el disco compacto
Se elaboroacute una carpeta nombrada ldquoBioBricks and Modulesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 61 hasta 610 y estaacute subdivida
en cuatro subcarpetas nombradas como ldquoBioBricks (secuencias originales)rdquo
ldquoModulesrdquo ldquoPlasmidsrdquo ldquoTemplatesrdquo y el ldquoDual Biosensor Killerdnardquo Estos archivos
fueron elaborados a traveacutes de la aplicacioacuten de SnapGene 113 y estaacuten guardados
en formato dna Tambieacuten entregamos dos documentos en formato PDF que
contienen la secuencia nucleotiacutedica optimizada de todos genes usados para el
moacutedulo de biosensor y para el moacutedulo de bacteriocina
Se creoacute una carpeta nombrada ldquoSignal and fusion peptidesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 611 hasta 618 y en esta se
encontraraacute la subcarpeta ldquoMapa Geneacutetico de vectores de expresioacuten de expresioacuten
pETNL y pSmbP-LnqQrdquo Ademaacutes se entregaron tres archivos PDF donde dos de
eacutestos archivos contienen datos predictivos de la estructura secundaria y terciaria
de los productos de pETNL ldquoPhyre2 pETNLpdfrdquo y de pSmbP-LnqQ ldquoPhyre2
pSmbP-LnqQrdquo a traveacutes de la aplicacioacuten en liacutenea Phyre2 y el otro archivo PDF
ldquoSimulacioacuten agarosa 1pdfrdquo que contiene una simulacioacuten en gel de agarosa 1
(pv) de los productos lineales de los vectores de expresioacuten pET30a(+) pETNL y
pSmbP-LnqQ En la carpeta de este capiacutetulo tambieacuten se entregaron cinco archivos
en formato dna que contienen la informacioacuten nucleotiacutedica de la construccioacuten de
los vectores de expresioacuten cuyos nombres son ldquopET30(a)-NAmyE-LnqQ
pETNLpdfrdquo ldquopET-30a(+)pdfrdquo ldquopET-30a(+)-N-AmyEpdfrdquo ldquopET30a-SmbPpdfrdquo y
ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01pdfrdquo Todos los archivos estaacuten marcados con sus
respectivas caracteriacutesticas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 108
Resumen autobiograacutefico
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
Candidato para el grado de
Doctor en Ciencias con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Tesis Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing de
Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Edad 31 antildeos
Campo de estudio Desarrollo de agentes terapeacuteuticos y biologiacutea sinteacutetica
Biografiacutea Nacido en Monterrey Nuevo Leoacuten el diacutea 24 de julio de 1990 hijo de
Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas
Educacioacuten Egresado de Licenciado en Biotecnologiacutea Genoacutemica (UANL) en el
2013 y Maestro en Ciencias con Acentuacioacuten en Microbiologiacutea (UANL) en 2015
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 109
REFERENCIAS
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UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 138
iii
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada iv
CONTRAPORTADA
RESUMEN
Diego Francisco Beniacutetez Chao Fecha de graduacioacuten 2021
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
Facultad de Ciencias Quiacutemicas
Tiacutetulo de Estudio Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing
de Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Nuacutemero de paacuteginas 156 Candidato para el Grado de Doctor en Ciencias con
Orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Aacuterea de estudio Microbiologiacutea Aplicada Biologiacutea Sinteacutetica y Bacteriocinas
Propoacutesito y Meacutetodo de Estudio El incremento de infecciones por S aureus
resistentes a meticilina (MRSA) ha ganado importancia en los sistemas de salud
puacuteblicos mundiales en las uacuteltimas deacutecadas Diversos agentes terapeacuteuticos
alternativos a los antibioacuteticos han sido desarrollados para el tratamiento de este
tipo de infecciones Recientemente bajo los principios de la Biologiacutea Sinteacutetica
se han habilitado ceacutelulas enteras que sirvan como biosensores detectando
moleacuteculas producidas por patoacutegenos y que como resultado liberen una
sustancia antimicrobiana que erradique al patoacutegeno como las bacteriocinas
Actualmente los peacuteptidos sentildeales y los peacuteptidos de fusioacuten han sido
ampliamente usados para mejorar la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas
en sistemas recombinantes En este trabajo presentamos el disentildeo in silico que
emula a E coli para que actuacutee como biosensor al detectar moleacuteculas de
Quorum Sensing (QS) de MRSA productoras de sentildeales AIP-II y que en
respuesta produzca Lacticina Q (LnqQ) una bacteriocina con antecedentes
contra ceacutelulas MRSA Adicionalmente experimentamos la capacidad del
peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la produccioacuten
heteroacuteloga de LnqQ en el periplasma y el citoplasma de ceacutelulas de E coli
respectivamente
Contribuciones y Conclusiones En primera instancia se construyeron dos moacutedulos
geneacuteticos biosensor y de bacteriocina ambos moacutedulos fueron ensamblados en
el plaacutesmido Dual Biosensor-Killer Ambos moacutedulos fueron optimizados para su
expresioacuten en E coli para incrementar el rendimiento de produccioacuten de proteiacutenas
recombinantes El anaacutelisis predictivo del vector nos permite intuir que su efecto
en las ceacutelulas E coli las emulariacutea para detectar moleacuteculas de QS producidas
por MRSA productoras de AIP clase II y ademaacutes para producir y excretar LnqQ
en funcioacuten a la concentracioacuten externa al peacuteptido autoinductor de MRSA Los
resultados predictivos abren la posibilidad de disentildear antibioacuteticos terapeacuteuticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada v
inteligentes que puedan atacar patoacutegenos de resistencia Con relacioacuten al
peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP observamos que nivel
predictivo ambos eran candidatos potenciales para la produccioacuten periplaacutesmica y
citoplaacutesmica de LnqQ en ceacutelulas de E coli respectivamente Sin embargo
nuestros resultados experimentales demostraron que la bacteriocina LnqQ no
logroacute ser producida ni purificada cuando estuvo acoplada con N-AmyE o SmbP
Estos resultados enriquecen la literatura sobre ambas etiquetas proteicas asiacute
como tambieacuten descubrimos puntos a consideracioacuten que pudieran ser
importantes en afectar la produccioacuten y purificacioacuten cuando LnqQ es acoplada
con diferentes etiquetas proteicas en ceacutelulas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vi
PRESENTACIOacuteN
CONTROL POBLACIONAL Y OSCILATORIO UTILIZANDO EL QUORUM
SENSING DE Staphylococcus aureus MEDIANTE UN CIRCUITO GENEacuteTICO
DE Escherichia coli
Presentado por
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
El presente proyecto fue mayormente realizado en las instalaciones del
Laboratorio de Biologiacutea Sinteacutetica y de Sistemas del Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con la asesoriacutea del Dr Joseacute Rubeacuten
Morones Ramiacuterez y en el menor medida en el Laboratorio de Expresioacuten y
Purificacioacuten de Proteiacutenas unidad perteneciente a la Facultad de Ciencias
Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con apoyo del Dr Xristo
Zaacuterate Kalfoacutepulos Este proyecto fue auspiciado por el Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) mediante el apoyo con el Beca Nacional de
Posgrado (nuacutemero de becario 289476)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vii
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) por el apoyo
brindado con la Beca Nacional de Posgrado con nuacutemero de becario 289476
(CVU no 516171) para la continuacioacuten de estudios
A la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) y a la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten (UANL) por el apoyo otorgado con la aprobacioacuten de becas y por el
uso directo e indirecto de sus instalaciones materiales y equipos
Al Dr Joseacute Rubeacuten Morones Ramiacuterez mi asesor a quien agradezco por la
oportunidad de colaborar en el equipo de investigacioacuten Nanobiotechnology
Research Group (NBR) Externo mi agradecimiento por las asesoriacuteas y el uso
de instalaciones equipos y materiales en el Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea (CIBYN) asiacute como el financiamiento para la
obtencioacuten de materiales de experimentacioacuten y ejecucioacuten de servicios y el
mejoramiento de mi vida profesional
Al MC Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros y al Dr Angel Leoacuten Buitimea
miembros del NBR y quienes fueron clave en la elaboracioacuten de este proyecto
asiacute como en los artiacuteculos cientiacuteficos redactados durante el proceso doctoral
Al Dr Xristo Zaacuterate Kalfoacutepulos miembro del comiteacute tutorial por su apoyo
teacutecnico y asesoriacutea por el equipo de investigacioacuten del Laboratorio de Expresioacuten y
Produccioacuten de Proteiacutenas (PEP) El agradecimiento se extiende a David Peacuterez
Bryan Santos y Jessica Goacutemez por sus importantes contribuciones
A los demaacutes miembros NBR asiacute como del comiteacute tutorial por sus comentarios
revisiones y asesoriacuteas en la elaboracioacuten de este proyecto
A mis padres Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas y a mi
hermano Angel Alejandro Beniacutetez Chao por su apoyo emocional e
incondicional en el transcurso de este proyecto
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada viii
DEDICATORIA
Para Dios iexclGracias por el don de pensar
Para mi mamaacute Lupita y mi papaacute Alejandro
Para mis hermanos Angel Alejandro y Jesuacutes Alejandro (+)
Para mis mejores amigos Esthela Maldonado Ricardo ldquoMankisrdquo Garciacutea Ricardo ldquoCiegordquo
Garciacutea Edgar ldquoBomboacutenrdquo Villareal Gerardo ldquoPepisrdquo Villarreal Mayela ldquoMonkeyrdquo Maldonado
Aniluacute Maldonado Eduardo Mendoza Alejandra Villarreal Isaac ldquoBebordquo Gonzaacutelez Cristy Llanes
Salma Alemaacuten iexclGracias por ser tan importantes para miacute
Para mis colegas del NBR muy en especial para Paco Balderas Angel Leoacuten Javier Garza
Paco ldquoNegrordquo Rodriacuteguez Dago Torres Luis Cepeda Albert Lerma Jordy Lerma Ceacutesar Garza
Alex de la Garza Isabel Caamal Gricelda Mendiola Fatemehalsadat Tabatabaeifar Hossein
Alishaharatobotni Nahid Rafiei y otros maacutes Se extiende la dedicatoria a mis colegas en PEP en
especial para David Peacuterez Jessica Goacutemez Brayan Santos Evelyn Martiacutenez
Para los que fueron mis estudiantes de verano o de servicio social con mencioacuten especial para
Montse Villegas Rauacutel Garciacutea Cinthia Castillo Sarai Fierros Jessica Ojeda y otros maacutes
Para mis colegas de generacioacuten de doctorado en especial para Paco Balderas David Peacuterez y
Gaby Quintanilla
Para el equipo administrativo del CIBYN con menciones especiales para Karla Islas y Mayra
Sandoval asiacute como de todo el equipo de intendencia muy en especial para la Sra Antonia
ldquoTontildeitardquo Sandoval y la Sra Martha Flores asiacute como para el guardia Nehemiacuteas y el chofer
Ernesto
Para el equipo administrativo de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
con mencioacuten especial para Karina Navarro y para la Sra Edmunda de intendencia
Para mis queridos perros muy en especial para Lucky Toby (+) y Pelusa (+)
Para mis ex alumnos de preparatoria del Centro Escolar Gante iexclLo logreacute
Para todos los que han trabajado como meseros y repartidores para continuar con sus estudios
yo sostener una familia iexclUstedes tienen mis maacutes sinceros respetos
Para todos los que han roto rompen y romperaacuten los liacutemites de lo conocido
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada ix
Si nos negamos categoacutericamente a reconocer que somos susceptibles de
cometer un error una equivocacioacuten profunda ndash nos acompantildearaacute siempre Pero
si somos capaces de evaluarnos con un poco de coraje por muy lamentables
que sean las reflexiones que podamos engendrarnos nuestras posibilidades
mejoran enormemente
Carl Sagan
El mundo y sus demonios La ciencia como una luz en la obscuridad (1995)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada x
TABLA DE CONTENIDO
PORTADA I
FIRMAS DE APROBACIOacuteN DE TESIS II
FIRMAS DE REVISIOacuteN DE TESIS III
CONTRAPORTADA IV
RESUMEN IV
PRESENTACIOacuteN VI
AGRADECIMIENTOS VII
DEDICATORIA VIII
TABLA DE CONTENIDO X
LISTA DE FIGURAS XIV
LISTA DE TABLAS XV
LISTA DE ABREVIATURAS XVI
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN 1
11 ERA DE LOS ANTIBIOacuteTICOS 1
12 INFECCIONES RESISTENTES A LOS ANTIBIOacuteTICOS AMENAZA MUNDIAL 2
13 PROBLEMA SANITARIO CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTES 4
14 TRATAMIENTOS ACTUALES PARA EL COMBATE A INFECCIONES RESISTENTES 5
15 TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS A LOS ANTIBIOacuteTICOS 6
CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES 8
21 CONTROL BIOLOacuteGICO POBLACIONAL POR MICROORGANISMOS 8
22 BIOLOGIacuteA SINTEacuteTICA Y SU PAPEL EN PRODUCCIOacuteN DE BACTERIOCINAS 8
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica 8
222 Definicioacuten de los biosensores 9
23 QUORUM SENSING COMUNICACIOacuteN ENTRE CEacuteLULAS 10
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus 11
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD 12
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA 12
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada 12
24 BIOSENSORES DE CEacuteLULAS ENTERAS BASADOS EN DETECCIOacuteN DE QS 13
25 LAS BACTERIOCINAS 15
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas 15
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos 17
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xi
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes 19
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos 19
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas 20
256 La bacteriocina Lacticina Q 21
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados 22
26 PRODUCCIOacuteN HETEROacuteLOGA DE BACTERIOCINAS 23
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE 24
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP 25
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS 26
31 Justificacioacuten 26
32 Hipoacutetesis 28
33 Objetivo General 28
34 Objetivos Especiacuteficos 28
35 Metas 29
36 Aportacioacuten cientiacutefica 29
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA 30
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 30
42 Cepas bacterianas 30
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina 31
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 33
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas 33
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 34
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 34
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 34
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 35
410 Prediccioacuten de alergenicidad 35
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 35
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 37
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 38
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 38
415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 39
418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 44
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en los geles 48
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xii
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS 50
51 Materiales y reactivos 50
52 Equipos de laboratorio 51
53 Lugares de experimentacioacuten 53
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos 53
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES 54
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 54
62 Cepas bacterianas 55
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina 55
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 57
65 Optimizacioacuten de los codones nativos 60
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 61
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 64
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 64
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 65
610 Prediccioacuten de alergenicidad 67
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 67
612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 72
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 73
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 73
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 74
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 75
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 78
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 84
619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de proteiacutenas 95
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES 105
ANEXOS 106
Divulgacioacuten de la investigacioacuten 106
Archivos de disentildeo 107
Resumen autobiograacutefico 108
REFERENCIAS 109
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiii
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 CONCEPTO DEL BIOSENSOR BASADO EN CEacuteLULAS ENTERAS 30
FIGURA 2 SISTEMA QS PARA DETECCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE S AUREUS 54
FIGURA 3 MOacuteDULOS BIOSENSOR Y DE BACTERIOCINA 55
FIGURA 4 ESTRATEGIA DE CONSTRUCCIOacuteN IN SILICO 58
FIGURA 5 REPRESENTACIOacuteN ESQUEMAacuteTICA DEL VECTOR DUAL BIOSENSOR-KILLER 59
FIGURA 6 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE N-AMYELNQQ 76
FIGURA 7 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE SMBP-LNQQ 76
FIGURA 8 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE N-AMYELNQQ 77
FIGURA 9 PREDICCIOacuteN DE HEacuteLICES TRANSMEMBRANALES PARA N-AMYELNQQ 77
FIGURA 10 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE SMBP-LNQQ 78
FIGURA 11 TRANSFORMACIOacuteN DE E COLI DH5Α Y BL21 (DE3) CON PET30A(+) PETNL Y PSMBP-LNQQ 79
FIGURA 12 GEL DE AGAROSA CON PLAacuteSMIDOS PETNL Y PSMBP-LNQQ 80
FIGURA 13 SIMULACIOacuteN DE PCR PARA VECTORES DE EXPRESIOacuteN 83
FIGURA 14 PCR DE PETNL 84
FIGURA 15 PCR DE PSMBP-LNQQ 84
FIGURA 16 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON PETNL INDUCIDO A 25degC 87
FIGURA 17 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PETNL INDUCIDO A 37degC 88
FIGURA 18 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 91
FIGURA 19 GEL DE E COLI ORIGAMI PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 92
FIGURA 20 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 37degC 93
FIGURA 21 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 25degC 94
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xv
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 USO DE CODONES PREVIO Y DESPUEacuteS DE LA OPTIMIZACIOacuteN 61
TABLA 2 PREDICCIOacuteN DE COMUNICACIOacuteN CRUZADA 63
TABLA 3 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD DE PROTEIacuteNAS 64
TABLA 4 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN SUBCELULAR DE PROTEIacuteNAS 65
TABLA 5 PREDICCIOacuteN DE EPIacuteTOPOS DE CEacuteLULAS B EN LNQQ 66
TABLA 6 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE N-AMYELNQQ 69
TABLA 7 SECUENCIAS UTILIZADAS PARA PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE N-AMYELNQQ 70
TABLA 8 PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE PEacutePTIDO SENtildeAL N-AMYE 71
TABLA 9 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE SMBP-LNQQ 73
TABLA 10 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
TABLA 11 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN CELULAR N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvi
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Significado
E coli Escherichia coli
S aureus Staphylococcus aureus
MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina
L lactis Lactococcus lactis
ESKAPE Acroacutenimo de seis especies bacterianas Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
QS Quorum Sensing (Percepcioacuten de Quoacuterum)
LnqQ Lacticina Q
agrBDCA Operoacuten agr de S aureus
agrB Gen que codifica AgrB
agrD Gen que codifica AgrD
HSL Moleacutecula homo serilactonado
AIP Moleacutecula autoinductora
agrC Gen que codifica AgrC
agrA Gen que codifica AgrA
AgrB Transportadora proteasa necesaria para la maduracioacuten de AgrD
AgrD Peacuteptido precursor a la moleacutecula autoinductora
AgrC Receptor transmembranal con actividad histidina quinasa
AgrA Proteiacutena reguladora de unioacuten al DNA de respuesta
AgrA-P AgrA fosforilado
pH Potencial de hidroacutegeno
pI Punto isoeleacutectrico
AMP Peacuteptidos antimicrobianos
kDA Kilo Dalton
MIC Concentracioacuten miacutenima inhibitoria
microM Micromolar
microgml Microgramo por mililitro
lnqRQBCDEF Cluacutester geneacutetico
AmyE Alfa-amilasa
N-AmyE Peacuteptido sentildeal de la AmyE
SmbP Proteiacutena pequentildea de unioacuten a metales
SmbP Regioacuten citoplaacutesmitica de la SmbP (peacuteptido de fusioacuten)
Ala33 Las letras indican el aminoaacutecido y los nuacutemeros la posicioacuten en la cadena
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranoacutesido
SBP Massachussets Institute of Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts
KEGG Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes
FPB FP Base
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvii
PDB Protein Data Bank
nm Nanoacutemetros
DBK Plaacutesmido Dual Biosensor Killer
CAI Caacutelculo de Iacutendice de Adaptacioacuten
CUD Codon Usage Database
BUSCA Bologna Unified Subcellular Component Annotador
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
pET30(+)a Plaacutesmido tipo pET30(+)a sin modificaciones
pETNL Plaacutesmido que contiene N-AmyELnqQ6xHis
pSmPc-LnqQ Plaacutesmido que contiene SmbP-LnqQ
LB Medio de cultivo LB
OD600 Densidad oacuteptica
microl Microlitros
microg Microgramos
degC Grados Celsius
h Hora
ml Mililitro
g Gramo
g Fuerza centriacutefuga relativa
rpm Revoluciones por minuto
min Minuto
dNTPs Trifosfatos de desoxinucleoacutetidos
V Volts
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
pv Peso volumen
NaCl Cloruro de sodio
Tris-HCl Solucioacuten de Tris ajustada con aacutecido clorhiacutedrico (HCl)
M Molar
SDS Dodecil Sulfato Soacutedico
APS Persulfato de amonio
TEMED Tetramethylethylenediamine
X Veces de concentracioacuten de trabajo
mm Miliacutemetros
lnqQ Gen de lacticina Q
P2 Promotor 2 inducible del operoacuten agr de S aureus
gfp Gen de GFP
GFP Proteiacutena verde fluorescente
J23110 Promotor J23110 constitutivo para E coli
AIP-I AIP clase I
AIP-II AIP clase 2
AIP-III AIP clase 3
AIP-IV AIP clase 4
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xviii
Ala Alanina (A)
Arg Arginina (R)
Asn Asparagina (N)
Asp Asparato (D)
Cys Cisteiacutena (C)
Gln Glutamina (Q)
Glu Glutamato (E)
Gly Glicina (G)
His Histidina (H)
Ile Isoleucina (I)
Leu Leucina (L)
Lys Lisina (K)
Met Metionina (M)
Phe Fenilalanina (F)
Pro Prolina (P)
Ser Serina (S)
Thr Treonina (T)
Trp Triptoacutefano (W)
Tyr Tirosina (Y)
Val Valina (V)
Pnl Liasa de pectina
AmyE Amilasa E
N-AmyEPnl Liasa de pectina asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
N-AmyEAmyE Amilasa E asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
VpDef Defensina de Venerupis philippinarum
Bin1b Defensina de Rattus norvegicus
LL-37 Catelicidina de humanoschimpanceacutes
SmbP-VpDef VpDef asociado con SmbP
SmbP-Bin1b Bin1b asociado con SmbP
SmbP-LL-37 LL-37 asociado con SmbP
SUMO-LnqQ LnqQ asociado con SUMO
AI Iacutendice alifaacutetico
GRAVY Iacutendice de hidrofobicidad
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN
A lo largo de nuestra historia los humanos hemos desarrollado soluciones a los
problemas del mundo que nos rodea No es extrantildeo que el combate a las
enfermedades sean uno de los temas maacutes recurrentes Existen referencias
histoacutericas entre las diferentes civilizaciones de la antiguumledad como los chinos
(Nicola amp Abagyan 2009) aztecas (Davidson amp De Montellano 1983) y los nubia-
sudaneses (Bassett Keith Armelagos Martin amp Villanueva 1980) del uso
empiacuterico de sustancias para tratar infecciones y enfermedades Hace unos
doscientos antildeos atraacutes se pensoacute que los subproductos de la revolucioacuten industrial
seriacutean tratamiento efectivo contra infecciones y aunque los resultados fueron
alentadores al principios los resultados observados ante otro tipo de infecciones
no tuvieron el mismo eacutexito (Gaynes 2017)
11 Era de los antibioacuteticos
En 1928 Alexander Fleming encontroacute una solucioacuten efectiva para contrarrestar las
infecciones al describir al hongo Penicillium notatum que teniacutea efectos antagoacutenicos
sobre diferentes cepas estafilocoacutecicas (Fleming 1929) inaugurando asiacute la
conocida era dorada en descubrimiento de los antibioacuteticos (Podolsky 2018) Las
virtudes observadas en los antibioacuteticos fueron raacutepidamente puestas en juicio
cuando el mismo Fleming vaticinoacute en su discurso de entrega al premio Nobel que
el abuso y uso excesivo de los antibioacuteticos podriacutea generar brotes de patoacutegenos
resistentes a los antibioacuteticos (Fleming 1945) Cada vez que un nuevo antibioacutetico
era liberado a los sistemas de salud puacuteblicos pronto se reportaba un brote de
resistencia relacionado a antibioacutetico (Clatworthy Pierson amp Hung 2007) Con el
boom de nuevas clases de antibioacuteticos desde los 1940s hasta principios de 1970s
la alerta por resistencia a los antibioacuteticos quedoacute praacutecticamente inadvertida De
hecho entre los 1960s y 1970s existe evidencia que la comunidad cientiacutefica
internacional fue apaacutetica y minimizoacute el hecho de que el abuso de los antibioacuteticos
fuera una causa de resistencia a los faacutermacos en las bacterias patoacutegenas
(Podolsky 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 2
El tema de la resistencia a los antibioacuteticos no tuvo impacto suficiente hasta que
con el paso de las deacutecadas surgieron de brotes de patoacutegenos resistentes de
importancia cliacutenica como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA
por sus siglas en ingleacutes) tanto en Reino Unido (Gardner Oxon Stamp Bowgen amp
Moore 1962) como en Estados Unidos (Barrett McGehee amp Finland 1968) y
ademaacutes las nuevas clases de antibioacuteticos empezaron a escasear desde los 1980s
hasta casi los 2000s Adicionalmente los inversionistas se motivaron a encontrar
nuevas clases antibioacuteticos al observar maacutes ganancias en descubrir compuestos
anticanceriacutegenos (Ventola 2015) los reglamentos sanitarios se volvieron maacutes
estrictos para la liberacioacuten de antibioacuteticos para prevenir la presentacioacuten de
infecciones multirresistentes emergentes (Davies 2006) Todos estos factores
incluyendo otros que tal vez no fueron mencionados allanaron el establecimiento
de poliacuteticas en salud puacuteblica para buscar o sintetizar alguacuten faacutermaco o sustancia
que contrarreste el avance de microorganismos patoacutegenos resistentes de
relevancia cliacutenica (World Health Organization 2017)
12 Infecciones resistentes a los antibioacuteticos amenaza mundial
Cifras de la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) mostraron el peligroso
ascenso de infecciones por bacterias resistentes en las uacuteltimas deacutecadas donde se
calcula un promedio de 700000 muertes anuales para el 2019 (World Health
Organization 2019b) y la advertencia de que si los gobiernos y organizaciones
responsables de la salud puacuteblica a nivel mundial no elaboran poliacuteticas efectivas
para el 2050 tendremos un promedio de 10 millones de muertes al antildeo por
consecuencias de este tipo de infecciones (Dadgostar 2019)
En Meacutexico carecemos de un sistema de recoleccioacuten de datos confiables en este
tipo de infecciones (Amabile-Cuevas 2010) pero en un estudio realizado durante
seis meses del 2019 se recuperaron 23000 cepas resistentes a faacutermacos en 47
centros de salud puacuteblicos de todo el paiacutes siendo algunas de las maacutes comunes E
coli Klebsiella sp Enterobacter sp Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter sp
Enterococcus faecium resistente a vancomicina y Staphylococccus aureus
resistente a meticilina (MRSA) (Vazquez-Rodriguez et al 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 3
En todas las regiones del mundo las infecciones resistentes han tenido un
peligroso ascenso En Estados Unidos las muertas anuales por infecciones
resistentes pasaron de 23000 muertes en 2013 (Frieden 2013) a 35000 durante
el 2019 (CDC 2019) Por otro lado en Europa las muertes atribuibles a
infecciones resistentes aumentaron de 25000 en 2007 (European Centre for
Disease Prevention and Control 2009) a 33110 en 2015 (Cassini et al 2019) En
42 paiacuteses del continente africano se registraron 54000 casos atribuibles a
tuberculosis multirresistente (MDR multi-resistant) y en ocho paiacuteses se registraron
3200 muertes relacionadas a la variante extremadamente resistente (XDR
extreme resistant) en un periacuteodo del 2004 al 2011 (Ndihokubwayo et al 2013) En
el continente asiaacutetico en China por ejemplo el rango de bacterias aislados que
eran resistentes a los antibioacuteticos pasoacute de 22774 casos a 190610 de 2005 a
2017 respectivamente (Qu Huang amp Lv 2019) en la India un estudio reporta
que el 70 de aislados cliacutenicos tipo Gram negativos son resistentes a los
faacutermacos y entre ellos se podiacutean encontrar cepas de Escherichia coli Klebsiella
pneumoniae Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa (Taneja amp
Sharma 2019)
Las infecciones resistentes son material incluso de intereacutes para el sector
econoacutemico El Banco Mundial ha elaborado dos escenarios para predecir el
impacto econoacutemico de las infecciones resistentes para el 2050 en un escenario
de bajo impacto el Producto Interno Bruto (PIB) mundial podriacutea disminuir hasta un
11 Sin embargo en un escenario de alto impacto el dantildeo al PIB global podriacutea
representar hasta una disminucioacuten de 38 Los costos al sistema de salud
puacuteblico en el mundo podriacutean oscilar entre los $300 mil millones a $1 cuatrilloacuten
presentando incluso un serio riesgo para el sector ganadero ya que en el
escenario de bajo impacto esto representariacutea una disminucioacuten de 26 esperado
a un 75 en un escenario de alto impacto (The World Bank 2016)
Las infecciones resistentes representa un punto de intereacutes incluso para la
Organizacioacuten de la Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
Food and Agriculture Organization) ya que actualmente se presume que en 42
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 4
paiacuteses donde existen datos confiables de consumo de antibioacuteticos en el sector
ganadero y de agricultura se estima que en el 2010 el consumo era de 63000
toneladas de antibioacuteticoantildeo mientras que para el 2030 se estima un consumo
105600 toneladas de antibioacuteticoantildeo representando un incremento de 67 Los
iacutendices de metabolizacioacuten de antibioacuteticos tanto en ganado como en produccioacuten
pesquera presentan una baja metabolizacioacuten ya que entre un 70-80 y un 75-
90 respectivamente son excretados a las fuentes acuiacuteferas La produccioacuten de
cultivos consume entre un 02 a 04 del total de antibioacuteticos en relacioacuten con la
produccioacuten ganadera (FAO sf)
La relevancia sanitaria mundial de S aureus es porque se trata de un miembro del
grupo ESKAPE un grupo de patoacutegenos localizados en infraestructuras
hospitalarias asilos o en equipos e instrumentos meacutedicos como ventiladores y
cateacuteteres y que son habitualmente resistentes a los antibioacuteticos (Rice 2008) Esta
bacteria es la primera causa nosocomial tanto en Latinoameacuterica (26)
Norteameacuterica (260) y la segunda causa nosocomial de Europa (195)
(Biedenbach Moet amp Jones 2004) Se presume que un 30 de la poblacioacuten total
de humanos estaacute colonizado con al menos una subespecie de S aureus
(Wertheim et al 2005) y esto podriacutea ser porque el haacutebitat de esta bacteria en los
humanos es la parte anterior de las fosas nasales (Mulcahy amp McLoughlin 2016)
13 Problema sanitario con Staphylococcus aureus resistentes
S aureus es una bacteria Gram positiva y es considerada una de las principales
causas de enfermedades en piel (Foster 1996) Ademaacutes es capaz de desarrollar
biopeliacuteculas en dispositivos implantados en seres humanos y cateacuteteres causando
infecciones croacutenicas y persistentes (Dunne 2002) La osteomielitis y periodontitis
tambieacuten son producto de la biopeliacutecula este patoacutegeno estaacute involucrado en heridas
croacutenicas en pacientes diabeacuteticos con uacutelceras y estaacute relacionado a infecciones al
endocardio oculares y en casos de rinosinusitis croacutenica (Archer et al 2011) Se
considera que es un patoacutegeno de alto riesgo para pacientes con Fibrosis Quiacutestica
ya que es el maacutes reportado entre personas con 11 a 15 antildeos con esta condicioacuten
(Razvi et al 2009)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 5
Ahora bien se estima que entre un 13 al 74 del total de infecciones resistentes
en el mundo son causados por una variante resistente de S aureus resistente a la
meticilina la cepa MRSA (Koumlck et al 2010) la cual estaacute es sentildealada desde el
2017 por la OMS como un patoacutegeno de alta prioridad al que debe encontrarse una
solucioacuten pronta y efectiva (World Health Organization 2017) Por ejemplo en
Estados Unidos el total de pacientes por infecciones nosocomiales tipo MRSA
ascendioacute de 24 en 1975 a un 29 en 1991 (Panlilio et al 1992) y hasta casi
57 para el antildeo 2000 (NNIS 2004) En la actualidad el MRSA es considerado
endeacutemico en ese paiacutes ya que se estima que el 2 de la poblacioacuten es acarreador
de este estafilococo (Kavanagh 2019)
En Meacutexico los primeros casos de MRSA asociado a comunidad (CA-MRSA) cepa
USA300 fueron reportados a inicios del 2008 (Mariacutea E Velazquez-Meza et al
2011) y durante el 2010 un estudio anuncioacute que la cepa de MRSA maacutes
frecuentemente aislada en nuestro paiacutes era la New YorkJapan (Rodriacuteguez-
Noriega et al 2010) Tambieacuten se conoce que cepas de MRSA en hospitales
puacuteblicos en nuestro paiacutes fluctuoacute entre un 7 al 30 en pacientes entre las
deacutecadas de 1980s a 2000s (M E Velazquez-Meza et al 2004) mientras que el
Instituto Nacional de Cancerologiacutea determinoacute que 17 de las cepas aisladas de
3000 hemocultivos recuperados entre el 2005 al 2015 de pacientes con caacutencer
correspondiacutean a MRSA (Velaacutezquez-Acosta Cornejo-Juaacuterez amp Volkow-Fernaacutendez
2018)
14 Tratamientos actuales para el combate a infecciones
resistentes
En la actualidad las clases maacutes comunes de antibioacuteticos para combatir
infecciones resistentes a los antibioacuteticos son las penicilinas cefalosporinas
quinolonas macroacutelidos tetraciclinas glucopeacuteptidos y monobactaacutemicos (Taylor
Stapleton amp Paul Luzio 2002) En las uacuteltimas dos deacutecadas se han aprobado una
gran variedad de antibioacuteticos para el tratamiento de infecciones causados por
bacterias tanto Gram positivos como Gram negativos Los antibioacuteticos maacutes
recientemente reportados para el tratamiento de bacterias multirresistentes Gram
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 6
positivas incluyen β-lactaacutemicos (ceftarolina y ceftobiprol) glicopeacuteptidos
(dalbavancin oritavancin y telavancin) oxazolidinonas (tedizolid fosfato)
quinolonas (besifloxacina delafloxacin y ozenoxacina) y tetraciclinas
(omadaciclina) (Koulenti et al 2019) Seguacuten la OMS hasta el 2019 se sabe de 50
agentes antimicrobianos que se encuentran en desarrollo cliacutenico donde 32 son
antibioacuteticos activos contra patoacutegenos de prioridad de la OMS diez son agentes
bioloacutegicos 2 son clasificados como agentes novedosos y dos pertenecen al grupo
de bacterias Gram negativas multirresistentes (World Health Organization 2019a)
15 Tratamientos alternativos a los antibioacuteticos
Los patoacutegenos resisten a los antibioacuteticos bajo tres grandes mecanismos de
resistencia intriacutenseca adaptativa yo adquirida (Arzanlou Chai amp Venter 2017
Blair Webber Baylay Ogbolu amp Piddock 2015 Sandoval-Motta amp Aldana 2016)
Es por ello que urge desarrollar una solucioacuten pronta y efectiva para contrarrestar
las infecciones causadas por patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos los cuales
son uno de los puntos que la OMS ha declarado como prioritarios (OrsquoNeill 2016)
En la guerra contra la resistencia a los antibioacuteticos nuestro grupo de investigacioacuten
ha participado en la creacioacuten de compuestos que puedan combatirlos como
tratamientos mixtos de antibioacuteticos (Montelongo-Peralta Leoacuten-Buitimea Palma-
Nicolaacutes Gonzalez-Christen amp Morones-Ramiacuterez 2019) nanopartiacuteculas de plata
asociados con metales de transicioacuten (Javier A Garza-Cervantes et al 2017)
nanomateriales asociados con nanopartiacuteculas de plata sintetizados con poliacutemeros
sensibles al ambiente (Ruben Morones amp Frey 2007) o producidos de manera
sustentable (Escaacutercega-Gonzaacutelez et al 2018) o a partir de un exopolisacaacuterido
producido por una levadura que actuacutea como agente reductor y que estaacuten
capeados por agentes con actividad antimicrobiana y antibiopeliacutecula (Javier
Alberto Garza-Cervantes et al 2019)
Otros grupos de investigacioacuten tambieacuten han desarrollado otro tipo de armas contra
la resistencia a los antibioacuteticos como el uso de teacutecnicas de decorado en
bacterioacutefagos (phage display) para producir vacunas en la caacutepside de
bacterioacutefagos inhabilitados (Bao et al 2019) o uso de agentes de control bioloacutegico
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contra patoacutegenos de alimentos (Gutieacuterrez Fernaacutendez Rodriacuteguez amp Garciacutea 2019)
o para el tratamiento de aguas residuales (Jassim Limoges amp El-Cheikh 2016)
Los esfuerzos actuales se han focalizado en encontrar yo desarrollar nuevas
clases de antibioacuteticos y agentes antimicrobianos contra bacterias resistentes (Fair
amp Tor 2014) y de prioridad ante la OMS (World Health Organization 2017) Las
corrientes alternativas a los antibioacuteticos maacutes reconocidas en la actualidad estaacuten
clasificadas en dos grandes enfoques el enfoque de prevencioacuten a las
enfermedades donde se desarrollan y se utilizan vacunas probioacuteticos o
prebioacuteticos mientras que en el enfoque por tratamiento a las enfermedades se
utilizan la terapia de fagos la aplicacioacuten directa de endolisinas yo exolisinas el
uso de microorganismos depredadores vivos o el uso directo de bacteriocinas
(Allen Trachsel Looft amp Casey 2014) Tambieacuten la Biologiacutea Sinteacutetica se ha
involucrado en resolver la problemaacutetica de infecciones resistentes a los faacutermacos
al participar en el disentildeo de biosensores basados en ceacutelulas completas que sean
capaces de destruir patoacutegenos mediante la previa de deteccioacuten de moleacuteculas
excretadas por microrganismos de intereacutes (Beniacutetez‐Chao Balderas‐Cisneros
Leoacuten‐Buitimea amp Morones‐Ramiacuterez 2021)
La biosiacutentesis purificacioacuten y aplicacioacuten de bacteriocinas contra patoacutegenos Gram
negativos y Gram positivos ha sido punto central para diversos grupos de
investigacioacuten (Cabral Penumutchu Norris Morones-Ramirez amp Belenky 2018
McAuliffe et al 1998 Rea Ross Cotter amp Hill 2011 Sandiford amp Upton 2012
Wong et al 2015) asiacute como la siacutentesis de nanocompuestos como liposomas
quitosano y nanopartiacuteculas hechos a base de compuestos de plantas (Sidhu amp
Nehra 2017) o de nanofibras (Fahim Khairalla amp El-Gendy 2016) que esteacuten
acomplejados con bacteriocinas Maacutes adelante se describiraacuten detalles sobre las
bacteriocinas y su relacioacuten en el combate a las infecciones resistentes a los
antibioacuteticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 8
CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES
21 Control bioloacutegico poblacional por microorganismos
En la Naturaleza todos los seres vivos estaacuten interactuando y compitiendo por
nichos ecoloacutegicos para sobrevivir crecer y reproducirse para una adaptacioacuten
efectiva en el ambiente donde se desarrollan Este fenoacutemeno es universal ya que
pueden encontrarse en estilos de vida unicelulares y multicelulares (Grice et al
2009) Para competir por los nutrientes los microorganismos contienen
compuestos que matan o limitan el crecimiento de otra poblacioacuten Estos
compuestos pueden ser antibioacuteticos peacuteptidos antimicrobianos moleacuteculas de bajo
peso molecular entre otros maacutes (Gonzalez et al 2011 2010)
Cuando microorganismos vivos por sus caracteriacutesticas bioloacutegicas son usados para
suprimir la densidad poblacional de un tipo especiacutefico de organismo hacieacutendolo
menos abundante o dantildeino se le conoce como control bioloacutegico Es importante
mencionar que esta definicioacuten solo incluye a especiacutemenes vivos como
depredadores paraacutesitos nemaacutetodos hongos bacterias protozoarios inclusive
virus Sin embargo genes sin un recipiente bioloacutegico o metabolitos producidos por
un organismo de control sin que eacuteste se encuentre presente durante el control
poblacional son excluidos de esta definicioacuten (Eilenberg Hajek amp Lomer 2001)
Por ejemplo cultivos de Candida albicans (Peters et al 2010) Pseudomonas
aeruginosa (Filkins et al 2015) Bacillus subtilis (Gonzalez et al 2011)
Enterococcus faecium (Viccedilosa et al 2018) Acanthamoeba polyphaga (de Souza
Soares Benitez amp Rott 2017) disminuyeron la expresioacuten de patogenicidad en S
aureus Incluso cultivos de E coli han mostrado actividad fungicida contra cultivos
de C albicans (Cabral et al 2018)
22 Biologiacutea Sinteacutetica y su papel en produccioacuten de bacteriocinas
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica
La Biologiacutea Sinteacutetica consiste en disentildear libreriacuteas de elementos geneacuteticos como
promotores secuencias codificadoras terminadores factores de transcripcioacuten
entre otras maacutes asiacute tambieacuten se enfoca en el ensamblaje de circuitos geneacuteticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 9
hasta en el disentildeo y creacioacuten de organismos completos Este campo utiliza datos
cuantitativos para crear modelos bioloacutegicos y matemaacuteticos que permitan predecir
el comportamiento de un sistema bioloacutegico (Cameron Bashor amp Collins 2014
Garciacutea-Granados Lerma-Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2019)
En la publicacioacuten de Brophy y Voigt se revisan los principios baacutesicos para el
disentildeo de circuitos geneacuteticos para que los sistemas bioloacutegicos sean emulados
para cumplir con tareas o puedan fabricar materiales es importante considerar la
correcta eleccioacuten de reguladores asiacute como puntos de control que cuantifiquen el
impacto en el rendimiento (Brophy amp Voigt 2014)
222 Definicioacuten de los biosensores
Un sensor quiacutemico es un dispositivo que transforma en una informacioacuten quiacutemica
en una sentildeal analiacutetica de utilidad y puede detectar desde la concentracioacuten de una
muestra especiacutefica hasta el anaacutelisis total de sus compuestos Este tipo de
sensores contiene dos unidades funcionales baacutesicas un receptor y un transductor
El receptor transforma la informacioacuten quiacutemica de la muestra en una forma de
energiacutea que puede ser medido por un transductor El transductor transforma la
energiacutea en una sentildeal analiacutetica uacutetil (Hulanicki Glab amp Ingman 1991) De esta
manera comprendemos que un biosensor es ldquoun dispositivo que a traveacutes de
reacciones especiacuteficas de enzimas aisladas sistemas inmunes tejidos organelos
o ceacutelulas enteras sirve para detectar compuestosrdquo (IUPAC 1992)
Asiacute en los biosensores basados en ceacutelulas completas un analito de intereacutes
ingresa al interior celular y es reconocido por un factor transcripcional el cual
controla la transcripcioacuten de un gen mediante el reconocimiento de un promotor
especiacutefico Estos biosensores pueden reconocer diferentes analitos como
hidrocarburos metales pesados antibioacuteticos (Garnier-Rocha 2019) Incluso
algunos modelos biosensores se han aprovechado del fenoacutemeno de quorum
sensing para crear sistemas de comunicacioacuten sinteacuteticos con la capacidad de
controlar poblaciones (Balagaddeacute et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 10
23 Quorum Sensing Comunicacioacuten entre ceacutelulas
El concepto QS refiere a que es un mecanismo de comunicacioacuten entre
microorganismos que dependen de sentildeales quiacutemicas (moleacuteculas sentildealizadoras)
que son excretadas al medio extracelular y que dependen la densidad celular
(Fuqua Winans amp Greenberg 1994) Las bacterias similares a organismos de
diferentes dominios se sostienen de mecanismos de comunicacioacuten y se valen de
diferentes moleacuteculas Esta interaccioacuten puede ser intriacutenseca (es decir intracelular o
adentro de la misma ceacutelula) o extriacutenseca (es decir extracelular o afuera de la
ceacutelula) y crea un fenotipo de respuesta en una poblacioacuten especiacutefica del mismo
(Fuqua et al 1994)
Mientras los cultivos productores de QS esteacuten creciendo eacutestos pueden producir
excretar acumular y detectar moleacuteculas de sentildealizacioacuten quiacutemicas externas
conocidas como autoinductores los cuales son producidos a niveles basales pero
que se acumulan en el exterior celular Cuando la densidad celular de bacterias y
la concentracioacuten de moleacuteculas autoinductoras alcanzan un umbral de
concentracioacuten especiacutefico el cultivo experimenta un cambio en su fenotipo (Garg
Manchanda amp Kumar 2014 Rutherford amp Bassler 2012) Esta respuesta variacutea
seguacuten el tipo de sentildeal emitido ya que su forma y composicioacuten quiacutemica es diferente
seguacuten la especie que la produzca (Fuqua et al 1994) siendo las respuestas maacutes
comunes la formulacioacuten de esporulados factores de virulencia asociados a
invasioacuten bioluminiscencia virulencia yo la creacioacuten biopeliacuteculas (Miller amp Bassler
2002)
El fenoacutemeno de QS sucede tanto en bacterias productoras Gram negativas y las
Gram positivas pero las moleacuteculas auto inductoras son de diferente composicioacuten
quiacutemica En las bacterias Gram negativas las moleacuteculas de sentildealizacioacuten son
conocidas como homoserina lactonada aciladas (HSL) mientras que en bacterias
Gram positivas el mecanismo es a traveacutes de peacuteptidos excretados (Miller amp
Bassler 2002)
En el modelo general de QS en Gram positivos en primera instancia el gen que
contiene el precursor de la moleacutecula sentildealizadora (tambieacuten conocido como
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autoinductor inmaduro) es transcrito y traducido y eacutesta es posteriormente
parcialmente hidrolizada para crear un autoinductor maduro Eacuteste uacuteltimo es
enviado al exterior celular por un transportador tipo ABC Cuando la concentracioacuten
del autoinductor maduro alcanza un umbral miacutenimo de activacioacuten una proteiacutena
tipo quinasa sensor de histidina localizada en el exterior celular detecta la
presencia de eacutesta mediante un sistema a dos componentes El sensor quinasa se
auto fosforila en un residuo conservado de histidina (H) Despueacutes este grupo
fosforilo es transferido a una proteiacutena reguladora de respuesta adyacente la cual
es fosforilada en un residuo conservado de aspartato (D) La proteiacutena reguladora
de respuesta fosforilado activa la transcripcioacuten de los genes de intereacutes (Miller amp
Bassler 2002)
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus
En S aureus estaacute gobernado por el operoacuten agr que es de un tamantildeo nucleotiacutedico
de 35 kb y se compone de dos unidades transcriptoacutemicas divergentes conocidos
como RNAII y RNAIII los cuales estaacuten gobernados por los promotores P2 y P3
respectivamente (Le amp Otto 2015) El promotor P2 estaacute involucrado en actividades
del QS mientras que el promotor P3 se encarga de la expresioacuten de factores de
virulencia (Miller amp Bassler 2002) como produccioacuten de hemolisinas proteasas
lipasas e indirectamente participan en la liberacioacuten de biopeliacuteculas (Quave amp
Horswill 2014) A nivel geneacutetico la induccioacuten del operoacuten agr depende
parcialmente por la unioacuten de los productos geacutenicos del operoacuten sar en los dos
promotores disponibles del operoacuten agr (Manna Bayer amp Cheung 1998)
El promotor P2 es el de importancia para el sistema QS debido a que el transcrito
resultante agrBDCA produce cuatro proteiacutenas AgrB AgrD AgrC y AgrA los
cuales son los componentes principales del sistema de QS de S aureus A
manera de resumen podemos en global que AgrC y AgrA participan como
elementos biosensores mientras que AgrB y AgrD son los elementos necesarios
para la biosiacutentesis de AIP El AgrD es un peacuteptido precursor a la moleacutecula
autoinductora (AIP por sus siglas en ingleacutes) y el AgrB funciona transportadora
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como proteasa y estaacute involucrada en la maduracioacuten del AIP (Gomes-Fernandes
et al 2017 Horswill Stoodley Stewart amp Parsek 2007)
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD
El gen que produce AgrD se expresa y se traduce en una versioacuten propeacuteptido de la
moleacutecula AIP que sufre de una modificacioacuten postraduccionalmente para que sea
bioloacutegicamente activo La moleacutecula AIP inmadura se compone de tres secciones
conocidas como regioacuten del peacuteptido liacuteder regioacuten madura del AIP y secuencia de
reconocimiento que corresponden a las regiones N- central y C-terminales
respectivamente (B Wang amp Muir 2016)
El AgrD es inicialmente procesado en la regioacuten N-terminal (se compone de 32
residuos) y sirve de guiacutea Eacuteste es translocado a la cara externa de la membrana
celular Mientras la regioacuten peptidasa de la proteiacutena transmembranal AgrB
reconoce la regioacuten N-terminal del AIP inmaduro
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA
AgrC y AgrA funcionan en conjunto con un sistema claacutesico de dos componentes
Donde la proteiacutena transmembranal tipo receptor con actividad histidina quinasa
AgrC se encarga de que detectar las moleacuteculas AIP liberadas al exterior por S
aureus una vez acoplado el AIP con el receptor eacuteste uacuteltimo causa una
autofosforilacioacuten del dominio citoplasmaacutetico del AgrC seguido de la transferencia
del grupo fosfato de la proteiacutena reguladora de respuesta de unioacuten al DNA AgrA
Una vez que AgrA es fosforilado (AgrA-P) eacuteste se une a la regioacuten intergeacutenica de
los promotores P2 y P3 del operoacuten agr (Gomes-Fernandes et al 2017)
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada
Bioquiacutemicamente el AgrD inmaduro tiene un tamantildeo entre 46 a 47 residuos seguacuten
su clase Despueacutes de procesamiento AgrD maduro tiene un tamantildeo final entre 7 a
8 aminoaacutecidos (que variacutea seguacuten la clase) y contiene un anillo tiolactonado
producto de la condensacioacuten entre un grupo tiol de una cisteiacutena interna ubicada
cuatro aminoaacutecidos antes del uacuteltimo aminoaacutecido y el grupo carboxilo del uacuteltimo
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aminoaacutecido (que puede ser metionina o fenilalanina dependiendo la clase) (B
Wang Zhao Novick amp Muir 2015)
En AgrC el dominio que contiene los elementos para deteccioacuten del receptor de la
moleacutecula AIP produce diferentes formas de propeacuteptidos De esta manera se
deduce que cada moleacutecula de AIP producida depende de su propia proteiacutena
detectora AgrC Por tanto la presencia en el medio de moleacuteculas de AIP que no
estaacuten filogeneacuteticamente relacionadas resultan en la inhibicioacuten de QS Es decir
miembros productores del mismo tipo de AIP pueden inducir el comportamiento
tiacutepico por QS pero si los productores no pertenecen al mismo grupo se puede
inhibir su respuesta Este fenoacutemeno es conocido como comunicacioacuten cruzada
(Rutherford amp Bassler 2012) La regioacuten hipervariable del operoacuten agr estaacute ubicado
en el transcrito gobernado por el promotor P2 entre los genes agrC agrD y agrB
Consensualmente se ha determinado cuatro grandes clases de AIP y permite
clasificar a los tipos de S aureus en base a esta regioacuten (Shopsin et al 2003)
24 Biosensores de ceacutelulas enteras basados en deteccioacuten de QS
A continuacioacuten presentamos una compilacioacuten de publicaciones de diferentes
ceacutelulas que fueron modificadas para actuar como biosensores capaces de detectar
moleacuteculas producidas por organismos productores de sentildeales quiacutemicas tipo QS
algunos de los ejemplos mencionados cuentan con la capacidad de producir yo
liberar sustancias antimicrobianas capaces de destruir al productor de esas
sentildeales
Balagaddeacute y otros disentildearon un sistema de comunicacioacuten sinteacutetico conocido como
depredador y presa en la que dos ceacutelulas modificadas de E coli son capaces de
comunicarse -y matar a una de ellas- a traveacutes del sistema de QS En este modelo
las ceacutelulas asignadas como depredadoras producen y liberar moleacuteculas tipo QS
que se difunden en el medio y al llegar a la ceacutelula presa por sus mecanismos
internos activan la produccioacuten una toxina especiacutefica para la ceacutelula asignada como
presa provocaacutendoles la muerte celular Por otro lado las ceacutelulas presas para
evitar su muerte temprana deben producir constantemente una proteiacutena antitoxina
que anule la actividad de la toxina (Balagaddeacute et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 14
Saeidi y sus colaboradores crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basados en la
deteccioacuten del QS al modificar ceacutelulas de E coli para que detectaran moleacuteculas
3OC12 HSL producidas por P aeruginosa En este sistema las moleacuteculas QS son
difundidas a traveacutes del medio y son reconocidas por un factor de transcripcioacuten en
E coli que activa una unidad transcripcional para producir piocianina un
antibioacutetico especiacutefico con actividad contra P aeruginosa y porina E7 un agente
liacutetico especiacutefico contra E coli a medida que aumenta la concentracioacuten de la
moleacutecula QS incrementa la concentracioacuten del antibioacutetico y de la porina Cuando
se acumula suficiente cantidad de porinas en el interior celular las ceacutelulas de E
coli son lisadas y se libera piocianina para finalmente atacar a las ceacutelulas de P
aeruginosa (Saeidi et al 2011) Dos antildeos maacutes tarde Gupta y sus colaboradores
modificaron este biosensor agregando un moacutedulo de excrecioacuten que libera una
sustancia antimicrobiana al exterior a traveacutes de un peacuteptido sentildeal y atacar
especiacuteficamente a P aeruginosa evitando la muerte de la ceacutelula productora de
antibioacutetico (S Gupta Bram amp Weiss 2013)
Marchand y sus colegas crearon un sistema de comunicacioacuten interespeciacutefico para
la interaccioacuten entre dos bacterias con oriacutegenes evolutivos diferentes Bacillus
megaterium (Gram positiva) y E coli (Gram negativa) utilizando el mecanismo del
operoacuten agr de S aureus En este reporte ceacutelulas de E coli fungieron como
productoras de moleacuteculas de QS al expresar las proteiacutenas AgrD y AgrB que en
condiciones nativas producen moleacuteculas de AIP en S aureus Mientras que
ceacutelulas de B megaterium fungieron como biosensores al producir las proteiacutenas
AgrC y AgrA que en condiciones nativas sirven como un sistema a dos
componentes que detectan la presencia externa de la moleacutecula de AIP y activan a
un factor de transcripcioacuten (Marchand amp Collins 2013)
Zeng y sus colaboradores crearon un modelo biomatemaacutetico a partir de una E coli
que funcionara como un biosensor de moleacuteculas de AIP producidas por S aureus
que seriacutea contrarrestado por accioacuten de la lisostafina una bacteriocina de actividad
contra S aureus La simulacioacuten del modelo indicoacute que una ceacutelula de E coli podriacutea
tardar hasta 25 horas en detectar las primeras moleacuteculas de AIP producidas de S
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 15
aureus al tiempo que generariacutea la suficiente concentracioacuten de bacteriocinas para
matar a ceacutelulas de S aureus (Zeng et al 2013)
Borrero y sus colegas crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basado en la
deteccioacuten de moleacuteculas de QS para poder contrarrestar moleacuteculas de QS
producidos por un patoacutegeno de intereacutes cliacutenico resistente a los antibioacuteticos En este
caso ceacutelulas modificadas de Lactobacillus lactis fueron capaces de detectar las
moleacuteculas producidas por Enterococcus faecalis El lactobacilo modificado mostroacute
alta efectividad de tres bacteriocinas producidas para controlar el crecimiento de
este patoacutegeno incluyendo sus variedades multirresistentes (Borrero Chen Dunny
amp Kaznessis 2015)
Holowko y sus colegas desarrollaron ceacutelulas de E coli capaces de sentir
moleacuteculas de QS producidas por Vibrio cholerae (Holowko Wang Jayaraman amp
Poh 2016) Mientras que Lubkowicz y sus colaboradores modificaron ceacutelulas de
Lactobacillus reuteri con la capacidad para detectar moleacuteculas de AIP clase I
producidas por S aureus en rangos de concentracioacuten desde la escala nanomolar
hasta micromolar (Lubkowicz et al 2018)
25 Las Bacteriocinas
En contexto a la anterior seccioacuten una fraccioacuten del total de biosensores de ceacutelulas
enteras disentildeados son capaces de producir y excretar sustancias antimicrobianas
que afecten el crecimiento de ceacutelulas productoras de moleacuteculas QS Para fines de
este trabajo nos referimos a las bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
que pertenece a un grupo de peacuteptidos con actividad antimicrobiana con origen
evolutivo en bacterias los cuales seraacuten descritos a continuacioacuten
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas
Las bacteriocinas son un grupo de peacuteptidos de bajo peso molecular que son
producidos exclusivamente y excretados por bacterias y que tienen la capacidad
de inhibir el crecimiento de otra bacteria Las bacteriocinas pueden ser producidas
in situ por bacterias probioacuteticas Al ser de origen proteico las bacteriocinas son
sujetos a modificaciones por Ingenieriacutea Geneacutetica (Cotter Ross amp Hill 2013) Las
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bacteriocinas usualmente actuacutean por permeabilizacioacuten por membrana causada por
su naturaleza catioacutenica al interactuar con la membrana Usualmente las
bacteriocinas son de caraacutecter hidrofoacutebico y anfipaacutetico Su estructura quiacutemica son
generalmente peacuteptidos acoplados con glicoproteiacutenas y lipoproteiacutenas Su punto
isoeleacutectrico estaacute habituado a 81 a 101 usualmente son termoestables y tiene un
rango de pH amplio entre 30 a 90 (Heredia-Castro Heacuternaacutendez-Mendoza
Gonzaacutelez-Coacuterdova amp Vallejo-Cordoba 2017) En la Naturaleza cuando las
bacterias comparten el mismo nicho ecoloacutegicos eacutestas deben luchar y defenderse
de otros y las bacteriocinas son uno de los mecanismos bioloacutegicos reconocidos
(Duffy Schouten amp Raaijmakers 2003)
La disponibilidad de datos en bacteriocinas en la Naturaleza es muy amplio ya que
se presume que un 99 del total de bacterias son productoras de al menos un tipo
de bacteriocina y muchos de ellos permanecen auacuten sin ser descubiertos
(Klaenhammer 1988) Hasta la fecha de acuerdo con datos de bases de datos
sobre bacteriocinas de calidad mundial (actualizado hasta la uacuteltima versioacuten 25 de
junio de 2021) indican que el University of Nebraska Medical Centerrsquos
Antimicrobial Peptide Database (ADP por sus siglas en ingleacutes)
(httpswangapd3commainphp) se mantienen registrados un total de 3257
peacuteptidos antimicrobianos de los seis reinos bioloacutegicos existentes de los cuales
181 son peacuteptidos con actividad anti-MRSA (G Wang Li amp Wang 2016) Aunque
Bactibase (httpbactibasehammamilaborgmainphp) es una base de datos de
bacteriocinas que no se ha actualizado desde 2017 sus datos siguen siendo muy
valiosos ya que nos ofrece una realidad en la ciencia de las bacteriocinas puesto
que la mayoriacutea de las bacteriocinas descubiertas han sido aisladas de bacterias
Gram positivas donde 206 pertenecen a este grupo y 19 a las cepas Gram
negativas El geacutenero maacutes reportado para las bacteriocinas de origen en Gram
positivas son los Lactobacillus seguido de Enterococcus Streptococcus
Lactococcus y el geacutenero Bacillus mientras que el geacutenero maacutes reportado para las
bacteriocinas de origen en Gram negativas es Escherichia El tamantildeo promedio de
las bacteriocinas es de 43 residuos (Hammami Zouhir Le Lay Ben Hamida amp
Fliss 2010)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 17
Un buen nuacutemero de bacteriocinas han sido previamente reportadas como agentes
terapeacuteuticos puesto que se han utilizado en dosis hasta cien veces superiores al
valor de concentracioacuten miacutenima inhibitoria reportado sin presentar efectos
citotoacutexicos en liacuteneas celulares eucarioacuteticas (Hols Ledesma-Garciacutea Gabant amp
Mignolet 2019) ni en tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Por
ejemplo la nisina la bacteriocina maacutes famosa en la industria y en el mundo ha
sido declarado por la Administracioacuten de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA por sus siglas en ingleacutes) como sustancia Generalmente Reconocida
como Segura (GRAS por sus siglas en ingleacutes) para su uso como conservador de
alimentos (Cotter Hill amp Ross 2005) Se sabe que la mayoriacutea de las bacteriocinas
han tenido un largo historial de seguridad (Silva Silva amp Ribeiro 2018) Sin
embargo a pesar de la gran disponibilidad de datos de ensayos en bacteriocinas
recientemente se ha manifestado la urgencia de incrementar y explorar su uso en
modelos in vivo para evaluar su eficacia como agentes antimicrobianos y evaluar
los posibles efectos secundarios los cuales son necesarios para asegurar su eacutexito
como candidatos potenciales a agentes terapeacuteuticos en su lucha contra
infecciones resistentes a los antibioacuteticos (Beniacutetez-Chao Leoacuten-Buitimea Lerma-
Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2021)
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos
Los peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos son sustancias de origen
bioloacutegico que cumplen con el mismo papel de defensa lo cierto es que existen
claras diferencias entre ellas que dependen de su origen composicioacuten quiacutemica
entre maacutes factores A continuacioacuten se ofrece una breve explicacioacuten entre los
diferentes tipos de sustancias antimicrobianas
Los Peacuteptidos Antimicrobianos (AMP antimicrobial peptides) tambieacuten conocidos
como peacuteptidos de autodefensa (HDP host defense peptide) son peacuteptidos
producidos por un hospedero y son parte del sistema inmune al conferirles
capacidades defensivas Son de un rango de tamantildeo entre 10 a 60 residuos en
promedio 3326 residuos que estaacuten compuestas mayoritariamente por α-heacutelices
con cargas positivas (catioacutenicas) o anfipaacuteticas (cargas hidrofoacutebicas e hidrofiacutelicas)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 18
tambieacuten existen referentes con carga anioacutenica Los AMP estaacuten clasificados seguacuten
su origen ya que estaacuten ubicuamente presentes en todos los reinos bioloacutegicos
como mamiacuteferos plantas microorganismos acuaacuteticos insectos yo anfibios
seguacuten su actividad ya que pueden ser antibacterianos antifuacutengicos
antiinflamatorios antivirales antiparasitarios yo anticanceriacutegenos seguacuten su
estructura como tipo lineal con estructurales secundarias con α-heacutelices y β-tiras
plegadas y por seguacuten por el tipo dominante de aminoaacutecidos como glicina arginina
prolina histidina y triptoacutefano (Huan Kong Mou amp Yi 2020 Lei et al 2019)
Si el AMP es de origen evolutivo bacteriano se les conoce como bacteriocinas Los
oriacutegenes pueden ser por bacterias Gram positivas como negativas incluyendo
miembros del dominio de las Archaea (Chikindas Weeks Drider Chistyakov amp
Dicks 2018) Sin embargo cuando el AMP es de origen eucarioacutetico existen tres
clasificaciones defensinas (Shafee Lay Hulett amp Anderson 2016) histatinas o
catelicidinas (De Smet amp Contreras 2005) Existen intermediarios evolutivos como
las bacteriocinas tipo defensina que son un grupo de bacteriocinas que comparte
los puentes de disulfuro en las mismas posiciones que podriacutean observarse en las
defensinas (Baindara et al 2016 Sugrue OrsquoConnor Hill Stanton amp Paul Ross
2020)
Tanto las bacteriocinas como los antibioacuteticos comparten funcionalidad bioloacutegica al
ser ambas sustancias que nulifican o matan a otras poblaciones pero existen
diferencias muy marcadas entre ellas puesto que las bacteriocinas son
sintetizadas como metabolitos primarios mientras que los antibioacuteticos son
secundarios El espectro de accioacuten de las bacteriocinas es mucho maacutes reducido
que los antibioacuteticos eacutestos uacuteltimos son muy amplios El grado de actividad es
mucho maacutes intenso entre bacteriocinas ya que su rango de accioacuten se encuentra
en el orden de los nano a micro molar mientras que los antibioacuteticos son rango de
accioacuten estaacute ranqueado entre los micro y milimolar Debido a su origen proteico las
bacteriocinas son altamente propensas a ser degradados por enzimas Sin
embargo las bacteriocinas son maacutes termodinaacutemicamente estables y con una
actividad maacutes amplia de pH que los antibioacuteticos Las bacteriocinas atacan
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 19
generalmente la membrana extracelular generando poros mientras que los
antibioacuteticos pueden atacar la membrana tambieacuten yo atacar blancos intracelulares
Se conoce que las bacteriocinas presentan baja o nula toxicidad en comparacioacuten
con los antibioacuteticos (Perez Zendo amp Sonomoto 2014)
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes
En la actualidad diversos estudios enfocados en bacteriocinas se han enfocado
en su actividad contra cepas de S aureus resistentes a los antibioacuteticos Por
ejemplo la lisostafina fue utilizado el control de S aureus ATCC 29740 (Oldham amp
Daley 1991) mientras que la pentocina JL-1 ha sido efectivo para el control de S
aureus multirresistente (Jiang Zou Cheng Fang amp Huang 2017) La bacteriocina
entianina mostroacute actividad contra MRSA (ATCC 43300) (S W Fuchs et al 2011)
La epidermicina NI01 mostroacute actividad contra MRSA (Sandiford amp Upton 2012)
Asiacute tambieacuten como las enterocinas DD28 y DD93 con actividad anti estafilocoacutecica
contra ceacutelulas MRSA (Al Atya et al 2016)
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos
Las bacteriocinas son un grupo muy bien definido de peacuteptidos antimicrobianos que
tienen su origen evolutivo en bacterias y en algunas arqueobacterias Por sus
caracteriacutesticas proteicas las bacteriocinas son elementos geneacuteticos que pueden
ser faacutecilmente modificados por teacutecnicas de Ingenieriacutea geneacutetica (Cotter et al
2013) Las caracteriacutesticas generales de las bacteriocinas son que su espectro de
accioacuten es actuar tanto en las bacterias Gram positivas como negativas Su modo
de actividad por actividad bactericida o bacteriostaacutetico Su mecanismo de accioacuten
es por permeabilizacioacuten de membrana creando lisis celular Su estructura
bioquiacutemica es muy variada que pueden ser peacuteptidos glicoproteiacutenas y
lipoproteiacutenas Son de peso molecular variable sin embargo las bacteriocinas de
origen en Gram positivas son de tamantildeo pequentildeo Debido a su naturaleza
proteica las bacteriocinas son susceptibles al corte proteoliacutetico y altamente
estables a altas temperaturas (Heredia-Castro et al 2017)
Entre algunas de las bacteriocinas que se han utilizado para el control de
patoacutegenos resistentes estaacute la bacteriocina AS-48 la cual ha sido ampliamente
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 20
utilizado contra cepas de referencia y cliacutenicos para Mycobacterium tuberculosis
(Aguilar-Peacuterez et al 2018) Otro ejemplo es la pentocina JL-1 ha demostrado
tener actividad contra diferentes cepas bacterianas (Jiang et al 2017) Entianina
ha mostrado actividad contra Enterococcus faecalis resistente a vancomicina
(ATCC 51299) (S W Fuchs et al 2011) Las klebcinas poseen actividad contra
especies resistentes y multirresistentes de cepas del geacutenero Klebsiella
(Denkovskienė et al 2019) La lista de bacteriocinas reportadas como efectivas
contra patoacutegenos resistentes de relevancia cliacutenica es muy larga y que puede ser
observada en la literatura correspondiente (Cui et al 2012 Gabrielsen Brede
Nes amp Diep 2014 Newstead Varjonen Nuttall amp Paterson 2020 Perez et al
2014)
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas
Las bacteriocinas pueden ser producidos tanto por microorganismos Gram
positivos como negativos inclusive por miembros del dominio Archaea (Chikindas
et al 2018)
Hasta el diacutea de hoy no hemos encontrado un oacutergano internacional que regule la
clasificacioacuten de las bacteriocinas maacutes que lo propuesto en grupos de investigacioacuten
ligados a la ciencia de las bacteriocinas Las bacteriocinas con origen evolutivo en
organismos Gram positivos estaacuten actualmente clasificados en cuatro grandes
clases la clase I corresponde a bacteriocinas modificadas postraduccionalmente
de muy bajo peso molecular (lt5 kDa) la clase II se refiere a bacteriocinas
termoestables no modificadas de bajo peso molecular (lt10 kDa) la clase III
contiene bacteriocinas termosensibles de alto peso molecular (gt10 kDa) y por
uacuteltimo la clase IV se compone de proteiacutenas acomplejadas con carbohidratos o
liacutepidos (Newstead et al 2020 Perez et al 2014)
Dada la diversidad de bacteriocinas para fines de este trabajo solo nos
enfocaremos en las bacteriocinas tipo II de las Gram positivas ya que se clasifican
en cuatro grandes subclases La clase IIa representa la familia de las
bacteriocinas con actividad antilisteria por su actividad especiacutefica contra cepas de
Listeria monocytogenes y ademaacutes porque se mantiene un dominio conservado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 21
YGNGV conocido como la caja de pediocina y que ubica en extremo N-terminal
Uno de los ejemplos maacutes reconocidos es la enterocina NKR-5-3C La clase IIb
representa a las bacteriocinas compuestas por dos peacuteptidos que en siacute son dos
peacuteptidos diferentes que actuacutean sineacutergicamente para atacar a un blanco como
lactococcin Q que se compone de los peacuteptidos lactococcina Qα y lactococcin Qβ
La clase IIc se relaciona con las bacteriocinas circularizadas que estaacuten unidas de
extremo a extremo como lactociclina Q y leucociclina Q La clase IId se compone
de bacteriocinas sin peacuteptido liacuteder y que se sintetizan sin una secuencia liacuteder en su
extremo N-terminal Algunos ejemplos son la weissllicina Y weissllicina M
leucocina Q leucocina N lacticina Z y lacticina Q (Perez et al 2014)
256 La bacteriocina Lacticina Q
La lacticina Q (LnqQ) es una bacteriocina que fue por vez descubierta por Fujita y
sus colaboradores en el 2007 Esta bacteriocina fue aislada por primera vez por
Lactococcus lactis QU5 una cepa Gram positiva que fue aislada de una muestra
de maiacutez fresco recolectado en campos agriacutecolas de la comunidad de Aso en
Kumamoto Japoacuten La composicioacuten bioquiacutemica de LnqQ es que se trata de peacuteptido
lineal compuesto por 53 residuos y con un peso molecular de 592050 Da (Fujita
et al 2007) La estructura tridimensional descubierta por Acedo y otros revela
que es una proteiacutena globular que se compone de cuatro α-heacutelices cuya superficie
es altamente catioacutenica y su nuacutecleo hidrofoacutebico Esta secuencia presenta una
carga neta +6 y su pI = 108 (Acedo et al 2016)
Esta bacteriocina ha mostrado ser un peacuteptido antimicrobiano con alta efectividad
contra bacterias Gram positivas siendo antagonista de uno los principales
patoacutegenos reportados en cliacutenicas como S aureus Por ejemplo se han registrado
diversos rangos de concentracioacuten miacutenima inhibitoria (MIC) de la LnqQ como 8 microM
contra S aureus ATCC 6538 y 32 microM contra S aureus ATCC 29213 (Acedo et al
2016) Tambieacuten se ha reportado 18 microM (Fujita et al 2007) o 10 microgml (Ma Yu
Han Wang amp Zhang 2012) contra S aureus ATCC 12600
Se conoce que la LnqQ genera alta permeabilidad en la membrana sin necesidad
de anclarse sobre moleacuteculas especiacuteficas como el Liacutepido II (Yoneyama Imura
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 22
Ichimasa et al 2009) Posteriormente se determinoacute que el mecanismo de accioacuten
es a traveacutes de un modelo conocido como Poro Toroidal Enorme (HTP huge
toroidal pore) donde las estructuras α-heacutelices cargadas positivamente y presentes
en la LnqQ se unen covalentemente hacia la membrana celular que estaacute cargada
negativamente y entonces genera un poro en forma de toroide enorme de 46 a
66 nm de diaacutemetro generando una estructura conocida como lipid flip-flop lo que
permite el goteo de moleacuteculas intercelular de manera que la ceacutelula muere La
translocacioacuten del peacuteptido desde el exterior a la cara interna de la ceacutelula ocurre
sincroacutenicamente con la formacioacuten del poro toroidal (Yoneyama Imura Ohno
et al 2009) En un estudio a nivel in vitro se determinoacute que cuando LnqQ es
agregado a niveles MIC sobre cultivos bacterianos sensibles aumenta la
acumulacioacuten de radicales libres tipo hidroxilos y por consecuencia la ceacutelula muere
(Li et al 2013)
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados
Las bacteriocinas son sustancias toacutexicas que pueden atacar a su microorganismo
productor si eacuteste no cuenta con caracteriacutesticas que le permitan resistir (Ishibashi
et al 2014 Iwatani et al 2012 Ladjouzi Lucau-Danila Benachour amp Drider
2020 Mesa-Pereira et al 2017 Nascimento et al 2012) De manera que todos
los operones de las bacteriocinas se componen habitualmente de los siguientes
elementos geneacuteticos promotor gen estructural (bacteriocina) genes de
inmunidad genes de transporte una proteiacutena accesoria y un terminador de la
transcripcioacuten (Mesa-Pereira et al 2017)
La LnqQ no es ninguna excepcioacuten a la regla ya que similar a otras bacteriocinas
la produccioacuten secrecioacuten y autoinmunidad estaacute regulado por el cluacutester geneacutetico
lnqRQBCDEF que se encuentra en Lactococcus lactis QU5 y que descubierto por
Iwatani y otros en el 2012 (Iwatani et al 2012) Al diacutea de hoy auacuten no estaacute del todo
bien determinado la funcionalidad de los elementos que conforman el operoacuten pero
se sabe que el cluacutester lnqQBCDEF es esencial para la completa produccioacuten de
LnqQ mientras que los productos LnqEF son esenciales y los productos LnqBCD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 23
estaacuten parcialmente involucrados en la inmunidad y secrecioacuten de la bacteriocina
(Iwatani Horikiri Zendo Nakayama amp Sonomoto 2013)
26 Produccioacuten heteroacuteloga de bacteriocinas
Entre las virtudes observadas en las bacteriocinas estaacuten en que gozan de una
excelente reputacioacuten en seguridad bioloacutegica (Silva et al 2018) y de una gran
diversidad de bancos de datos sobre bacteriocinas (Hammami et al 2010 G
Wang et al 2016) Estos datos pueden apoyar para el disentildeo y construccioacuten de
bacteriocinas de novo (Fields et al 2020) Sin embargo a la fecha una cantidad
raquiacutetica de bacteriocinas han sido capaces de ser producidos en masa siendo la
nisina y la pediocina PA-1 las uacutenicas bacteriocinas en destacar industrialmente
Una de las hipoacutetesis que maacutes planteada supone que las bacteriocinas no han
destacado en el mercado porque eacutestas deben de producirse en altas cantidades y
con suficiente actividad bioloacutegica y en los organismos nativos este proceso se
considera que es un desgaste energeacutetico significativo ya que el rendimiento
productivo es usualmente bajo (Mesa-Pereira Rea Cotter Hill amp Ross 2018)
Desde la fundacioacuten de la Ingenieriacutea Geneacutetica las proteiacutenas han sido objeto de
muacuteltiples modificaciones para aumentar su produccioacuten y purificacioacuten utilizando
diversos sistemas bioloacutegicos productores desde sistemas procariotas como E coli
hasta sistemas eucariotas como ceacutelulas de levaduras o inclusive en liacuteneas
celulares eucariotas A pesar del avance actual que existen ya en estas teacutecnicas
la produccioacuten de proteiacutenas puede presentar incluso problemas de rutina en
laboratorios dedicados a este campo como la formacioacuten de cuerpos de inclusioacuten
toxicidad o baja produccioacuten de proteiacutenas (Bell Engleka Malik amp Strickler 2013)
En este trabajo nos hemos enfocado en la exploracioacuten de un peacuteptido sentildeal N-
AmyE y un peacuteptido de fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de la bacteriocina
LnqQ tanto en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica de ceacutelulas de E coli Nuestro
objetivo es que la aplicacioacuten de las etiquetas en la produccioacuten de la bacteriocina
permita la produccioacuten y purificacioacuten de LnqQ en ceacutelulas de E coli mientras
mantiene su funcionalidad bioloacutegica bactericida contra cultivos de S aureus En
este capiacutetulo presentaremos antecedentes relacionados al peacuteptido sentildeal N-AmyE
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 24
y al peacuteptido de fusioacuten SmbP asiacute como los disentildeos bioinformaacuteticos utilizados para
la construccioacuten de las etiquetas con la bacteriocina se incluyen ensayos in silico
predictivos para estimar la estructura tridimensional de la bacteriocina con su
etiqueta asiacute como ensayos para estimar el corte
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE es un dominio proteico localizado en la regioacuten N-terminal
de la α-amilasa (AmyE) (Yang Galiii amp Henner 1983) Bioquiacutemicamente la AmyE
es una enzima (1 4-α-D-glucano-glucanohidrolasa EC 3211) cuya funcioacuten es
catalizar la hidroacutelisis de enlaces glicosiacutedicos (α-14) del almidoacuten para producir
glucosa y dextrinas (R Gupta Gigras Mohapatra Goswami amp Chauhan 2003)
La secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica de algunas AmyE fueron reportadas
desde hace varias deacutecadas Por ejemplo en 1983 Yang y sus colaboradores
reportaron la secuencia nucleotiacutedica del AmyE de la cepa Bacillus subtilis 1A289
(Yang et al 1983) Antildeos maacutes tarde en 1988 Emori y sus colegas tambieacuten
reportaron la secuencia nucleotiacutedica completa de la variante producida por la cepa
de B subtilis 2633 (Emori amp Maruo 1988)
La existencia del peacuteptido sentildeal N-AmyE de la α-amilasa fue propuesta por Yang y
sus colaboradores cuando develaron la secuencia nucleotiacutedica completa del
mismo argumentando que el presunto peacuteptido sentildeal debiacutea tener un tamantildeo de 32
aminoaacutecidos Tambieacuten observaron que AmyE podriacutea expresarse en ceacutelulas de
otras especies como E coli manteniendo su actividad bioloacutegica (Yang et al 1983)
La utilidad biotecnoloacutegica del peacuteptido sentildeal N-AmyE es porque se ha reportado
que es funcionalmente activo tanto en Bacillus subtilis como en E coli ya que al
fusionarse eacutesta con la regioacuten N-terminal de una proteiacutena de intereacutes biotecnoloacutegico
estaacute puede ser liberado al medio extracelular Por ejemplo al fusionar el peacuteptido
sentildeal N-AmyE con una β-lactamasa eacutesta es capaz de excretarse al medio
extracelular tanto en ceacutelulas de B subtilis como de E coli Sin embargo el sitio de
reconocimiento para el corte del peacuteptido sentildeal difiere entre ambos tipos de ceacutelulas
(Nakazawa Takano Sohma amp Yamane 1986) Un anaacutelisis multivariado de datos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 25
determinoacute que las secuencias nucleotiacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en su seccioacuten N-terminal tienden a ser excretados en el periplasma y en la
seccioacuten extracelular de E coli (Sjoumlstroumlm Wold Wieslander amp Rilfors 1987)
El mecanismo de corte hidroliacutetico por el que el peacuteptido sentildeal N-AmyE se separa de
la amilasa AmyE es debido a su estructura secundaria y a la presencia de un
dominio rico en alaninas (aminoaacutecido apolar) en el extremo C-terminal de del
peacuteptido N-AmyE Sin embargo el patroacuten de corte enzimaacutetico difiere seguacuten el tipo
organismo donde sea expresado ya que el sitio de corte oacuteptimo de este peacuteptido
se encuentra entre Ala33 y X34 cuando se expresa en B subtilis pero en E coli la
AmyE tiende a cortarse entre Ala31 y un aminoaacutecido cual sea (X) (Sakakibara
Tsutsumi Nakamura amp Yamane 1993)
En el 2005 el peacuteptido sentildeal N-AmyE reportado por Yang y otros fue acoplado en
la regioacuten N-terminal de una liasa de pectina para permitir su expresioacuten en ceacutelulas
de E coli (DE3) en la regioacuten periplaacutesmica Los resultados de ese estudio indicaron
que se logroacute la excrecioacuten efectiva de la liasa de pectina al medio extracelular
espacio periplaacutesmico citoplasma y a nivel membranal de E coli despueacutes de haber
sido inducido por con IPTG (R M Papi Chaitidou Trikka amp Kyriakidis 2005)
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP
La mayoriacutea de peacuteptidos de fusioacuten utilizados para la expresioacuten de proteiacutenas
recombinantes son el Dominio de Unioacuten a Celulosa (CBDcenA) Glutatioacuten-S-
Transferasa (GST) Proteiacutena de Unioacuten a Maltosa (MBP) tiorredoxina (TRX) y las
Proteiacutenas Modificadoras tipo Ubiquitina de Tamantildeo Pequentildeo (SUMO) (Mesa-
Pereira et al 2018) o la regioacuten citoplasmaacutetica del proteiacutena pequentildea de unioacuten a
metales SmbP (Vargas-Cortez Morones-Ramirez Balderas-Renteria amp Zarate
2016) a continuacioacuten ofrecemos maacutes informacioacuten relacionada al uacuteltimo peacuteptido de
fusioacuten
En el 2004 Barney y sus colaboradores describieron a la Proteiacutena Pequentildea de
Unioacuten a Metales en el periplasma de Nitrosomonas europaea Esta proteiacutena posee
un peso molecular de 99 kDa y presenta una inusual cantidad de residuos de
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 26
histidina (17) seguido de alanina (16) glutamato (14) glicina (11) y lisina
(9) los cuales componen el 67 de la composicioacuten total de residuos Esta
proteiacutena carece naturalmente de metionina y de cisteiacutenas Estructuralmente se
trata de una unidad monomeacuterica compuesta por 93 residuos cuya principal
caracteriacutestica es una regioacuten compuesta de 10 repeticiones secuenciales cada una
con motivo de siete aminoaacutecidos donde el cuarto residuo es una histidina
conservada estos motivos permiten la estabilizacioacuten de un nuacutecleo hidrofoacutebico
Como su nombre lo establece esta proteiacutena posee alta afinidad a metales
divalentes como Cu2+ Ni2+ Zn2+ y de otras valencias como Fe3+ (Barney LoBrutto
amp Francisco 2004) Esta proteiacutena ha sido utilizada para la expresioacuten periplaacutesmica
y posterior purificacioacuten de Hormona de Crecimiento Humano (hGH)
bioloacutegicamente activa (Perez-Perez et al 2020)
En 2015 el dominio periplaacutesmico de la SmbP que corresponde a la seccioacuten maacutes
proacutexima al extremo N-terminal en la estructura lineal del mismo fue removido por
Vargas y sus colaboradores manteniendo uacutenicamente el dominio citoplasmaacutetico
de la SmbP citoplasmaacutetica (SmbP) Eacutesta uacuteltima es uacutetil como etiqueta de afinidad
para teacutecnicas de cromatografiacutea de afinidad con iones metaacutelicos inmovilizados
(IMAC por sus siglas en ingleacutes) Esta proteiacutena fue reportada como efectiva para la
expresioacuten citoplaacutesmica de proteiacutenas en E coli como RFP GFP SHY2 NDPK2 y
LovR (Vargas-Cortez et al 2016)
Recientemente la SmbP fue utilizada por primera vez para la produccioacuten del
peacuteptido antimicrobiano Bin1b utilizando E coli como hospedero para la
sobreproduccioacuten El peacuteptido fue sobre producido y purificado mostrando actividad
antimicrobiana contra E coli y S aureus (Montfort-Gardeazabal Balderas-
Renteria Casillas-Vega amp Zarate 2021)
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS
31 Justificacioacuten
La idea de disentildear y utilizar un biosensor de ceacutelula para controlar cultivos de
MRSA es porque las moleacuteculas sentildealizadoras del QS se han reportado como
estiacutemulos quiacutemicos para ser reconocidos como ceacutelulas enteras vivas modificadas
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para su reconocimiento Ademaacutes de que ya se han reportado diversos biosensores
completos de ceacutelulas que pueden producir y excretar bacteriocinas capaces de
matar a microorganismos multirresistentes productores de sentildeales QS
La decisioacuten de inclinarnos hacia las bacteriocinas como patoacutegenos es porque
atacan un espectro limitado de bacterias dentro de una comunidad microbioloacutegica
y no ocurre de manera simultaacutenea en un espectro amplio como ocurre
habitualmente con los antibioacuteticos lo que promueve una mayor probabilidad de
seleccioacuten de mutantes que puedan conferir resistencia Ademaacutes las bacteriocinas
estaacuten constantemente evolucionando y permiten a sus productores combatir
contra patoacutegenos de resistencia emergentes (Riley et al 2012)
Las bacteriocinas han mostrado ademaacutes ser potenciales agentes terapeacuteuticos ya
que no afectan tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Incluso las
bacteriocinas se han administrado en concentraciones tan altas como 100 veces
superiores al MIC originalmente reportado con nulos efectos citotoacutexicos en liacuteneas
celulares eucarioacuteticas (Hols et al 2019) Ademaacutes la mayoriacutea de los productores
nativos en bacteriocinas poseen un excelente historial en seguridad (Silva et al
2018)
La propuesta de etiquetar bacteriocinas con un peacuteptido sentildeal es porque durante el
proceso de recuperacioacuten previo a la purificacioacuten es comuacuten encontrar una baja
cantidad de proteiacutenas y ademaacutes proteasas que disminuyen el rendimiento
productivo Con el peacuteptido sentildeal la purificacioacuten de las proteiacutenas se simplifica
porque son faacutecilmente recuperadas de la fraccioacuten periplaacutesmica seguido un choque
osmoacutetico sin la necesidad de lisar toda la ceacutelula (Ramanan et al 2010) mientras
que la decisioacuten de antildeadir peacuteptidos de fusioacuten en los disentildeos geneacuteticos es porque se
trata de etiquetas que se colocan en la regioacuten N-terminal o C-terminal de una
proteiacutena con intereacutes biotecnoloacutegico Estos peacuteptidos representan un meacutetodo
recurrente en la sobreexpresioacuten de bacteriocinas porque ayudan en la purificacioacuten
aumentan la expresioacuten proteica mejoran la solubilidad permiten que la proteiacutena
sea producida en un estado similar al nativo incrementan el rendimiento de
produccioacuten y disminuyen su degradacioacuten (Mesa-Pereira et al 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 28
32 Hipoacutetesis
El disentildeo de un biosensor construido a base de ceacutelulas enteras E coli modificadas
pronostica indica que funcionaraacute como alarma bioloacutegica al detectar moleacuteculas de
QS de S aureus En consecuencia liberaraacute un compuesto antimicrobiano con
actividad especiacutefica contra el organismo blanco El peacuteptido antimicrobiano seraacute
validado experimentalmente a traveacutes del peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de
fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de LnqQ en E coli que seraacute producido
en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica respectivamente
33 Objetivo General
Presentar el disentildeo in silico de un mecanismo biosensor basado en el sistema de
quorum sensing de S aureus para producir Lacticina Q y producir
experimentalmente este peacuteptido antimicrobiano tanto en la regioacuten periplaacutesmica
como citoplaacutesmica de E coli
34 Objetivos Especiacuteficos
1 Disentildear el moacutedulo geneacutetico biosensor para detectar la presencia externa de
moleacuteculas autoinductoras (AIP) producidos por MRSA
2 Disentildear el moacutedulo geneacutetico de bacteriocinas para liberar lacticina Q (LnqQ)
en funcioacuten a la concentracioacuten externa de moleacuteculas AIP producidos por
MRSA
3 Disentildear un vector de expresioacuten que contenga ambos moacutedulos geneacuteticos
tanto biosensor como de bacteriocinas
4 Predecir la especificidad teoacuterica del biosensor completo de ceacutelulas enteras
entre diferentes sentildeales de QS
5 Predecir la solubilidad y localizacioacuten subcelular de cada una de las
proteiacutenas utilizadas para el disentildeo del moacutedulo biosensor y el moacutedulo de
bacteriocina
6 Predecir la existencia de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B y nivel de alergenicidad
en la LnqQ producida en E coli
7 Disentildear el vector de expresioacuten pETNL que contenga el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en conjunto con el LnqQ acoplado con una etiqueta de polihistidina
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8 Disentildear el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ que contenga el peacuteptido de
fusioacuten SmbP en conjunto con el LnqQ
9 Construir los vectores de expresioacuten pETNL y pSmbP-LnqQ y transformar
ceacutelulas de E coli
10 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten periplaacutesmica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pETNL
11 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten citoplasmaacutetica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ
35 Metas
En un periacuteodo a tres antildeos nos propusimos alcanzar las siguientes metas
bull Disentildear in silico un sistema biosensor en E coli capaz de sentir moleacuteculas
de Quorum Sensing producidas por S aureus y producir una sustancia
antimicrobiana en funcioacuten a la concentracioacuten externa de las moleacuteculas QS
bull Predecir la capacidad del peacuteptido sentildeal N-AmyE y del peacuteptido de fusioacuten
SmbP para producir bacteriocinas en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica
de E coli respectivamente
bull Presentar los resultados obtenidos en al menos un artiacuteculo de investigacioacuten
con arbitraje internacional
bull Cumplir con eacutexito el examen predoctoral
bull Obtener el grado de Doctor en Ciencias con Orientacioacuten en Microbiologiacutea
36 Aportacioacuten cientiacutefica
Nuestra aportacioacuten consiste en presentar el disentildeo y el trabajo teoacuterico necesario
para la construccioacuten de un biosensor de ceacutelulas enteras basado en quorum
sensing capaz de producir bacteriocinas en funcioacuten a la concentracioacuten disponible
de moleacuteculas tipo QS evitando asiacute la sobreproduccioacuten yo goteo de bacteriocinas
que pueden contribuir a la resistencia en patoacutegenos Asiacute tambieacuten experimentamos
en peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP para validarlos como una
herramienta bioloacutegica para la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas en ceacutelulas
modificadas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 30
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
La idea de disentildear un biosensor basado en ceacutelulas enteras surge al yuxtaponer
dos enfoques usados para tratar enfermedades resistentes a los antibioacuteticos que
es mediante el uso de organismos bioloacutegicamente activos con bacteriocinas (Allen
et al 2014)
En este sentido tenemos dos ceacutelulas independientes que son reconocidas como α
y β respectivamente (Figura 1) las ceacutelulas α que corresponden a un productor
de sentildeales tipo QS liberan moleacuteculas de sentildealizacioacuten al medio externo mientras
que las ceacutelulas β que corresponden al biosensor son emulados para detectar
moleacuteculas de QS de las ceacutelulas α En respuesta a esta deteccioacuten los mecanismos
internos de las ceacutelulas β producen y excretan una toxina especiacutefica contra las
ceacutelulas α y asiacute controlar su crecimiento poblacional
Figura 1 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
Ceacutelulas β fungen como sistema de deteccioacuten y destruccioacuten al reconocer moleacuteculas de reconocimiento tipo QS
producidos por ceacutelulas α y causar su muerte
42 Cepas bacterianas
Nosotros designamos a E coli (BL21) DE3 como chasis bioloacutegico porque ha sido
ampliamente reconocido para la sobreproduccioacuten de bacteriocinas recombinantes
(Mesa-Pereira et al 2018) Para el disentildeo del moacutedulo biosensor optamos por
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utilizar los datos anotados del genoma de la cepa S aureus N315 una cepa
reconocida como MRSA y que ha sido reportado como unas de las principales
causas de infecciones resistentes a meticilina asociado a comunidad (CA-MRSA)
y a hospitales (HA-MRSA) (Kuroda et al 2001) Para el disentildeo del moacutedulo de
bacteriocina utilizamos los datos bioinformaacuteticos del cluacutester de genes lnqQBCDEF
de L lactis QU5 que permiten la produccioacuten y excrecioacuten la LnqQ asiacute como para su
autoinmunidad (Fujita et al 2007 Iwatani et al 2012) Abajo se presentan los
disentildeos de ambos moacutedulos asiacute como la estrategia general para su ensamblado en
un vector de expresioacuten
La cepa de E coli BL21 (DE3) fue seleccionada para ensayos de expresioacuten
proteica con el peacuteptido sentildeal N-AmyE o con el peacuteptido de fusioacuten SmbP La cepa E
coli DH5 fue utilizada para ensayos de clonacioacuten La cepa E coli Origami fue
escogida para produccioacuten de proteiacutenas problemaacuteticas
Un cultivo de E coli BL21 (DE3) fue amablemente donado por el Instituto
Tecnoloacutegico de Monterrey (Monterrey Nuevo Leoacuten) La cepa de E coli DH5α fue
recuperada de un stock de cultivos de nuestro laboratorio en el CIBYN (Apodaca
Nuevo Leoacuten) La cepa E coli Origami fue compartida por el Dr Xristo Zaacuterate de la
UANL (Monterrey Nuevo Leoacuten) Todas las cepas fueron mantenidas y crecidas en
caldo LB o suplementado con agar (2) a 37degC en condiciones aeroacutebicas
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina
Tanto los moacutedulos biosensor como el de bacteriocina fueron disentildeados de la
siguiente manera contienen un promotor un sitio de unioacuten al ribosoma gen
estructural y un terminador doble de transcripcioacuten Los disentildeos fueron elaborados
bajo la herramienta bioinformaacutetica SnapGene 113 en el formato correspondiente
Todos los datos bioinformaacuteticos utilizados para ambos disentildeos fueron recuperados
de alguna de las siguientes bases de datos Massachussets Institute of
Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts (SBP) (httppartsigemorg)
(Galdzicki Rodriguez Chandran Sauro amp Gennari 2011) Kyoto Encyclopedia
Genes and Genomes (KEGG) (httpswwwgenomejpkegg) (Kanehisa amp Goto
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2000) FP Base (FPB) (httpswwwfpbaseorg) (Lambert 2019) y GenBank
(httpswwwncbinlmnihgovgenbank) (Clark Karsch-Mizrachi Lipman Ostell amp
Sayers 2016) y Protein Data Bank (PDB) (httpswwwrcsborg) (Berman et al
2000)
Para el disentildeo del moacutedulo biosensor usamos los datos del promotor constitutivo
de E coli J23110 (SBP no BBa_J23110) como regulador transcripcional de los
genes del operoacuten agrC y agrA Nosotros utilizamos la secuencia nucleotiacutedica y
aminoaciacutedica del agrC (KEGG no SA1843) que se compone de 1116 nucleoacutetidos
y 371 residuos respectivamente y tambieacuten de la informacioacuten disponible para la
agrA (KEGG no SA1844) que se compone de 717 nucleoacutetidos y 238 residuos Los
sitios de unioacuten a ribosoma (SBP no BBa_B0034) fueron colocados entre cada gen
estructural y al final de la unidad transcriptoacutemica se colocoacute un doble terminador de
transcripcioacuten (SBP no BBa_B0015) tanto el moacutedulo biosensor como en moacutedulo
de bacteriocina
Para el disentildeo del moacutedulo de bacteriocina utilizamos los datos del promotor
inducible P2 del MRSA para regular la expresioacuten del cluacutester geneacutetico lnqQBCDEF
y el gen reportero gfp Debido a que la secuencia del promotor P2 no se
encontraba disponible de manera que primero tuvimos que localizar la regioacuten en
el archivo genoacutemico de la MRSA (GenBank no BA0000183) los resultados de
este punto seraacuten explicados maacutes a fondo en la seccioacuten correspondiente
Para la seccioacuten estructural del moacutedulo de bacteriocina buscamos el archivo
bioinformaacutetico que contuviera los genes estructurales secrecioacuten y de auto
inmunidad del cluacutester lnqQBCDEF (GenBank no AB7123931) El archivo original
fue manipulado para seccionar los elementos geneacuteticos que pertenecen al cluacutester
esta informacioacuten seraacute explicada con maacutes detalle
Por uacuteltimo usamos la secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica del gen monomeacuterico
gfp (FPBase no QKFJN) como reportero de Aequorea victoria (Zacharias Violin
Newton amp Tsien 2002) Esta proteiacutena es monomeacuterica posee un peso molecular
en 270 kDa El valor maacuteximo de excitacioacuten es λ = 488 nm mientras que el valor
maacuteximo de emisioacuten es λ = 507 nm El coeficiente de extincioacuten es 56000 M-1cm-1
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44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
El plaacutesmido de AddGene (httpswwwaddgeneorg) (AddGene no 116850) fue
utilizado para la construccioacuten in silico de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
dentro de un plaacutesmido al cual nos referiremos a partir de ahora como plaacutesmido
Dual Biosensor Killer (DBK) Este plaacutesmido fue disentildeado en la aplicacioacuten
SnapGene versioacuten 113
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas
Para la optimizacioacuten de los codones de todas las secuencias nucleotiacutedicas se
utilizoacute la herramienta bioinformaacutetica GenSmart Codon Optimization Tool
(httpswwwgenscriptcomtoolsgensmart-codon-optimization) versioacuten Beta 10
Las secuencias nucleotiacutedicas yo aminoaciacutedicas recolectadas para el disentildeo de los
moacutedulos geneacuteticos funcionaron como datos de entrada La aplicacioacuten fue
configurada para ldquoEscherichia colirdquo como organismo para expresioacuten de proteiacutenas
Es importante mencionar que solicitamos la exclusioacuten de sitios de restriccioacuten
habitualmente localizados en la regioacuten muacuteltiple de clonacioacuten del vector de
expresioacuten pET30a(+) como BamHI (GGATCC) BglII (AGATCT) ClaI (ATCGAT)
EcoRI (GAATTC) HindIII (AAGCTT) KpnI (GGTACC) NcoI (CCATGG) NdeI
(CATATG) NheI (GCTAGC) NotI (GCGGCCGC) PstI (CTGCAG) SacI (GAGCTC) SacII
(CCGCGG) SalI (GTCGAC) SmaI (CCCGGG) SpeI (ACTAGT) SphI (GCATGC) XbaI
(TCTAGA) XhoI (CTCGAG) XmaI (CCCGGG)
Una vez optimizadas usamos CAI Tool (httpgenomesurvesCAIcal) para el
Caacutelculo del Iacutendice de Adaptacioacuten (CAI por sus siglas en ingleacutes) para determinar el
iacutendice de adaptacioacuten de las secuencias nucleotiacutedicas antes y despueacutes de la
optimizacioacuten Esta herramienta utiliza la secuencia nucleotiacutedica y el uso de
codones tanto del organismo nativo como el organismo productor heteroacutelogo (u
organismo recipiente) como entradas para la optimizacioacuten De acuerdo a los
autores el iacutendice tiene un rango de respuesta que oscila entre 0 hasta 1 donde el
valor correspondiente 1 indica si la secuencia de entrada usa los codones maacutes
frecuentemente utilizados por el organismo recipiente (Puigbograve Bravo amp Garcia-
Vallve 2008) Para esta aplicacioacuten los iacutendices de uso de codones de cada
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organismo los datos de entrada deben ser descargados y posteriormente deben
ingresarse manualmente Todos los iacutendices fueron descargados de la base de
datos Codon Usage Database (httpswwwkazusaorjpcodon) y se descargaron
para los organismos E coli B (CUD no 413997) S aureus N315 (CUD
no158879) L lactis subsp cremoris (CUD no 1359) and A victoria (CUD no
6100)
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Se realizoacute un alineamiento local entre pares probando de manera independiente
cada una las cuatro clases maacutes comunes de AgrD contra la secuencia
aminoaciacutedica del AgrD del MRSA seleccionada para determinar la especificidad
del biosensor y en consecuencia la existencia de un comportamiento de
comunicacioacuten cruzada El alineamiento se realizoacute en la aplicacioacuten EMBOSS Water
(httpswwwebiacukToolspsaemboss_water) (Madeira et al 2019) Las
secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro clases maacutes representativas de AgrD
fueron descargadas de los datos publicados por Wang y otros (B Wang amp Muir
2016) mientras que la secuencia de AgrD de la cepa MRSA que seleccionamos
fue recuperada de una base de datos (KEGG no SAS066)
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
La solubilidad de las proteiacutenas seleccionadas para su expresioacuten en E coli fue
predicha por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk)
(Hebditch Carballo-Amador Charonis Curtis amp Warwicker 2017) La precisioacuten
general de la herramienta fue estimada en 706 De acuerdo con los autores
cualquier valor de solubilidad superior a 045 se considera que es soluble De esta
manera cualquier proteiacutena con valor inferior a 045 se infiere que no son solubles
Es importante mencionar que esta herramienta no es uacutetil para determinar el iacutendice
de solubilidad en proteiacutenas membranales
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
La herramienta bioinformaacutetica BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo
Martelli Fariselli Profiti amp Casadio 2018) predice la localizacioacuten subcelular de
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una proteiacutena en E coli Esta aplicacioacuten nos permite distinguir entre proteiacutenas
globulares de proteiacutenas membranales Para fines de nuestro proyecto nosotros
configuramos a la aplicacioacuten para identificar ldquoProkarya ndash Gram negativerdquo debido a
que eacuteste es el origen taxonoacutemico de nuestro organismo productor heteroacutelogo
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
410 Prediccioacuten de alergenicidad
La alergenicidad de la LnqQ fue evaluada en la herramienta bioinformaacutetica
AllerCatPro versioacuten 17 (httpsallercatprobiia-staredusg) la cual permite
predecir si el componente es capaz de crear una respuesta aleacutergica tipo I mediada
a la inmunoglobulina tipo E (IgE) basada en el anaacutelisis estructural lineal y
tridimensional de la proteiacutena (Maurer-Stroh et al 2019)
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
4111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica de la amilasa AmyE fue
descargado del cataacutelogo de GenBank (GenBank no V001011) El peacuteptido sentildeal
de este archivo fue manualmente extraiacutedo con la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 113 siguiendo las recomendaciones de la publicacioacuten de Papi y sus
colaboradores (R M Papi et al 2005)
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4112 Disentildeo y acoplamiento del peacuteptido sentildeal N-AmyE con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo nucleotiacutedico de la LnqQ (GenBank no AB2352011) El
acoplamiento fue manualmente resuelto utilizando la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 110 agregando sitios de restriccioacuten y algunos nucleoacutetidos tomando
en cuenta las recomendaciones de AddGene de dejar un espacio para asistir en la
clonacioacuten molecular por PCR (httpswwwaddgeneorgprotocolspcr-cloning)
Dos vectores de expresioacuten basados en pET-30a(+) fueron disentildeados in silico
donde uno de los vectores contiene exclusivamente el peacuteptido sentildeal N-AmyE y en
el siguiente estaacute el N-AmyE acoplado con la LnqQ
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pETNL fue
elaborado en SnapGene 113 y guardado en formato dna y enviado a BioBasic
Inc (Canadaacute) a traveacutes del tercero autorizado Productos y Equipos
Biotecnoloacutegicos SA de CV (Probiotek Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
4113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido sentildeal N-AmyE del
conjunto LnqQ con etiqueta de polihistidina fue evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea
SignalP 50 (httpwwwcbsdtudkservicesSignalP) el cual es un servidor que
determina la presencia de peacuteptidos sentildeales y la localizacioacuten de sus sitios de corte
proteoliacutetico en proteiacutenas de origen en Archaea bacterias Gram positivas y
negativas y organismos eucarioacuteticos (Armenteros et al 2019)
Esta herramienta puede distinguir entre tres tipos de peacuteptidos sentildeales tiacutepicos El
primer mecanismo es a traveacutes la viacutea Sec tipo I (SPI) que es conocido como el
mecanismo estaacutendar de excrecioacuten donde los peacuteptidos sentildeales son transportados
por el translocoacuten Sec y son escindidos por accioacuten de la Peptidasa de Sentildeal tipo I
(Lep) El segundo mecanismo corresponde a la viacutea Sec tipo II (SPII) donde los
peacuteptidos sentildeales lipoproteiacutecos son transportados por el translocoacuten Sec y cortados
mediante la Peptidasa de Sentildeal tipo II (Lsp) El uacuteltimo mecanismo corresponde a
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 37
la viacutea Tat donde los peacuteptidos sentildeales son transportados por el translocoacuten Tat tipo
y son escindidos por la Peptidasa de Sentildeal tipo I (Lep) (Armenteros et al 2019)
En la aplicacioacuten se puede elegir entre cuatro grupos de organismos para el
anaacutelisis de corte predictivo los cuales corresponden a organismos eucarioacuteticos
organismos Gram positivos organismos Gram negativos y en tipo Archaea Para
fines de nuestro proyecto dado que esta construccioacuten fue intencionada para ser
producida en ceacutelulas de E coli se eligioacute la opcioacuten para organismos Gram
negativos
Para comparar la probabilidad de corte enzimaacutetico de nuestra construccioacuten in silico
de N-AmyELnqQ6xHis se descargoacute los datos bioinformaacuteticos de seis secuencias
aminoaciacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y cuyo corte proteoliacutetico fue
demostrado experimentalmente
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
4121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica del peacuteptido de fusioacuten SmbP fue
amablemente cedido por el Dr Xristo Zaacuterate de la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten La secuencia nucleotiacutedica del SmbP estaacute contenida en un vector de
expresioacuten tipo pET30a(+) y guardado en formato dna
4122 Disentildeo y acoplamiento de peacuteptido de fusioacuten SmbP con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido de fusioacuten con la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo geneacutetico desde la base de datos biotecnoloacutegicos Este
acoplamiento fue manualmente resulto a traveacutes de SnapGene
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pSmbP-
LnqQ fueron elaborado en SnapGene 113 guardados en formato dna y enviado
a Gene Universal Inc (Estados Unidos) a traveacutes del tercero autorizado
Distribuidora Bakterlab SA de CV (Bakterlab Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
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4123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP del
conjunto LnqQ evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea PeptideCutter
(httpswebexpasyorgpeptide_cutter) la cual predice sitios potenciales para ser
cortados por proteasas o por sustancias quiacutemicas en una secuencia de proteiacutena
determinada (Gasteiger et al 2005) Esta aplicacioacuten contiene una lista extensa de
reacciones enzimaacuteticas y quiacutemicas Para fines de nuestro proyecto se eligioacute la
opcioacuten de ldquoEnterokinaserdquo ya que nuestra construccioacuten contiene este dominio
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Para descartar que la existencia de alguacuten codoacuten de paro no observado durante la
fase de post disentildeo optamos por analizar la secuencia nucleotiacutedica de la regioacuten
de intereacutes de pETNL y pSmbP-LnqQ en la aplicacioacuten en liacutenea ORF Finder
(httpswwwncbinlmnihgovorffinder) la cual es una aplicacioacuten que encuentra
marcos de lectura abiertos en una secuencia de nucleoacutetidos Los paraacutemetros
seleccionados correspondieron a ldquoATGrdquo exclusivamente como codoacuten de inicio y
como coacutedigo geneacutetico se utilizoacute la opcioacuten 1 correspondiente a ldquoStandardrdquo Esta
aplicacioacuten realiza una traduccioacuten de la secuencia nucleotiacutedica a partir de la
traduccioacuten de seis marcos de lectura y devuelve un graacutefico que indica la ubicacioacuten
donde se encuentra cada marco de lectura identificado (Wheeler et al 2003)
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
El peso molecular estimado de los productos de los vectores pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron estimado a traveacutes de la aplicacioacuten Compute pIMW de ExPasy
(httpswebexpasyorgcompute_pi) la cual permite estimar el punto isoeleacutectrico
(pI) teoacuterico y el peso molecular (MW) teoacuterico a partir de secuencias reportadas o
secuencias de aminoaacutecidos ingresados por el usuario (Gasteiger et al 2005)
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415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
La solubilidad de los productos de los pETNL y pSmbP-LnqQ fueron analizados
por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk) (Hebditch et al
2017) mientras que la localizacioacuten subcelular de las proteiacutenas fue determinada por
la herramienta BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo et al 2018)
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
Phyre2 (httpwwwsbgbioicacukphyre2htmlpagecgiid=index) es una
aplicacioacuten en liacutenea para el anaacutelisis de modelado para estructuras secundarias y
tridimensionales Esta herramienta permite predecir y analizar la estructura de la
proteiacutena asiacute como funciones y mutaciones haciendo maacutes faacutecil la interfaz al usuario
para interpretar la estructura secundaria y terciaria de los modelos asiacute como la
composicioacuten de dominios y la calidad del modelo (Kelley Mezulis Yates Wass amp
Sternberg 2015)
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
4171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Para transformar las ceacutelulas de E coli con el vector de expresioacuten pET30a(+)
pETNL o pSmbP-LnqQ se utilizoacute la teacutecnica de electroporacioacuten (Potter amp Heller
2003) que consiste en la introduccioacuten de DNA exoacutegeno al interior de las ceacutelulas
por meacutetodos fiacutesico-quiacutemicos A continuacioacuten describimos la teacutecnica
Se preparoacute un cultivo overnight de E coli en un tubo con caldo LB esteacuteril y se
incuboacute por 37degC en agitacioacuten constante por 18 h Al diacutea siguiente 20 microl del cultivo
preinoacuteculo fueron retirados y depositados en un microtubo con 1 ml de caldo LB
esteacuteril este proceso se realizoacute en seis tubos donde tres son etiquetados ldquoMuestrardquo
(M) ldquoAntibioacuteticordquo (A) ldquoViabilidadrdquo (V) y tres maacutes fueron reservados para anaacutelisis
espectrofotomeacutetricos Se incubaron todos los tubos a 37degC durante
aproximadamente 15 h (OD600 entre 04-06) en agitacioacuten constante Todos los
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tubos asignados para anaacutelisis espectrofotomeacutetricos fueron usados para monitoreo
Una vez alcanzado el tiempo establecido los tubos M A y V fueron centrifugados
a 9000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente El sobrenadante de los tubos
fue descartado y las ceacutelulas fueron resuspendidas en 1 ml de agua ultrapura
esteacuteril a temperatura ambiente Los tubos fueron centrifugados a 9000 rpm
durante 2 min a temperatura ambiente Este paso se repitioacute una vez El precipitado
celular en los tubos M A y V fue resuspendido en 35 microl de agua ultrapura esteacuteril y
se agregoacute al menos 2 a 3 microl de plaacutesmido (asymp 500 microg totales) o de agua seguacuten el
caso Finalmente se mezcloacute cuidadosamente con la micropipeta
En el tubo de viabilidad no se agregoacute plaacutesmido y fue sembrado en una placa LB
En el tubo etiquetado como antibioacutetico no se agregoacute plaacutesmido y el precipitado fue
sembrado en una placa de LB suplementado con kanamicina (50 microgml) Al tubo
de control positivo se agregoacute un plaacutesmido resistente a la kanamicina y eacutesta fue
sometida a electroporacioacuten y sembrada en una placa con LB con kanamicina En
la muestra se agregoacute alguno de los siguientes plaacutesmidos pET30a(+) pETNL o
pSmbP-LnqQ y posteriormente fue sometido a electroporacioacuten y sembrado en una
placa de LB con kanamicina
El volumen total de los tubos fue transferido a una celda de electroporacioacuten en el
espacio de 2 mm El equipo de electroporacioacuten (previamente irradiado con luz UV
por 15 min) fue encendido y configurado para electroporar a 2500 V
Posteriormente se agregoacute 1 ml de caldo LB esteacuteril a la celda de electroporacioacuten y
cuidadosamente mezclado (para evitar estresar a la ceacutelula) La mezcla es tomada
con mucho cuidado desde la celda y transferido a un tubo de 15 ml esteacuteril El tubo
fue incubado a 37degC por 1 h en agitacioacuten muy baja Cumplido el tiempo
establecido el tubo fue centrifugado a 9000 rpm durante 2 min Se retiroacute la mayor
parte del sobrenadante (asymp 950 ml) y el restante fue mezclado suavemente con el
precipitado celular hasta suspender la solucioacuten El volumen total resuspendido fue
sembrado en placas de LB agar o LB agar suplementado con kanamicina (50
microgml) dependiendo el caso Las placas fueron incubadas a 37degC en condiciones
de aerobiosis durante 16 h Al terminar las placas fueron revisadas y
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 41
seleccionadas Las ceacutelulas efectivamente transformadas con los plaacutesmidos fueron
resistentes a la accioacuten de la kanamicina mientras que las no transformadas fueron
eliminadas Las ceacutelulas transformadas fueron validadas posteriormente por
teacutecnicas moleculares como extraccioacuten de DNA plasmiacutedico yo identificacioacuten por
producto de PCR punto final
4172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Para la extraccioacuten y purificacioacuten utilizamos el Isolate II Plasmid Mini Kit de
Meridian Biosciencereg (Estados Unidos Cat BIO-52056) Se preparoacute un cultivo
overnight de E coli en un tubo 5 ml de caldo LB esteacuteril y se incuboacute por 37degC en
agitacioacuten constante por no maacutes ni menos de 16 h Al diacutea siguiente previo al
ensayo de extraccioacuten se precalentoacute la solucioacuten de buffer de lavado PW1 a 50degC y
la temperatura se mantuvo a esta temperatura hasta su uso Se verificoacute que el
buffer de lavado PW2 estuviera suplementado con etanol
El cultivo overnight fue centrifugado a 11000 x g por 30 minutos El volumen se
retiroacute y se mantuvo el precipitado celular al cual se agregoacute 250 microl del buffer de
resuspensioacuten P1 y el precipitado se resuspendioacute por completo por voacutertex Es
importante que no quede masa celular adherida en los tubos Posteriormente se
agregaron 250 microl de buffer de lisis P2 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas
6 a 8 veces El tubo fue incubado a temperatura ambiente por 5 min o hasta que el
lisado celular se tornara claro Cumplido el tiempo anterior se adicionaron 300 microl
de buffer de neutralizacioacuten P3 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas 6 a 8
veces Este procedimiento fue para evitar el rompimiento del DNA genoacutemico Los
tubos fueron centrifugados a 11000 x g durante 5 min a temperatura ambiente
Este paso fue repetido hasta que el sobrenadante quedara lo maacutes claro posible
Posteriormente se tomoacute una columna tipo spin y sobre eacutesta se agregoacute un tubo
colector y sobre eacutesta se antildeadioacute el volumen recuperado del paso anterior El tubo
con el volumen fue centrifugado a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Sobre el tubo colector se
agregoacute 500 microl de buffer de lavado PW1 precalentado y se centrifugoacute a 11000 x g
por 5 min a temperatura ambiente El sobrenadante del tubo fue eliminado por
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decantacioacuten Se adicionoacute 600 microl de buffer de lavado PW2 (suplementado con
etanol) y se centrifugoacute a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Centrifugar de nuevo el tubo
colector a 11000 x g por 2 min a temperatura ambiente para remover etanol
residual
Debajo del tubo colector se colocoacute un tubo de 15 ml esteacuteril y se agregoacute 50 microl de
buffer de elucioacuten P directamente sobre la membrana de siacutelice Se incuboacute a
temperatura ambiente y se centrifugoacute a 11000 x g por 2 min a temperatura
ambiente Del tubo con DNA purificado se tomaron 2 microl y se analizaron por nano-
espectrofotometriacutea para el caacutelculo de concentracioacuten y de pureza del DNA
plasmiacutedico
4173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Para comprobar que las ceacutelulas de E coli fueran efectivamente transformadas con
el vector de expresioacuten pET30a(+) pETNL y pSmbP-LnqQ se realizoacute un
experimento de PCR punto final para identificar al plaacutesmido recuperado de las
ceacutelulas de E coli Para ello nos enfocamos en primer lugar a elegir un par de
oligonucleoacutetidos que cumplieran de identificar los vectores de expresioacuten
El par de oligonucleoacutetidos elegidos para el anaacutelisis de las construcciones
corresponden al T7 promoter primer (5rsquo- TAATACGACTCACTATAGGG-3rsquo) y al T7
terminal primer (5rsquo- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3rsquo) los cuales son oligonucleoacutetidos
especiacuteficos para vectores construidos basados en pET30a(+) La secuencia de
ambos oligonucleoacutetidos fue recuperada de una compilacioacuten de AddGene para
ldquoSequencing Primersrdquo (httpswwwaddgeneorgmol-bio-referencesequencing-
primers)
Para determinar la temperatura de fusioacuten oacuteptima del par de oligonucleoacutetidos
utilizamos dos herramientas bioinformaacuteticas en liacutenea La primera aplicacioacuten fue
OligoAnalyzertrade (httpswwwidtdnacomcalcanalyzer) de la compantildeiacutea Integrated
DNA Technologies Inc (Estados Unidos) donde se ajustaron paraacutemetros como la
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concentracioacuten de oligonucleoacutetido las concentraciones de iones monovalentes
(Na+) y divalentes (Mg2+) asiacute como la concentracioacuten de nucleoacutetidos (dNTPs) en la
reaccioacuten para el caacutelculo de formacioacuten de hairpin homodiacutemeros y heterodiacutemeros
La otra aplicacioacuten es Net Primer (httpswwwpremierbiosoftcomnetprimer) de
Premier Biosoft que tambieacuten contiene puntos como la aplicacioacuten anteriormente
mencionada pero contiene opciones como el caacutelculo de rating de eacutexito y
estabilidad en el extremo 3rsquo-terminal
Para realizacioacuten del ensayo de PCR punto final utilizamos el High-Stability PCR
kit (Cat No L00342 Manual No 0285 Versioacuten 08272013) de GenScript Inc
(Estados Unidos) De esta manera ajustamos las condiciones de reaccioacuten de PCR
seguacuten lo determinado por el fabricante para por la DNA polimerasa Green Taq La
reaccioacuten de PCR punto final se ajustoacute a una concentracioacuten de oligonucleoacutetidos de
trabajo para 10 microM concentracioacuten de monovalentes (Na+K+) a 500 mM
concentracioacuten de divalentes (Mg2+) a 15 mM y concentracioacuten de dNTPs a 05 mM
El protocolo general para ensayo de PCR punto final de acuerdo con el fabricante
consistioacute en que por cada 50 microl de volumen de reaccioacuten se agregariacutean 5 microl de 10
X de Reaction Buffer 10 microl de 10 mM de dNTPs 10 microl por el oligonucleoacutetido 5rsquo-
terminal a 20 microM 10 microl por el oligonucleoacutetido 3rsquo-terminal a 20 microM 20 microl de
plaacutesmido (de al menos 100 ngmicrol) 395 microl de agua ultrapura esteacuteril y 05 microl de la
DNA polimerasa Green Taq
4174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Las muestras obtenidas fueron procesadas en un gel de agarosa (1 pv)
adicionada con Eco-Stain ready to use (Cat No DT81413) de BioBasic Inc
(Canadaacute) el cual es una sustancia que tiene un pico de excitacioacuten a λ = 490 nm y
dos picos de emisioacuten λ = 520 nm y λ = 635 nm y esta solucioacuten se agrega al gel en
una relacioacuten de 1 microl por 20 ml de solucioacuten de agarosa Las muestras fueron
corridas durante 1 h a 100 V en caacutemara para electroforesis Al terminar el tiempo
establecido el gel fue retirado e iluminado con luz UV en el transiluminador y se
tomoacute una fotografiacutea como evidencia Todos los geles fueron elaborados con su
respectivos controles positivos negativos y muestras
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418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
4181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Brevemente cultivos con diferentes cepas de E coli transformados con
pET30a(+) pETNL o pSmbP-LnqQ fueron inducidos con IPTG Se realizoacute un
cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado en un matraz con 25 ml de
caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50 microgml) a 37degC en agitacioacuten
constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se registroacute el valor de OD600 del
cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo preinoacuteculo en un matraz
esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina hasta llegar a un valor
inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado a 37degC en agitacioacuten constante
hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de OD600 asymp 04
Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue inoculado con
IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos diferentes
temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue distribuido en
tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten Todos los tubos
usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los tubos fueron
propiamente etiquetados
4182 Extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pETNL
Los cultivos de E coli transformados ya fuera con pET30a(+) pETNL o pSmbP-
LnqQ fueron inducidos por IPTG para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
Brevemente se realizoacute un cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado
en un matraz con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50
microgml) a 37degC en agitacioacuten constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se
registroacute el valor de OD600 del cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo
preinoacuteculo en un matraz esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con
kanamicina hasta llegar a un valor inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado
a 37degC en agitacioacuten constante hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de
OD600 asymp 04 Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue
inoculado con IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 45
diferentes temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue
distribuido en tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten
Todos los tubos usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los
tubos fueron propiamente etiquetados
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten periplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Santos y sus colaboradores (BD Santos et al 2019) que es un
procedimiento en un ensayo de lisozima con choque osmoacutetico Se descongeloacute los
tubos a baja temperatura y posteriormente fueron centrifugados a 8000 times g
durante 15 min a 4degC El sobrenadante de cada tubo fue eliminado y lavado dos
veces con buffer PBS 1X pH 74 (Gibco) friacuteo (8000 times g durante 10 min a 4degC) En
el uacuteltimo lavado los tubos con precipitado celular fueron pesados y sus pesos se
registraron Por uacuteltimo se calculoacute la diferencia entre los tubos con precipitado
celular contra los tubos cuando estaban vaciacuteos A cada uno de los tubos con
precipitado celular se le agregoacute solucioacuten hipertoacutenica friacuteo (sacarosa 20 trizma 20
mM EDTA 2 mM y lisozima 20 mgml pH 80) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten
hipertoacutenica por cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido
de cada tubo fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el
tiempo el cultivo fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC
El sobrenadante fue recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten
periplaacutesmica hipertoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El
precipitado celular es reservado Una vez retirada la fraccioacuten anterior los tubos
con precipitado celular remanentes fueron pesados de nuevo y se agregoacute solucioacuten
hipotoacutenica (agua ultrapura esteacuteril) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten hipotoacutenica por
cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido de cada tubo
fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el tiempo el cultivo
fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC El sobrenadante fue
recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten periplaacutesmica
hipotoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El precipitado celular se
eliminado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 46
4183 Extraccioacuten de proteiacutenas citoplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pSmbP-LnqQ
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten citoplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Vargas y sus colaboradores (Vargas-Cortez et al 2016) junto con
recomendaciones de Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) que es un
procedimiento basado en perlas de vidrio
Se descongelaron los tubos a baja temperatura y posteriormente centrifugados a
8000 times g durante 15 min a 4degC El precipitado celular de los tubos fueron
resuspendidos en buffer de lisis friacuteo (Tris-HCl 50 mM NaCl 500 mM pH 80) y se
agregaron 150 mg de perlas de vidrio limpios de 01 mm Los precipitados
celulares resuspendidos en perlas fueron mezclados por voacutertex durante 1 min Los
tubos fueron centrifugados a maacutexima velocidad por 15 min a 4degC El sobrenadante
fue recuperado con cuidado de cada tubo y fue etiquetado como ldquoFraccioacuten
citoplaacutesmicardquo
4184 Obtencioacuten de fracciones solubles e insolubles para SDS-PAGE
Para obtener las fracciones solubles e insolubles seguimos el protocolo de Santos
(Byran Santos 2017) Para la fraccioacuten soluble a partir del sedimento celular eacutesta
es resuspendida en 120 microl de agua ultrapura esteacuteril y despueacutes se le agregan 40 microl
de solucioacuten amortiguadora de carga SDS-PAGE 4X suplementado con β-
mercaptoetanol para una concentracioacuten final al 1X La solucioacuten fue hervida durante
10 min y posteriormente centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante
fue separado y guardado como ldquoFraccioacuten solublerdquo Luego al sedimento restante
se le agregaron 120 microl de solucioacuten de urea 8 M y se hierve de nuevo durante otros
10 min para solubilizacioacuten de los cuerpos de inclusioacuten Finalmente la solucioacuten fue
centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante fue separado y guardado
como ldquoFraccioacuten insolublerdquo Ambas fracciones fueron visualizadas posteriormente
en los geles de SDS-PAGE
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 47
4185 Preparacioacuten de gel de SDS-PAGE 16
Los geles de SDS-PAGE fueron preparados bajo las siguientes condiciones se
prepararon dos geles en dos tubos nuevos e independientes conocidos como
lower y upper con suficiente capacidad para almacenar el volumen de cada gel
Primero se preparoacute el lower gel y solo hasta haber terminado ese gel se procedioacute
a preparar el upper gel
Para preparar el lower gel a 16 preparamos una reaccioacuten considerando un
volumen de 10 ml Para ello mezclamos 350 ml de agua destilada 400 ml de
solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) 250 ml de lower buffer (para 25 ml Tris
1515 g SDS 01 g pH 68) 200 microl de APS 10 (pv) y TEMED 20 microl Para el
upper gel a 4 estaacute reaccioacuten fue montada con un volumen de 5 ml Para ello
mezclamos 325 ml de agua destilada 050 ml de solucioacuten de BisAcrilamida 40
(291) 125 ml de upper buffer (para 25 ml Tris 454 g SDS 01 g pH 88) 100 microl
de APS 10 (pv) y 20 microl de TEMED
Tanto la solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) del upper buffer y el lower buffer
fueron retirados del refrigerador y atemperados a temperatura ambiente cuando
menos unos 15 min antes de uso La solucioacuten de APS a una relacioacuten de 01 g por
1 ml (10 pv) debioacute prepararse al momento con agua destilada limpia Toda la
cristaleriacutea usada para preparar el gel de poliacrilamida debioacute ser lavada con agua
destilada limpia y secarse con suficiencia evitando rayar los vidrios
Una vez agregado el TEMED a la mezcla la solucioacuten fue inmediatamente vertido
sobre placas de vidrio Fue necesario esperar entre 20 a 30 minutos para que
completar el proceso de polimerizacioacuten En el lower gel se agregaron 200 microl de
isobutanol para el upper gel en la parte superior se agregoacute un molde para
pocillos Terminado el tiempo de polimerizacioacuten se agregaron las muestras de
proteiacutenas en los pocillos del gel de SDS-PAGE Los geles fueron puestos sobre
una caacutemara de electroforesis vertical y sumergidos en un buffer de corrida a 1X
(para 1000 ml Tris 3 g Glicina 144 g y SDS 1 g) El gel fue corrido a 150 V
durante 1 a 15 h dependiendo de la liacutenea de corrida de la solucioacuten
amortiguadora
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 48
4186 Tincioacuten de gel SDS-PAGE
Previo a tentildeir los geles se prepararon dos soluciones Para la solucioacuten de tincioacuten
se pesaron cuidadosamente y con guantes 50 mg de Coomasie Blue R-250 en un
tubo plaacutestico limpio para un volumen de 50 ml Despueacutes se agregaron 25 ml de
metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta
50 ml con agua destilada limpia Mantener a temperatura ambiente y en
condiciones de obscuridad hasta su uso Mientras que para la solucioacuten de
destincioacuten se midieron 75 ml de metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico
absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta 50 ml con agua destilada limpia
Mantener a temperatura ambiente hasta su uso
Cuando terminado el paso de corrida por electroforesis los geles fueron
cuidadosamente separados de los vidrios El gel fue tentildeido con la solucioacuten de
tincioacuten durante toda la noche en agitacioacuten constante a temperatura ambiente y
posteriormente fue destentildeido con la solucioacuten de destincioacuten durante el resto del diacutea
siguiente bajo las mismas condiciones previas El gel fue puesto sobre un fondo
blanco y se fotografioacute como evidencia
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en
los geles
La presente seccioacuten fue desarrollada posterior a la conclusioacuten de la fase
experimental con el objetivo de explicar la ausencia de bandas tanto de N-
AmyELnqQ como de SmbP-LnqQ en los geles de SDS-PAGE Para abordar el
problema exploramos las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas por el
anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle un anaacutelisis de perfil
aminoaciacutedico y finalmente a traveacutes de diferencias por su origen evolutivo
Las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas como el tamantildeo de proteiacutenas
peso molecular punto isoeleacutectrico nuacutemero total de residuos con carga positiva y
negativa iacutendice alifaacutetico (AI) e iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) fueron calculadas
a traveacutes de ProtParam de ExPasy (httpswebexpasyorgprotparamprotparam-
dochtml) (Gasteiger et al 2005) El iacutendice alifaacutetico (AI) estaacute principalmente
afectado por los cuatro aminoaacutecidos con cadena lateral alifaacutetico alanina valina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 49
leucina e isoleucina El incremento del AI es directamente proporcional a la
termoestabilidad en proteiacutenas globulares (Atsushi 1980) El iacutendice de
hidrofobicidad (GRAVY) es el resultado del promedio que representa la suma total
de los valores de hidropatiacutea de cada uno de los residuos dentro de una cadena
lineal de aminoaacutecidos dividido por el tamantildeo del peacuteptidoproteiacutena Una proteiacutena
con valor GRAVY negativo una proteiacutena hidrofiacutelica mientras que una proteiacutena con
valor GRAVY positivo es hidrofoacutebica (Kyte amp Doolittle 1982)
El anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle fue elaborado a
partir de ProtScale de ExPasy (httpswebexpasyorgprotscale) (Gasteiger et al
2005) Esta herramienta permite elaborar un perfil producido por cualquier escala
aminoaciacutedica a partir de una secuencia aminoaciacutedica Existen 57 escalas de
hidrofobicidad yo hidrofilicidad para fines de nuestro experimento utilizamos la
opcioacuten ldquoHphob Kyte amp Doolittlerdquo
El mapa de calor representa el porcentaje de aminoaacutecidos dada en una secuencia
lineal de aminoaacutecidos con el fin de elaborar un perfil aminoaciacutedico entre los
diferentes peacuteptidos antimicrobianos que fueron efectivamente sobreproducidos por
SmbP La graacutefica fue elaborada a traveacutes de Excel con datos descargados desde la
aplicacioacuten ProtParam de ExPasy
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 50
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS
Las actividades del proyecto fueron realizadas en los Laboratorios de Biologiacutea y de
Sistemas del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea y el
Laboratorio de Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas ubicado en la Divisioacuten de
Estudios de Posgrado ambas infraestructuras pertenecientes a la Facultad de
Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
A continuacioacuten se presenta un listado completo de los materiales y equipos
utilizado
51 Materiales y reactivos
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Microtubos de 15 ml 15 ml y 50 ml Distintas marcas No especificado
Cajas Petri de plaacutestico o vidrio Distintas marcas No especificado
Matraces tipo Erlenmeyer Distintas marcas No especificado
Celdas para espectrofotoacutemetro No especificado No especificado
Celdas de electroporacioacuten No especificado No especificado
Micropipetas (varios voluacutemenes) Distintas marcas No especificado
Medio de cultivo LB Difco 244620
Agar bacterioloacutegico MCD-LAB 9011
Agua grado Biologiacutea Molecular Invitrogen 10977-015
Kanamicina sulfato AG Scientific K-1022
Ampicilina soacutedica Sigma Aldrich A0166
Perlas de vidrio 01 mm Biospec 11079101
IPTG Bioline BIO-37036
LDS Sample Buffer 4X GenScript M00676-10
SDS IBI Scientific IB07062
Persulfato de Amonio (APS) BioBasic AB0072
TEMED Merck 110732
Glicina BioBasic GB0235
Bis-Acrilamida 40 (29109) Merck 100641
Coomasie Briliant Blue BioBasic CB0038
2-mercaptoetanol BioBasic MB0338
Isopropanol 100 DEQ No especificado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 51
Aacutecido fosfoacuterico 85 Jalmek A1825-13
Hidroacutexido de sodio DEQ No especificado
Aacutecido clorhiacutedrico DEQ No especificado
Alcohol metiacutelico DEQ No especificado
Aacutecido aceacutetico glacial Jalmek A0925-13
Etanol anhidro Jalmek E5325-18
Urea BioBasic UB0148
Buffer de fosfatos salinos 1X (PBS) Gibco 10010-023
Cloruro de sodio Jalmek S2325-05
Tris BioBasic TB0196
Glicerol DEQ No especificado
Guantes de nitrilo Ambiderm No especificado
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S657-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 7 J T Baker S656-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S655-02
QuickClean II Plasmid Miniprep kit GenScript L00420-100
QuickClean II Gel Extraction Kit GenScript L00418-100
QuickClean II PCR Purification Kit GenScript L00419-50
52 Equipos de laboratorio
USO PERSONAL
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Computadora personal Acer Aspire A515-51
LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA Y DE SISTEMAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Incubadora estaacutetica Lab Companion IB-11E
Incubadora de piso con agitacioacuten Lab Companion IS-971
Incubadora de agitacioacuten (microtubos) Eppendorf ThermoMixer C
Horno de secado Shel Lab SGO 6E
Horno de microondas Everstar P90D23AL-XF
Concentrador Thermo Fisher SpeedVac SPD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 52
Bantildeo de ultrasonido VMR Symphony 97043-996
Contador de colonias Reichert 3327
Agitador orbital Labnet Orbit 1000
Agitador vertical Thermo Scientific Compact Digital Rocket
Termociclador miniPCR Mini8
Termociclador Techne 3Prime
Refrigerador de puertas deslizantes Thermo Scientific MH45PA-GAEE-TS GPR Series
Refrigerador a dos puertas Norlake Scientific LRF 201WW
Congelador de -20 degC MetalFrio Solutions
No especificado
Espectrofotoacutemetro UV-Vis Optizen 2120 UV Plus
Nanoespectrofotoacutemetro BioSpec Shimadzu
Gabinete bioseguridad clase II Labconco Delta Series
Centriacutefuga para microtubos Ohaus Frontier 5515
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
Voacutertex Scientific Industries
Genie 2
Plancha de calentamiento con agitacioacuten magneacutetica
Lab Companion HP-3000L
Microscopio oacuteptico Fisher Scientific Micromaster
Autoclave Lab Companion ST-G Series
Caacutemara profesional Canon EOS M10
Transiluminador Maestro No especificado
Balanza analiacutetica AND GR-200
Balanza semianaliacutetica Ohaus Traveler
Electroporador Eppendorf Eppendorf
Fuente de Poder BioRad PowerPac Basic
Potencioacutemetro Ohaus Starter 5000
LABORATORIO DE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Cromatoacutegrafo GE Life Sciences Aumlktaprime Plus
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 53
53 Lugares de experimentacioacuten
Nuestro proyecto fue elaborado entre Febrero de 2018 a Mayo de 2021 y fue
mayoritariamente realizado en las instalaciones del Laboratorio de Biologiacutea
Sinteacutetica y de Sistemas (LBSS) a cargo del Dr Heacutector Javier Ameacutezquita Garciacutea
encontraacutendose en el interior del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y
Nanotecnologiacutea (CIBYN) dependencia de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
(FCQ) de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten El centro estaacute ubicado en la
autopista al Aeropuerto ldquoMariano Escobedordquo Km 10 Parque de Investigacioacuten e
Innovacioacuten Tecnoloacutegica (PIIT) CP 66628 en Apodaca Nuevo Leoacuten Meacutexico
En menor proporcioacuten nuestro trabajo tambieacuten fue realizado en el Laboratorio de
Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas (PEP) a cargo del Dr Xristo Zaacuterate
Kalfoacutepulos Esta unidad estaacute localizada en el interior de la Divisioacuten de Estudios de
Posgrado (DEP) de Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la Universidad
Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) La ubicacioacuten de la divisioacuten estaacute en la calle
Vicente Guerrero sn Col Trevintildeo CP 64570 en Monterrey Nuevo Leoacuten
Meacutexico
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos
Declaracioacuten de manejo y disposicioacuten de residuos
Todos residuos generados durante la realizacioacuten del proyecto de investigacioacuten
fueron gestionados de acuerdo con las caracteriacutesticas de estos siguiendo los
lineamientos establecidos por el Departamento de Medio Ambiente y Seguridad de
la Facultad de Ciencias Quiacutemicas utilizando los recipientes proporcionados por
este departamento en base a la Norma PR-CLB-SRR-000
Los residuos bioloacutegico-quiacutemicos fueron dispuestos en los contenedores
correspondientes en el interior de los laboratorios
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 54
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
En esta seccioacuten nos centramos en el disentildeo in silico de ceacutelulas de E coli
configuradas para detectar moleacuteculas de AIP producidos por el sistema nativo de
QS de ceacutelulas de MRSA De acuerdo con nuestro disentildeo (Figura 2) las ceacutelulas α
corresponden a ceacutelulas de S aureus productoras de moleacuteculas AIP mientras que
las ceacutelulas β corresponden a ceacutelulas de E coli que han sido modificadas con un
par de moacutedulos geneacuteticos biosensor y bacteriocina que le permiten detectar
moleacuteculas de AIP y en respuesta destruyen ceacutelulas de S aureus en el medio A
manera de resumen las ceacutelulas de E coli modificadas producen y excretan LnqQ
en funcioacuten de la concentracioacuten externa de moleacuteculas de AIP
Nuestra determinacioacuten por elegir bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
para nuestro sistema biosensor se explica en la siguiente numeracioacuten en primer
lugar consideramos que debido a su origen proteico son susceptibles a
modificaciones geneacuteticas (Cotter et al 2013)
Figura 2 Sistema QS para deteccioacuten y eliminacioacuten de S aureus
El moacutedulo biosensor conformado por agrC y agrA (azul marino y azul celeste respectivamente) estaacute regulado
por el promotor constitutivo J23110 La deteccioacuten del AIP-II (pentaacutegonos naranja) estaacute regulado por AgrC la
cual activa la fosforilacioacuten (ciacuterculos amarillo) de AgrA y activa la expresioacuten del moacutedulo bacteriocina a traveacutes
de la lnqQ lnqBCEDF y gfp (rojo amarillo y verde respectivamente) regulado por el promotor P2 LnqQ
destruye ceacutelulas de S aureus
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 55
62 Cepas bacterianas
La razoacuten de escoger a E coli como chasis bioloacutegico de produccioacuten es porque ya
ha sido reportado previamente como biosensor de ceacutelulas enteras basados en
deteccioacuten del QS (Sedlmayer Hell Muumlller Auslaumlnder amp Fussenegger 2018) y
ademaacutes porque es el organismo de produccioacuten heteroacuteloga maacutes usado en el campo
de las bacteriocinas (Mesa-Pereira et al 2018) Nuestro modelo estaacute disentildeado
para ser aplicado en E coli BL21 (DE3) ya que ha sido efectivamente reportado
para producir y secretar bacteriocinas de las clases IIa y IId eacuteste uacuteltimo es
importante ya que esta es la clase a la que pertenece la bacteriocina LnqQ (Mesa-
Pereira et al 2017)
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
Para determinar el comportamiento in silico de nuestra ceacutelula de E coli fue
necesario disentildear un vector de expresioacuten con dos moacutedulos geneacuteticos y eacutestos
fueron referidos como moacutedulo biosensor y moacutedulo de bacteriocina
respectivamente Ambos moacutedulos fueron disentildeados de la siguiente manera
promotor-RBS-gene(s) estructural(es)-doble terminador (Figura 3)
Figura 3 Moacutedulos biosensor y de bacteriocina
El moacutedulo biosensor es configurado con agrC y agrA y estaacuten regulados transcripcionalmente por el promotor
J23110 (A) El moacutedulo de bacteriocina estaacute armado con los genes lnqQ y gfp y estaacuten regulados
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 56
transcripcionalmente por el promotor P2 (B) Por uacuteltimo se muestra el disentildeo del sistema detectar y destruir
con los promotores divergentes J23110 y P2 (C)
En primera instancia se debioacute localizar el locus geneacutetico del promotor P2 de
nuestra MRSA fue manualmente localizado puesto que no existiacutea informacioacuten
relacionada al mismo De acuerdo con Shao y otros el locus de un promotor se
encuentra evolutivamente conservado entre especies que estaacuten relacionadas
(Shao Price Deutschbauer Romine amp Arkin 2014) De esta manera utilizamos
la anterior premisa para localizar el promotor P2 en un primer enfoque
localizamos la secuencia nucleotiacutedica del agrB en el archivo genoacutemico de la
MRSA (564 nucleoacutetidos KEGG no SA1842) como referencia ya que se conoce
que este gen es conocido que eacutesta es la primera unidad transcripcional ubicada riacuteo
abajo del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Para el segundo
enfoque usamos la informacioacuten disponible del promotor P2 de S aureus NCTC
8325 (Rajasree Fasim amp Gopal 2016 Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) una
cepa catalogada como estaacutendar para estudios bioinformaacuteticos (S Fuchs et al
2017 Herbert et al 2010) Al combinar lo mejor de ambos enfoques logramos
localizar la composicioacuten nucleotiacutedica del promotor P2 y su tamantildeo a traveacutes de la
identificacioacuten de los dominios
A continuacioacuten explicamos el principio del disentildeo de ambos moacutedulos En primer
lugar el moacutedulo designado como biosensor los genes agrC y agrA son
constitutivamente expresados por accioacuten del promotor J23110 Brevemente se
describe el principio del disentildeo donde inicialmente el AgrC anclado a membrana
de E coli detecta la presencia de moleacuteculas de AIP externas (Marchand amp Collins
2013) De esta manera AgrC sufre de un cambio conformacional y fosforila al
factor de transcripcioacuten AgrA Despueacutes el AgrA fosforilado (AgrA) actuacutea como
factor de transcripcioacuten del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Una
vez que AgrA-P se ha acoplado al promotor P2 el moacutedulo de bacteriocina es
expresado incluyendo los genes tipo estructural (lnqQ) excrecioacuten y
autoinmunidad (lnqBCEDF) del operoacuten lnq asiacute como del gen reportero gfp
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 57
Algunos autores han demostrado que mantener intacto el operoacuten nativo de una
bacteriocina cualesquiera (es decir que contenga los elementos geneacuteticos de su
estructura para su secrecioacuten y para autoinmunidad) en E coli eacutesta ceacutelula
modificada es capaz de excretar bacteriocinas Gram positivos al medio
extracelular (Mesa-Pereira et al 2017)
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
Los moacutedulos geneacuteticos fueron disentildeados para operar en el mismo sentido que el
ensamble por tipo BioBrick al yuxtaponer las propiedades del BioBrick (RFC 10) y
el BglBrick (RFC 21) La intencioacuten del disentildeo es que nuestros moacutedulos geneacuteticos
sean faacutecilmente ensamblados o removidos por teacutecnicas como In-Fusion (Sleight
Bartley Lieviant amp Sauro 2010) o ensamblado por clonacioacuten in vivo (Garciacutea-
Nafriacutea Watson amp Greger 2016) dado que los sitios de restriccioacuten actuacutean como
sitios homoacutelogos para la clonacioacuten
Cada moacutedulo estaacute flanqueado por sitios de restriccioacuten para que puedan ser
intercambiados de ser necesario El moacutedulo de promotores estaacute flanqueado por
los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI manteniendo a EcoRI como unidad neutral
para cuando sean necesario el intercambio de piezas Los elementos del moacutedulo
biosensor estaacuten flanqueados por los sitios BglII y BamHI y los elementos del
moacutedulo de bacteriocinas estaacuten rodeados por los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI
(Figura 4)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 58
Figura 4 Estrategia de construccioacuten in silico
El moacutedulo biosensor (seccioacuten A) estaacute constituido por el BglBrick RFC21 mientras que el moacutedulo bacteriocina
(seccioacuten C) estaacute representado por el BioBrick RFC10 La seccioacuten de promotores (seccioacuten B) fue colocado en
caso de que los promotores fueran cambiados Cada bloque contiene una regioacuten prefija y otra sufija y cada
bloque estaacute flanqueado en ambas direcciones por terminadores dobles de transcripcioacuten (BBa_B0015 ciacuterculos
rojos) La seccioacuten B estaacute bordeada por los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI (G-X) con la regioacuten EcoRI como
neutral La seccioacuten A EcoRI y BglII (E-G) estaacuten anclados como prefijos mientras que BamHI y XhoI (B-X)
estaacuten puestos como sufijos Los sitios de restriccioacuten BglII y BamHI fueron usados para construir el promotor
constitutivo J23110 en conjunto a su parte estructural (RBS-gen) para el moacutedulo de biosensor Por otro lado
para la seccioacuten C el prefijo estaacute compuesto por los sitios EcoRI-XbaI (E-X) y los sitios SpeI-PstI (S-P) son
colocados como prefijos Los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI fueron usados para construir el promotor
inducible P2 y en conjunto a su parte estructural (RBS-gene) para el moacutedulo de bacteriocina
El plaacutesmido pSB1A3 (AddGene no 116850) (Dupin amp Simmel 2019) sirvioacute como
plantilla para la construccioacuten de los moacutedulos geneacuteticos Las secciones prefijo y
sufijo fueron manualmente remplazados por cualquiera de los moacutedulos disentildeados
El replicoacuten y los genes de resistencia a antibioacutetico del plaacutesmido fueron retenidos
pero el terminador de transcripcioacuten fue remplazado por terminadores dobles
Finalmente un par de plaacutesmidos fueron construidos y cada uno contiene
individualmente del moacutedulo de biosensor o de bacteriocina respectivamente
Finalmente ambos plaacutesmidos fueron manualmente mezclados para crear un
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 59
plaacutesmido que contiene un par de moacutedulos que estaacuten en direcciones divergentes
Este vector de expresioacuten fue nombrado Dual Biosensor-Killer (Figura 5)
Figura 5 Representacioacuten esquemaacutetica del vector Dual Biosensor-Killer
El moacutedulo biosensor contiene los genes agrC y agrA y estaacute rodeado por los sitios de restriccioacuten EcoRI BglII y
XhoI mientras que el moacutedulo de bacteriocina contiene los genes del cluacutester lnqQBCDEF y el gen reportero gfp
y estaacute flanqueado por los sitios de restriccioacuten EcoRI XbaI SpeI y PstI Este plaacutesmido contiene un marcador
de resistencia a ampicilina y se compone de un total de 8904 pb
Parte de la estrategia de nuestro disentildeo consistioacute en que los promotores J23110 y
P2 fueran colocadas en sentidos opuestos para regular de manera independiente
la actividad de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina respectivamente La razoacuten
de aislar ambos moacutedulos es para evitar la expresioacuten por goteo que pudiera existir
por efecto de la fuerza de alguno de los promotores al mantenerse en la misma
direccioacuten transcripcional (Lubkowicz et al 2018) Todos los archivos generados
para la elaboracioacuten del vector de expresioacuten Dual Biosensor-Killer fueron
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 60
elaborados por SnapGene y estaacuten disponibles en los archivos anexos de esta
misma tesis
65 Optimizacioacuten de los codones nativos
De acuerdo con las observaciones (Tabla 1) todas las secuencias fueron
optimizadas para ser expresadas en E coli cepa tipo B Noacutetese que los sitios de
restriccioacuten tiacutepicos y los codones de paro de todas las secuencias utilizadas fueron
removidos El iacutendice CAI antes de la optimizacioacuten en AgrC AgrA LnqQ LnqB
LnqC LnqE LnqD y LnqQ era de 0407 0402 0532 0525 0518 0511 0503
and 0521 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores cambiaron a
0770 0766 0675 0735 0771 0773 0777 y 0747 respectivamente El valor
CAI para la GFP no pudo ser determinado por la aplicacioacuten antes de la
optimizacioacuten pero siacute despueacutes de la optimizacioacuten el cual correspondioacute a 0759 En
relacioacuten con el contenido de GC los valores antes de la optimizacioacuten fueron
282 272 333 225 231 305 y 245 respectivamente Despueacutes de
la optimizacioacuten los datos fueron 433 446 469 400 421 410
431 424 y 424 respectivamente El contenido GC para GFP despueacutes de
la optimizacioacuten fue de 491
Nuestros resultados el promedio del valor CAI y el promedio de contenido GC de
todas las secuencias aminoaciacutedicas antes de ser optimizadas era de 049 plusmn 005 y
2690 plusmn 371 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores
promedio fueron 075 plusmn 003 y 4361 plusmn 287 respectivamente Seguacuten las
especificaciones de la aplicacioacuten si el valor CAI es maacutes cercano a 1 eacuteste indica
que la secuencia de nucleoacutetidos utiliza los codones maacutes utilizados por el
organismo productor heteroacutelogo (Puigbograve et al 2008) Seguacuten los resultados los
valores CAI y el contenido GC de todas las proteiacutenas utilizadas como datos de
entrada fue substancialmente mejorados y estaacute optimizada para ser utilizado en E
coli heteroacuteloga La finalidad de optimizar el contenido nucleotiacutedico de las
secuencias utilizadas para disentildeo a las caracteriacutesticas requeridas del hospedero
es para incrementar el rendimiento de produccioacuten (Puigbograve et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 61
Tabla 1 Uso de codones previo y despueacutes de la optimizacioacuten
Paraacutemetros Previo a la optimizacioacuten Despueacutes de la optimizacioacuten
Gen Tamantildeo (pb) CAI GC CAI GC
agrC 1116 0407 282 0770 433
agrA 717 0402 272 0766 446
lnqQ 162 0532 333 0675 469
lnqB 240 0525 225 0735 400
lnqC 480 0518 231 0771 421
lnqE 1299 0511 259 0773 410
lnqD 678 0503 305 0777 431
lnqF 795 0521 245 0747 424
gfp NA NA NA 0759 491
El iacutendice de adaptacioacuten (CAI) y el contenido de guanidina y citosina (GC) La tabla se divide en dos
secciones previo a la optimizacioacuten y despueacutes de la optimizacioacuten La columna de gen representa el nombre del
dato de entrada y el tamantildeo que indica el total de nucleoacutetidos para cada entrada Los resultados en la tabla
representan la adaptabilidad de las secuencias de entrada usando a E coli como hospedero No fue posible
determinar el uso de codones antes de la optimizacioacuten para el gen gfp debido a que no hay suficiente
informacioacuten al computador el iacutendice CAI con esta tabla de referencia NA = No Aplica
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Es conocido que S aureus posee cuatro grandes variantes de clases de
moleacuteculas de AIP (desde I hasta IV) la cual difiere entre uno a dos residuos en la
seccioacuten madura del AIP (Ji et al 2005 B Wang amp Muir 2016) La diferencia
estructural entre las clases de AIP pueden actuar como inhibidores competitivos
del QS cuando interactuacutean con cepas filogeneacuteticamente relacionadas Este
fenoacutemeno bioloacutegico es conocido como comunicacioacuten cruzada (Everett amp
Rumbaugh 2014)
Para predecir la probabilidad de comunicacioacuten cruzada de nuestro biosensor
descargamos las secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro variantes maacutes
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 62
representativas de AgrD junto la informacioacuten anotada del AgrD de la cepa MRSA
estaacutendar Finalmente realizamos un alineamiento local bajo la herramienta
EMBOSS Water entre cada una de las secuencias aminoaciacutedicas representativas
contra la secuencia aminoaciacutedica de nuestra cepa Los resultados revelan (Tabla
2) que el AgrD de nuestro MRSA tuvo un porcentaje de identidad y de similitud con
el AgrD clase I de 478 y 652 respectivamente Para la clase II los
porcentajes fueron 100 y 100 respectivamente mientras que con la clase III
fueron de 326 y 500 respectivamente Finalmente con la clase IV los
porcentajes fueron de 457 y 609 respectivamente Seguacuten los resultados del
alineamiento podemos inferir que nuestro biosensor es uacutetil para detectar
moleacuteculas de QS producidos por S aureus N315 y por otros S aureus que sean
productores de AIP tipo II Al mismo tiempo nuestro sistema estariacutea limitado a no
detectar S aureus productores de AIP clases I III y IV
Bajo la prediccioacuten anterior nuestro biosensor completo de ceacutelulas estariacutea
capacitado para detectar ceacutelulas de S aureus N315 inclusive cepas de S aureus
USA100 las cuales son productoras naturales de moleacuteculas de AIP clase II
(Grundstad et al 2019) y estaacuten sentildealadas como entre las principales cepas tipo
MRSA que circulan a nivel mundial esta cepa es altamente letal y es una causa
de endocarditis infecciosa en la vaacutelvula nativa del corazoacuten A nivel in vitro se
reporta que es una productora de biopeliacuteculas fuertes (King Kulhankova Stach
Vu amp Salgado-Paboacuten 2016) A pesar de ser una cepa principalmente asociada a
infecciones adquiridas en hospitales (Limbago et al 2009 Tenover et al 2008)
tambieacuten se ha encontrado entre individuos que no han recibido cuidados meacutedicos
previos Noacutetese que esta cepa es resistente a vancomicina (Roberts 2013)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 63
Tabla 2 Prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Clase AIP Alineamiento de proteiacutenas Tamantildeo ID Similitud Gaps Score Ref
I MNTLFNLFFDFITGILKNIGNIAAYSTCDFIMDEVEVPKELTQLHE- 46 478 652 00 1700 1 2
II MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK 47 1000 100 00 24000 1 2
III MKKLLNKVIELLVDFFNSIGYRAAYINCDFLLDEAEVPKELTQLHE- 46 326 500 00 7200 1 2
IV MNTLYKSFFDFITGVLKNIGNVASYSTCYFIMDEVEIPKELTQLHE- 46 457 609 00 10500 2
MRSA MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK - - - - -
El alineamiento de proteiacutenas se realizoacute entre las cuatro clases mayoritarias de AIP contra el MRSA El alineamiento fue realizado en el programa Clustal Omega
mientras que la identificacioacuten (ID) similitud gaps y score fue determinado de la aplicacioacuten EMBOSS Water
1 (B Wang amp Muir 2016)
2 (Ji et al 2005)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 64
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
El anaacutelisis de solubilidad y localizacioacuten subcelular entre todas las secuencias
aminoaciacutedicas utilizadas para construir biosensor de ceacutelulas enteras es necesario
para obtener un alto rendimiento productivo (Ghosh et al 2004) Seguacuten los
resultados obtenidos por la aplicacioacuten Protein-Sol (Tabla 3) para prediccioacuten de
solubilidad eacutestos indican que LnqQ LnqF AgrA y GFP son considerados solubles
mientras que los datos obtenidos para LnqB LnqC y LnqE no pudieron ser
considerados ya que la aplicacioacuten los clasificoacute como proteiacutenas de membrana
Tabla 3 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
Gen Iacutendice Solubilidad
AgrC 0366 Invaacutelido
AgrA 0514 Soluble
LnqQ 0655 Soluble
LnqB 0655 Invaacutelido
LnqC 0644 Invaacutelido
LnqD 0388 Invaacutelido
LnqE 0609 Invaacutelido
LnqF 0607 Soluble
GFP 0592 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice superior de 045 es
porque se consideraron proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
De acuerdo con las predicciones de la aplicacioacuten BUSCA (Tabla 4) la localizacioacuten
subcelular de las proteiacutenas AgrA LnqQ LnqE y GFP es en el citoplasma mientras
que AgrC LnqB LnqC LnqD LnqE y LnqF son producidos en la membrana
plasmaacutetica Los caacutelculos predictivos en las proteiacutenas a sobreproducirse en E coli
concuerda con lo observado en la literatura para los elementos geneacuteticos del
moacutedulo biosensor el AgrC actuariacutea como una proteiacutena transmembranal con
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 65
actividad histidina quinasa mientras que AgrA actuariacutea como factor de
transcripcioacuten que se mueve a traveacutes del citoplasma para anclarse al promotor P2
(Gomes-Fernandes et al 2017) En los elementos del moacutedulo de bacteriocina se
espera que la LnqQ actuacutee como una proteiacutena soluble de bajo peso molecular que
es producido y excretado al medio extracelular (Fujita et al 2007) Para los demaacutes
elementos estructurales de este moacutedulo se sabe que LnqB es una proteiacutena
membranal tipo permeasa mientras que LnqC y LnqD son proteiacutenas con dominios
franqueados en membrana asiacute como LnqE y LnqF son proteiacutenas transportadoras
tipo ABC-2 y ABC respectivamente (Iwatani et al 2012) Por uacuteltimo los valores
de predictivos indican que la GFP seraacute producida como una proteiacutena soluble y
monomeacuterica (Zacharias et al 2002)
Tabla 4 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
Gen Valor Localizacioacuten subcelular
AgrC 075 Membrana plasmaacutetica
AgrA 07 Citoplasma
LnqQ 07 Citoplasma
LnqB 09 Membrana plasmaacutetica
LnqC 083 Membrana plasmaacutetica
LnqD 072 Membrana plasmaacutetica
LnqE 086 Membrana plasmaacutetica
LnqF 07 Citoplasma
GFP 07 Citoplasma
De acuerdo con la aplicacioacuten BUSCA las localizaciones subcelulares disponibles son membrana plasmaacutetica y
citoplasma
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
La determinacioacuten de la alergenicidad es un aspecto deseado durante la
construccioacuten del biosensor de ceacutelulas enteras debido a que nuestro sistema seriacutea
presentado en el futuro como un potencial candidato a agente terapeacuteutico Para
demostrar este punto fue necesario demostrar que la estructura tanto primaria
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como secundaria de la LnqQ presentaba epiacutetopos para ceacutelulas tipo B dado que la
alergenicidad estaacute mediada tanto por ceacutelulas De acuerdo con los resultados de la
secuencia aminoaciacutedica de la LnqQ en su estructura en forma lineal (Tabla 5) se
indica que los potenciales residuos epiacutetopos corresponden a E13 S16-V19 y W21-
D31 Mientras tanto los anaacutelisis realizados por la aplicacioacuten Discotope 20 a la
secuencia aminoaciacutedica en su forma tridimensional indican que no se encontraron
residuos potencialmente epiacutetopos para ceacutelulas B ni se determinaron sitios de
alergenicidad
Tabla 5 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas B en LnqQ
Epiacutetopos EEEEEEEEEEEEEEEE
Secuencia lineal MAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIK
Estructura CCHHHHHHHHHHHHCCHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCC
Superficie EEEBEEBBEBBBEBEEEBBEBBBEEEEEBBEBBEBBBBBEBBBEEBEEEEEEE
La prediccioacuten fue resuelta en la aplicacioacuten BediPrep En la seccioacuten de epiacutetopos si la posicioacuten estaacute arriba de
05 entonces es marcado con una letra ldquoErdquo La aplicacioacuten anexa NetsurfP fue usada para la prediccioacuten
estructural a partir de secuencia lineal y se divide en tres categoriacuteas ldquoHrdquo para heacutelice ldquoErdquo para hoja y ldquoCrdquo para
cadena En la seccioacuten de superficie se divide en dos secciones ldquoBrdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el interior de la proteiacutena (burial) mientras que ldquoErdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el exterior de la proteiacutena (exposed)
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
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610 Prediccioacuten de alergenicidad
De acuerdo con el reporte realizado por la aplicacioacuten AllerCatPro la bacteriocina
LnqQ no posee elementos alergeacutenicos
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
6111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE fue seleccionado porque se ha demostrado que los
primeros 33 residuos de la α-amilasa (AmyE) de B subtilis pueden ser acoplados
a la regioacuten N-terminal a una proteiacutena de intereacutes para su produccioacuten periplaacutesmica
en ceacutelulas de E coli (R M Papi et al 2005)
En primer lugar descargamos la secuencia nucleotiacutedica de la AmyE desde la base
de datos de GenBank Despueacutes utilizamos los dos oligonucleoacutetidos reportados
por Papi y sus colaboradores (R M Papi et al 2005) que estaacuten modificados con
extremos overhangs Cada oligonucleoacutetido estaacute compuesto por un sitio de
restriccioacuten en su extremo 3rsquo-terminal que corresponden a NdeI y BamHI
respectivamente
En la aplicacioacuten SnapGene el archivo geneacutetico del AmyE fue abierto y sobre eacutesta
se incorporaron los dos oligonucleoacutetidos mencionados arriba despueacutes se corrioacute un
ensayo de PCR in silico para extraer el peacuteptido sentildeal N-AmyE de la amilasa El
producto in silico resultante corresponde a un tamantildeo 117 pb que estaacute ordenado
de la siguiente manera 5rsquo-NdeI-(N-AmyE)-BamHI-3rsquo
En la misma aplicacioacuten realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten con
el producto de PCR in silico y el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)dnardquo Desde la
aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten pET-30a(+) y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten NdeI y BamHI
Posteriormente el producto de PCR compuesto con los extremos overhangs fue
cortado tambieacuten con el mismo conjunto de enzimas de restriccioacuten y procedimos a
clonar creando un vector de expresioacuten El vector fue nombrado y guardado como
ldquopET-30a(+)-N-AmyEdnardquo
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6112 Disentildeo y construccioacuten de pETNL
En el extremo del peacuteptido sentildeal N-AmyE se le acoploacute la secuencia nucleotiacutedica de
la LnqQ por teacutecnicas de clonacioacuten molecular in silico Inicialmente el archivo
geneacutetico del gen lnqQ fue descargado (GenBank no AB2352011) y abierto en la
aplicacioacuten de SnapGene
A la secuencia nucleotiacutedica original de la lnqQ en el extremo 5rsquo-terminal
agregamos manualmente una secuencia que contiene el sitio de restriccioacuten BamHI
y riacuteo debajo de eacutesta agregamos un par de nucleoacutetidos (TT) Inmediatamente
despueacutes se colocoacute un codoacuten de inicio (ATG) y se antildeadieron los 52 residuos
restantes para un total de 53 de aminoaacutecidos que representan a LnqQ Justo en el
extremo C-terminal de esta bacteriocina se agregoacute una cola de polihistidina (H89-
H94) y un codoacuten de paro (TAG) En seguida se agregaron otro par de nucleoacutetidos
(TA) y se integroacute un sitio de restriccioacuten SalI Esta seccioacuten correspondioacute a un
fragmento lineal de 193 pb de la secuencia nucleotiacutedica que codifica para
LnqQ6xHis (Tabla 6)
Desde SnapGene realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten entre el
fragmento lineal de 193 pb con el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)N-AmyEdnardquo
Desde la aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten BamHI y SalI
Posteriormente el fragmento lineal fue cortado tambieacuten con el mismo conjunto de
enzimas de restriccioacuten y procedimos a clonar creando un vector de expresioacuten
nombrado y guardado como ldquopETNLdnardquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pETNL estaacute guardando en formato dna bajo el
nombre ldquopETNLdnardquo En este plaacutesmido se observan por los elementos geneacuteticos
propios de un vector pET30(a)+ en conjunto con los genes necesarios para la
construccioacuten N-AmyELnqQ
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Tabla 6 Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ (5rsquorarr3rsquo) Tamantildeo
pETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQL
LAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIKHH
HHHH
94
Los residuos subrayados representan el peacuteptido sentildeal Los residuos en negritas representan a LnqQ
6113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
Los resultados obtenidos del corte proteoliacutetico en el peacuteptido sentildeal N-AmyE fueron
contrastados con los datos de seis secuencias aminoaciacutedicas (Tabla 7) que teniacutean
el reporte de que este mismo peacuteptido sentildeal N-AmyE era cortado de manera
efectiva en cada una de ellas Tres de las secuencias corresponden a las
secuencias aminoaciacutedicas totales de tres α-amilasas reportadas en diferentes
cepas de B subtilis (Emori amp Maruo 1988 Kunst et al 1997 Yang et al 1983)
Dos de eacutestas corresponden a secuencias que se utilizaron para investigar queacute
aminoaacutecidos eran los necesarios para cortar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en ceacutelulas
de B subtilis o de E coli (Nakazawa et al 1986 Sakakibara et al 1993) La
uacuteltima corresponde a una construccioacuten sinteacutetica donde el peacuteptido sentildeal N-AmyE
fue utilizado para transportar liasa de pectina a la regioacuten periplaacutesmica de E coli (R
M Papi et al 2005)
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Tabla 7 Secuencias utilizadas para prediccioacuten de corte enzimaacutetico de N-
AmyELnqQ
Nombre Secuencia aminoaciacutedica
gtYang1983
(CAA234371)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPDDRRLRMEINSQSEKEIQFGKTYTIML
KGTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPAD
TDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtNakazawa1986
(PTUE33)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAQACPPETLVKVKDAEDQL
gtEmori1988
(CAA306431)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIEIRCNTFFQ
gtSakakibara1993
(PTUBE695)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASACAAPFNGTM
gtKunst1997
(NP_3881862)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPETAFKDGDQFTIGKGDPFGKTYTIMLK
GTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPADT
DTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtPapi2005 MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRIRMSYPESKLTGLTGFALAAKVTGGWAGPVVSITNLDQLKANIG
TVTPQVLVINSNISASSLTKVNMGANKTLIGSFQNRTLENIHLRATAQSQNIILQNLIFKHSANIKANDDIQVYLNY
GSKYWIDHCSFVGHSWSTTDGSEDKLLYIGEKADYATISNCFFGSHKYGLIFGHPADDNNAAFNGYPRLTLCHNRFD
NMEVRAPGLMRYGYFHVYNNYINKFHLGFTLAQNANILSESNYFGEGSQNNGMLDDKGSGTFTDTNSVPPITNQKSP
KAQWTATSNYAYTLKTAAQAKDFTQKNAGAQAAALVFGS
gtpETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWV
VSKIKQILGIKHHHHHH
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En las bacterias existen dos mecanismos generales para la secrecioacuten de
proteiacutenas a traveacutes de la membrana citoplasmaacutetica En la viacutea de Secrecioacuten General
denominada como viacutea Sec las proteiacutenas son translocadas a la membrana en su
forma desnaturalizada y posteriormente son plegados en forma nativa en el lado
transversal de la membrana Mientras tanto en la viacutea de Translocacioacuten de
Gemelos Argininas conocida como viacutea Tat las proteiacutenas son translocadas en su
estado plegado nativo (Natale Bruumlser amp Driessen 2008)
De acuerdo con nuestros resultados (Tabla 8) el valor de calculado de prediccioacuten
de corte de peacuteptido sentildeal de las secuencias aminoaciacutedicas completas de tres α-
amilasas representan 09724 (Yang et al 1983) 09458 (Emori amp Maruo 1988) y
09724 (Kunst et al 1997) respectivamente De las secuencias parciales de
peacuteptidos sentildeales N-AmyE los resultados indican 08722 (Nakazawa et al 1986) y
06092 (Sakakibara et al 1993) Para la secuencia que se utilizoacute para exportar la
liasa de pectina al periplasma de E coli el valor calculado correspondioacute a 08262
(R M Papi et al 2005) en todas estas secuencias el mecanismo de secrecioacuten
general de proteiacutenas es el tipo Sec clase I Para nuestra proteiacutena N-AmyELnqQ
el valor calculado estimado fue de 04063 sin que fuera determinado su
mecanismo de corte predictivo Es decir nuestro valor calculado es mucho menor
a lo observado contra secuencias que habiacutean sido probados experimentalmente
Tabla 8 Prediccioacuten de corte enzimaacutetico de peacuteptido sentildeal N-AmyE
Identificacioacuten Prediccioacuten SecSPI TatSPI SecSPII Otro Pos
gtYang1983 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtNakazawa1986 SP(SecSPI) 08722 00359 00229 0069 33 y 34
gtEmori1988 SP(SecSPI) 09458 00122 0009 0033 33 y 34
gtSakakibara1993 SP(SecSPI) 06092 00428 01377 02103 31 y 32
gtKunst1997 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtPapi2005 SP(SecSPI) 08262 00183 00178 01377 31 y 32
gtpETNL Otro 04063 00249 00134 05554 Otro
SecSPI Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal I (Lep) TatSPI Translocoacuten Tat mediado por
Peptidasa de Sentildeal I (Lep) SecSPII Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal II (Lsp) Pos Sitio de
corte enzimaacutetico dentro de la estructura aminoaciacutedica lineal
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612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
6121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo geneacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP estaacute guardado en formato dna
bajo el nombre ldquopET30a-SmbPdnardquo y estaacute flanqueado en el extremo 5rsquo-terminal
por el sitio de restriccioacuten NdeI y en el extremo 3rsquo-terminal por el sitio de restriccioacuten
NcoI El peacuteptido de fusioacuten estaacute dividido en dos secciones en el extremo N-terminal
estaacute compuesta por la regioacuten citoplasmaacutetica de la SmbP (SmbP) compuesta por
94 residuos seguido de dos residuos G95 y T96 riacuteo abajo inicia el extremo C-
terminal que estaacute compuesta por cinco residuos y representa al sitio de corte por
enteroquinasa (DDDDK)
6122 Disentildeo y construccioacuten de pSmbP-LnqQ
El archivo geneacutetico que contiene la bacteriocina LnqQ fue descargado de la base
de datos (GenBank no AB2352011) Inmediatamente en el extremo C-terminal
del peacuteptido de fusioacuten mediante la aplicacioacuten SnapGene antildeadimos manualmente
un residuo de alanina en la posicioacuten 102 y riacuteo debajo de eacutesta antildeadimos los 53
residuos que conforman el LnqQ iniciando con M103 En direccioacuten al extremo C-
terminal inmediatamente despueacutes del codoacuten de teacutermino (TAA) se agregoacute el sitio
de restriccioacuten XhoI Los elementos que componen la construccioacuten del pSmbP-
LnqQ (Tabla 9) estaacuten representados en el siguiente orden 5rsquo-NdeI-SmbP-DDDDK-
LnqQ-XhoI-3rsquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pSmbP-LnqQ estaacute guardado en formato dna bajo
el nombre ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01dnardquo En este plaacutesmido se observan por los
elementos geneacuteticos propios de un vector pET30(a)+
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Tabla 9 Secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica del producto del vector de
expresioacuten (5rsquorarr3rsquo)
Tamantildeo
pSmbP-LnqQ MSGHTAHVDEAVKHAEEAVAHGKEGHTDQLLEHAKESLTHAKAAS
EAGGNTHVGHGIKHLEDAIKHGEEGHVGVATKHAQEAIEHLRASE
HKSHGTDDDDKAMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWL
NAGQAIDWVVSKIKQILGIK
155
Los residuos subrayados representan el peacuteptido de fusioacuten Los residuos resaltados representan el sitio de
corte de enteroquinasa Los residuos en negritas representan a LnqQ
6123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten de PeptideCutter se detectoacute un
uacutenico sitio de corte en la proteiacutena SmbP-LnqQ para la enzima enteroquinasa que
se encuentra ubicado en el residuo K101 lo cual coincide con lo esperado
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Los resultados sobre la identificacioacuten de codones de paro post disentildeo en la
construccioacuten de pETNL y pSmbP-LnqQ indicaron que no existe evidencia de
codones de paro ya que la aplicacioacuten en liacutenea logroacute identificar un marco de lectura
abierto con un tamantildeo de 285 pb que codifican para 94 aminoaacutecidos cuya
secuencia coincide con exactitud con la secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
para el caso de pETNL Mientras tanto un marco de lectura compuesto por un
tamantildeo molecular de 488 pb que se traducen para 155 aminoaacutecidos y cuya
secuencia coincide en su totalidad con la secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
De acuerdo con los resultados calculados por la aplicacioacuten de Compute pIMw tool
de ExPasy el peso molecular teoacuterico estimado del producto N-AmyELnqQ de
pETNL es de 1053468 Da con un punto isoeleacutectrico pi = 1063 mientras que para
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el producto SmbP-LnqQ de pSmbP-LnqQ el peso estimado es de 1669771 Da
con punto isoeleacutectrico pI = 645
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
Seguacuten los resultados los iacutendices de solubilizacioacuten (Tabla 10) de N-AmyELnqQ y
del SmbP-LnqQ es de 0575 y 0865 respectivamente La aplicacioacuten sin embargo
clasifica a los productos del vector pETNL como invaacutelidos mientras que los
productos de pSmbP-LnqQ fueron considerados como solubles La razoacuten porque
la N-AmyELnqQ es considerado como invaacutelido se debe a que fue identificado
como proteiacutena de membrana En el caso de localizacioacuten celular (Tabla 11) los
pronoacutesticos indican que los productos producidos por pETNL y pSmbP-LnqQ se
encontraraacuten en membrana plasmaacutetica y en el citoplasma respectivamente
Tabla 10 Prediccioacuten de solubilidad N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Iacutendice Solubilidad
N-AmyELnqQ 0575 Invaacutelido
SmbP-LnqQ 0865 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice de solubilidad superior
a 045 es porque son considerados proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
Tabla 11 Prediccioacuten de localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Valor Localizacioacuten subcelular
N-AmyELnqQ 085 Membrana plasmaacutetica
SmbP-LnqQ 07 Citoplasma
Esto coincide con lo observado en los antecedentes ya que indican que las
proteiacutenas expresadas en E coli con el peacuteptido sentildeal N-AmyE en su regioacuten N-
terminal a menudo se localizan en el periplasma (Nakazawa et al 1986 R M
Papi et al 2005) Mientras que las proteiacutenas acopladas con el peacuteptido de fusioacuten
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SmbP son reportadas para encontrarse en la regioacuten citoplasmaacutetica debido a que la
seccioacuten aminoaciacutedica que las orienta al periplasma fue removida de la secuencia
original de residuos quedaacutendose por tanto en el citoplasma celular de E coli
(Vargas-Cortez et al 2016)
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
El modelo estructural tanto en su forma secundaria (Figura 6) como tridimensional
(Figura 8) para N-AmyELnqQ asiacute como la presunta estructura secundaria (Figura
7) y tridimensional (Figura 10) para SmbP-LnqQ fueron revelados en este
documento En la estructura secundaria prevista para N-AmyELnqQ se espera
que el 96 de la secuencia esteacute compuesta por estructuras tipo α-heacutelices y se
estima que el 17 de la secuencia aminoaciacutedica total esteacuten embebidas en la
regioacuten transmembranal La evidencia predictiva de la N-AmyELnqQ (Figura 9) a
traveacutes de la aplicacioacuten Phyre2 indicoacute que los primeros 12 residuos del extremo N-
terminal estariacutean orientados en la regioacuten extracelular mientras que los residuos 15
al 30 estariacutean ubicados en regioacuten intermembranal entre el espacio extracelular y la
citoplasmaacutetica El resto de los residuos del extremo C-terminal estariacutean orientados
en la cara citoplasmaacutetica de la ceacutelula de E coli Mientras tanto la estructura
secundaria putativa para SmbP-LnqQ indica que el 85 de secuencia total estaacute
compuesta por α-heacutelices
En las estructuras tridimensionales putativas tanto para N-AmyELnqQ como en la
SmbP-LnqQ prevalece la formacioacuten de cuatro α-heacutelices Estos motivos
estructurales tipo α-heacutelices son comuacutenmente observados en bacteriocinas
similares a LnqQ (Lynch et al 2019) de manera que podemos predecir que la
estructura secundaria y tridimensional de la LnqQ no se ve afectada cuando estaacuten
acopladas tanto por N-AmyE como con SmbP
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 76
Figura 6 Prediccioacuten de la estructura secundaria de N-AmyELnqQ
La estructura secundaria predicha del N-AmyELnqQ en Phyre2
Figura 7 Prediccioacuten de la estructura secundaria de SmbP-LnqQ
La estructura secundaria putativa del SmbP-LnqQ en Phyre2
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Figura 8 Prediccioacuten de estructura tridimensional de N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de N-
AmyELnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones
propuestas por modelo son de (Å) X29824 Y24988 Z25496
Figura 9 Prediccioacuten de heacutelices transmembranales para N-AmyELnqQ
La imagen es resultado de la prediccioacuten propuesta por Phyre2 para heacutelices transmembranales de N-
AmyELnqQ
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Figura 10 Prediccioacuten de estructura tridimensional de SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de SmbP-
LnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones propuestas
por modelo son de (Å) X32655 Y24988 Z25496
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
6171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Las ceacutelulas presuntamente transformadas fueron seleccionadas con kanamicina
De acuerdo con la evidencia presentada (Figura 11) los controles experimentales
cumplieron con su objetivo ya que no se registroacute crecimiento en placas de LB agar
esteacuteriles en el control negativo (Figura 11 a) en cuanto al control de viabilidad
eacuteste demostroacute que la electroporacioacuten no fue un factor significativo que causara la
muerte de ceacutelulas de E coli DH5α como BL21 (DE3) (Figura 11 b c) Por uacuteltimo
los controles con antibioacutetico demostraron que la kanamicina (50 microgml) era lo
suficientemente potente para seleccionar ceacutelulas (Figura 11 d e) Por uacuteltimo
demostramos bajo la teacutecnica de electroporacioacuten que las cepas de ceacutelulas de E
coli tanto BL21 (DE3) como DH5α fueron correctamente transformadas con los
vectores de expresioacuten pETNL (Figura 11 f g) pET30(a)+ (Figura 11 h j) y
pSmbP-LnqQ (Figura 11 i k) Los ensayos fueron realizados por triplicado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 79
Figura 11 Transformacioacuten de E coli DH5α y BL21 (DE3) con pET30a(+)
pETNL y pSmbP-LnqQ
Roacutetulo Descripcioacuten
a Control negativo
b Control viabilidad DH5α
c Control viabilidad BL21 (DE3)
d Control kanamicina + DH5α
e Control kanamicina + BL21 (DE3)
f DH5α + pETNL
g BL21 (DE3) + pETNL
h DH5α + pET30a(+)
i DH5α + pSmbP-LnqQ
j BL21 (DE3) + pET30a(+)
k BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ
Las placas rotuladas del a-c son placas LB con agar mientras que las placas d-k son placas LB
con agar suplementadas con kanamicina (50 microgml concentracioacuten final)
80
6172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Los ensayos para la extraccioacuten y purificacioacuten de los plaacutesmidos pET30(a)+ pETNL
y pSmbP-LnqQ de ceacutelulas de E coli que fueron observados en un gel de agarosa
1 (pv) Seguacuten la evidencia (Figura 12) nuestros controles demuestran que
tanto el plaacutesmido pETNL como el vector pSmbP-LnqQ se encontraban presentes
Los iacutendices de concentracioacuten y calidad de cada uno de los vectores fueron para
pET30(a)+ de 911 ngmicrol con A260A280 en 195 para el vector pETNL de 532 ngmicrol
con A260A280 en 194 y para el vector pSmbP-LnqQ de 2861 ngmicrol con A260A280 en
188 Seguacuten la literatura los iacutendices para considerar a un DNA plasmiacutedico como
puro deben tener valores espectrofotomeacutetricos de A260A280 entre 18-20 donde un
valor menor a 18 se considera como contaminacioacuten con proteiacutenas y un valor de
superior a 20 se considera contaminacioacuten por RNA (Koetsier Cantor amp Biolabs
sf) Podemos inferir que los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron recuperados en buena cantidad con un buen iacutendice de pureza
Figura 12 Gel de agarosa con plaacutesmidos
pETNL y pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer
TBE 1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Plaacutesmido pETNL
3 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
4 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli
BL21 (DE3) transformados con los vectores
de expresioacuten pETNL o pSmbP-LnqQ
El marcador de peso molecular corresponde
a 100-5000bp DNA Marker Plus Ready to
Use (Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 81
6173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Seguacuten los resultados obtenidos por OligoAnalyzer Tool tras ajustar las
condiciones de los oligonucleoacutetidos a las especificaciones del fabricante del kit de
la polimerasa el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 promoter primer es de
20 pb con un contenido GC a 40 y un valor Tm = 591degC con un hairpin de -036
kcalmol a una Tm de 316degC y un valor homodiacutemero de -416 kcalmol Mientras
tanto el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 terminal primer es de 19 pb con
un contenido GC a 526 y un valor Tm = 61degC con un hairpin de 002 kcalmol a
una Tm de 248degC y un valor homodiacutemero de -474 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten NetPrimer el oligonucleoacutetido T7
promoter primer tiene un rating de eacutexito en 860 y presenta un valor de estabilidad
en su extremo 3rsquo-terminal de -87 kcalmol y no se identificoacute al hairpin el valor
homodiacutemero se registroacute en -759 kcalmol En el caso del oligonucleoacutetido T7
terminal primer este presenta un rating de eacutexito en 870 con un valor de
estabilidad en su extremo 3rsquo-terminal de -1142 kcalmol y tampoco se identificaron
hairpins el valor homodiacutemero se registroacute en -574 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los criterios habituales para seleccioacuten de oligonucleoacutetidos ambos
se mantuvieron en los estaacutendares ya que presentaron un tamantildeo entre 18 a 25 pb
con un hairpin cuyo valor de Tm fue menor a la Tm reportado para el
oligonucleoacutetido y los valores tanto de los homodiacutemeros y heterodiacutemeros nunca
fueron maacutes negativo o iguales a -9 kcalmol
En cuanto al caacutelculo de la Ta para ambos oligonucleoacutetidos utilizamos la regla
general de sustraer 5degC al Tm calculado para en ambos oligonucleoacutetidos Para el
caacutelculo de la Ta oacuteptimo para un par de oligonucleoacutetidos para un blanco en
particular se utilizoacute la siguiente foacutermula matemaacutetica TaOpt = 03 times (Tm de oligo) +
07 times (Tm producto) minus 149 donde el valor de Tm del oligonucleoacutetido es la
temperatura de fusioacuten del oligonucleoacutetido menos estable y la Tm es el valor del
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 82
temperatura de fusioacuten del producto de PCR (Rychlik Spencer amp Rhoads 1990)
De esta manera promediamos el valor de la Tm de ambos oligonucleoacutetidos y el
resultado fue 60degC A este valor le sustrajimos 5degC para un Ta ajustado en 55degC
en los ensayos de PCR punto final para la identificacioacuten de los plaacutesmidos
Por uacuteltimo calculamos el total de ciclos y el tiempo de extensioacuten para los ensayos
de PCR punto final De acuerdo con las especificaciones del fabricante se debe
agregar 1 minuto por cada kb por sintetizar en los ensayos De esta manera
calculamos en primera instancia el tamantildeo molecular de los productos de los
ensayos de PCR de los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
para determinar el tiempo de extensioacuten Para lograr este objetivo realizamos una
reaccioacuten in silico de PCR punto final entre los dos oligonucleoacutetidos T7 con cada
uno de los vectores de expresioacuten utilizados
Los archivos geneacuteticos de los tres vectores de expresioacuten fueron abiertos desde la
aplicacioacuten de SnapGene y ejecutamos una PCR punto final in silico
Posteriormente corrimos una simulacioacuten de gel de agarosa al 1 De acuerdo con
los resultados de nuestra simulacioacuten (Figura 13) las bandas esperadas de los
productos lineales de PCR de los vectores de pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
se encontrariacutean entre 367 pb 488 pb y 651 pb respectivamente Con esto
confirmamos que ninguno de los productos de PCR esperados tendriacutea un tamantildeo
superior al 1 kb y procedimos a configurar la reaccioacuten para el ensayo de PCR
punto final
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 83
Figura 13 Simulacioacuten de PCR para
vectores de expresioacuten
Gel de agarosa 10 generado desde
SnapGene
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Producto PCR de pET-30a(+)
2 Producto PCR de pETNL
3 Producto PCR de pSmbP-LnqQ
Las bandas corresponden a productos lineales
de PCR
El marcador de peso molecular in silico
corresponde a PCR DNA Ladder de GenScript
(Cat En desuso Estados Unidos) y fue tomado
desde la aplicacioacuten de SnapGene versioacuten 113
Asiacute pues configuramos las condiciones de corrida en el termociclador las cuales
fueron registradas de la siguiente manera una desnaturalizacioacuten inicial a 94degC por
180 s despueacutes 30 ciclos de desnaturalizacioacuten alineamiento y extensioacuten con
temperaturas en 94degC 55degC y 72degC respectivamente y sus respectivos tiempos de
reaccioacuten a 30 s 45 s y 30 s Finalmente se agregoacute una etapa de extensioacuten final
con una temperatura a 72degC por 420 s
6174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Despueacutes de realizar la teacutecnica de PCR punto final y una posterior corrida en un gel
de agarosa al 1 con buffer TBE 1X observamos una banda con tamantildeo de 367
pb para el producto de PCR obtenida del vector pET30(a)+ al tiempo que
recolectamos una banda de 488 pb para el producto de PCR del vector pETNL
(Figura 14) y finalmente encontramos una banda de 651 pb para el producto de
PCR del vector pSmbP-LnqQ (Figura 15) Dado que los valores predichos en la
simulacioacuten coinciden con los observado experimentalmente confirmamos que
nuestras cepas de E coli estaban efectivamente transformadas con su respectivo
vector de expresioacuten
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 84
Figura 14 PCR de pETNL
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 PCR de pET30(a) virgen
3 PCR de pETNL
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
Figura 15 PCR de pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Control positivo pET30(a) vaciacuteo
3 Control positivo pETNL
4 Control negativo PCR pUC57-DPQ
5 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
6 Control negativo PCR pUC57-DPQ
7 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
Para los anaacutelisis de expresioacuten de proteiacutenas utilizamos algunos vectores de
expresioacuten que han sido exitosos en la produccioacuten de proteiacutenas Los vectores
pET30a-SmbP_LL-37 y pET30a-SmbP_MP1106 fueron amablemente compartidos
por David Antonio Peacuterez miembro del grupo de investigacioacuten PEP con sede en la
Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la UANL
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 85
(Monterrey Nuevo Leoacuten) Similarmente el vector pET30NP-Hoc fue compartido
por Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros miembro del grupo de investigacioacuten
NBR con sede en el CIBYN (Apodaca Nuevo Leoacuten)
Dado que la informacioacuten de los tres plaacutesmidos se encuentra o se encontraba en
estado de revisioacuten al momento de redactar este documento por sus respectivos
comiteacutes de revisioacuten solo podemos limitarnos a mencionar los pesos moleculares
de los productos de cada vector de expresioacuten Para los dos vectores de David
Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) el peso molecular estimado de
ambos productos es 15 kDa mientras que el vector de Francisco Balderas el peso
molecular de su producto es de 95 kDa (F Balderas comunicacioacuten personal
2021)
6181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Para la induccioacuten por IPTG seguimos los protocolos preestablecidos para la
induccioacuten de proteiacutenas heteroacutelogas en ceacutelulas de E coli En nuestro ensayo la
concentracioacuten de IPTG elegida para la induccioacuten de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
correspondioacute a 01 mM Nosotros utilizamos esta concentracioacuten debido a que los
reportes indican que esta concentracioacuten es lo suficiente para saturar la reaccioacuten
bioloacutegica evitando la toxicidad celular por este compuesto (Malakar amp Venkatesh
2012) Los valores tiacutepicos de IPTG maacutes utilizados para la induccioacuten usualmente se
encuentran entre 05 mM y 10 mM (Mesa-Pereira et al 2018)
En nuestros cultivos el IPTG fue antildeadido en la fase exponencial tardiacutea (OD600 =
04-06) dado que el costo energeacutetico es maacutes alto durante la fase exponencial
temprana que en la tardiacutea (Malakar amp Venkatesh 2012) Ademaacutes se presume que
en esta fase el total de proteiacutenas producidas pueden alcanzar rendimientos
productivos superiores a 350 (Larentis et al 2014) Para nuestros ensayos
utilizamos dos temperaturas para inducir 37degC y 25degC y la razoacuten de utilizar una
temperatura maacutes baja es porque es un meacutetodo habitual para incrementar la
solubilidad de proteiacutenas recombinantes en E coli (Schein 1989)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 86
6182 SDS-PAGE de proteiacutenas periplaacutesmicas de E coli modificadas
con pETNL
Nuestros estudios preliminares bioinformaacuteticos indicaban que la proteiacutena N-
AmyELnqQ seriacutea insoluble (Tabla 10) y que tanto por sus antecedentes
(Nakazawa et al 1986 R M Papi et al 2005 Sjoumlstroumlm et al 1987) por sus
caracteriacutesticas moleculares estariacutea presuntamente ubicada en la regioacuten
periplaacutesmica de E coli (Tabla 11) Sin embargo nuestros resultados por ensayos
de SDS-PAGE indicaron que la induccioacuten por IPTG en ceacutelulas de E coli BL21
(DE3) transformados con el vector pETNL para la produccioacuten de N-AmyELnqQ
tanto en la fraccioacuten soluble como insoluble de proteiacutenas a una temperatura de
induccioacuten 25degC (Figura 16) como a 37degC (Figura 17) en la fraccioacuten periplaacutesmica
no fue posible en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) esta manifestacioacuten fue reportado
en muacuteltiples ocasiones De acuerdo con nuestros resultados no logramos
determinar la presencia de bandas de proteiacutenas en la regioacuten esperada que seguacuten
los anaacutelisis predictivos la proteiacutena N-AmyELnqQ debiacutea tener un peso molecular
cercano a 105 kDa
Es de mencionar que el valor de prediccioacuten de corte de peacuteptido sentildeal de la
proteiacutena N-AmyELnqQ fue muy inferior a los valores de prediccioacuten observados en
secuencias que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y que habiacutean sido previamente
validados experimentalmente (Tabla 8) Otro aspecto para considerar es que los
residuos reconocidos para el corte enzimaacutetico difieren entre los diferentes tipos de
bacterias (Nakazawa et al 1986) Esto quedoacute demostrado cuando observamos
que los residuos utilizados para el corte de este peacuteptido sentildeal podiacutean diferir
inclusive en el mismo tipo de bacteria Por ejemplo en la secuencia total de
aminoaacutecidos de la α-amilasa reportada por Yang y otros (Yang et al 1983) Emori
y otros (Emori amp Maruo 1988) y Kunst y otros (Kunst et al 1997) los residuos
observados corresponden al 33 y 34 mientras que para las secuencias de
aminoaacutecidos a los que se les fue acoplado el peacuteptido sentildeal en su regioacuten N-terminal
como las reportadas por Sakakibara y otros (Sakakibara et al 1993) y Papi y
otros (R M Papi et al 2005) los residuos de corte se ubicaron en la posicioacuten 31 y
32
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 87
Figura 16 Gel de E coli BL21 (DE3) con pETNL inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 88
Figura 17 Gel de E coli BL21 (DE3) pETNL inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 89
6183 SDS-PAGE de proteiacutenas citoplaacutesmicas de E coli modificadas
con pSmbP-LnqQ
Los estudios preliminares predictivos para la produccioacuten heteroacuteloga de SmbP-
LnqQ en E coli indicaban que la presencia del peacuteptido de fusioacuten SmbP
aumentariacutea la solubilidad de la proteiacutena recombinante solubilidad (Tabla 10) y que
ademaacutes seriacutea localizado en el citoplasma celular (Tabla 11) con un peso
molecular aproximado de 167 kDa Nuestros resultados por ensayos de SDS-
PAGE indicaron que no hubo produccioacuten citoplasmaacutetica de una banda esperada
de 15 kDa tras inducir con IPTG a ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) transformados
con el vector pSmbP-LnqQ para la produccioacuten del peacuteptido SmbP-LnqQ tanto a
25degC como 37degC (Figura 18) Estos ensayos fueron realizados por triplicado
Esto nos orilloacute a plantearnos dos posibilidades con relacioacuten a la proteiacutena SmbP-
LnqQ la primera era que pudiera presentar problemas por plegamiento durante su
produccioacuten en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) y que la segunda fuera problemas
internos relacionados al IPTG Para demostrar la primera hipoacutetesis transformamos
ceacutelulas de E coli Origami con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ y utilizamos el
vector pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo este vector seguacuten su autor
produce una proteiacutena de un tamantildeo de 15 kDa en ceacutelulas de E coli Origami
debido a que es una proteiacutena problemaacutetica (datos no publicados) Nuestra
evidencia (Figura 19) sentildeala que el IPTG no es causa probable de la nula
produccioacuten debido a que se observoacute una banda muy definida en la regioacuten de los
15 kDa para las bacterias transformadas con el vector terminacioacuten MP1106 que
habiacutean sido inducidas por IPTG tanto a 25degC como 37degC Tampoco se observoacute
que la cepa Origami contuviera un factor bioloacutegico no considerado en la cepa
BL21 (DE3) que pudiera agilizar la produccioacuten de la proteiacutena SmbP-LnqQ ya que
no encontramos ninguna banda de un tamantildeo de 15 kDa en las ceacutelulas Origami
transformados
Ante los resultados previos consideramos posibilidad de que el problema se
encontrara especiacuteficamente en la cepa de E coli (DE3) presente en nuestro
laboratorio Para demostrar este punto procedimos a transformarla la cepa con el
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 90
vector de expresioacuten pET30NP-Hoc para fines de control positivo para nuestro
experimento Seguacuten su autor este vector de expresioacuten produce una proteiacutena lineal
de 95 kDa al inducirse por IPTG a 1 mM (datos no publicados) Nuestros
resultados en el gel SDS-PAGE muestran una banda de proteiacutenas extraiacutedas de E
coli transformados pET30NP-Hoc en la seccioacuten de 95 kDa y es producido tanto a
37degC (Figura 20) como a 25degC (Figura 21) Sin embargo no pudimos observar
ninguna banda sobre expresada de 10 kDa para las BL21 (DE3) transformadas
con pETNL ni una banda tampoco de 15 kDa para las bacterias transformadas con
pSmbP-LnqQ De esta manera descartamos la idea que existiera un problema
bioloacutegico procedente en la cepa de E coli BL21 (DE3) mantenida en nuestro
laboratorio
Se conoce que la bacteriocina LnqQ ya ha sido sujeta a modificaciones geneacuteticas
para incrementar su produccioacuten al ser clonada y expresada con eacutexito con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) registraacutendose
rendimientos hasta de 130 mg por litro de cultivo bacteriano (Ma et al 2012) Ante
la ausencia de una banda de proteiacutenas en la regioacuten de 15 kDa en nuestro vector
de expresioacuten con peacuteptido de fusioacuten SmbP-LnqQ se ha comentado que no existen
razones para suponer que todas las etiquetas de fusioacuten son aptas para todo tipo
de necesidades ya que es casi imposible determinar cuaacutel es el peacuteptido de fusioacuten
oacuteptimo para la produccioacuten Sin embargo una de las ventajas de utilizar peacuteptidos
de fusioacuten reconocidos es que son reconocidos sus ventajas y desventajas ya que
en algunos casos algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la solubilidad
de las proteiacutenas tales como TRX MBP NusA etc pero otros peacuteptidos sentildeales no
incrementan la solubilidad de la proteiacutena de intereacutes como GST BAP etc Incluso
algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la carga metaboacutelica en la ceacutelula
como GST MBP y NusA (Waugh 2005)
A pesar del buen registro experimental disponible sobre construcciones que
contienen el peacuteptido de fusioacuten SmbP (Vargas-Cortez et al 2016) suponemos en
nuestro caso en particular que dada las limitaciones de su corto historial
experimental auacuten no existe informacioacuten que determine las ventajas y desventajas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 91
pertinente al peacuteptido de fusioacuten SmbP para observar si son viables para la
produccioacuten solubilidad yo purificacioacuten de maacutes tipos de bacteriocinas
Figura 18 Gel de E coli BL21 (DE3) pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3)+ pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3) transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 92
Figura 19 Gel de E coli Origami pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli Origami transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
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Figura 20 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 37degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 37degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 37degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 37degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 37degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 37degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 37degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 37degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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Figura 21 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 25degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 25degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 25degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 25degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 25degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 25degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 25degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 25degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de
proteiacutenas
Seguacuten el anaacutelisis fisicoquiacutemico de las secuencias aminoaciacutedicas que fueron
utilizadas en las construcciones para N-AmyE (Tabla 12) todas son de gran
tamantildeo y de alto peso molecular este peacuteptido se ha reportado para la
sobreexpresioacuten de AmyE en E coli (Nakazawa et al 1986) Asiacute como para la
sobreexpresioacuten de una regioacuten de 39 kDa que codifica para una regioacuten N-terminal
de una liasa de pectina (Pnl) en E coli (R Papi amp Kyriakidis 2003) a la fecha no
hemos visto alguacuten reporte de que este peacuteptido sentildeal haya sido utilizado para
producir proteiacutenas de bajo peso molecular
Por otro lado las secuencias que fueron exitosamente producidos con peacuteptido de
fusioacuten SmbP (Tabla 14) tambieacuten han mostrado ser uacutetil para producir proteiacutenas de
alto peso molecular o peacuteptidos de bajo peso molecular con actividad
antimicrobiana como VpDef (Montfort-Gardeazabal Claudio Casillas-Vega amp
Zarate 2020) Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al 2021) y muy recientemente LL-
37 (Perez-Perez et al 2021) el peacuteptido de fusioacuten tambieacuten ha demostrado ser
exitoso para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas de alto peso molecular como GFP y
RFP (Vargas-Cortez et al 2016) De esta manera consideramos que tanto el
tamantildeo como el peso molecular no son factores que intervengan durante el
proceso sobreproduccioacuten mediado tanto N-AmyE como con SmbP El punto
isoeleacutectrico tampoco parece ser un factor importante ya que el valor de AmyE es
aacutecido (561) mientras que Pnl es baacutesico (877) Situacioacuten similar sucede entre los
peacuteptidos microbianos puesto que VpDef es ligeramente aacutecido (686) en cambio el
resto de los peacuteptidos (Bin1b 949 LL-37 1061) son baacutesicos similar a LnqQ
Sin embargo observamos que tanto el iacutendice alifaacutetico (AI) como los valores del
iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) siacute son diferentes entre los distintos tipos de
peacuteptidos antimicrobianos Individualmente el valor AI de LnqQ es de 12115
(Tabla 12) y es superior al resto de los demaacutes peacuteptidos antimicrobianos con una
media de 5363 plusmn 3321) El valor AI para N-AmyELnqQ es de 11947 (Tabla 13) y
para SmbP-LnqQ es de 8323 (Tabla 15) respectivamente
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Tabla 12 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con N-AmyE
ID AmyE Pnl LnqQ
L 627 316 53
MW 6929711 3448665 589810
pI 561 877 1010
R(-) 69 21 2
R(+) 55 25 8
AI 6694 7636 12115
GRAVY -0648 -0291 +0300
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 13 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con N-AmyE
ID N-AmyEAmyE N-AmyEPnl N-AmyELnqQ
L 660 360 94
MW 7279942 3947961 1053468
pI 588 922 1063
R(-) 69 22 2
R(+) 58 30 12
AI 6982 8061 11947
GRAVY -0553 -0205 +0426
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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Tabla 14 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID VpDef Bin1b LL-37
L 49 45 37
MW 543498 520906 449332
pI 686 949 1061
R(-) 6 3 5
R(+) 6 9 11
AI 2388 4756 8946
GRAVY -0996 -0571 -0724
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 15 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID SmbP-VpDef SmbP-Bin1b SmbP-LL-37 SmbP-LnqQ
L 152 148 140 155
MW 1630268 1607675 1536102 1669471
pI 594 648 645 645
R(-) 26 23 25 22
R(+) 16 19 21 18
AI 5086 5878 1828 8323
GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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En cuanto al iacutendice de hidrofobicidad LnqQ mostroacute un valor GRAVY positivo
(+0300) mientras que el resto de los peacuteptidos antimicrobianos donde el valor
GRAVY promedio era de -073 plusmn 019 No es de sorprender que las bacteriocinas
del subgrupo de la familia de las aureocinas similares a A53 como LnqQ
aureocina A53 lacticina Z epidermicina NI01 lactolisterina BU y BHT-B tengan
valores GRAVY positivos (Perez Zendo amp Sonomoto 2018) Sin embargo cuando
LnqQ estaacute acoplado a N-AmyE el valor GRAVY se vuelve auacuten maacutes positivo con
+0426 (Tabla 13) y cuando estaacute fusionado con SmbP el valor GRAVY cambia a -
0514 (Tabla 15)
La literatura menciona que un peacuteptido o proteiacutena presenta un valor GRAVY
positivo debe considerarse como hidrofoacutebica mientras que un valor GRAVY
negativo significa que la proteiacutena es hidrofiacutelica (Kyte amp Doolittle 1982) De manera
que proteiacutenas con valores GRAVY negativos indican que la proteiacutena presenta una
estructura globular (hidrofiacutelicos) mientras que proteiacutenas con valores GRAVY
positivos indican la posibilidad que la proteiacutena guarde alguna relacioacuten con la
membrana (hidrofoacutebicos) (Enany 2014)
El valor GRAVY es considerado como el factor que maacutes influye en la movilidad de
las proteiacutenas en los geles de SDS-PAGE una proteiacutena con un valor GRAVY
negativo tiende a migrar maacutes lento que las proteiacutenas con valores positivos en los
geles para proteiacutenas (Shirai et al 2008) Las unioacuten de las moleacuteculas de SDS con
las proteiacutenas se produce a traveacutes de los aminoaacutecidos hidrofoacutebicos (Robinson amp
Tanford 2002) algunas estructuras hidrofoacutebicas son capaces de unir moleacuteculas
SDS hasta en un rango desde 34 a 10 g de SDS por 1 g de proteiacutena lo que
influiriacutea en una migracioacuten electroforeacutetica anoacutemala en los geles de SDS-PAGE
(Rath Glibowicka Nadeau Chen amp Deber 2009) LnqQ es una proteiacutena globular
(Acedo et al 2016) que utiliza la membrana especiacuteficamente para atacar
(Yoneyama Imura Ohno et al 2009) con lo que suponemos que el iacutendice de
hidrofobicidad pudiera estar afectando en el comportamiento electroforeacutetico de las
proteiacutenas Sin embargo tambieacuten la literatura sugiere que el comportamiento
anoacutemalo en las proteiacutenas de membrana en los geles de SDS-PAGE pudiera no
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 99
necesariamente relacionado a la carga neta de la proteiacutena ni a su iacutendice de
hidrofobicidad (Rath amp Deber 2013)
Al evaluar individualmente a LnqQ a traveacutes la escala Kyte-Doolittle observamos
que el peacuteptido posee dos secciones hidrofoacutebicas que se encuentran
aproximadamente entre los extremos del peacuteptido (entre residuos 5 al 15 y del 31 al
49) representando el 60 del total de la secuencia de LnqQ es hidrofoacutebica
(Figura 22) Si LnqQ estaacute acoplada con N-AmyE se observan las dos regiones
hidrofoacutebicas (entre residuos 9-50 y 66-85) que representa que el 6860 del total
de la secuencia sea hidrofoacutebica (Figura 23) Mientras tanto SmbP retiene sus dos
regiones hidrofoacutebicas que se ubican hacia la regioacuten C-terminal entre los residuos
103-117 y 133-151 componiendo el 2313 de total de la secuencia (Figura 24)
Dado que existe un reporte de produccioacuten exitosa entre la LnqQ acoplada con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO (Ma et al 2012) decidimos evaluar su valor AI GRAVY
y su escala Kyte-Doolittle Seguacuten los resultados de ProtParam para SUMO-LnqQ
los valores AI y GRAVY son de 8337 y -0516 respectivamente los cuales son
similares a lo reportado para SmbP-LnqQ Por otro lado seguacuten la escala Kyte-
Doolittle cinco regiones hidrofoacutebicas fueron descritas a lo largo de toda la
construccioacuten y estaacuten aproximadamente repartidas en toda la estructura lineal
entre los residuos 16-18 53-70 87-91 119-134 y 150-168 lo que representa el
28 del total de la secuencia (Figura 25) El valor GRAVY positivo y el alto
porcentaje de residuos hidrofoacutebicos para N-AmyELnqQ nos permite suponer que
estaacute proteiacutena se encontrariacutea anclada en la membrana celular lo que dificultariacutea su
solubilizacioacuten en los geles de proteiacutenas
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Figura 22 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la LnqQ
Figura 23 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de N-AmyELnqQ
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 10 20 30 40 50 60
Valo
r
Posicioacuten
LnqQ
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
N-AmyELnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 101
Figura 24 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SmbP-LnqQ
Figura 25 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SUMO-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SUMO-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Va
lor
Posicioacuten
SmbP-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Va
lor
Posicioacuten
SUMO-LnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 102
Ante la ausencia de una respuesta objetiva que explique la ausencia de bandas de
SmbP-LnqQ en los ensayos analizamos el perfil de aminoaacutecidos y detectamos
que la presencia de cisteiacutenas entre los peacuteptidos antimicrobianos tampoco fue un
factor determinante durante la sobreproduccioacuten con la SmbP ya que tanto VpDef
como Bin1b (que se caracterizan por ser abundantes en cisteiacutenas) como LL-37
(que no tiene cisteiacutenas) fueron exitosamente producidos El mapa de calor (Figura
26) sentildealoacute un alto porcentaje de Trp en LnqQ en comparacioacuten con los demaacutes
peacuteptidos antimicrobianos De acuerdo con la escala Kyte-Doolittle Trp es
considerado un residuo hidrofiacutelico (Kyte amp Doolittle 1982) cuando en realidad es
hidrofoacutebico por sus caracteriacutesticas uacutenicas (Mishra Choi Moon amp Baek 2018)
Este residuo funge como estabilizador de las proteiacutenas en la membranas anclaje
y orientacioacuten hacia el lado hidrofiacutelico de la bicapa lipiacutedica (Khemaissa Sagan amp
Walrant 2021) por eso son de alta importancia en proteiacutenas de membrana porque
apoyan en la estabilidad proteiacutena en la interfaz lipiacutedica por su forma riacutegida y plana
(Yau Wimley Gawrisch amp White 1998) Se presume que Trp permite que
peacuteptidos antimicrobianos similares a la aureocina A53 se mantengan unidos a la
membrana (Netz Bastos amp Sahl 2002) Sin embargo al analizar el porcentaje de
Trp entre N-AmyELnqQ SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ descubrimos que los
valores son muy similares 11 26 y 23 Por lo que Trp no seriacutea un factor
clave para que LnqQ sea producido en E coli
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
VpDef
Bin1b
LL37
LnqQ
Figura 26 Perfil aminoaciacutedico de los peacuteptidos antes de acoplarse con SmbPc
El mapa de calor representa la distribucioacuten de los residuos entre los peacuteptidos La intensidad del color negro
representa el porcentaje de residuos entre los peacuteptidos antes de ser acoplados con SmbP
Dada la similitud fisicoquiacutemica entre SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ abordamos el
problema desde el punto de vista analiacutetico otros autores demostraron que
proteiacutenas de peso molecular alto como N-AmyEPnl (R Papi amp Kyriakidis 2003) o
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 103
de peso molecular pequentildeo como SmbP-Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al
2021) SmbP-VpDef (Montfort-Gardeazabal et al 2020) SmbP-LL-37 (Perez-
Perez et al 2021) eran faacutecilmente observables mediante la teacutecnica de SDS-
PAGE hechos que utilizamos para la visualizacioacuten preliminar tanto N-AmyELnqQ
como de SmbP-LnqQ en los ensayos electroforeacuteticos Sin embargo en el reporte
de sobreproduccioacuten por SUMO-LnqQ los ensayos electroforeacuteticos preliminares
fueron realizados bajo la teacutecnica SDS-PAGE con Tricina (Ma et al 2012) Esta
variante es utilizada para resolver proteiacutenas con pesos moleculares pequentildeos que
oscilan entre 1 a 30 kDa (Haider Reid amp Sharp 2012) pero tambieacuten es uacutetil para
analizar proteiacutenas hidrofoacutebicas (Schaumlgger 2006) lo cual seriacutea un candidato ad
hoc a las caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas observadas de la LnqQ
Por uacuteltimo y no menos importante es tambieacuten de mencionar todas las
secuencias aminoaciacutedicas donde los peacuteptidos antimicrobianos tuvieron eacutexito con la
SmbP tienen su origen evolutivo en sistemas eucarioacuteticos las defensinas VpDef
(Zhang et al 2015) y Bin1b (Guo et al 2009) provienen del invertebrado
Venerupis philippinarum y del epidiacutedimo de la rata Rattus norvegicus
respectivamente mientras que la catelicidina LL-37 proviene del sistema inmune
de chimpanceacutes y humanos (Agerberth et al 1995) nuestra LnqQ posee un origen
procariota a traveacutes de Lactococcus lactis QU5 (Fujita et al 2007) Las defensinas
estaacuten compuestas por estructuras tipo beta plegadas mediadas por cisteiacutenas
conservadas mientras que los dominios antimicrobianos de las catelicidinas son
estructuralmente lineales carentes de puentes disulfuro y estaacuten compuestas por
varias heacutelices (Dorin McHugh Cox amp Davidson 2014) LnqQ es una estructura
lineal compuesta por dos heacutelices anfipaacuteticas (Perez et al 2014) por lo que el
factor estructural tampoco seriacutea un factor clave salvo por el hecho de que
provienen de oriacutegenes evolutivos distintos
A manera de conclusioacuten de acuerdo con la evidencia recolectada tanto a nivel
bioinformaacutetico como experimental encontramos que el marco de lectura de los
vectores para la produccioacuten de N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ estaban
correctamente orientados y dispuestos en sus marcos de lecturas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 104
correspondientes los geles de poliacrilamida siacute fueron efectivos para detectar
proteiacutenas con un peso similar (lisozima 144 kDa) a los peacuteptidos de nuestras
construcciones (N-AmyELnqQ= 1053 kDa y SmbP-LnqQ= 1669 kDa)
Confirmamos que el IPTG siacute es capaz de inducir la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
de control tanto en cepas de E coli BL21 (DE3) como de Origami tanto a 25degC
como a 37degC De manera que tanto N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ suponemos
que siacute son producidas pero por caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas propias de la LnqQ
es posible que 1) dado su alta hidrofobicidad es posible que N-AmyELnqQ se
mantenga acoplada en la membrana celular lo que dificultariacutea su solubilizacioacuten en
los geles de SDS-PAGE 2) desde el punto de vista analiacutetico es posible que SDS-
PAGE no sea la teacutecnica oacuteptima para la visualizacioacuten de las proteiacutenas hidrofoacutebicas
3) no existe informacioacuten conclusiva que respalde soacutelidamente porqueacute SmbP-LnqQ
no logroacute ser sobreproducida utilizando E coli como organismo heteroacutelogo
productor
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 105
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES
El biosensor disentildeado de ceacutelulas de E coli basado en la deteccioacuten de moleacuteculas
de QS es capaz de producir LnqQ en base a la concentracioacuten externa de AIP
excretada por MRSA La capacidad del biosensor estaacute mediada por un vector de
expresioacuten disentildeado que lleva por nombre Dual Biosensor-Killer Este plaacutesmido
ademaacutes puede ser utilizado para la construccioacuten de otros biosensores que
compartan el objetivo de detectar y destruir otros patoacutegenos productores de
sentildeales tipo QS Seguacuten nuestros anaacutelisis bioinformaacuteticos in silico nuestro
biosensor estaacute capacitado para detectar y destruir cepas de S aureus que sean
productoras de moleacuteculas de sentildealizacioacuten tipo AIP clase II De acuerdo con
nuestros pronoacutesticos nuestra cepa modificada seriacutea capaz de producir secretar y
ser capaz de ser resistente a la produccioacuten de LnqQ debido a que la maquinaria
geneacutetica se mantuvo intacto Nuestros resultados revelan indican que la LnqQ
seraacute lo suficientemente soluble cuando sea sobreexpresado Por uacuteltimo
determinamos que no existen epiacutetopos para ceacutelulas tipo B ni riesgo de
alergenicidad De esta manera la LnqQ producida por este sistema bioloacutegico es
aparentemente seguro para ser utilizado como un potencial candidato a agente
terapeacuteutico Los resultados in silico motivan al desarrollo y disentildeo de nuevos
agentes antimicrobianos a traveacutes de biosensores de ceacutelulas enteras para eliminar
patoacutegenos tanto sensibles como resistentes a los antibioacuteticos A pesar de los
favorables resultados reportados en publicaciones anteriores y la evidencia
predictiva sobre el peacuteptido sentildeal N-AmyE y con el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la
produccioacuten de proteiacutenas recombinantes como la bacteriocina LnqQ dichas
observaciones no pueden ser aplicadas para la produccioacuten expresioacuten y
purificacioacuten desde ceacutelulas de E coli BL21 (DE3)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 106
ANEXOS
Divulgacioacuten de la investigacioacuten
Publicaciones
Beniacutetez-Chao DF Balderas-Cisneros FDJ Leoacuten-Buitimea A and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Design and in silico analysis of a whole-cell biosensor able to
kill methicillin-resistant Staphylococcus aureus Biotechnol Appl Biochem
httpsdoiorg101002bab2210
Beniacutetez-Chao DF Leoacuten-Buitimea A Lerma-Escalera JA and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Bacteriocins An Overview of Antimicrobial Toxicity and
Biosafety Assessment by in vivo Models Front Microbiol
httpsdoiorg103389fmicb2021630695
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 107
Archivos de disentildeo
Todos los archivos gestionados para los disentildeos estaacuten guardados en su formato
correspondiente adentro de la carpeta de ldquoDoctoral ndash Anexosrdquo la cual fue anexada
propiamente en el disco compacto
Se elaboroacute una carpeta nombrada ldquoBioBricks and Modulesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 61 hasta 610 y estaacute subdivida
en cuatro subcarpetas nombradas como ldquoBioBricks (secuencias originales)rdquo
ldquoModulesrdquo ldquoPlasmidsrdquo ldquoTemplatesrdquo y el ldquoDual Biosensor Killerdnardquo Estos archivos
fueron elaborados a traveacutes de la aplicacioacuten de SnapGene 113 y estaacuten guardados
en formato dna Tambieacuten entregamos dos documentos en formato PDF que
contienen la secuencia nucleotiacutedica optimizada de todos genes usados para el
moacutedulo de biosensor y para el moacutedulo de bacteriocina
Se creoacute una carpeta nombrada ldquoSignal and fusion peptidesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 611 hasta 618 y en esta se
encontraraacute la subcarpeta ldquoMapa Geneacutetico de vectores de expresioacuten de expresioacuten
pETNL y pSmbP-LnqQrdquo Ademaacutes se entregaron tres archivos PDF donde dos de
eacutestos archivos contienen datos predictivos de la estructura secundaria y terciaria
de los productos de pETNL ldquoPhyre2 pETNLpdfrdquo y de pSmbP-LnqQ ldquoPhyre2
pSmbP-LnqQrdquo a traveacutes de la aplicacioacuten en liacutenea Phyre2 y el otro archivo PDF
ldquoSimulacioacuten agarosa 1pdfrdquo que contiene una simulacioacuten en gel de agarosa 1
(pv) de los productos lineales de los vectores de expresioacuten pET30a(+) pETNL y
pSmbP-LnqQ En la carpeta de este capiacutetulo tambieacuten se entregaron cinco archivos
en formato dna que contienen la informacioacuten nucleotiacutedica de la construccioacuten de
los vectores de expresioacuten cuyos nombres son ldquopET30(a)-NAmyE-LnqQ
pETNLpdfrdquo ldquopET-30a(+)pdfrdquo ldquopET-30a(+)-N-AmyEpdfrdquo ldquopET30a-SmbPpdfrdquo y
ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01pdfrdquo Todos los archivos estaacuten marcados con sus
respectivas caracteriacutesticas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 108
Resumen autobiograacutefico
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
Candidato para el grado de
Doctor en Ciencias con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Tesis Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing de
Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Edad 31 antildeos
Campo de estudio Desarrollo de agentes terapeacuteuticos y biologiacutea sinteacutetica
Biografiacutea Nacido en Monterrey Nuevo Leoacuten el diacutea 24 de julio de 1990 hijo de
Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas
Educacioacuten Egresado de Licenciado en Biotecnologiacutea Genoacutemica (UANL) en el
2013 y Maestro en Ciencias con Acentuacioacuten en Microbiologiacutea (UANL) en 2015
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 109
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UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 138
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada iv
CONTRAPORTADA
RESUMEN
Diego Francisco Beniacutetez Chao Fecha de graduacioacuten 2021
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
Facultad de Ciencias Quiacutemicas
Tiacutetulo de Estudio Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing
de Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Nuacutemero de paacuteginas 156 Candidato para el Grado de Doctor en Ciencias con
Orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Aacuterea de estudio Microbiologiacutea Aplicada Biologiacutea Sinteacutetica y Bacteriocinas
Propoacutesito y Meacutetodo de Estudio El incremento de infecciones por S aureus
resistentes a meticilina (MRSA) ha ganado importancia en los sistemas de salud
puacuteblicos mundiales en las uacuteltimas deacutecadas Diversos agentes terapeacuteuticos
alternativos a los antibioacuteticos han sido desarrollados para el tratamiento de este
tipo de infecciones Recientemente bajo los principios de la Biologiacutea Sinteacutetica
se han habilitado ceacutelulas enteras que sirvan como biosensores detectando
moleacuteculas producidas por patoacutegenos y que como resultado liberen una
sustancia antimicrobiana que erradique al patoacutegeno como las bacteriocinas
Actualmente los peacuteptidos sentildeales y los peacuteptidos de fusioacuten han sido
ampliamente usados para mejorar la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas
en sistemas recombinantes En este trabajo presentamos el disentildeo in silico que
emula a E coli para que actuacutee como biosensor al detectar moleacuteculas de
Quorum Sensing (QS) de MRSA productoras de sentildeales AIP-II y que en
respuesta produzca Lacticina Q (LnqQ) una bacteriocina con antecedentes
contra ceacutelulas MRSA Adicionalmente experimentamos la capacidad del
peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la produccioacuten
heteroacuteloga de LnqQ en el periplasma y el citoplasma de ceacutelulas de E coli
respectivamente
Contribuciones y Conclusiones En primera instancia se construyeron dos moacutedulos
geneacuteticos biosensor y de bacteriocina ambos moacutedulos fueron ensamblados en
el plaacutesmido Dual Biosensor-Killer Ambos moacutedulos fueron optimizados para su
expresioacuten en E coli para incrementar el rendimiento de produccioacuten de proteiacutenas
recombinantes El anaacutelisis predictivo del vector nos permite intuir que su efecto
en las ceacutelulas E coli las emulariacutea para detectar moleacuteculas de QS producidas
por MRSA productoras de AIP clase II y ademaacutes para producir y excretar LnqQ
en funcioacuten a la concentracioacuten externa al peacuteptido autoinductor de MRSA Los
resultados predictivos abren la posibilidad de disentildear antibioacuteticos terapeacuteuticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada v
inteligentes que puedan atacar patoacutegenos de resistencia Con relacioacuten al
peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP observamos que nivel
predictivo ambos eran candidatos potenciales para la produccioacuten periplaacutesmica y
citoplaacutesmica de LnqQ en ceacutelulas de E coli respectivamente Sin embargo
nuestros resultados experimentales demostraron que la bacteriocina LnqQ no
logroacute ser producida ni purificada cuando estuvo acoplada con N-AmyE o SmbP
Estos resultados enriquecen la literatura sobre ambas etiquetas proteicas asiacute
como tambieacuten descubrimos puntos a consideracioacuten que pudieran ser
importantes en afectar la produccioacuten y purificacioacuten cuando LnqQ es acoplada
con diferentes etiquetas proteicas en ceacutelulas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vi
PRESENTACIOacuteN
CONTROL POBLACIONAL Y OSCILATORIO UTILIZANDO EL QUORUM
SENSING DE Staphylococcus aureus MEDIANTE UN CIRCUITO GENEacuteTICO
DE Escherichia coli
Presentado por
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
El presente proyecto fue mayormente realizado en las instalaciones del
Laboratorio de Biologiacutea Sinteacutetica y de Sistemas del Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con la asesoriacutea del Dr Joseacute Rubeacuten
Morones Ramiacuterez y en el menor medida en el Laboratorio de Expresioacuten y
Purificacioacuten de Proteiacutenas unidad perteneciente a la Facultad de Ciencias
Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con apoyo del Dr Xristo
Zaacuterate Kalfoacutepulos Este proyecto fue auspiciado por el Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) mediante el apoyo con el Beca Nacional de
Posgrado (nuacutemero de becario 289476)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vii
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) por el apoyo
brindado con la Beca Nacional de Posgrado con nuacutemero de becario 289476
(CVU no 516171) para la continuacioacuten de estudios
A la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) y a la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten (UANL) por el apoyo otorgado con la aprobacioacuten de becas y por el
uso directo e indirecto de sus instalaciones materiales y equipos
Al Dr Joseacute Rubeacuten Morones Ramiacuterez mi asesor a quien agradezco por la
oportunidad de colaborar en el equipo de investigacioacuten Nanobiotechnology
Research Group (NBR) Externo mi agradecimiento por las asesoriacuteas y el uso
de instalaciones equipos y materiales en el Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea (CIBYN) asiacute como el financiamiento para la
obtencioacuten de materiales de experimentacioacuten y ejecucioacuten de servicios y el
mejoramiento de mi vida profesional
Al MC Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros y al Dr Angel Leoacuten Buitimea
miembros del NBR y quienes fueron clave en la elaboracioacuten de este proyecto
asiacute como en los artiacuteculos cientiacuteficos redactados durante el proceso doctoral
Al Dr Xristo Zaacuterate Kalfoacutepulos miembro del comiteacute tutorial por su apoyo
teacutecnico y asesoriacutea por el equipo de investigacioacuten del Laboratorio de Expresioacuten y
Produccioacuten de Proteiacutenas (PEP) El agradecimiento se extiende a David Peacuterez
Bryan Santos y Jessica Goacutemez por sus importantes contribuciones
A los demaacutes miembros NBR asiacute como del comiteacute tutorial por sus comentarios
revisiones y asesoriacuteas en la elaboracioacuten de este proyecto
A mis padres Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas y a mi
hermano Angel Alejandro Beniacutetez Chao por su apoyo emocional e
incondicional en el transcurso de este proyecto
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada viii
DEDICATORIA
Para Dios iexclGracias por el don de pensar
Para mi mamaacute Lupita y mi papaacute Alejandro
Para mis hermanos Angel Alejandro y Jesuacutes Alejandro (+)
Para mis mejores amigos Esthela Maldonado Ricardo ldquoMankisrdquo Garciacutea Ricardo ldquoCiegordquo
Garciacutea Edgar ldquoBomboacutenrdquo Villareal Gerardo ldquoPepisrdquo Villarreal Mayela ldquoMonkeyrdquo Maldonado
Aniluacute Maldonado Eduardo Mendoza Alejandra Villarreal Isaac ldquoBebordquo Gonzaacutelez Cristy Llanes
Salma Alemaacuten iexclGracias por ser tan importantes para miacute
Para mis colegas del NBR muy en especial para Paco Balderas Angel Leoacuten Javier Garza
Paco ldquoNegrordquo Rodriacuteguez Dago Torres Luis Cepeda Albert Lerma Jordy Lerma Ceacutesar Garza
Alex de la Garza Isabel Caamal Gricelda Mendiola Fatemehalsadat Tabatabaeifar Hossein
Alishaharatobotni Nahid Rafiei y otros maacutes Se extiende la dedicatoria a mis colegas en PEP en
especial para David Peacuterez Jessica Goacutemez Brayan Santos Evelyn Martiacutenez
Para los que fueron mis estudiantes de verano o de servicio social con mencioacuten especial para
Montse Villegas Rauacutel Garciacutea Cinthia Castillo Sarai Fierros Jessica Ojeda y otros maacutes
Para mis colegas de generacioacuten de doctorado en especial para Paco Balderas David Peacuterez y
Gaby Quintanilla
Para el equipo administrativo del CIBYN con menciones especiales para Karla Islas y Mayra
Sandoval asiacute como de todo el equipo de intendencia muy en especial para la Sra Antonia
ldquoTontildeitardquo Sandoval y la Sra Martha Flores asiacute como para el guardia Nehemiacuteas y el chofer
Ernesto
Para el equipo administrativo de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
con mencioacuten especial para Karina Navarro y para la Sra Edmunda de intendencia
Para mis queridos perros muy en especial para Lucky Toby (+) y Pelusa (+)
Para mis ex alumnos de preparatoria del Centro Escolar Gante iexclLo logreacute
Para todos los que han trabajado como meseros y repartidores para continuar con sus estudios
yo sostener una familia iexclUstedes tienen mis maacutes sinceros respetos
Para todos los que han roto rompen y romperaacuten los liacutemites de lo conocido
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada ix
Si nos negamos categoacutericamente a reconocer que somos susceptibles de
cometer un error una equivocacioacuten profunda ndash nos acompantildearaacute siempre Pero
si somos capaces de evaluarnos con un poco de coraje por muy lamentables
que sean las reflexiones que podamos engendrarnos nuestras posibilidades
mejoran enormemente
Carl Sagan
El mundo y sus demonios La ciencia como una luz en la obscuridad (1995)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada x
TABLA DE CONTENIDO
PORTADA I
FIRMAS DE APROBACIOacuteN DE TESIS II
FIRMAS DE REVISIOacuteN DE TESIS III
CONTRAPORTADA IV
RESUMEN IV
PRESENTACIOacuteN VI
AGRADECIMIENTOS VII
DEDICATORIA VIII
TABLA DE CONTENIDO X
LISTA DE FIGURAS XIV
LISTA DE TABLAS XV
LISTA DE ABREVIATURAS XVI
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN 1
11 ERA DE LOS ANTIBIOacuteTICOS 1
12 INFECCIONES RESISTENTES A LOS ANTIBIOacuteTICOS AMENAZA MUNDIAL 2
13 PROBLEMA SANITARIO CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTES 4
14 TRATAMIENTOS ACTUALES PARA EL COMBATE A INFECCIONES RESISTENTES 5
15 TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS A LOS ANTIBIOacuteTICOS 6
CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES 8
21 CONTROL BIOLOacuteGICO POBLACIONAL POR MICROORGANISMOS 8
22 BIOLOGIacuteA SINTEacuteTICA Y SU PAPEL EN PRODUCCIOacuteN DE BACTERIOCINAS 8
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica 8
222 Definicioacuten de los biosensores 9
23 QUORUM SENSING COMUNICACIOacuteN ENTRE CEacuteLULAS 10
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus 11
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD 12
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA 12
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada 12
24 BIOSENSORES DE CEacuteLULAS ENTERAS BASADOS EN DETECCIOacuteN DE QS 13
25 LAS BACTERIOCINAS 15
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas 15
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos 17
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xi
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes 19
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos 19
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas 20
256 La bacteriocina Lacticina Q 21
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados 22
26 PRODUCCIOacuteN HETEROacuteLOGA DE BACTERIOCINAS 23
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE 24
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP 25
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS 26
31 Justificacioacuten 26
32 Hipoacutetesis 28
33 Objetivo General 28
34 Objetivos Especiacuteficos 28
35 Metas 29
36 Aportacioacuten cientiacutefica 29
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA 30
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 30
42 Cepas bacterianas 30
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina 31
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 33
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas 33
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 34
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 34
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 34
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 35
410 Prediccioacuten de alergenicidad 35
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 35
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 37
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 38
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 38
415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 39
418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 44
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en los geles 48
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xii
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS 50
51 Materiales y reactivos 50
52 Equipos de laboratorio 51
53 Lugares de experimentacioacuten 53
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos 53
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES 54
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 54
62 Cepas bacterianas 55
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina 55
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 57
65 Optimizacioacuten de los codones nativos 60
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 61
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 64
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 64
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 65
610 Prediccioacuten de alergenicidad 67
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 67
612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 72
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 73
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 73
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 74
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 75
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 78
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 84
619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de proteiacutenas 95
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES 105
ANEXOS 106
Divulgacioacuten de la investigacioacuten 106
Archivos de disentildeo 107
Resumen autobiograacutefico 108
REFERENCIAS 109
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiii
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 CONCEPTO DEL BIOSENSOR BASADO EN CEacuteLULAS ENTERAS 30
FIGURA 2 SISTEMA QS PARA DETECCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE S AUREUS 54
FIGURA 3 MOacuteDULOS BIOSENSOR Y DE BACTERIOCINA 55
FIGURA 4 ESTRATEGIA DE CONSTRUCCIOacuteN IN SILICO 58
FIGURA 5 REPRESENTACIOacuteN ESQUEMAacuteTICA DEL VECTOR DUAL BIOSENSOR-KILLER 59
FIGURA 6 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE N-AMYELNQQ 76
FIGURA 7 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE SMBP-LNQQ 76
FIGURA 8 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE N-AMYELNQQ 77
FIGURA 9 PREDICCIOacuteN DE HEacuteLICES TRANSMEMBRANALES PARA N-AMYELNQQ 77
FIGURA 10 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE SMBP-LNQQ 78
FIGURA 11 TRANSFORMACIOacuteN DE E COLI DH5Α Y BL21 (DE3) CON PET30A(+) PETNL Y PSMBP-LNQQ 79
FIGURA 12 GEL DE AGAROSA CON PLAacuteSMIDOS PETNL Y PSMBP-LNQQ 80
FIGURA 13 SIMULACIOacuteN DE PCR PARA VECTORES DE EXPRESIOacuteN 83
FIGURA 14 PCR DE PETNL 84
FIGURA 15 PCR DE PSMBP-LNQQ 84
FIGURA 16 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON PETNL INDUCIDO A 25degC 87
FIGURA 17 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PETNL INDUCIDO A 37degC 88
FIGURA 18 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 91
FIGURA 19 GEL DE E COLI ORIGAMI PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 92
FIGURA 20 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 37degC 93
FIGURA 21 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 25degC 94
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xv
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 USO DE CODONES PREVIO Y DESPUEacuteS DE LA OPTIMIZACIOacuteN 61
TABLA 2 PREDICCIOacuteN DE COMUNICACIOacuteN CRUZADA 63
TABLA 3 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD DE PROTEIacuteNAS 64
TABLA 4 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN SUBCELULAR DE PROTEIacuteNAS 65
TABLA 5 PREDICCIOacuteN DE EPIacuteTOPOS DE CEacuteLULAS B EN LNQQ 66
TABLA 6 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE N-AMYELNQQ 69
TABLA 7 SECUENCIAS UTILIZADAS PARA PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE N-AMYELNQQ 70
TABLA 8 PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE PEacutePTIDO SENtildeAL N-AMYE 71
TABLA 9 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE SMBP-LNQQ 73
TABLA 10 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
TABLA 11 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN CELULAR N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvi
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Significado
E coli Escherichia coli
S aureus Staphylococcus aureus
MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina
L lactis Lactococcus lactis
ESKAPE Acroacutenimo de seis especies bacterianas Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
QS Quorum Sensing (Percepcioacuten de Quoacuterum)
LnqQ Lacticina Q
agrBDCA Operoacuten agr de S aureus
agrB Gen que codifica AgrB
agrD Gen que codifica AgrD
HSL Moleacutecula homo serilactonado
AIP Moleacutecula autoinductora
agrC Gen que codifica AgrC
agrA Gen que codifica AgrA
AgrB Transportadora proteasa necesaria para la maduracioacuten de AgrD
AgrD Peacuteptido precursor a la moleacutecula autoinductora
AgrC Receptor transmembranal con actividad histidina quinasa
AgrA Proteiacutena reguladora de unioacuten al DNA de respuesta
AgrA-P AgrA fosforilado
pH Potencial de hidroacutegeno
pI Punto isoeleacutectrico
AMP Peacuteptidos antimicrobianos
kDA Kilo Dalton
MIC Concentracioacuten miacutenima inhibitoria
microM Micromolar
microgml Microgramo por mililitro
lnqRQBCDEF Cluacutester geneacutetico
AmyE Alfa-amilasa
N-AmyE Peacuteptido sentildeal de la AmyE
SmbP Proteiacutena pequentildea de unioacuten a metales
SmbP Regioacuten citoplaacutesmitica de la SmbP (peacuteptido de fusioacuten)
Ala33 Las letras indican el aminoaacutecido y los nuacutemeros la posicioacuten en la cadena
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranoacutesido
SBP Massachussets Institute of Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts
KEGG Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes
FPB FP Base
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvii
PDB Protein Data Bank
nm Nanoacutemetros
DBK Plaacutesmido Dual Biosensor Killer
CAI Caacutelculo de Iacutendice de Adaptacioacuten
CUD Codon Usage Database
BUSCA Bologna Unified Subcellular Component Annotador
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
pET30(+)a Plaacutesmido tipo pET30(+)a sin modificaciones
pETNL Plaacutesmido que contiene N-AmyELnqQ6xHis
pSmPc-LnqQ Plaacutesmido que contiene SmbP-LnqQ
LB Medio de cultivo LB
OD600 Densidad oacuteptica
microl Microlitros
microg Microgramos
degC Grados Celsius
h Hora
ml Mililitro
g Gramo
g Fuerza centriacutefuga relativa
rpm Revoluciones por minuto
min Minuto
dNTPs Trifosfatos de desoxinucleoacutetidos
V Volts
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
pv Peso volumen
NaCl Cloruro de sodio
Tris-HCl Solucioacuten de Tris ajustada con aacutecido clorhiacutedrico (HCl)
M Molar
SDS Dodecil Sulfato Soacutedico
APS Persulfato de amonio
TEMED Tetramethylethylenediamine
X Veces de concentracioacuten de trabajo
mm Miliacutemetros
lnqQ Gen de lacticina Q
P2 Promotor 2 inducible del operoacuten agr de S aureus
gfp Gen de GFP
GFP Proteiacutena verde fluorescente
J23110 Promotor J23110 constitutivo para E coli
AIP-I AIP clase I
AIP-II AIP clase 2
AIP-III AIP clase 3
AIP-IV AIP clase 4
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Ala Alanina (A)
Arg Arginina (R)
Asn Asparagina (N)
Asp Asparato (D)
Cys Cisteiacutena (C)
Gln Glutamina (Q)
Glu Glutamato (E)
Gly Glicina (G)
His Histidina (H)
Ile Isoleucina (I)
Leu Leucina (L)
Lys Lisina (K)
Met Metionina (M)
Phe Fenilalanina (F)
Pro Prolina (P)
Ser Serina (S)
Thr Treonina (T)
Trp Triptoacutefano (W)
Tyr Tirosina (Y)
Val Valina (V)
Pnl Liasa de pectina
AmyE Amilasa E
N-AmyEPnl Liasa de pectina asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
N-AmyEAmyE Amilasa E asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
VpDef Defensina de Venerupis philippinarum
Bin1b Defensina de Rattus norvegicus
LL-37 Catelicidina de humanoschimpanceacutes
SmbP-VpDef VpDef asociado con SmbP
SmbP-Bin1b Bin1b asociado con SmbP
SmbP-LL-37 LL-37 asociado con SmbP
SUMO-LnqQ LnqQ asociado con SUMO
AI Iacutendice alifaacutetico
GRAVY Iacutendice de hidrofobicidad
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN
A lo largo de nuestra historia los humanos hemos desarrollado soluciones a los
problemas del mundo que nos rodea No es extrantildeo que el combate a las
enfermedades sean uno de los temas maacutes recurrentes Existen referencias
histoacutericas entre las diferentes civilizaciones de la antiguumledad como los chinos
(Nicola amp Abagyan 2009) aztecas (Davidson amp De Montellano 1983) y los nubia-
sudaneses (Bassett Keith Armelagos Martin amp Villanueva 1980) del uso
empiacuterico de sustancias para tratar infecciones y enfermedades Hace unos
doscientos antildeos atraacutes se pensoacute que los subproductos de la revolucioacuten industrial
seriacutean tratamiento efectivo contra infecciones y aunque los resultados fueron
alentadores al principios los resultados observados ante otro tipo de infecciones
no tuvieron el mismo eacutexito (Gaynes 2017)
11 Era de los antibioacuteticos
En 1928 Alexander Fleming encontroacute una solucioacuten efectiva para contrarrestar las
infecciones al describir al hongo Penicillium notatum que teniacutea efectos antagoacutenicos
sobre diferentes cepas estafilocoacutecicas (Fleming 1929) inaugurando asiacute la
conocida era dorada en descubrimiento de los antibioacuteticos (Podolsky 2018) Las
virtudes observadas en los antibioacuteticos fueron raacutepidamente puestas en juicio
cuando el mismo Fleming vaticinoacute en su discurso de entrega al premio Nobel que
el abuso y uso excesivo de los antibioacuteticos podriacutea generar brotes de patoacutegenos
resistentes a los antibioacuteticos (Fleming 1945) Cada vez que un nuevo antibioacutetico
era liberado a los sistemas de salud puacuteblicos pronto se reportaba un brote de
resistencia relacionado a antibioacutetico (Clatworthy Pierson amp Hung 2007) Con el
boom de nuevas clases de antibioacuteticos desde los 1940s hasta principios de 1970s
la alerta por resistencia a los antibioacuteticos quedoacute praacutecticamente inadvertida De
hecho entre los 1960s y 1970s existe evidencia que la comunidad cientiacutefica
internacional fue apaacutetica y minimizoacute el hecho de que el abuso de los antibioacuteticos
fuera una causa de resistencia a los faacutermacos en las bacterias patoacutegenas
(Podolsky 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 2
El tema de la resistencia a los antibioacuteticos no tuvo impacto suficiente hasta que
con el paso de las deacutecadas surgieron de brotes de patoacutegenos resistentes de
importancia cliacutenica como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA
por sus siglas en ingleacutes) tanto en Reino Unido (Gardner Oxon Stamp Bowgen amp
Moore 1962) como en Estados Unidos (Barrett McGehee amp Finland 1968) y
ademaacutes las nuevas clases de antibioacuteticos empezaron a escasear desde los 1980s
hasta casi los 2000s Adicionalmente los inversionistas se motivaron a encontrar
nuevas clases antibioacuteticos al observar maacutes ganancias en descubrir compuestos
anticanceriacutegenos (Ventola 2015) los reglamentos sanitarios se volvieron maacutes
estrictos para la liberacioacuten de antibioacuteticos para prevenir la presentacioacuten de
infecciones multirresistentes emergentes (Davies 2006) Todos estos factores
incluyendo otros que tal vez no fueron mencionados allanaron el establecimiento
de poliacuteticas en salud puacuteblica para buscar o sintetizar alguacuten faacutermaco o sustancia
que contrarreste el avance de microorganismos patoacutegenos resistentes de
relevancia cliacutenica (World Health Organization 2017)
12 Infecciones resistentes a los antibioacuteticos amenaza mundial
Cifras de la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) mostraron el peligroso
ascenso de infecciones por bacterias resistentes en las uacuteltimas deacutecadas donde se
calcula un promedio de 700000 muertes anuales para el 2019 (World Health
Organization 2019b) y la advertencia de que si los gobiernos y organizaciones
responsables de la salud puacuteblica a nivel mundial no elaboran poliacuteticas efectivas
para el 2050 tendremos un promedio de 10 millones de muertes al antildeo por
consecuencias de este tipo de infecciones (Dadgostar 2019)
En Meacutexico carecemos de un sistema de recoleccioacuten de datos confiables en este
tipo de infecciones (Amabile-Cuevas 2010) pero en un estudio realizado durante
seis meses del 2019 se recuperaron 23000 cepas resistentes a faacutermacos en 47
centros de salud puacuteblicos de todo el paiacutes siendo algunas de las maacutes comunes E
coli Klebsiella sp Enterobacter sp Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter sp
Enterococcus faecium resistente a vancomicina y Staphylococccus aureus
resistente a meticilina (MRSA) (Vazquez-Rodriguez et al 2018)
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En todas las regiones del mundo las infecciones resistentes han tenido un
peligroso ascenso En Estados Unidos las muertas anuales por infecciones
resistentes pasaron de 23000 muertes en 2013 (Frieden 2013) a 35000 durante
el 2019 (CDC 2019) Por otro lado en Europa las muertes atribuibles a
infecciones resistentes aumentaron de 25000 en 2007 (European Centre for
Disease Prevention and Control 2009) a 33110 en 2015 (Cassini et al 2019) En
42 paiacuteses del continente africano se registraron 54000 casos atribuibles a
tuberculosis multirresistente (MDR multi-resistant) y en ocho paiacuteses se registraron
3200 muertes relacionadas a la variante extremadamente resistente (XDR
extreme resistant) en un periacuteodo del 2004 al 2011 (Ndihokubwayo et al 2013) En
el continente asiaacutetico en China por ejemplo el rango de bacterias aislados que
eran resistentes a los antibioacuteticos pasoacute de 22774 casos a 190610 de 2005 a
2017 respectivamente (Qu Huang amp Lv 2019) en la India un estudio reporta
que el 70 de aislados cliacutenicos tipo Gram negativos son resistentes a los
faacutermacos y entre ellos se podiacutean encontrar cepas de Escherichia coli Klebsiella
pneumoniae Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa (Taneja amp
Sharma 2019)
Las infecciones resistentes son material incluso de intereacutes para el sector
econoacutemico El Banco Mundial ha elaborado dos escenarios para predecir el
impacto econoacutemico de las infecciones resistentes para el 2050 en un escenario
de bajo impacto el Producto Interno Bruto (PIB) mundial podriacutea disminuir hasta un
11 Sin embargo en un escenario de alto impacto el dantildeo al PIB global podriacutea
representar hasta una disminucioacuten de 38 Los costos al sistema de salud
puacuteblico en el mundo podriacutean oscilar entre los $300 mil millones a $1 cuatrilloacuten
presentando incluso un serio riesgo para el sector ganadero ya que en el
escenario de bajo impacto esto representariacutea una disminucioacuten de 26 esperado
a un 75 en un escenario de alto impacto (The World Bank 2016)
Las infecciones resistentes representa un punto de intereacutes incluso para la
Organizacioacuten de la Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
Food and Agriculture Organization) ya que actualmente se presume que en 42
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paiacuteses donde existen datos confiables de consumo de antibioacuteticos en el sector
ganadero y de agricultura se estima que en el 2010 el consumo era de 63000
toneladas de antibioacuteticoantildeo mientras que para el 2030 se estima un consumo
105600 toneladas de antibioacuteticoantildeo representando un incremento de 67 Los
iacutendices de metabolizacioacuten de antibioacuteticos tanto en ganado como en produccioacuten
pesquera presentan una baja metabolizacioacuten ya que entre un 70-80 y un 75-
90 respectivamente son excretados a las fuentes acuiacuteferas La produccioacuten de
cultivos consume entre un 02 a 04 del total de antibioacuteticos en relacioacuten con la
produccioacuten ganadera (FAO sf)
La relevancia sanitaria mundial de S aureus es porque se trata de un miembro del
grupo ESKAPE un grupo de patoacutegenos localizados en infraestructuras
hospitalarias asilos o en equipos e instrumentos meacutedicos como ventiladores y
cateacuteteres y que son habitualmente resistentes a los antibioacuteticos (Rice 2008) Esta
bacteria es la primera causa nosocomial tanto en Latinoameacuterica (26)
Norteameacuterica (260) y la segunda causa nosocomial de Europa (195)
(Biedenbach Moet amp Jones 2004) Se presume que un 30 de la poblacioacuten total
de humanos estaacute colonizado con al menos una subespecie de S aureus
(Wertheim et al 2005) y esto podriacutea ser porque el haacutebitat de esta bacteria en los
humanos es la parte anterior de las fosas nasales (Mulcahy amp McLoughlin 2016)
13 Problema sanitario con Staphylococcus aureus resistentes
S aureus es una bacteria Gram positiva y es considerada una de las principales
causas de enfermedades en piel (Foster 1996) Ademaacutes es capaz de desarrollar
biopeliacuteculas en dispositivos implantados en seres humanos y cateacuteteres causando
infecciones croacutenicas y persistentes (Dunne 2002) La osteomielitis y periodontitis
tambieacuten son producto de la biopeliacutecula este patoacutegeno estaacute involucrado en heridas
croacutenicas en pacientes diabeacuteticos con uacutelceras y estaacute relacionado a infecciones al
endocardio oculares y en casos de rinosinusitis croacutenica (Archer et al 2011) Se
considera que es un patoacutegeno de alto riesgo para pacientes con Fibrosis Quiacutestica
ya que es el maacutes reportado entre personas con 11 a 15 antildeos con esta condicioacuten
(Razvi et al 2009)
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Ahora bien se estima que entre un 13 al 74 del total de infecciones resistentes
en el mundo son causados por una variante resistente de S aureus resistente a la
meticilina la cepa MRSA (Koumlck et al 2010) la cual estaacute es sentildealada desde el
2017 por la OMS como un patoacutegeno de alta prioridad al que debe encontrarse una
solucioacuten pronta y efectiva (World Health Organization 2017) Por ejemplo en
Estados Unidos el total de pacientes por infecciones nosocomiales tipo MRSA
ascendioacute de 24 en 1975 a un 29 en 1991 (Panlilio et al 1992) y hasta casi
57 para el antildeo 2000 (NNIS 2004) En la actualidad el MRSA es considerado
endeacutemico en ese paiacutes ya que se estima que el 2 de la poblacioacuten es acarreador
de este estafilococo (Kavanagh 2019)
En Meacutexico los primeros casos de MRSA asociado a comunidad (CA-MRSA) cepa
USA300 fueron reportados a inicios del 2008 (Mariacutea E Velazquez-Meza et al
2011) y durante el 2010 un estudio anuncioacute que la cepa de MRSA maacutes
frecuentemente aislada en nuestro paiacutes era la New YorkJapan (Rodriacuteguez-
Noriega et al 2010) Tambieacuten se conoce que cepas de MRSA en hospitales
puacuteblicos en nuestro paiacutes fluctuoacute entre un 7 al 30 en pacientes entre las
deacutecadas de 1980s a 2000s (M E Velazquez-Meza et al 2004) mientras que el
Instituto Nacional de Cancerologiacutea determinoacute que 17 de las cepas aisladas de
3000 hemocultivos recuperados entre el 2005 al 2015 de pacientes con caacutencer
correspondiacutean a MRSA (Velaacutezquez-Acosta Cornejo-Juaacuterez amp Volkow-Fernaacutendez
2018)
14 Tratamientos actuales para el combate a infecciones
resistentes
En la actualidad las clases maacutes comunes de antibioacuteticos para combatir
infecciones resistentes a los antibioacuteticos son las penicilinas cefalosporinas
quinolonas macroacutelidos tetraciclinas glucopeacuteptidos y monobactaacutemicos (Taylor
Stapleton amp Paul Luzio 2002) En las uacuteltimas dos deacutecadas se han aprobado una
gran variedad de antibioacuteticos para el tratamiento de infecciones causados por
bacterias tanto Gram positivos como Gram negativos Los antibioacuteticos maacutes
recientemente reportados para el tratamiento de bacterias multirresistentes Gram
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positivas incluyen β-lactaacutemicos (ceftarolina y ceftobiprol) glicopeacuteptidos
(dalbavancin oritavancin y telavancin) oxazolidinonas (tedizolid fosfato)
quinolonas (besifloxacina delafloxacin y ozenoxacina) y tetraciclinas
(omadaciclina) (Koulenti et al 2019) Seguacuten la OMS hasta el 2019 se sabe de 50
agentes antimicrobianos que se encuentran en desarrollo cliacutenico donde 32 son
antibioacuteticos activos contra patoacutegenos de prioridad de la OMS diez son agentes
bioloacutegicos 2 son clasificados como agentes novedosos y dos pertenecen al grupo
de bacterias Gram negativas multirresistentes (World Health Organization 2019a)
15 Tratamientos alternativos a los antibioacuteticos
Los patoacutegenos resisten a los antibioacuteticos bajo tres grandes mecanismos de
resistencia intriacutenseca adaptativa yo adquirida (Arzanlou Chai amp Venter 2017
Blair Webber Baylay Ogbolu amp Piddock 2015 Sandoval-Motta amp Aldana 2016)
Es por ello que urge desarrollar una solucioacuten pronta y efectiva para contrarrestar
las infecciones causadas por patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos los cuales
son uno de los puntos que la OMS ha declarado como prioritarios (OrsquoNeill 2016)
En la guerra contra la resistencia a los antibioacuteticos nuestro grupo de investigacioacuten
ha participado en la creacioacuten de compuestos que puedan combatirlos como
tratamientos mixtos de antibioacuteticos (Montelongo-Peralta Leoacuten-Buitimea Palma-
Nicolaacutes Gonzalez-Christen amp Morones-Ramiacuterez 2019) nanopartiacuteculas de plata
asociados con metales de transicioacuten (Javier A Garza-Cervantes et al 2017)
nanomateriales asociados con nanopartiacuteculas de plata sintetizados con poliacutemeros
sensibles al ambiente (Ruben Morones amp Frey 2007) o producidos de manera
sustentable (Escaacutercega-Gonzaacutelez et al 2018) o a partir de un exopolisacaacuterido
producido por una levadura que actuacutea como agente reductor y que estaacuten
capeados por agentes con actividad antimicrobiana y antibiopeliacutecula (Javier
Alberto Garza-Cervantes et al 2019)
Otros grupos de investigacioacuten tambieacuten han desarrollado otro tipo de armas contra
la resistencia a los antibioacuteticos como el uso de teacutecnicas de decorado en
bacterioacutefagos (phage display) para producir vacunas en la caacutepside de
bacterioacutefagos inhabilitados (Bao et al 2019) o uso de agentes de control bioloacutegico
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contra patoacutegenos de alimentos (Gutieacuterrez Fernaacutendez Rodriacuteguez amp Garciacutea 2019)
o para el tratamiento de aguas residuales (Jassim Limoges amp El-Cheikh 2016)
Los esfuerzos actuales se han focalizado en encontrar yo desarrollar nuevas
clases de antibioacuteticos y agentes antimicrobianos contra bacterias resistentes (Fair
amp Tor 2014) y de prioridad ante la OMS (World Health Organization 2017) Las
corrientes alternativas a los antibioacuteticos maacutes reconocidas en la actualidad estaacuten
clasificadas en dos grandes enfoques el enfoque de prevencioacuten a las
enfermedades donde se desarrollan y se utilizan vacunas probioacuteticos o
prebioacuteticos mientras que en el enfoque por tratamiento a las enfermedades se
utilizan la terapia de fagos la aplicacioacuten directa de endolisinas yo exolisinas el
uso de microorganismos depredadores vivos o el uso directo de bacteriocinas
(Allen Trachsel Looft amp Casey 2014) Tambieacuten la Biologiacutea Sinteacutetica se ha
involucrado en resolver la problemaacutetica de infecciones resistentes a los faacutermacos
al participar en el disentildeo de biosensores basados en ceacutelulas completas que sean
capaces de destruir patoacutegenos mediante la previa de deteccioacuten de moleacuteculas
excretadas por microrganismos de intereacutes (Beniacutetez‐Chao Balderas‐Cisneros
Leoacuten‐Buitimea amp Morones‐Ramiacuterez 2021)
La biosiacutentesis purificacioacuten y aplicacioacuten de bacteriocinas contra patoacutegenos Gram
negativos y Gram positivos ha sido punto central para diversos grupos de
investigacioacuten (Cabral Penumutchu Norris Morones-Ramirez amp Belenky 2018
McAuliffe et al 1998 Rea Ross Cotter amp Hill 2011 Sandiford amp Upton 2012
Wong et al 2015) asiacute como la siacutentesis de nanocompuestos como liposomas
quitosano y nanopartiacuteculas hechos a base de compuestos de plantas (Sidhu amp
Nehra 2017) o de nanofibras (Fahim Khairalla amp El-Gendy 2016) que esteacuten
acomplejados con bacteriocinas Maacutes adelante se describiraacuten detalles sobre las
bacteriocinas y su relacioacuten en el combate a las infecciones resistentes a los
antibioacuteticos
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CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES
21 Control bioloacutegico poblacional por microorganismos
En la Naturaleza todos los seres vivos estaacuten interactuando y compitiendo por
nichos ecoloacutegicos para sobrevivir crecer y reproducirse para una adaptacioacuten
efectiva en el ambiente donde se desarrollan Este fenoacutemeno es universal ya que
pueden encontrarse en estilos de vida unicelulares y multicelulares (Grice et al
2009) Para competir por los nutrientes los microorganismos contienen
compuestos que matan o limitan el crecimiento de otra poblacioacuten Estos
compuestos pueden ser antibioacuteticos peacuteptidos antimicrobianos moleacuteculas de bajo
peso molecular entre otros maacutes (Gonzalez et al 2011 2010)
Cuando microorganismos vivos por sus caracteriacutesticas bioloacutegicas son usados para
suprimir la densidad poblacional de un tipo especiacutefico de organismo hacieacutendolo
menos abundante o dantildeino se le conoce como control bioloacutegico Es importante
mencionar que esta definicioacuten solo incluye a especiacutemenes vivos como
depredadores paraacutesitos nemaacutetodos hongos bacterias protozoarios inclusive
virus Sin embargo genes sin un recipiente bioloacutegico o metabolitos producidos por
un organismo de control sin que eacuteste se encuentre presente durante el control
poblacional son excluidos de esta definicioacuten (Eilenberg Hajek amp Lomer 2001)
Por ejemplo cultivos de Candida albicans (Peters et al 2010) Pseudomonas
aeruginosa (Filkins et al 2015) Bacillus subtilis (Gonzalez et al 2011)
Enterococcus faecium (Viccedilosa et al 2018) Acanthamoeba polyphaga (de Souza
Soares Benitez amp Rott 2017) disminuyeron la expresioacuten de patogenicidad en S
aureus Incluso cultivos de E coli han mostrado actividad fungicida contra cultivos
de C albicans (Cabral et al 2018)
22 Biologiacutea Sinteacutetica y su papel en produccioacuten de bacteriocinas
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica
La Biologiacutea Sinteacutetica consiste en disentildear libreriacuteas de elementos geneacuteticos como
promotores secuencias codificadoras terminadores factores de transcripcioacuten
entre otras maacutes asiacute tambieacuten se enfoca en el ensamblaje de circuitos geneacuteticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 9
hasta en el disentildeo y creacioacuten de organismos completos Este campo utiliza datos
cuantitativos para crear modelos bioloacutegicos y matemaacuteticos que permitan predecir
el comportamiento de un sistema bioloacutegico (Cameron Bashor amp Collins 2014
Garciacutea-Granados Lerma-Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2019)
En la publicacioacuten de Brophy y Voigt se revisan los principios baacutesicos para el
disentildeo de circuitos geneacuteticos para que los sistemas bioloacutegicos sean emulados
para cumplir con tareas o puedan fabricar materiales es importante considerar la
correcta eleccioacuten de reguladores asiacute como puntos de control que cuantifiquen el
impacto en el rendimiento (Brophy amp Voigt 2014)
222 Definicioacuten de los biosensores
Un sensor quiacutemico es un dispositivo que transforma en una informacioacuten quiacutemica
en una sentildeal analiacutetica de utilidad y puede detectar desde la concentracioacuten de una
muestra especiacutefica hasta el anaacutelisis total de sus compuestos Este tipo de
sensores contiene dos unidades funcionales baacutesicas un receptor y un transductor
El receptor transforma la informacioacuten quiacutemica de la muestra en una forma de
energiacutea que puede ser medido por un transductor El transductor transforma la
energiacutea en una sentildeal analiacutetica uacutetil (Hulanicki Glab amp Ingman 1991) De esta
manera comprendemos que un biosensor es ldquoun dispositivo que a traveacutes de
reacciones especiacuteficas de enzimas aisladas sistemas inmunes tejidos organelos
o ceacutelulas enteras sirve para detectar compuestosrdquo (IUPAC 1992)
Asiacute en los biosensores basados en ceacutelulas completas un analito de intereacutes
ingresa al interior celular y es reconocido por un factor transcripcional el cual
controla la transcripcioacuten de un gen mediante el reconocimiento de un promotor
especiacutefico Estos biosensores pueden reconocer diferentes analitos como
hidrocarburos metales pesados antibioacuteticos (Garnier-Rocha 2019) Incluso
algunos modelos biosensores se han aprovechado del fenoacutemeno de quorum
sensing para crear sistemas de comunicacioacuten sinteacuteticos con la capacidad de
controlar poblaciones (Balagaddeacute et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 10
23 Quorum Sensing Comunicacioacuten entre ceacutelulas
El concepto QS refiere a que es un mecanismo de comunicacioacuten entre
microorganismos que dependen de sentildeales quiacutemicas (moleacuteculas sentildealizadoras)
que son excretadas al medio extracelular y que dependen la densidad celular
(Fuqua Winans amp Greenberg 1994) Las bacterias similares a organismos de
diferentes dominios se sostienen de mecanismos de comunicacioacuten y se valen de
diferentes moleacuteculas Esta interaccioacuten puede ser intriacutenseca (es decir intracelular o
adentro de la misma ceacutelula) o extriacutenseca (es decir extracelular o afuera de la
ceacutelula) y crea un fenotipo de respuesta en una poblacioacuten especiacutefica del mismo
(Fuqua et al 1994)
Mientras los cultivos productores de QS esteacuten creciendo eacutestos pueden producir
excretar acumular y detectar moleacuteculas de sentildealizacioacuten quiacutemicas externas
conocidas como autoinductores los cuales son producidos a niveles basales pero
que se acumulan en el exterior celular Cuando la densidad celular de bacterias y
la concentracioacuten de moleacuteculas autoinductoras alcanzan un umbral de
concentracioacuten especiacutefico el cultivo experimenta un cambio en su fenotipo (Garg
Manchanda amp Kumar 2014 Rutherford amp Bassler 2012) Esta respuesta variacutea
seguacuten el tipo de sentildeal emitido ya que su forma y composicioacuten quiacutemica es diferente
seguacuten la especie que la produzca (Fuqua et al 1994) siendo las respuestas maacutes
comunes la formulacioacuten de esporulados factores de virulencia asociados a
invasioacuten bioluminiscencia virulencia yo la creacioacuten biopeliacuteculas (Miller amp Bassler
2002)
El fenoacutemeno de QS sucede tanto en bacterias productoras Gram negativas y las
Gram positivas pero las moleacuteculas auto inductoras son de diferente composicioacuten
quiacutemica En las bacterias Gram negativas las moleacuteculas de sentildealizacioacuten son
conocidas como homoserina lactonada aciladas (HSL) mientras que en bacterias
Gram positivas el mecanismo es a traveacutes de peacuteptidos excretados (Miller amp
Bassler 2002)
En el modelo general de QS en Gram positivos en primera instancia el gen que
contiene el precursor de la moleacutecula sentildealizadora (tambieacuten conocido como
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 11
autoinductor inmaduro) es transcrito y traducido y eacutesta es posteriormente
parcialmente hidrolizada para crear un autoinductor maduro Eacuteste uacuteltimo es
enviado al exterior celular por un transportador tipo ABC Cuando la concentracioacuten
del autoinductor maduro alcanza un umbral miacutenimo de activacioacuten una proteiacutena
tipo quinasa sensor de histidina localizada en el exterior celular detecta la
presencia de eacutesta mediante un sistema a dos componentes El sensor quinasa se
auto fosforila en un residuo conservado de histidina (H) Despueacutes este grupo
fosforilo es transferido a una proteiacutena reguladora de respuesta adyacente la cual
es fosforilada en un residuo conservado de aspartato (D) La proteiacutena reguladora
de respuesta fosforilado activa la transcripcioacuten de los genes de intereacutes (Miller amp
Bassler 2002)
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus
En S aureus estaacute gobernado por el operoacuten agr que es de un tamantildeo nucleotiacutedico
de 35 kb y se compone de dos unidades transcriptoacutemicas divergentes conocidos
como RNAII y RNAIII los cuales estaacuten gobernados por los promotores P2 y P3
respectivamente (Le amp Otto 2015) El promotor P2 estaacute involucrado en actividades
del QS mientras que el promotor P3 se encarga de la expresioacuten de factores de
virulencia (Miller amp Bassler 2002) como produccioacuten de hemolisinas proteasas
lipasas e indirectamente participan en la liberacioacuten de biopeliacuteculas (Quave amp
Horswill 2014) A nivel geneacutetico la induccioacuten del operoacuten agr depende
parcialmente por la unioacuten de los productos geacutenicos del operoacuten sar en los dos
promotores disponibles del operoacuten agr (Manna Bayer amp Cheung 1998)
El promotor P2 es el de importancia para el sistema QS debido a que el transcrito
resultante agrBDCA produce cuatro proteiacutenas AgrB AgrD AgrC y AgrA los
cuales son los componentes principales del sistema de QS de S aureus A
manera de resumen podemos en global que AgrC y AgrA participan como
elementos biosensores mientras que AgrB y AgrD son los elementos necesarios
para la biosiacutentesis de AIP El AgrD es un peacuteptido precursor a la moleacutecula
autoinductora (AIP por sus siglas en ingleacutes) y el AgrB funciona transportadora
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como proteasa y estaacute involucrada en la maduracioacuten del AIP (Gomes-Fernandes
et al 2017 Horswill Stoodley Stewart amp Parsek 2007)
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD
El gen que produce AgrD se expresa y se traduce en una versioacuten propeacuteptido de la
moleacutecula AIP que sufre de una modificacioacuten postraduccionalmente para que sea
bioloacutegicamente activo La moleacutecula AIP inmadura se compone de tres secciones
conocidas como regioacuten del peacuteptido liacuteder regioacuten madura del AIP y secuencia de
reconocimiento que corresponden a las regiones N- central y C-terminales
respectivamente (B Wang amp Muir 2016)
El AgrD es inicialmente procesado en la regioacuten N-terminal (se compone de 32
residuos) y sirve de guiacutea Eacuteste es translocado a la cara externa de la membrana
celular Mientras la regioacuten peptidasa de la proteiacutena transmembranal AgrB
reconoce la regioacuten N-terminal del AIP inmaduro
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA
AgrC y AgrA funcionan en conjunto con un sistema claacutesico de dos componentes
Donde la proteiacutena transmembranal tipo receptor con actividad histidina quinasa
AgrC se encarga de que detectar las moleacuteculas AIP liberadas al exterior por S
aureus una vez acoplado el AIP con el receptor eacuteste uacuteltimo causa una
autofosforilacioacuten del dominio citoplasmaacutetico del AgrC seguido de la transferencia
del grupo fosfato de la proteiacutena reguladora de respuesta de unioacuten al DNA AgrA
Una vez que AgrA es fosforilado (AgrA-P) eacuteste se une a la regioacuten intergeacutenica de
los promotores P2 y P3 del operoacuten agr (Gomes-Fernandes et al 2017)
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada
Bioquiacutemicamente el AgrD inmaduro tiene un tamantildeo entre 46 a 47 residuos seguacuten
su clase Despueacutes de procesamiento AgrD maduro tiene un tamantildeo final entre 7 a
8 aminoaacutecidos (que variacutea seguacuten la clase) y contiene un anillo tiolactonado
producto de la condensacioacuten entre un grupo tiol de una cisteiacutena interna ubicada
cuatro aminoaacutecidos antes del uacuteltimo aminoaacutecido y el grupo carboxilo del uacuteltimo
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aminoaacutecido (que puede ser metionina o fenilalanina dependiendo la clase) (B
Wang Zhao Novick amp Muir 2015)
En AgrC el dominio que contiene los elementos para deteccioacuten del receptor de la
moleacutecula AIP produce diferentes formas de propeacuteptidos De esta manera se
deduce que cada moleacutecula de AIP producida depende de su propia proteiacutena
detectora AgrC Por tanto la presencia en el medio de moleacuteculas de AIP que no
estaacuten filogeneacuteticamente relacionadas resultan en la inhibicioacuten de QS Es decir
miembros productores del mismo tipo de AIP pueden inducir el comportamiento
tiacutepico por QS pero si los productores no pertenecen al mismo grupo se puede
inhibir su respuesta Este fenoacutemeno es conocido como comunicacioacuten cruzada
(Rutherford amp Bassler 2012) La regioacuten hipervariable del operoacuten agr estaacute ubicado
en el transcrito gobernado por el promotor P2 entre los genes agrC agrD y agrB
Consensualmente se ha determinado cuatro grandes clases de AIP y permite
clasificar a los tipos de S aureus en base a esta regioacuten (Shopsin et al 2003)
24 Biosensores de ceacutelulas enteras basados en deteccioacuten de QS
A continuacioacuten presentamos una compilacioacuten de publicaciones de diferentes
ceacutelulas que fueron modificadas para actuar como biosensores capaces de detectar
moleacuteculas producidas por organismos productores de sentildeales quiacutemicas tipo QS
algunos de los ejemplos mencionados cuentan con la capacidad de producir yo
liberar sustancias antimicrobianas capaces de destruir al productor de esas
sentildeales
Balagaddeacute y otros disentildearon un sistema de comunicacioacuten sinteacutetico conocido como
depredador y presa en la que dos ceacutelulas modificadas de E coli son capaces de
comunicarse -y matar a una de ellas- a traveacutes del sistema de QS En este modelo
las ceacutelulas asignadas como depredadoras producen y liberar moleacuteculas tipo QS
que se difunden en el medio y al llegar a la ceacutelula presa por sus mecanismos
internos activan la produccioacuten una toxina especiacutefica para la ceacutelula asignada como
presa provocaacutendoles la muerte celular Por otro lado las ceacutelulas presas para
evitar su muerte temprana deben producir constantemente una proteiacutena antitoxina
que anule la actividad de la toxina (Balagaddeacute et al 2008)
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Saeidi y sus colaboradores crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basados en la
deteccioacuten del QS al modificar ceacutelulas de E coli para que detectaran moleacuteculas
3OC12 HSL producidas por P aeruginosa En este sistema las moleacuteculas QS son
difundidas a traveacutes del medio y son reconocidas por un factor de transcripcioacuten en
E coli que activa una unidad transcripcional para producir piocianina un
antibioacutetico especiacutefico con actividad contra P aeruginosa y porina E7 un agente
liacutetico especiacutefico contra E coli a medida que aumenta la concentracioacuten de la
moleacutecula QS incrementa la concentracioacuten del antibioacutetico y de la porina Cuando
se acumula suficiente cantidad de porinas en el interior celular las ceacutelulas de E
coli son lisadas y se libera piocianina para finalmente atacar a las ceacutelulas de P
aeruginosa (Saeidi et al 2011) Dos antildeos maacutes tarde Gupta y sus colaboradores
modificaron este biosensor agregando un moacutedulo de excrecioacuten que libera una
sustancia antimicrobiana al exterior a traveacutes de un peacuteptido sentildeal y atacar
especiacuteficamente a P aeruginosa evitando la muerte de la ceacutelula productora de
antibioacutetico (S Gupta Bram amp Weiss 2013)
Marchand y sus colegas crearon un sistema de comunicacioacuten interespeciacutefico para
la interaccioacuten entre dos bacterias con oriacutegenes evolutivos diferentes Bacillus
megaterium (Gram positiva) y E coli (Gram negativa) utilizando el mecanismo del
operoacuten agr de S aureus En este reporte ceacutelulas de E coli fungieron como
productoras de moleacuteculas de QS al expresar las proteiacutenas AgrD y AgrB que en
condiciones nativas producen moleacuteculas de AIP en S aureus Mientras que
ceacutelulas de B megaterium fungieron como biosensores al producir las proteiacutenas
AgrC y AgrA que en condiciones nativas sirven como un sistema a dos
componentes que detectan la presencia externa de la moleacutecula de AIP y activan a
un factor de transcripcioacuten (Marchand amp Collins 2013)
Zeng y sus colaboradores crearon un modelo biomatemaacutetico a partir de una E coli
que funcionara como un biosensor de moleacuteculas de AIP producidas por S aureus
que seriacutea contrarrestado por accioacuten de la lisostafina una bacteriocina de actividad
contra S aureus La simulacioacuten del modelo indicoacute que una ceacutelula de E coli podriacutea
tardar hasta 25 horas en detectar las primeras moleacuteculas de AIP producidas de S
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aureus al tiempo que generariacutea la suficiente concentracioacuten de bacteriocinas para
matar a ceacutelulas de S aureus (Zeng et al 2013)
Borrero y sus colegas crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basado en la
deteccioacuten de moleacuteculas de QS para poder contrarrestar moleacuteculas de QS
producidos por un patoacutegeno de intereacutes cliacutenico resistente a los antibioacuteticos En este
caso ceacutelulas modificadas de Lactobacillus lactis fueron capaces de detectar las
moleacuteculas producidas por Enterococcus faecalis El lactobacilo modificado mostroacute
alta efectividad de tres bacteriocinas producidas para controlar el crecimiento de
este patoacutegeno incluyendo sus variedades multirresistentes (Borrero Chen Dunny
amp Kaznessis 2015)
Holowko y sus colegas desarrollaron ceacutelulas de E coli capaces de sentir
moleacuteculas de QS producidas por Vibrio cholerae (Holowko Wang Jayaraman amp
Poh 2016) Mientras que Lubkowicz y sus colaboradores modificaron ceacutelulas de
Lactobacillus reuteri con la capacidad para detectar moleacuteculas de AIP clase I
producidas por S aureus en rangos de concentracioacuten desde la escala nanomolar
hasta micromolar (Lubkowicz et al 2018)
25 Las Bacteriocinas
En contexto a la anterior seccioacuten una fraccioacuten del total de biosensores de ceacutelulas
enteras disentildeados son capaces de producir y excretar sustancias antimicrobianas
que afecten el crecimiento de ceacutelulas productoras de moleacuteculas QS Para fines de
este trabajo nos referimos a las bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
que pertenece a un grupo de peacuteptidos con actividad antimicrobiana con origen
evolutivo en bacterias los cuales seraacuten descritos a continuacioacuten
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas
Las bacteriocinas son un grupo de peacuteptidos de bajo peso molecular que son
producidos exclusivamente y excretados por bacterias y que tienen la capacidad
de inhibir el crecimiento de otra bacteria Las bacteriocinas pueden ser producidas
in situ por bacterias probioacuteticas Al ser de origen proteico las bacteriocinas son
sujetos a modificaciones por Ingenieriacutea Geneacutetica (Cotter Ross amp Hill 2013) Las
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bacteriocinas usualmente actuacutean por permeabilizacioacuten por membrana causada por
su naturaleza catioacutenica al interactuar con la membrana Usualmente las
bacteriocinas son de caraacutecter hidrofoacutebico y anfipaacutetico Su estructura quiacutemica son
generalmente peacuteptidos acoplados con glicoproteiacutenas y lipoproteiacutenas Su punto
isoeleacutectrico estaacute habituado a 81 a 101 usualmente son termoestables y tiene un
rango de pH amplio entre 30 a 90 (Heredia-Castro Heacuternaacutendez-Mendoza
Gonzaacutelez-Coacuterdova amp Vallejo-Cordoba 2017) En la Naturaleza cuando las
bacterias comparten el mismo nicho ecoloacutegicos eacutestas deben luchar y defenderse
de otros y las bacteriocinas son uno de los mecanismos bioloacutegicos reconocidos
(Duffy Schouten amp Raaijmakers 2003)
La disponibilidad de datos en bacteriocinas en la Naturaleza es muy amplio ya que
se presume que un 99 del total de bacterias son productoras de al menos un tipo
de bacteriocina y muchos de ellos permanecen auacuten sin ser descubiertos
(Klaenhammer 1988) Hasta la fecha de acuerdo con datos de bases de datos
sobre bacteriocinas de calidad mundial (actualizado hasta la uacuteltima versioacuten 25 de
junio de 2021) indican que el University of Nebraska Medical Centerrsquos
Antimicrobial Peptide Database (ADP por sus siglas en ingleacutes)
(httpswangapd3commainphp) se mantienen registrados un total de 3257
peacuteptidos antimicrobianos de los seis reinos bioloacutegicos existentes de los cuales
181 son peacuteptidos con actividad anti-MRSA (G Wang Li amp Wang 2016) Aunque
Bactibase (httpbactibasehammamilaborgmainphp) es una base de datos de
bacteriocinas que no se ha actualizado desde 2017 sus datos siguen siendo muy
valiosos ya que nos ofrece una realidad en la ciencia de las bacteriocinas puesto
que la mayoriacutea de las bacteriocinas descubiertas han sido aisladas de bacterias
Gram positivas donde 206 pertenecen a este grupo y 19 a las cepas Gram
negativas El geacutenero maacutes reportado para las bacteriocinas de origen en Gram
positivas son los Lactobacillus seguido de Enterococcus Streptococcus
Lactococcus y el geacutenero Bacillus mientras que el geacutenero maacutes reportado para las
bacteriocinas de origen en Gram negativas es Escherichia El tamantildeo promedio de
las bacteriocinas es de 43 residuos (Hammami Zouhir Le Lay Ben Hamida amp
Fliss 2010)
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Un buen nuacutemero de bacteriocinas han sido previamente reportadas como agentes
terapeacuteuticos puesto que se han utilizado en dosis hasta cien veces superiores al
valor de concentracioacuten miacutenima inhibitoria reportado sin presentar efectos
citotoacutexicos en liacuteneas celulares eucarioacuteticas (Hols Ledesma-Garciacutea Gabant amp
Mignolet 2019) ni en tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Por
ejemplo la nisina la bacteriocina maacutes famosa en la industria y en el mundo ha
sido declarado por la Administracioacuten de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA por sus siglas en ingleacutes) como sustancia Generalmente Reconocida
como Segura (GRAS por sus siglas en ingleacutes) para su uso como conservador de
alimentos (Cotter Hill amp Ross 2005) Se sabe que la mayoriacutea de las bacteriocinas
han tenido un largo historial de seguridad (Silva Silva amp Ribeiro 2018) Sin
embargo a pesar de la gran disponibilidad de datos de ensayos en bacteriocinas
recientemente se ha manifestado la urgencia de incrementar y explorar su uso en
modelos in vivo para evaluar su eficacia como agentes antimicrobianos y evaluar
los posibles efectos secundarios los cuales son necesarios para asegurar su eacutexito
como candidatos potenciales a agentes terapeacuteuticos en su lucha contra
infecciones resistentes a los antibioacuteticos (Beniacutetez-Chao Leoacuten-Buitimea Lerma-
Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2021)
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos
Los peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos son sustancias de origen
bioloacutegico que cumplen con el mismo papel de defensa lo cierto es que existen
claras diferencias entre ellas que dependen de su origen composicioacuten quiacutemica
entre maacutes factores A continuacioacuten se ofrece una breve explicacioacuten entre los
diferentes tipos de sustancias antimicrobianas
Los Peacuteptidos Antimicrobianos (AMP antimicrobial peptides) tambieacuten conocidos
como peacuteptidos de autodefensa (HDP host defense peptide) son peacuteptidos
producidos por un hospedero y son parte del sistema inmune al conferirles
capacidades defensivas Son de un rango de tamantildeo entre 10 a 60 residuos en
promedio 3326 residuos que estaacuten compuestas mayoritariamente por α-heacutelices
con cargas positivas (catioacutenicas) o anfipaacuteticas (cargas hidrofoacutebicas e hidrofiacutelicas)
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tambieacuten existen referentes con carga anioacutenica Los AMP estaacuten clasificados seguacuten
su origen ya que estaacuten ubicuamente presentes en todos los reinos bioloacutegicos
como mamiacuteferos plantas microorganismos acuaacuteticos insectos yo anfibios
seguacuten su actividad ya que pueden ser antibacterianos antifuacutengicos
antiinflamatorios antivirales antiparasitarios yo anticanceriacutegenos seguacuten su
estructura como tipo lineal con estructurales secundarias con α-heacutelices y β-tiras
plegadas y por seguacuten por el tipo dominante de aminoaacutecidos como glicina arginina
prolina histidina y triptoacutefano (Huan Kong Mou amp Yi 2020 Lei et al 2019)
Si el AMP es de origen evolutivo bacteriano se les conoce como bacteriocinas Los
oriacutegenes pueden ser por bacterias Gram positivas como negativas incluyendo
miembros del dominio de las Archaea (Chikindas Weeks Drider Chistyakov amp
Dicks 2018) Sin embargo cuando el AMP es de origen eucarioacutetico existen tres
clasificaciones defensinas (Shafee Lay Hulett amp Anderson 2016) histatinas o
catelicidinas (De Smet amp Contreras 2005) Existen intermediarios evolutivos como
las bacteriocinas tipo defensina que son un grupo de bacteriocinas que comparte
los puentes de disulfuro en las mismas posiciones que podriacutean observarse en las
defensinas (Baindara et al 2016 Sugrue OrsquoConnor Hill Stanton amp Paul Ross
2020)
Tanto las bacteriocinas como los antibioacuteticos comparten funcionalidad bioloacutegica al
ser ambas sustancias que nulifican o matan a otras poblaciones pero existen
diferencias muy marcadas entre ellas puesto que las bacteriocinas son
sintetizadas como metabolitos primarios mientras que los antibioacuteticos son
secundarios El espectro de accioacuten de las bacteriocinas es mucho maacutes reducido
que los antibioacuteticos eacutestos uacuteltimos son muy amplios El grado de actividad es
mucho maacutes intenso entre bacteriocinas ya que su rango de accioacuten se encuentra
en el orden de los nano a micro molar mientras que los antibioacuteticos son rango de
accioacuten estaacute ranqueado entre los micro y milimolar Debido a su origen proteico las
bacteriocinas son altamente propensas a ser degradados por enzimas Sin
embargo las bacteriocinas son maacutes termodinaacutemicamente estables y con una
actividad maacutes amplia de pH que los antibioacuteticos Las bacteriocinas atacan
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generalmente la membrana extracelular generando poros mientras que los
antibioacuteticos pueden atacar la membrana tambieacuten yo atacar blancos intracelulares
Se conoce que las bacteriocinas presentan baja o nula toxicidad en comparacioacuten
con los antibioacuteticos (Perez Zendo amp Sonomoto 2014)
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes
En la actualidad diversos estudios enfocados en bacteriocinas se han enfocado
en su actividad contra cepas de S aureus resistentes a los antibioacuteticos Por
ejemplo la lisostafina fue utilizado el control de S aureus ATCC 29740 (Oldham amp
Daley 1991) mientras que la pentocina JL-1 ha sido efectivo para el control de S
aureus multirresistente (Jiang Zou Cheng Fang amp Huang 2017) La bacteriocina
entianina mostroacute actividad contra MRSA (ATCC 43300) (S W Fuchs et al 2011)
La epidermicina NI01 mostroacute actividad contra MRSA (Sandiford amp Upton 2012)
Asiacute tambieacuten como las enterocinas DD28 y DD93 con actividad anti estafilocoacutecica
contra ceacutelulas MRSA (Al Atya et al 2016)
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos
Las bacteriocinas son un grupo muy bien definido de peacuteptidos antimicrobianos que
tienen su origen evolutivo en bacterias y en algunas arqueobacterias Por sus
caracteriacutesticas proteicas las bacteriocinas son elementos geneacuteticos que pueden
ser faacutecilmente modificados por teacutecnicas de Ingenieriacutea geneacutetica (Cotter et al
2013) Las caracteriacutesticas generales de las bacteriocinas son que su espectro de
accioacuten es actuar tanto en las bacterias Gram positivas como negativas Su modo
de actividad por actividad bactericida o bacteriostaacutetico Su mecanismo de accioacuten
es por permeabilizacioacuten de membrana creando lisis celular Su estructura
bioquiacutemica es muy variada que pueden ser peacuteptidos glicoproteiacutenas y
lipoproteiacutenas Son de peso molecular variable sin embargo las bacteriocinas de
origen en Gram positivas son de tamantildeo pequentildeo Debido a su naturaleza
proteica las bacteriocinas son susceptibles al corte proteoliacutetico y altamente
estables a altas temperaturas (Heredia-Castro et al 2017)
Entre algunas de las bacteriocinas que se han utilizado para el control de
patoacutegenos resistentes estaacute la bacteriocina AS-48 la cual ha sido ampliamente
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utilizado contra cepas de referencia y cliacutenicos para Mycobacterium tuberculosis
(Aguilar-Peacuterez et al 2018) Otro ejemplo es la pentocina JL-1 ha demostrado
tener actividad contra diferentes cepas bacterianas (Jiang et al 2017) Entianina
ha mostrado actividad contra Enterococcus faecalis resistente a vancomicina
(ATCC 51299) (S W Fuchs et al 2011) Las klebcinas poseen actividad contra
especies resistentes y multirresistentes de cepas del geacutenero Klebsiella
(Denkovskienė et al 2019) La lista de bacteriocinas reportadas como efectivas
contra patoacutegenos resistentes de relevancia cliacutenica es muy larga y que puede ser
observada en la literatura correspondiente (Cui et al 2012 Gabrielsen Brede
Nes amp Diep 2014 Newstead Varjonen Nuttall amp Paterson 2020 Perez et al
2014)
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas
Las bacteriocinas pueden ser producidos tanto por microorganismos Gram
positivos como negativos inclusive por miembros del dominio Archaea (Chikindas
et al 2018)
Hasta el diacutea de hoy no hemos encontrado un oacutergano internacional que regule la
clasificacioacuten de las bacteriocinas maacutes que lo propuesto en grupos de investigacioacuten
ligados a la ciencia de las bacteriocinas Las bacteriocinas con origen evolutivo en
organismos Gram positivos estaacuten actualmente clasificados en cuatro grandes
clases la clase I corresponde a bacteriocinas modificadas postraduccionalmente
de muy bajo peso molecular (lt5 kDa) la clase II se refiere a bacteriocinas
termoestables no modificadas de bajo peso molecular (lt10 kDa) la clase III
contiene bacteriocinas termosensibles de alto peso molecular (gt10 kDa) y por
uacuteltimo la clase IV se compone de proteiacutenas acomplejadas con carbohidratos o
liacutepidos (Newstead et al 2020 Perez et al 2014)
Dada la diversidad de bacteriocinas para fines de este trabajo solo nos
enfocaremos en las bacteriocinas tipo II de las Gram positivas ya que se clasifican
en cuatro grandes subclases La clase IIa representa la familia de las
bacteriocinas con actividad antilisteria por su actividad especiacutefica contra cepas de
Listeria monocytogenes y ademaacutes porque se mantiene un dominio conservado
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YGNGV conocido como la caja de pediocina y que ubica en extremo N-terminal
Uno de los ejemplos maacutes reconocidos es la enterocina NKR-5-3C La clase IIb
representa a las bacteriocinas compuestas por dos peacuteptidos que en siacute son dos
peacuteptidos diferentes que actuacutean sineacutergicamente para atacar a un blanco como
lactococcin Q que se compone de los peacuteptidos lactococcina Qα y lactococcin Qβ
La clase IIc se relaciona con las bacteriocinas circularizadas que estaacuten unidas de
extremo a extremo como lactociclina Q y leucociclina Q La clase IId se compone
de bacteriocinas sin peacuteptido liacuteder y que se sintetizan sin una secuencia liacuteder en su
extremo N-terminal Algunos ejemplos son la weissllicina Y weissllicina M
leucocina Q leucocina N lacticina Z y lacticina Q (Perez et al 2014)
256 La bacteriocina Lacticina Q
La lacticina Q (LnqQ) es una bacteriocina que fue por vez descubierta por Fujita y
sus colaboradores en el 2007 Esta bacteriocina fue aislada por primera vez por
Lactococcus lactis QU5 una cepa Gram positiva que fue aislada de una muestra
de maiacutez fresco recolectado en campos agriacutecolas de la comunidad de Aso en
Kumamoto Japoacuten La composicioacuten bioquiacutemica de LnqQ es que se trata de peacuteptido
lineal compuesto por 53 residuos y con un peso molecular de 592050 Da (Fujita
et al 2007) La estructura tridimensional descubierta por Acedo y otros revela
que es una proteiacutena globular que se compone de cuatro α-heacutelices cuya superficie
es altamente catioacutenica y su nuacutecleo hidrofoacutebico Esta secuencia presenta una
carga neta +6 y su pI = 108 (Acedo et al 2016)
Esta bacteriocina ha mostrado ser un peacuteptido antimicrobiano con alta efectividad
contra bacterias Gram positivas siendo antagonista de uno los principales
patoacutegenos reportados en cliacutenicas como S aureus Por ejemplo se han registrado
diversos rangos de concentracioacuten miacutenima inhibitoria (MIC) de la LnqQ como 8 microM
contra S aureus ATCC 6538 y 32 microM contra S aureus ATCC 29213 (Acedo et al
2016) Tambieacuten se ha reportado 18 microM (Fujita et al 2007) o 10 microgml (Ma Yu
Han Wang amp Zhang 2012) contra S aureus ATCC 12600
Se conoce que la LnqQ genera alta permeabilidad en la membrana sin necesidad
de anclarse sobre moleacuteculas especiacuteficas como el Liacutepido II (Yoneyama Imura
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Ichimasa et al 2009) Posteriormente se determinoacute que el mecanismo de accioacuten
es a traveacutes de un modelo conocido como Poro Toroidal Enorme (HTP huge
toroidal pore) donde las estructuras α-heacutelices cargadas positivamente y presentes
en la LnqQ se unen covalentemente hacia la membrana celular que estaacute cargada
negativamente y entonces genera un poro en forma de toroide enorme de 46 a
66 nm de diaacutemetro generando una estructura conocida como lipid flip-flop lo que
permite el goteo de moleacuteculas intercelular de manera que la ceacutelula muere La
translocacioacuten del peacuteptido desde el exterior a la cara interna de la ceacutelula ocurre
sincroacutenicamente con la formacioacuten del poro toroidal (Yoneyama Imura Ohno
et al 2009) En un estudio a nivel in vitro se determinoacute que cuando LnqQ es
agregado a niveles MIC sobre cultivos bacterianos sensibles aumenta la
acumulacioacuten de radicales libres tipo hidroxilos y por consecuencia la ceacutelula muere
(Li et al 2013)
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados
Las bacteriocinas son sustancias toacutexicas que pueden atacar a su microorganismo
productor si eacuteste no cuenta con caracteriacutesticas que le permitan resistir (Ishibashi
et al 2014 Iwatani et al 2012 Ladjouzi Lucau-Danila Benachour amp Drider
2020 Mesa-Pereira et al 2017 Nascimento et al 2012) De manera que todos
los operones de las bacteriocinas se componen habitualmente de los siguientes
elementos geneacuteticos promotor gen estructural (bacteriocina) genes de
inmunidad genes de transporte una proteiacutena accesoria y un terminador de la
transcripcioacuten (Mesa-Pereira et al 2017)
La LnqQ no es ninguna excepcioacuten a la regla ya que similar a otras bacteriocinas
la produccioacuten secrecioacuten y autoinmunidad estaacute regulado por el cluacutester geneacutetico
lnqRQBCDEF que se encuentra en Lactococcus lactis QU5 y que descubierto por
Iwatani y otros en el 2012 (Iwatani et al 2012) Al diacutea de hoy auacuten no estaacute del todo
bien determinado la funcionalidad de los elementos que conforman el operoacuten pero
se sabe que el cluacutester lnqQBCDEF es esencial para la completa produccioacuten de
LnqQ mientras que los productos LnqEF son esenciales y los productos LnqBCD
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estaacuten parcialmente involucrados en la inmunidad y secrecioacuten de la bacteriocina
(Iwatani Horikiri Zendo Nakayama amp Sonomoto 2013)
26 Produccioacuten heteroacuteloga de bacteriocinas
Entre las virtudes observadas en las bacteriocinas estaacuten en que gozan de una
excelente reputacioacuten en seguridad bioloacutegica (Silva et al 2018) y de una gran
diversidad de bancos de datos sobre bacteriocinas (Hammami et al 2010 G
Wang et al 2016) Estos datos pueden apoyar para el disentildeo y construccioacuten de
bacteriocinas de novo (Fields et al 2020) Sin embargo a la fecha una cantidad
raquiacutetica de bacteriocinas han sido capaces de ser producidos en masa siendo la
nisina y la pediocina PA-1 las uacutenicas bacteriocinas en destacar industrialmente
Una de las hipoacutetesis que maacutes planteada supone que las bacteriocinas no han
destacado en el mercado porque eacutestas deben de producirse en altas cantidades y
con suficiente actividad bioloacutegica y en los organismos nativos este proceso se
considera que es un desgaste energeacutetico significativo ya que el rendimiento
productivo es usualmente bajo (Mesa-Pereira Rea Cotter Hill amp Ross 2018)
Desde la fundacioacuten de la Ingenieriacutea Geneacutetica las proteiacutenas han sido objeto de
muacuteltiples modificaciones para aumentar su produccioacuten y purificacioacuten utilizando
diversos sistemas bioloacutegicos productores desde sistemas procariotas como E coli
hasta sistemas eucariotas como ceacutelulas de levaduras o inclusive en liacuteneas
celulares eucariotas A pesar del avance actual que existen ya en estas teacutecnicas
la produccioacuten de proteiacutenas puede presentar incluso problemas de rutina en
laboratorios dedicados a este campo como la formacioacuten de cuerpos de inclusioacuten
toxicidad o baja produccioacuten de proteiacutenas (Bell Engleka Malik amp Strickler 2013)
En este trabajo nos hemos enfocado en la exploracioacuten de un peacuteptido sentildeal N-
AmyE y un peacuteptido de fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de la bacteriocina
LnqQ tanto en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica de ceacutelulas de E coli Nuestro
objetivo es que la aplicacioacuten de las etiquetas en la produccioacuten de la bacteriocina
permita la produccioacuten y purificacioacuten de LnqQ en ceacutelulas de E coli mientras
mantiene su funcionalidad bioloacutegica bactericida contra cultivos de S aureus En
este capiacutetulo presentaremos antecedentes relacionados al peacuteptido sentildeal N-AmyE
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y al peacuteptido de fusioacuten SmbP asiacute como los disentildeos bioinformaacuteticos utilizados para
la construccioacuten de las etiquetas con la bacteriocina se incluyen ensayos in silico
predictivos para estimar la estructura tridimensional de la bacteriocina con su
etiqueta asiacute como ensayos para estimar el corte
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE es un dominio proteico localizado en la regioacuten N-terminal
de la α-amilasa (AmyE) (Yang Galiii amp Henner 1983) Bioquiacutemicamente la AmyE
es una enzima (1 4-α-D-glucano-glucanohidrolasa EC 3211) cuya funcioacuten es
catalizar la hidroacutelisis de enlaces glicosiacutedicos (α-14) del almidoacuten para producir
glucosa y dextrinas (R Gupta Gigras Mohapatra Goswami amp Chauhan 2003)
La secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica de algunas AmyE fueron reportadas
desde hace varias deacutecadas Por ejemplo en 1983 Yang y sus colaboradores
reportaron la secuencia nucleotiacutedica del AmyE de la cepa Bacillus subtilis 1A289
(Yang et al 1983) Antildeos maacutes tarde en 1988 Emori y sus colegas tambieacuten
reportaron la secuencia nucleotiacutedica completa de la variante producida por la cepa
de B subtilis 2633 (Emori amp Maruo 1988)
La existencia del peacuteptido sentildeal N-AmyE de la α-amilasa fue propuesta por Yang y
sus colaboradores cuando develaron la secuencia nucleotiacutedica completa del
mismo argumentando que el presunto peacuteptido sentildeal debiacutea tener un tamantildeo de 32
aminoaacutecidos Tambieacuten observaron que AmyE podriacutea expresarse en ceacutelulas de
otras especies como E coli manteniendo su actividad bioloacutegica (Yang et al 1983)
La utilidad biotecnoloacutegica del peacuteptido sentildeal N-AmyE es porque se ha reportado
que es funcionalmente activo tanto en Bacillus subtilis como en E coli ya que al
fusionarse eacutesta con la regioacuten N-terminal de una proteiacutena de intereacutes biotecnoloacutegico
estaacute puede ser liberado al medio extracelular Por ejemplo al fusionar el peacuteptido
sentildeal N-AmyE con una β-lactamasa eacutesta es capaz de excretarse al medio
extracelular tanto en ceacutelulas de B subtilis como de E coli Sin embargo el sitio de
reconocimiento para el corte del peacuteptido sentildeal difiere entre ambos tipos de ceacutelulas
(Nakazawa Takano Sohma amp Yamane 1986) Un anaacutelisis multivariado de datos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 25
determinoacute que las secuencias nucleotiacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en su seccioacuten N-terminal tienden a ser excretados en el periplasma y en la
seccioacuten extracelular de E coli (Sjoumlstroumlm Wold Wieslander amp Rilfors 1987)
El mecanismo de corte hidroliacutetico por el que el peacuteptido sentildeal N-AmyE se separa de
la amilasa AmyE es debido a su estructura secundaria y a la presencia de un
dominio rico en alaninas (aminoaacutecido apolar) en el extremo C-terminal de del
peacuteptido N-AmyE Sin embargo el patroacuten de corte enzimaacutetico difiere seguacuten el tipo
organismo donde sea expresado ya que el sitio de corte oacuteptimo de este peacuteptido
se encuentra entre Ala33 y X34 cuando se expresa en B subtilis pero en E coli la
AmyE tiende a cortarse entre Ala31 y un aminoaacutecido cual sea (X) (Sakakibara
Tsutsumi Nakamura amp Yamane 1993)
En el 2005 el peacuteptido sentildeal N-AmyE reportado por Yang y otros fue acoplado en
la regioacuten N-terminal de una liasa de pectina para permitir su expresioacuten en ceacutelulas
de E coli (DE3) en la regioacuten periplaacutesmica Los resultados de ese estudio indicaron
que se logroacute la excrecioacuten efectiva de la liasa de pectina al medio extracelular
espacio periplaacutesmico citoplasma y a nivel membranal de E coli despueacutes de haber
sido inducido por con IPTG (R M Papi Chaitidou Trikka amp Kyriakidis 2005)
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP
La mayoriacutea de peacuteptidos de fusioacuten utilizados para la expresioacuten de proteiacutenas
recombinantes son el Dominio de Unioacuten a Celulosa (CBDcenA) Glutatioacuten-S-
Transferasa (GST) Proteiacutena de Unioacuten a Maltosa (MBP) tiorredoxina (TRX) y las
Proteiacutenas Modificadoras tipo Ubiquitina de Tamantildeo Pequentildeo (SUMO) (Mesa-
Pereira et al 2018) o la regioacuten citoplasmaacutetica del proteiacutena pequentildea de unioacuten a
metales SmbP (Vargas-Cortez Morones-Ramirez Balderas-Renteria amp Zarate
2016) a continuacioacuten ofrecemos maacutes informacioacuten relacionada al uacuteltimo peacuteptido de
fusioacuten
En el 2004 Barney y sus colaboradores describieron a la Proteiacutena Pequentildea de
Unioacuten a Metales en el periplasma de Nitrosomonas europaea Esta proteiacutena posee
un peso molecular de 99 kDa y presenta una inusual cantidad de residuos de
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 26
histidina (17) seguido de alanina (16) glutamato (14) glicina (11) y lisina
(9) los cuales componen el 67 de la composicioacuten total de residuos Esta
proteiacutena carece naturalmente de metionina y de cisteiacutenas Estructuralmente se
trata de una unidad monomeacuterica compuesta por 93 residuos cuya principal
caracteriacutestica es una regioacuten compuesta de 10 repeticiones secuenciales cada una
con motivo de siete aminoaacutecidos donde el cuarto residuo es una histidina
conservada estos motivos permiten la estabilizacioacuten de un nuacutecleo hidrofoacutebico
Como su nombre lo establece esta proteiacutena posee alta afinidad a metales
divalentes como Cu2+ Ni2+ Zn2+ y de otras valencias como Fe3+ (Barney LoBrutto
amp Francisco 2004) Esta proteiacutena ha sido utilizada para la expresioacuten periplaacutesmica
y posterior purificacioacuten de Hormona de Crecimiento Humano (hGH)
bioloacutegicamente activa (Perez-Perez et al 2020)
En 2015 el dominio periplaacutesmico de la SmbP que corresponde a la seccioacuten maacutes
proacutexima al extremo N-terminal en la estructura lineal del mismo fue removido por
Vargas y sus colaboradores manteniendo uacutenicamente el dominio citoplasmaacutetico
de la SmbP citoplasmaacutetica (SmbP) Eacutesta uacuteltima es uacutetil como etiqueta de afinidad
para teacutecnicas de cromatografiacutea de afinidad con iones metaacutelicos inmovilizados
(IMAC por sus siglas en ingleacutes) Esta proteiacutena fue reportada como efectiva para la
expresioacuten citoplaacutesmica de proteiacutenas en E coli como RFP GFP SHY2 NDPK2 y
LovR (Vargas-Cortez et al 2016)
Recientemente la SmbP fue utilizada por primera vez para la produccioacuten del
peacuteptido antimicrobiano Bin1b utilizando E coli como hospedero para la
sobreproduccioacuten El peacuteptido fue sobre producido y purificado mostrando actividad
antimicrobiana contra E coli y S aureus (Montfort-Gardeazabal Balderas-
Renteria Casillas-Vega amp Zarate 2021)
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS
31 Justificacioacuten
La idea de disentildear y utilizar un biosensor de ceacutelula para controlar cultivos de
MRSA es porque las moleacuteculas sentildealizadoras del QS se han reportado como
estiacutemulos quiacutemicos para ser reconocidos como ceacutelulas enteras vivas modificadas
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para su reconocimiento Ademaacutes de que ya se han reportado diversos biosensores
completos de ceacutelulas que pueden producir y excretar bacteriocinas capaces de
matar a microorganismos multirresistentes productores de sentildeales QS
La decisioacuten de inclinarnos hacia las bacteriocinas como patoacutegenos es porque
atacan un espectro limitado de bacterias dentro de una comunidad microbioloacutegica
y no ocurre de manera simultaacutenea en un espectro amplio como ocurre
habitualmente con los antibioacuteticos lo que promueve una mayor probabilidad de
seleccioacuten de mutantes que puedan conferir resistencia Ademaacutes las bacteriocinas
estaacuten constantemente evolucionando y permiten a sus productores combatir
contra patoacutegenos de resistencia emergentes (Riley et al 2012)
Las bacteriocinas han mostrado ademaacutes ser potenciales agentes terapeacuteuticos ya
que no afectan tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Incluso las
bacteriocinas se han administrado en concentraciones tan altas como 100 veces
superiores al MIC originalmente reportado con nulos efectos citotoacutexicos en liacuteneas
celulares eucarioacuteticas (Hols et al 2019) Ademaacutes la mayoriacutea de los productores
nativos en bacteriocinas poseen un excelente historial en seguridad (Silva et al
2018)
La propuesta de etiquetar bacteriocinas con un peacuteptido sentildeal es porque durante el
proceso de recuperacioacuten previo a la purificacioacuten es comuacuten encontrar una baja
cantidad de proteiacutenas y ademaacutes proteasas que disminuyen el rendimiento
productivo Con el peacuteptido sentildeal la purificacioacuten de las proteiacutenas se simplifica
porque son faacutecilmente recuperadas de la fraccioacuten periplaacutesmica seguido un choque
osmoacutetico sin la necesidad de lisar toda la ceacutelula (Ramanan et al 2010) mientras
que la decisioacuten de antildeadir peacuteptidos de fusioacuten en los disentildeos geneacuteticos es porque se
trata de etiquetas que se colocan en la regioacuten N-terminal o C-terminal de una
proteiacutena con intereacutes biotecnoloacutegico Estos peacuteptidos representan un meacutetodo
recurrente en la sobreexpresioacuten de bacteriocinas porque ayudan en la purificacioacuten
aumentan la expresioacuten proteica mejoran la solubilidad permiten que la proteiacutena
sea producida en un estado similar al nativo incrementan el rendimiento de
produccioacuten y disminuyen su degradacioacuten (Mesa-Pereira et al 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 28
32 Hipoacutetesis
El disentildeo de un biosensor construido a base de ceacutelulas enteras E coli modificadas
pronostica indica que funcionaraacute como alarma bioloacutegica al detectar moleacuteculas de
QS de S aureus En consecuencia liberaraacute un compuesto antimicrobiano con
actividad especiacutefica contra el organismo blanco El peacuteptido antimicrobiano seraacute
validado experimentalmente a traveacutes del peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de
fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de LnqQ en E coli que seraacute producido
en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica respectivamente
33 Objetivo General
Presentar el disentildeo in silico de un mecanismo biosensor basado en el sistema de
quorum sensing de S aureus para producir Lacticina Q y producir
experimentalmente este peacuteptido antimicrobiano tanto en la regioacuten periplaacutesmica
como citoplaacutesmica de E coli
34 Objetivos Especiacuteficos
1 Disentildear el moacutedulo geneacutetico biosensor para detectar la presencia externa de
moleacuteculas autoinductoras (AIP) producidos por MRSA
2 Disentildear el moacutedulo geneacutetico de bacteriocinas para liberar lacticina Q (LnqQ)
en funcioacuten a la concentracioacuten externa de moleacuteculas AIP producidos por
MRSA
3 Disentildear un vector de expresioacuten que contenga ambos moacutedulos geneacuteticos
tanto biosensor como de bacteriocinas
4 Predecir la especificidad teoacuterica del biosensor completo de ceacutelulas enteras
entre diferentes sentildeales de QS
5 Predecir la solubilidad y localizacioacuten subcelular de cada una de las
proteiacutenas utilizadas para el disentildeo del moacutedulo biosensor y el moacutedulo de
bacteriocina
6 Predecir la existencia de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B y nivel de alergenicidad
en la LnqQ producida en E coli
7 Disentildear el vector de expresioacuten pETNL que contenga el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en conjunto con el LnqQ acoplado con una etiqueta de polihistidina
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8 Disentildear el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ que contenga el peacuteptido de
fusioacuten SmbP en conjunto con el LnqQ
9 Construir los vectores de expresioacuten pETNL y pSmbP-LnqQ y transformar
ceacutelulas de E coli
10 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten periplaacutesmica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pETNL
11 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten citoplasmaacutetica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ
35 Metas
En un periacuteodo a tres antildeos nos propusimos alcanzar las siguientes metas
bull Disentildear in silico un sistema biosensor en E coli capaz de sentir moleacuteculas
de Quorum Sensing producidas por S aureus y producir una sustancia
antimicrobiana en funcioacuten a la concentracioacuten externa de las moleacuteculas QS
bull Predecir la capacidad del peacuteptido sentildeal N-AmyE y del peacuteptido de fusioacuten
SmbP para producir bacteriocinas en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica
de E coli respectivamente
bull Presentar los resultados obtenidos en al menos un artiacuteculo de investigacioacuten
con arbitraje internacional
bull Cumplir con eacutexito el examen predoctoral
bull Obtener el grado de Doctor en Ciencias con Orientacioacuten en Microbiologiacutea
36 Aportacioacuten cientiacutefica
Nuestra aportacioacuten consiste en presentar el disentildeo y el trabajo teoacuterico necesario
para la construccioacuten de un biosensor de ceacutelulas enteras basado en quorum
sensing capaz de producir bacteriocinas en funcioacuten a la concentracioacuten disponible
de moleacuteculas tipo QS evitando asiacute la sobreproduccioacuten yo goteo de bacteriocinas
que pueden contribuir a la resistencia en patoacutegenos Asiacute tambieacuten experimentamos
en peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP para validarlos como una
herramienta bioloacutegica para la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas en ceacutelulas
modificadas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 30
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
La idea de disentildear un biosensor basado en ceacutelulas enteras surge al yuxtaponer
dos enfoques usados para tratar enfermedades resistentes a los antibioacuteticos que
es mediante el uso de organismos bioloacutegicamente activos con bacteriocinas (Allen
et al 2014)
En este sentido tenemos dos ceacutelulas independientes que son reconocidas como α
y β respectivamente (Figura 1) las ceacutelulas α que corresponden a un productor
de sentildeales tipo QS liberan moleacuteculas de sentildealizacioacuten al medio externo mientras
que las ceacutelulas β que corresponden al biosensor son emulados para detectar
moleacuteculas de QS de las ceacutelulas α En respuesta a esta deteccioacuten los mecanismos
internos de las ceacutelulas β producen y excretan una toxina especiacutefica contra las
ceacutelulas α y asiacute controlar su crecimiento poblacional
Figura 1 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
Ceacutelulas β fungen como sistema de deteccioacuten y destruccioacuten al reconocer moleacuteculas de reconocimiento tipo QS
producidos por ceacutelulas α y causar su muerte
42 Cepas bacterianas
Nosotros designamos a E coli (BL21) DE3 como chasis bioloacutegico porque ha sido
ampliamente reconocido para la sobreproduccioacuten de bacteriocinas recombinantes
(Mesa-Pereira et al 2018) Para el disentildeo del moacutedulo biosensor optamos por
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 31
utilizar los datos anotados del genoma de la cepa S aureus N315 una cepa
reconocida como MRSA y que ha sido reportado como unas de las principales
causas de infecciones resistentes a meticilina asociado a comunidad (CA-MRSA)
y a hospitales (HA-MRSA) (Kuroda et al 2001) Para el disentildeo del moacutedulo de
bacteriocina utilizamos los datos bioinformaacuteticos del cluacutester de genes lnqQBCDEF
de L lactis QU5 que permiten la produccioacuten y excrecioacuten la LnqQ asiacute como para su
autoinmunidad (Fujita et al 2007 Iwatani et al 2012) Abajo se presentan los
disentildeos de ambos moacutedulos asiacute como la estrategia general para su ensamblado en
un vector de expresioacuten
La cepa de E coli BL21 (DE3) fue seleccionada para ensayos de expresioacuten
proteica con el peacuteptido sentildeal N-AmyE o con el peacuteptido de fusioacuten SmbP La cepa E
coli DH5 fue utilizada para ensayos de clonacioacuten La cepa E coli Origami fue
escogida para produccioacuten de proteiacutenas problemaacuteticas
Un cultivo de E coli BL21 (DE3) fue amablemente donado por el Instituto
Tecnoloacutegico de Monterrey (Monterrey Nuevo Leoacuten) La cepa de E coli DH5α fue
recuperada de un stock de cultivos de nuestro laboratorio en el CIBYN (Apodaca
Nuevo Leoacuten) La cepa E coli Origami fue compartida por el Dr Xristo Zaacuterate de la
UANL (Monterrey Nuevo Leoacuten) Todas las cepas fueron mantenidas y crecidas en
caldo LB o suplementado con agar (2) a 37degC en condiciones aeroacutebicas
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina
Tanto los moacutedulos biosensor como el de bacteriocina fueron disentildeados de la
siguiente manera contienen un promotor un sitio de unioacuten al ribosoma gen
estructural y un terminador doble de transcripcioacuten Los disentildeos fueron elaborados
bajo la herramienta bioinformaacutetica SnapGene 113 en el formato correspondiente
Todos los datos bioinformaacuteticos utilizados para ambos disentildeos fueron recuperados
de alguna de las siguientes bases de datos Massachussets Institute of
Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts (SBP) (httppartsigemorg)
(Galdzicki Rodriguez Chandran Sauro amp Gennari 2011) Kyoto Encyclopedia
Genes and Genomes (KEGG) (httpswwwgenomejpkegg) (Kanehisa amp Goto
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2000) FP Base (FPB) (httpswwwfpbaseorg) (Lambert 2019) y GenBank
(httpswwwncbinlmnihgovgenbank) (Clark Karsch-Mizrachi Lipman Ostell amp
Sayers 2016) y Protein Data Bank (PDB) (httpswwwrcsborg) (Berman et al
2000)
Para el disentildeo del moacutedulo biosensor usamos los datos del promotor constitutivo
de E coli J23110 (SBP no BBa_J23110) como regulador transcripcional de los
genes del operoacuten agrC y agrA Nosotros utilizamos la secuencia nucleotiacutedica y
aminoaciacutedica del agrC (KEGG no SA1843) que se compone de 1116 nucleoacutetidos
y 371 residuos respectivamente y tambieacuten de la informacioacuten disponible para la
agrA (KEGG no SA1844) que se compone de 717 nucleoacutetidos y 238 residuos Los
sitios de unioacuten a ribosoma (SBP no BBa_B0034) fueron colocados entre cada gen
estructural y al final de la unidad transcriptoacutemica se colocoacute un doble terminador de
transcripcioacuten (SBP no BBa_B0015) tanto el moacutedulo biosensor como en moacutedulo
de bacteriocina
Para el disentildeo del moacutedulo de bacteriocina utilizamos los datos del promotor
inducible P2 del MRSA para regular la expresioacuten del cluacutester geneacutetico lnqQBCDEF
y el gen reportero gfp Debido a que la secuencia del promotor P2 no se
encontraba disponible de manera que primero tuvimos que localizar la regioacuten en
el archivo genoacutemico de la MRSA (GenBank no BA0000183) los resultados de
este punto seraacuten explicados maacutes a fondo en la seccioacuten correspondiente
Para la seccioacuten estructural del moacutedulo de bacteriocina buscamos el archivo
bioinformaacutetico que contuviera los genes estructurales secrecioacuten y de auto
inmunidad del cluacutester lnqQBCDEF (GenBank no AB7123931) El archivo original
fue manipulado para seccionar los elementos geneacuteticos que pertenecen al cluacutester
esta informacioacuten seraacute explicada con maacutes detalle
Por uacuteltimo usamos la secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica del gen monomeacuterico
gfp (FPBase no QKFJN) como reportero de Aequorea victoria (Zacharias Violin
Newton amp Tsien 2002) Esta proteiacutena es monomeacuterica posee un peso molecular
en 270 kDa El valor maacuteximo de excitacioacuten es λ = 488 nm mientras que el valor
maacuteximo de emisioacuten es λ = 507 nm El coeficiente de extincioacuten es 56000 M-1cm-1
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 33
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
El plaacutesmido de AddGene (httpswwwaddgeneorg) (AddGene no 116850) fue
utilizado para la construccioacuten in silico de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
dentro de un plaacutesmido al cual nos referiremos a partir de ahora como plaacutesmido
Dual Biosensor Killer (DBK) Este plaacutesmido fue disentildeado en la aplicacioacuten
SnapGene versioacuten 113
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas
Para la optimizacioacuten de los codones de todas las secuencias nucleotiacutedicas se
utilizoacute la herramienta bioinformaacutetica GenSmart Codon Optimization Tool
(httpswwwgenscriptcomtoolsgensmart-codon-optimization) versioacuten Beta 10
Las secuencias nucleotiacutedicas yo aminoaciacutedicas recolectadas para el disentildeo de los
moacutedulos geneacuteticos funcionaron como datos de entrada La aplicacioacuten fue
configurada para ldquoEscherichia colirdquo como organismo para expresioacuten de proteiacutenas
Es importante mencionar que solicitamos la exclusioacuten de sitios de restriccioacuten
habitualmente localizados en la regioacuten muacuteltiple de clonacioacuten del vector de
expresioacuten pET30a(+) como BamHI (GGATCC) BglII (AGATCT) ClaI (ATCGAT)
EcoRI (GAATTC) HindIII (AAGCTT) KpnI (GGTACC) NcoI (CCATGG) NdeI
(CATATG) NheI (GCTAGC) NotI (GCGGCCGC) PstI (CTGCAG) SacI (GAGCTC) SacII
(CCGCGG) SalI (GTCGAC) SmaI (CCCGGG) SpeI (ACTAGT) SphI (GCATGC) XbaI
(TCTAGA) XhoI (CTCGAG) XmaI (CCCGGG)
Una vez optimizadas usamos CAI Tool (httpgenomesurvesCAIcal) para el
Caacutelculo del Iacutendice de Adaptacioacuten (CAI por sus siglas en ingleacutes) para determinar el
iacutendice de adaptacioacuten de las secuencias nucleotiacutedicas antes y despueacutes de la
optimizacioacuten Esta herramienta utiliza la secuencia nucleotiacutedica y el uso de
codones tanto del organismo nativo como el organismo productor heteroacutelogo (u
organismo recipiente) como entradas para la optimizacioacuten De acuerdo a los
autores el iacutendice tiene un rango de respuesta que oscila entre 0 hasta 1 donde el
valor correspondiente 1 indica si la secuencia de entrada usa los codones maacutes
frecuentemente utilizados por el organismo recipiente (Puigbograve Bravo amp Garcia-
Vallve 2008) Para esta aplicacioacuten los iacutendices de uso de codones de cada
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organismo los datos de entrada deben ser descargados y posteriormente deben
ingresarse manualmente Todos los iacutendices fueron descargados de la base de
datos Codon Usage Database (httpswwwkazusaorjpcodon) y se descargaron
para los organismos E coli B (CUD no 413997) S aureus N315 (CUD
no158879) L lactis subsp cremoris (CUD no 1359) and A victoria (CUD no
6100)
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Se realizoacute un alineamiento local entre pares probando de manera independiente
cada una las cuatro clases maacutes comunes de AgrD contra la secuencia
aminoaciacutedica del AgrD del MRSA seleccionada para determinar la especificidad
del biosensor y en consecuencia la existencia de un comportamiento de
comunicacioacuten cruzada El alineamiento se realizoacute en la aplicacioacuten EMBOSS Water
(httpswwwebiacukToolspsaemboss_water) (Madeira et al 2019) Las
secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro clases maacutes representativas de AgrD
fueron descargadas de los datos publicados por Wang y otros (B Wang amp Muir
2016) mientras que la secuencia de AgrD de la cepa MRSA que seleccionamos
fue recuperada de una base de datos (KEGG no SAS066)
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
La solubilidad de las proteiacutenas seleccionadas para su expresioacuten en E coli fue
predicha por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk)
(Hebditch Carballo-Amador Charonis Curtis amp Warwicker 2017) La precisioacuten
general de la herramienta fue estimada en 706 De acuerdo con los autores
cualquier valor de solubilidad superior a 045 se considera que es soluble De esta
manera cualquier proteiacutena con valor inferior a 045 se infiere que no son solubles
Es importante mencionar que esta herramienta no es uacutetil para determinar el iacutendice
de solubilidad en proteiacutenas membranales
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
La herramienta bioinformaacutetica BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo
Martelli Fariselli Profiti amp Casadio 2018) predice la localizacioacuten subcelular de
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una proteiacutena en E coli Esta aplicacioacuten nos permite distinguir entre proteiacutenas
globulares de proteiacutenas membranales Para fines de nuestro proyecto nosotros
configuramos a la aplicacioacuten para identificar ldquoProkarya ndash Gram negativerdquo debido a
que eacuteste es el origen taxonoacutemico de nuestro organismo productor heteroacutelogo
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
410 Prediccioacuten de alergenicidad
La alergenicidad de la LnqQ fue evaluada en la herramienta bioinformaacutetica
AllerCatPro versioacuten 17 (httpsallercatprobiia-staredusg) la cual permite
predecir si el componente es capaz de crear una respuesta aleacutergica tipo I mediada
a la inmunoglobulina tipo E (IgE) basada en el anaacutelisis estructural lineal y
tridimensional de la proteiacutena (Maurer-Stroh et al 2019)
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
4111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica de la amilasa AmyE fue
descargado del cataacutelogo de GenBank (GenBank no V001011) El peacuteptido sentildeal
de este archivo fue manualmente extraiacutedo con la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 113 siguiendo las recomendaciones de la publicacioacuten de Papi y sus
colaboradores (R M Papi et al 2005)
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4112 Disentildeo y acoplamiento del peacuteptido sentildeal N-AmyE con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo nucleotiacutedico de la LnqQ (GenBank no AB2352011) El
acoplamiento fue manualmente resuelto utilizando la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 110 agregando sitios de restriccioacuten y algunos nucleoacutetidos tomando
en cuenta las recomendaciones de AddGene de dejar un espacio para asistir en la
clonacioacuten molecular por PCR (httpswwwaddgeneorgprotocolspcr-cloning)
Dos vectores de expresioacuten basados en pET-30a(+) fueron disentildeados in silico
donde uno de los vectores contiene exclusivamente el peacuteptido sentildeal N-AmyE y en
el siguiente estaacute el N-AmyE acoplado con la LnqQ
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pETNL fue
elaborado en SnapGene 113 y guardado en formato dna y enviado a BioBasic
Inc (Canadaacute) a traveacutes del tercero autorizado Productos y Equipos
Biotecnoloacutegicos SA de CV (Probiotek Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
4113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido sentildeal N-AmyE del
conjunto LnqQ con etiqueta de polihistidina fue evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea
SignalP 50 (httpwwwcbsdtudkservicesSignalP) el cual es un servidor que
determina la presencia de peacuteptidos sentildeales y la localizacioacuten de sus sitios de corte
proteoliacutetico en proteiacutenas de origen en Archaea bacterias Gram positivas y
negativas y organismos eucarioacuteticos (Armenteros et al 2019)
Esta herramienta puede distinguir entre tres tipos de peacuteptidos sentildeales tiacutepicos El
primer mecanismo es a traveacutes la viacutea Sec tipo I (SPI) que es conocido como el
mecanismo estaacutendar de excrecioacuten donde los peacuteptidos sentildeales son transportados
por el translocoacuten Sec y son escindidos por accioacuten de la Peptidasa de Sentildeal tipo I
(Lep) El segundo mecanismo corresponde a la viacutea Sec tipo II (SPII) donde los
peacuteptidos sentildeales lipoproteiacutecos son transportados por el translocoacuten Sec y cortados
mediante la Peptidasa de Sentildeal tipo II (Lsp) El uacuteltimo mecanismo corresponde a
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la viacutea Tat donde los peacuteptidos sentildeales son transportados por el translocoacuten Tat tipo
y son escindidos por la Peptidasa de Sentildeal tipo I (Lep) (Armenteros et al 2019)
En la aplicacioacuten se puede elegir entre cuatro grupos de organismos para el
anaacutelisis de corte predictivo los cuales corresponden a organismos eucarioacuteticos
organismos Gram positivos organismos Gram negativos y en tipo Archaea Para
fines de nuestro proyecto dado que esta construccioacuten fue intencionada para ser
producida en ceacutelulas de E coli se eligioacute la opcioacuten para organismos Gram
negativos
Para comparar la probabilidad de corte enzimaacutetico de nuestra construccioacuten in silico
de N-AmyELnqQ6xHis se descargoacute los datos bioinformaacuteticos de seis secuencias
aminoaciacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y cuyo corte proteoliacutetico fue
demostrado experimentalmente
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
4121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica del peacuteptido de fusioacuten SmbP fue
amablemente cedido por el Dr Xristo Zaacuterate de la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten La secuencia nucleotiacutedica del SmbP estaacute contenida en un vector de
expresioacuten tipo pET30a(+) y guardado en formato dna
4122 Disentildeo y acoplamiento de peacuteptido de fusioacuten SmbP con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido de fusioacuten con la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo geneacutetico desde la base de datos biotecnoloacutegicos Este
acoplamiento fue manualmente resulto a traveacutes de SnapGene
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pSmbP-
LnqQ fueron elaborado en SnapGene 113 guardados en formato dna y enviado
a Gene Universal Inc (Estados Unidos) a traveacutes del tercero autorizado
Distribuidora Bakterlab SA de CV (Bakterlab Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 38
4123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP del
conjunto LnqQ evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea PeptideCutter
(httpswebexpasyorgpeptide_cutter) la cual predice sitios potenciales para ser
cortados por proteasas o por sustancias quiacutemicas en una secuencia de proteiacutena
determinada (Gasteiger et al 2005) Esta aplicacioacuten contiene una lista extensa de
reacciones enzimaacuteticas y quiacutemicas Para fines de nuestro proyecto se eligioacute la
opcioacuten de ldquoEnterokinaserdquo ya que nuestra construccioacuten contiene este dominio
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Para descartar que la existencia de alguacuten codoacuten de paro no observado durante la
fase de post disentildeo optamos por analizar la secuencia nucleotiacutedica de la regioacuten
de intereacutes de pETNL y pSmbP-LnqQ en la aplicacioacuten en liacutenea ORF Finder
(httpswwwncbinlmnihgovorffinder) la cual es una aplicacioacuten que encuentra
marcos de lectura abiertos en una secuencia de nucleoacutetidos Los paraacutemetros
seleccionados correspondieron a ldquoATGrdquo exclusivamente como codoacuten de inicio y
como coacutedigo geneacutetico se utilizoacute la opcioacuten 1 correspondiente a ldquoStandardrdquo Esta
aplicacioacuten realiza una traduccioacuten de la secuencia nucleotiacutedica a partir de la
traduccioacuten de seis marcos de lectura y devuelve un graacutefico que indica la ubicacioacuten
donde se encuentra cada marco de lectura identificado (Wheeler et al 2003)
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
El peso molecular estimado de los productos de los vectores pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron estimado a traveacutes de la aplicacioacuten Compute pIMW de ExPasy
(httpswebexpasyorgcompute_pi) la cual permite estimar el punto isoeleacutectrico
(pI) teoacuterico y el peso molecular (MW) teoacuterico a partir de secuencias reportadas o
secuencias de aminoaacutecidos ingresados por el usuario (Gasteiger et al 2005)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 39
415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
La solubilidad de los productos de los pETNL y pSmbP-LnqQ fueron analizados
por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk) (Hebditch et al
2017) mientras que la localizacioacuten subcelular de las proteiacutenas fue determinada por
la herramienta BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo et al 2018)
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
Phyre2 (httpwwwsbgbioicacukphyre2htmlpagecgiid=index) es una
aplicacioacuten en liacutenea para el anaacutelisis de modelado para estructuras secundarias y
tridimensionales Esta herramienta permite predecir y analizar la estructura de la
proteiacutena asiacute como funciones y mutaciones haciendo maacutes faacutecil la interfaz al usuario
para interpretar la estructura secundaria y terciaria de los modelos asiacute como la
composicioacuten de dominios y la calidad del modelo (Kelley Mezulis Yates Wass amp
Sternberg 2015)
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
4171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Para transformar las ceacutelulas de E coli con el vector de expresioacuten pET30a(+)
pETNL o pSmbP-LnqQ se utilizoacute la teacutecnica de electroporacioacuten (Potter amp Heller
2003) que consiste en la introduccioacuten de DNA exoacutegeno al interior de las ceacutelulas
por meacutetodos fiacutesico-quiacutemicos A continuacioacuten describimos la teacutecnica
Se preparoacute un cultivo overnight de E coli en un tubo con caldo LB esteacuteril y se
incuboacute por 37degC en agitacioacuten constante por 18 h Al diacutea siguiente 20 microl del cultivo
preinoacuteculo fueron retirados y depositados en un microtubo con 1 ml de caldo LB
esteacuteril este proceso se realizoacute en seis tubos donde tres son etiquetados ldquoMuestrardquo
(M) ldquoAntibioacuteticordquo (A) ldquoViabilidadrdquo (V) y tres maacutes fueron reservados para anaacutelisis
espectrofotomeacutetricos Se incubaron todos los tubos a 37degC durante
aproximadamente 15 h (OD600 entre 04-06) en agitacioacuten constante Todos los
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 40
tubos asignados para anaacutelisis espectrofotomeacutetricos fueron usados para monitoreo
Una vez alcanzado el tiempo establecido los tubos M A y V fueron centrifugados
a 9000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente El sobrenadante de los tubos
fue descartado y las ceacutelulas fueron resuspendidas en 1 ml de agua ultrapura
esteacuteril a temperatura ambiente Los tubos fueron centrifugados a 9000 rpm
durante 2 min a temperatura ambiente Este paso se repitioacute una vez El precipitado
celular en los tubos M A y V fue resuspendido en 35 microl de agua ultrapura esteacuteril y
se agregoacute al menos 2 a 3 microl de plaacutesmido (asymp 500 microg totales) o de agua seguacuten el
caso Finalmente se mezcloacute cuidadosamente con la micropipeta
En el tubo de viabilidad no se agregoacute plaacutesmido y fue sembrado en una placa LB
En el tubo etiquetado como antibioacutetico no se agregoacute plaacutesmido y el precipitado fue
sembrado en una placa de LB suplementado con kanamicina (50 microgml) Al tubo
de control positivo se agregoacute un plaacutesmido resistente a la kanamicina y eacutesta fue
sometida a electroporacioacuten y sembrada en una placa con LB con kanamicina En
la muestra se agregoacute alguno de los siguientes plaacutesmidos pET30a(+) pETNL o
pSmbP-LnqQ y posteriormente fue sometido a electroporacioacuten y sembrado en una
placa de LB con kanamicina
El volumen total de los tubos fue transferido a una celda de electroporacioacuten en el
espacio de 2 mm El equipo de electroporacioacuten (previamente irradiado con luz UV
por 15 min) fue encendido y configurado para electroporar a 2500 V
Posteriormente se agregoacute 1 ml de caldo LB esteacuteril a la celda de electroporacioacuten y
cuidadosamente mezclado (para evitar estresar a la ceacutelula) La mezcla es tomada
con mucho cuidado desde la celda y transferido a un tubo de 15 ml esteacuteril El tubo
fue incubado a 37degC por 1 h en agitacioacuten muy baja Cumplido el tiempo
establecido el tubo fue centrifugado a 9000 rpm durante 2 min Se retiroacute la mayor
parte del sobrenadante (asymp 950 ml) y el restante fue mezclado suavemente con el
precipitado celular hasta suspender la solucioacuten El volumen total resuspendido fue
sembrado en placas de LB agar o LB agar suplementado con kanamicina (50
microgml) dependiendo el caso Las placas fueron incubadas a 37degC en condiciones
de aerobiosis durante 16 h Al terminar las placas fueron revisadas y
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 41
seleccionadas Las ceacutelulas efectivamente transformadas con los plaacutesmidos fueron
resistentes a la accioacuten de la kanamicina mientras que las no transformadas fueron
eliminadas Las ceacutelulas transformadas fueron validadas posteriormente por
teacutecnicas moleculares como extraccioacuten de DNA plasmiacutedico yo identificacioacuten por
producto de PCR punto final
4172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Para la extraccioacuten y purificacioacuten utilizamos el Isolate II Plasmid Mini Kit de
Meridian Biosciencereg (Estados Unidos Cat BIO-52056) Se preparoacute un cultivo
overnight de E coli en un tubo 5 ml de caldo LB esteacuteril y se incuboacute por 37degC en
agitacioacuten constante por no maacutes ni menos de 16 h Al diacutea siguiente previo al
ensayo de extraccioacuten se precalentoacute la solucioacuten de buffer de lavado PW1 a 50degC y
la temperatura se mantuvo a esta temperatura hasta su uso Se verificoacute que el
buffer de lavado PW2 estuviera suplementado con etanol
El cultivo overnight fue centrifugado a 11000 x g por 30 minutos El volumen se
retiroacute y se mantuvo el precipitado celular al cual se agregoacute 250 microl del buffer de
resuspensioacuten P1 y el precipitado se resuspendioacute por completo por voacutertex Es
importante que no quede masa celular adherida en los tubos Posteriormente se
agregaron 250 microl de buffer de lisis P2 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas
6 a 8 veces El tubo fue incubado a temperatura ambiente por 5 min o hasta que el
lisado celular se tornara claro Cumplido el tiempo anterior se adicionaron 300 microl
de buffer de neutralizacioacuten P3 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas 6 a 8
veces Este procedimiento fue para evitar el rompimiento del DNA genoacutemico Los
tubos fueron centrifugados a 11000 x g durante 5 min a temperatura ambiente
Este paso fue repetido hasta que el sobrenadante quedara lo maacutes claro posible
Posteriormente se tomoacute una columna tipo spin y sobre eacutesta se agregoacute un tubo
colector y sobre eacutesta se antildeadioacute el volumen recuperado del paso anterior El tubo
con el volumen fue centrifugado a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Sobre el tubo colector se
agregoacute 500 microl de buffer de lavado PW1 precalentado y se centrifugoacute a 11000 x g
por 5 min a temperatura ambiente El sobrenadante del tubo fue eliminado por
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 42
decantacioacuten Se adicionoacute 600 microl de buffer de lavado PW2 (suplementado con
etanol) y se centrifugoacute a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Centrifugar de nuevo el tubo
colector a 11000 x g por 2 min a temperatura ambiente para remover etanol
residual
Debajo del tubo colector se colocoacute un tubo de 15 ml esteacuteril y se agregoacute 50 microl de
buffer de elucioacuten P directamente sobre la membrana de siacutelice Se incuboacute a
temperatura ambiente y se centrifugoacute a 11000 x g por 2 min a temperatura
ambiente Del tubo con DNA purificado se tomaron 2 microl y se analizaron por nano-
espectrofotometriacutea para el caacutelculo de concentracioacuten y de pureza del DNA
plasmiacutedico
4173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Para comprobar que las ceacutelulas de E coli fueran efectivamente transformadas con
el vector de expresioacuten pET30a(+) pETNL y pSmbP-LnqQ se realizoacute un
experimento de PCR punto final para identificar al plaacutesmido recuperado de las
ceacutelulas de E coli Para ello nos enfocamos en primer lugar a elegir un par de
oligonucleoacutetidos que cumplieran de identificar los vectores de expresioacuten
El par de oligonucleoacutetidos elegidos para el anaacutelisis de las construcciones
corresponden al T7 promoter primer (5rsquo- TAATACGACTCACTATAGGG-3rsquo) y al T7
terminal primer (5rsquo- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3rsquo) los cuales son oligonucleoacutetidos
especiacuteficos para vectores construidos basados en pET30a(+) La secuencia de
ambos oligonucleoacutetidos fue recuperada de una compilacioacuten de AddGene para
ldquoSequencing Primersrdquo (httpswwwaddgeneorgmol-bio-referencesequencing-
primers)
Para determinar la temperatura de fusioacuten oacuteptima del par de oligonucleoacutetidos
utilizamos dos herramientas bioinformaacuteticas en liacutenea La primera aplicacioacuten fue
OligoAnalyzertrade (httpswwwidtdnacomcalcanalyzer) de la compantildeiacutea Integrated
DNA Technologies Inc (Estados Unidos) donde se ajustaron paraacutemetros como la
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 43
concentracioacuten de oligonucleoacutetido las concentraciones de iones monovalentes
(Na+) y divalentes (Mg2+) asiacute como la concentracioacuten de nucleoacutetidos (dNTPs) en la
reaccioacuten para el caacutelculo de formacioacuten de hairpin homodiacutemeros y heterodiacutemeros
La otra aplicacioacuten es Net Primer (httpswwwpremierbiosoftcomnetprimer) de
Premier Biosoft que tambieacuten contiene puntos como la aplicacioacuten anteriormente
mencionada pero contiene opciones como el caacutelculo de rating de eacutexito y
estabilidad en el extremo 3rsquo-terminal
Para realizacioacuten del ensayo de PCR punto final utilizamos el High-Stability PCR
kit (Cat No L00342 Manual No 0285 Versioacuten 08272013) de GenScript Inc
(Estados Unidos) De esta manera ajustamos las condiciones de reaccioacuten de PCR
seguacuten lo determinado por el fabricante para por la DNA polimerasa Green Taq La
reaccioacuten de PCR punto final se ajustoacute a una concentracioacuten de oligonucleoacutetidos de
trabajo para 10 microM concentracioacuten de monovalentes (Na+K+) a 500 mM
concentracioacuten de divalentes (Mg2+) a 15 mM y concentracioacuten de dNTPs a 05 mM
El protocolo general para ensayo de PCR punto final de acuerdo con el fabricante
consistioacute en que por cada 50 microl de volumen de reaccioacuten se agregariacutean 5 microl de 10
X de Reaction Buffer 10 microl de 10 mM de dNTPs 10 microl por el oligonucleoacutetido 5rsquo-
terminal a 20 microM 10 microl por el oligonucleoacutetido 3rsquo-terminal a 20 microM 20 microl de
plaacutesmido (de al menos 100 ngmicrol) 395 microl de agua ultrapura esteacuteril y 05 microl de la
DNA polimerasa Green Taq
4174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Las muestras obtenidas fueron procesadas en un gel de agarosa (1 pv)
adicionada con Eco-Stain ready to use (Cat No DT81413) de BioBasic Inc
(Canadaacute) el cual es una sustancia que tiene un pico de excitacioacuten a λ = 490 nm y
dos picos de emisioacuten λ = 520 nm y λ = 635 nm y esta solucioacuten se agrega al gel en
una relacioacuten de 1 microl por 20 ml de solucioacuten de agarosa Las muestras fueron
corridas durante 1 h a 100 V en caacutemara para electroforesis Al terminar el tiempo
establecido el gel fue retirado e iluminado con luz UV en el transiluminador y se
tomoacute una fotografiacutea como evidencia Todos los geles fueron elaborados con su
respectivos controles positivos negativos y muestras
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418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
4181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Brevemente cultivos con diferentes cepas de E coli transformados con
pET30a(+) pETNL o pSmbP-LnqQ fueron inducidos con IPTG Se realizoacute un
cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado en un matraz con 25 ml de
caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50 microgml) a 37degC en agitacioacuten
constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se registroacute el valor de OD600 del
cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo preinoacuteculo en un matraz
esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina hasta llegar a un valor
inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado a 37degC en agitacioacuten constante
hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de OD600 asymp 04
Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue inoculado con
IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos diferentes
temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue distribuido en
tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten Todos los tubos
usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los tubos fueron
propiamente etiquetados
4182 Extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pETNL
Los cultivos de E coli transformados ya fuera con pET30a(+) pETNL o pSmbP-
LnqQ fueron inducidos por IPTG para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
Brevemente se realizoacute un cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado
en un matraz con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50
microgml) a 37degC en agitacioacuten constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se
registroacute el valor de OD600 del cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo
preinoacuteculo en un matraz esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con
kanamicina hasta llegar a un valor inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado
a 37degC en agitacioacuten constante hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de
OD600 asymp 04 Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue
inoculado con IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 45
diferentes temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue
distribuido en tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten
Todos los tubos usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los
tubos fueron propiamente etiquetados
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten periplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Santos y sus colaboradores (BD Santos et al 2019) que es un
procedimiento en un ensayo de lisozima con choque osmoacutetico Se descongeloacute los
tubos a baja temperatura y posteriormente fueron centrifugados a 8000 times g
durante 15 min a 4degC El sobrenadante de cada tubo fue eliminado y lavado dos
veces con buffer PBS 1X pH 74 (Gibco) friacuteo (8000 times g durante 10 min a 4degC) En
el uacuteltimo lavado los tubos con precipitado celular fueron pesados y sus pesos se
registraron Por uacuteltimo se calculoacute la diferencia entre los tubos con precipitado
celular contra los tubos cuando estaban vaciacuteos A cada uno de los tubos con
precipitado celular se le agregoacute solucioacuten hipertoacutenica friacuteo (sacarosa 20 trizma 20
mM EDTA 2 mM y lisozima 20 mgml pH 80) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten
hipertoacutenica por cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido
de cada tubo fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el
tiempo el cultivo fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC
El sobrenadante fue recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten
periplaacutesmica hipertoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El
precipitado celular es reservado Una vez retirada la fraccioacuten anterior los tubos
con precipitado celular remanentes fueron pesados de nuevo y se agregoacute solucioacuten
hipotoacutenica (agua ultrapura esteacuteril) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten hipotoacutenica por
cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido de cada tubo
fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el tiempo el cultivo
fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC El sobrenadante fue
recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten periplaacutesmica
hipotoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El precipitado celular se
eliminado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 46
4183 Extraccioacuten de proteiacutenas citoplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pSmbP-LnqQ
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten citoplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Vargas y sus colaboradores (Vargas-Cortez et al 2016) junto con
recomendaciones de Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) que es un
procedimiento basado en perlas de vidrio
Se descongelaron los tubos a baja temperatura y posteriormente centrifugados a
8000 times g durante 15 min a 4degC El precipitado celular de los tubos fueron
resuspendidos en buffer de lisis friacuteo (Tris-HCl 50 mM NaCl 500 mM pH 80) y se
agregaron 150 mg de perlas de vidrio limpios de 01 mm Los precipitados
celulares resuspendidos en perlas fueron mezclados por voacutertex durante 1 min Los
tubos fueron centrifugados a maacutexima velocidad por 15 min a 4degC El sobrenadante
fue recuperado con cuidado de cada tubo y fue etiquetado como ldquoFraccioacuten
citoplaacutesmicardquo
4184 Obtencioacuten de fracciones solubles e insolubles para SDS-PAGE
Para obtener las fracciones solubles e insolubles seguimos el protocolo de Santos
(Byran Santos 2017) Para la fraccioacuten soluble a partir del sedimento celular eacutesta
es resuspendida en 120 microl de agua ultrapura esteacuteril y despueacutes se le agregan 40 microl
de solucioacuten amortiguadora de carga SDS-PAGE 4X suplementado con β-
mercaptoetanol para una concentracioacuten final al 1X La solucioacuten fue hervida durante
10 min y posteriormente centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante
fue separado y guardado como ldquoFraccioacuten solublerdquo Luego al sedimento restante
se le agregaron 120 microl de solucioacuten de urea 8 M y se hierve de nuevo durante otros
10 min para solubilizacioacuten de los cuerpos de inclusioacuten Finalmente la solucioacuten fue
centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante fue separado y guardado
como ldquoFraccioacuten insolublerdquo Ambas fracciones fueron visualizadas posteriormente
en los geles de SDS-PAGE
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4185 Preparacioacuten de gel de SDS-PAGE 16
Los geles de SDS-PAGE fueron preparados bajo las siguientes condiciones se
prepararon dos geles en dos tubos nuevos e independientes conocidos como
lower y upper con suficiente capacidad para almacenar el volumen de cada gel
Primero se preparoacute el lower gel y solo hasta haber terminado ese gel se procedioacute
a preparar el upper gel
Para preparar el lower gel a 16 preparamos una reaccioacuten considerando un
volumen de 10 ml Para ello mezclamos 350 ml de agua destilada 400 ml de
solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) 250 ml de lower buffer (para 25 ml Tris
1515 g SDS 01 g pH 68) 200 microl de APS 10 (pv) y TEMED 20 microl Para el
upper gel a 4 estaacute reaccioacuten fue montada con un volumen de 5 ml Para ello
mezclamos 325 ml de agua destilada 050 ml de solucioacuten de BisAcrilamida 40
(291) 125 ml de upper buffer (para 25 ml Tris 454 g SDS 01 g pH 88) 100 microl
de APS 10 (pv) y 20 microl de TEMED
Tanto la solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) del upper buffer y el lower buffer
fueron retirados del refrigerador y atemperados a temperatura ambiente cuando
menos unos 15 min antes de uso La solucioacuten de APS a una relacioacuten de 01 g por
1 ml (10 pv) debioacute prepararse al momento con agua destilada limpia Toda la
cristaleriacutea usada para preparar el gel de poliacrilamida debioacute ser lavada con agua
destilada limpia y secarse con suficiencia evitando rayar los vidrios
Una vez agregado el TEMED a la mezcla la solucioacuten fue inmediatamente vertido
sobre placas de vidrio Fue necesario esperar entre 20 a 30 minutos para que
completar el proceso de polimerizacioacuten En el lower gel se agregaron 200 microl de
isobutanol para el upper gel en la parte superior se agregoacute un molde para
pocillos Terminado el tiempo de polimerizacioacuten se agregaron las muestras de
proteiacutenas en los pocillos del gel de SDS-PAGE Los geles fueron puestos sobre
una caacutemara de electroforesis vertical y sumergidos en un buffer de corrida a 1X
(para 1000 ml Tris 3 g Glicina 144 g y SDS 1 g) El gel fue corrido a 150 V
durante 1 a 15 h dependiendo de la liacutenea de corrida de la solucioacuten
amortiguadora
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 48
4186 Tincioacuten de gel SDS-PAGE
Previo a tentildeir los geles se prepararon dos soluciones Para la solucioacuten de tincioacuten
se pesaron cuidadosamente y con guantes 50 mg de Coomasie Blue R-250 en un
tubo plaacutestico limpio para un volumen de 50 ml Despueacutes se agregaron 25 ml de
metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta
50 ml con agua destilada limpia Mantener a temperatura ambiente y en
condiciones de obscuridad hasta su uso Mientras que para la solucioacuten de
destincioacuten se midieron 75 ml de metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico
absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta 50 ml con agua destilada limpia
Mantener a temperatura ambiente hasta su uso
Cuando terminado el paso de corrida por electroforesis los geles fueron
cuidadosamente separados de los vidrios El gel fue tentildeido con la solucioacuten de
tincioacuten durante toda la noche en agitacioacuten constante a temperatura ambiente y
posteriormente fue destentildeido con la solucioacuten de destincioacuten durante el resto del diacutea
siguiente bajo las mismas condiciones previas El gel fue puesto sobre un fondo
blanco y se fotografioacute como evidencia
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en
los geles
La presente seccioacuten fue desarrollada posterior a la conclusioacuten de la fase
experimental con el objetivo de explicar la ausencia de bandas tanto de N-
AmyELnqQ como de SmbP-LnqQ en los geles de SDS-PAGE Para abordar el
problema exploramos las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas por el
anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle un anaacutelisis de perfil
aminoaciacutedico y finalmente a traveacutes de diferencias por su origen evolutivo
Las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas como el tamantildeo de proteiacutenas
peso molecular punto isoeleacutectrico nuacutemero total de residuos con carga positiva y
negativa iacutendice alifaacutetico (AI) e iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) fueron calculadas
a traveacutes de ProtParam de ExPasy (httpswebexpasyorgprotparamprotparam-
dochtml) (Gasteiger et al 2005) El iacutendice alifaacutetico (AI) estaacute principalmente
afectado por los cuatro aminoaacutecidos con cadena lateral alifaacutetico alanina valina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 49
leucina e isoleucina El incremento del AI es directamente proporcional a la
termoestabilidad en proteiacutenas globulares (Atsushi 1980) El iacutendice de
hidrofobicidad (GRAVY) es el resultado del promedio que representa la suma total
de los valores de hidropatiacutea de cada uno de los residuos dentro de una cadena
lineal de aminoaacutecidos dividido por el tamantildeo del peacuteptidoproteiacutena Una proteiacutena
con valor GRAVY negativo una proteiacutena hidrofiacutelica mientras que una proteiacutena con
valor GRAVY positivo es hidrofoacutebica (Kyte amp Doolittle 1982)
El anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle fue elaborado a
partir de ProtScale de ExPasy (httpswebexpasyorgprotscale) (Gasteiger et al
2005) Esta herramienta permite elaborar un perfil producido por cualquier escala
aminoaciacutedica a partir de una secuencia aminoaciacutedica Existen 57 escalas de
hidrofobicidad yo hidrofilicidad para fines de nuestro experimento utilizamos la
opcioacuten ldquoHphob Kyte amp Doolittlerdquo
El mapa de calor representa el porcentaje de aminoaacutecidos dada en una secuencia
lineal de aminoaacutecidos con el fin de elaborar un perfil aminoaciacutedico entre los
diferentes peacuteptidos antimicrobianos que fueron efectivamente sobreproducidos por
SmbP La graacutefica fue elaborada a traveacutes de Excel con datos descargados desde la
aplicacioacuten ProtParam de ExPasy
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 50
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS
Las actividades del proyecto fueron realizadas en los Laboratorios de Biologiacutea y de
Sistemas del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea y el
Laboratorio de Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas ubicado en la Divisioacuten de
Estudios de Posgrado ambas infraestructuras pertenecientes a la Facultad de
Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
A continuacioacuten se presenta un listado completo de los materiales y equipos
utilizado
51 Materiales y reactivos
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Microtubos de 15 ml 15 ml y 50 ml Distintas marcas No especificado
Cajas Petri de plaacutestico o vidrio Distintas marcas No especificado
Matraces tipo Erlenmeyer Distintas marcas No especificado
Celdas para espectrofotoacutemetro No especificado No especificado
Celdas de electroporacioacuten No especificado No especificado
Micropipetas (varios voluacutemenes) Distintas marcas No especificado
Medio de cultivo LB Difco 244620
Agar bacterioloacutegico MCD-LAB 9011
Agua grado Biologiacutea Molecular Invitrogen 10977-015
Kanamicina sulfato AG Scientific K-1022
Ampicilina soacutedica Sigma Aldrich A0166
Perlas de vidrio 01 mm Biospec 11079101
IPTG Bioline BIO-37036
LDS Sample Buffer 4X GenScript M00676-10
SDS IBI Scientific IB07062
Persulfato de Amonio (APS) BioBasic AB0072
TEMED Merck 110732
Glicina BioBasic GB0235
Bis-Acrilamida 40 (29109) Merck 100641
Coomasie Briliant Blue BioBasic CB0038
2-mercaptoetanol BioBasic MB0338
Isopropanol 100 DEQ No especificado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 51
Aacutecido fosfoacuterico 85 Jalmek A1825-13
Hidroacutexido de sodio DEQ No especificado
Aacutecido clorhiacutedrico DEQ No especificado
Alcohol metiacutelico DEQ No especificado
Aacutecido aceacutetico glacial Jalmek A0925-13
Etanol anhidro Jalmek E5325-18
Urea BioBasic UB0148
Buffer de fosfatos salinos 1X (PBS) Gibco 10010-023
Cloruro de sodio Jalmek S2325-05
Tris BioBasic TB0196
Glicerol DEQ No especificado
Guantes de nitrilo Ambiderm No especificado
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S657-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 7 J T Baker S656-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S655-02
QuickClean II Plasmid Miniprep kit GenScript L00420-100
QuickClean II Gel Extraction Kit GenScript L00418-100
QuickClean II PCR Purification Kit GenScript L00419-50
52 Equipos de laboratorio
USO PERSONAL
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Computadora personal Acer Aspire A515-51
LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA Y DE SISTEMAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Incubadora estaacutetica Lab Companion IB-11E
Incubadora de piso con agitacioacuten Lab Companion IS-971
Incubadora de agitacioacuten (microtubos) Eppendorf ThermoMixer C
Horno de secado Shel Lab SGO 6E
Horno de microondas Everstar P90D23AL-XF
Concentrador Thermo Fisher SpeedVac SPD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 52
Bantildeo de ultrasonido VMR Symphony 97043-996
Contador de colonias Reichert 3327
Agitador orbital Labnet Orbit 1000
Agitador vertical Thermo Scientific Compact Digital Rocket
Termociclador miniPCR Mini8
Termociclador Techne 3Prime
Refrigerador de puertas deslizantes Thermo Scientific MH45PA-GAEE-TS GPR Series
Refrigerador a dos puertas Norlake Scientific LRF 201WW
Congelador de -20 degC MetalFrio Solutions
No especificado
Espectrofotoacutemetro UV-Vis Optizen 2120 UV Plus
Nanoespectrofotoacutemetro BioSpec Shimadzu
Gabinete bioseguridad clase II Labconco Delta Series
Centriacutefuga para microtubos Ohaus Frontier 5515
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
Voacutertex Scientific Industries
Genie 2
Plancha de calentamiento con agitacioacuten magneacutetica
Lab Companion HP-3000L
Microscopio oacuteptico Fisher Scientific Micromaster
Autoclave Lab Companion ST-G Series
Caacutemara profesional Canon EOS M10
Transiluminador Maestro No especificado
Balanza analiacutetica AND GR-200
Balanza semianaliacutetica Ohaus Traveler
Electroporador Eppendorf Eppendorf
Fuente de Poder BioRad PowerPac Basic
Potencioacutemetro Ohaus Starter 5000
LABORATORIO DE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Cromatoacutegrafo GE Life Sciences Aumlktaprime Plus
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 53
53 Lugares de experimentacioacuten
Nuestro proyecto fue elaborado entre Febrero de 2018 a Mayo de 2021 y fue
mayoritariamente realizado en las instalaciones del Laboratorio de Biologiacutea
Sinteacutetica y de Sistemas (LBSS) a cargo del Dr Heacutector Javier Ameacutezquita Garciacutea
encontraacutendose en el interior del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y
Nanotecnologiacutea (CIBYN) dependencia de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
(FCQ) de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten El centro estaacute ubicado en la
autopista al Aeropuerto ldquoMariano Escobedordquo Km 10 Parque de Investigacioacuten e
Innovacioacuten Tecnoloacutegica (PIIT) CP 66628 en Apodaca Nuevo Leoacuten Meacutexico
En menor proporcioacuten nuestro trabajo tambieacuten fue realizado en el Laboratorio de
Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas (PEP) a cargo del Dr Xristo Zaacuterate
Kalfoacutepulos Esta unidad estaacute localizada en el interior de la Divisioacuten de Estudios de
Posgrado (DEP) de Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la Universidad
Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) La ubicacioacuten de la divisioacuten estaacute en la calle
Vicente Guerrero sn Col Trevintildeo CP 64570 en Monterrey Nuevo Leoacuten
Meacutexico
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos
Declaracioacuten de manejo y disposicioacuten de residuos
Todos residuos generados durante la realizacioacuten del proyecto de investigacioacuten
fueron gestionados de acuerdo con las caracteriacutesticas de estos siguiendo los
lineamientos establecidos por el Departamento de Medio Ambiente y Seguridad de
la Facultad de Ciencias Quiacutemicas utilizando los recipientes proporcionados por
este departamento en base a la Norma PR-CLB-SRR-000
Los residuos bioloacutegico-quiacutemicos fueron dispuestos en los contenedores
correspondientes en el interior de los laboratorios
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 54
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
En esta seccioacuten nos centramos en el disentildeo in silico de ceacutelulas de E coli
configuradas para detectar moleacuteculas de AIP producidos por el sistema nativo de
QS de ceacutelulas de MRSA De acuerdo con nuestro disentildeo (Figura 2) las ceacutelulas α
corresponden a ceacutelulas de S aureus productoras de moleacuteculas AIP mientras que
las ceacutelulas β corresponden a ceacutelulas de E coli que han sido modificadas con un
par de moacutedulos geneacuteticos biosensor y bacteriocina que le permiten detectar
moleacuteculas de AIP y en respuesta destruyen ceacutelulas de S aureus en el medio A
manera de resumen las ceacutelulas de E coli modificadas producen y excretan LnqQ
en funcioacuten de la concentracioacuten externa de moleacuteculas de AIP
Nuestra determinacioacuten por elegir bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
para nuestro sistema biosensor se explica en la siguiente numeracioacuten en primer
lugar consideramos que debido a su origen proteico son susceptibles a
modificaciones geneacuteticas (Cotter et al 2013)
Figura 2 Sistema QS para deteccioacuten y eliminacioacuten de S aureus
El moacutedulo biosensor conformado por agrC y agrA (azul marino y azul celeste respectivamente) estaacute regulado
por el promotor constitutivo J23110 La deteccioacuten del AIP-II (pentaacutegonos naranja) estaacute regulado por AgrC la
cual activa la fosforilacioacuten (ciacuterculos amarillo) de AgrA y activa la expresioacuten del moacutedulo bacteriocina a traveacutes
de la lnqQ lnqBCEDF y gfp (rojo amarillo y verde respectivamente) regulado por el promotor P2 LnqQ
destruye ceacutelulas de S aureus
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 55
62 Cepas bacterianas
La razoacuten de escoger a E coli como chasis bioloacutegico de produccioacuten es porque ya
ha sido reportado previamente como biosensor de ceacutelulas enteras basados en
deteccioacuten del QS (Sedlmayer Hell Muumlller Auslaumlnder amp Fussenegger 2018) y
ademaacutes porque es el organismo de produccioacuten heteroacuteloga maacutes usado en el campo
de las bacteriocinas (Mesa-Pereira et al 2018) Nuestro modelo estaacute disentildeado
para ser aplicado en E coli BL21 (DE3) ya que ha sido efectivamente reportado
para producir y secretar bacteriocinas de las clases IIa y IId eacuteste uacuteltimo es
importante ya que esta es la clase a la que pertenece la bacteriocina LnqQ (Mesa-
Pereira et al 2017)
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
Para determinar el comportamiento in silico de nuestra ceacutelula de E coli fue
necesario disentildear un vector de expresioacuten con dos moacutedulos geneacuteticos y eacutestos
fueron referidos como moacutedulo biosensor y moacutedulo de bacteriocina
respectivamente Ambos moacutedulos fueron disentildeados de la siguiente manera
promotor-RBS-gene(s) estructural(es)-doble terminador (Figura 3)
Figura 3 Moacutedulos biosensor y de bacteriocina
El moacutedulo biosensor es configurado con agrC y agrA y estaacuten regulados transcripcionalmente por el promotor
J23110 (A) El moacutedulo de bacteriocina estaacute armado con los genes lnqQ y gfp y estaacuten regulados
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 56
transcripcionalmente por el promotor P2 (B) Por uacuteltimo se muestra el disentildeo del sistema detectar y destruir
con los promotores divergentes J23110 y P2 (C)
En primera instancia se debioacute localizar el locus geneacutetico del promotor P2 de
nuestra MRSA fue manualmente localizado puesto que no existiacutea informacioacuten
relacionada al mismo De acuerdo con Shao y otros el locus de un promotor se
encuentra evolutivamente conservado entre especies que estaacuten relacionadas
(Shao Price Deutschbauer Romine amp Arkin 2014) De esta manera utilizamos
la anterior premisa para localizar el promotor P2 en un primer enfoque
localizamos la secuencia nucleotiacutedica del agrB en el archivo genoacutemico de la
MRSA (564 nucleoacutetidos KEGG no SA1842) como referencia ya que se conoce
que este gen es conocido que eacutesta es la primera unidad transcripcional ubicada riacuteo
abajo del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Para el segundo
enfoque usamos la informacioacuten disponible del promotor P2 de S aureus NCTC
8325 (Rajasree Fasim amp Gopal 2016 Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) una
cepa catalogada como estaacutendar para estudios bioinformaacuteticos (S Fuchs et al
2017 Herbert et al 2010) Al combinar lo mejor de ambos enfoques logramos
localizar la composicioacuten nucleotiacutedica del promotor P2 y su tamantildeo a traveacutes de la
identificacioacuten de los dominios
A continuacioacuten explicamos el principio del disentildeo de ambos moacutedulos En primer
lugar el moacutedulo designado como biosensor los genes agrC y agrA son
constitutivamente expresados por accioacuten del promotor J23110 Brevemente se
describe el principio del disentildeo donde inicialmente el AgrC anclado a membrana
de E coli detecta la presencia de moleacuteculas de AIP externas (Marchand amp Collins
2013) De esta manera AgrC sufre de un cambio conformacional y fosforila al
factor de transcripcioacuten AgrA Despueacutes el AgrA fosforilado (AgrA) actuacutea como
factor de transcripcioacuten del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Una
vez que AgrA-P se ha acoplado al promotor P2 el moacutedulo de bacteriocina es
expresado incluyendo los genes tipo estructural (lnqQ) excrecioacuten y
autoinmunidad (lnqBCEDF) del operoacuten lnq asiacute como del gen reportero gfp
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 57
Algunos autores han demostrado que mantener intacto el operoacuten nativo de una
bacteriocina cualesquiera (es decir que contenga los elementos geneacuteticos de su
estructura para su secrecioacuten y para autoinmunidad) en E coli eacutesta ceacutelula
modificada es capaz de excretar bacteriocinas Gram positivos al medio
extracelular (Mesa-Pereira et al 2017)
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
Los moacutedulos geneacuteticos fueron disentildeados para operar en el mismo sentido que el
ensamble por tipo BioBrick al yuxtaponer las propiedades del BioBrick (RFC 10) y
el BglBrick (RFC 21) La intencioacuten del disentildeo es que nuestros moacutedulos geneacuteticos
sean faacutecilmente ensamblados o removidos por teacutecnicas como In-Fusion (Sleight
Bartley Lieviant amp Sauro 2010) o ensamblado por clonacioacuten in vivo (Garciacutea-
Nafriacutea Watson amp Greger 2016) dado que los sitios de restriccioacuten actuacutean como
sitios homoacutelogos para la clonacioacuten
Cada moacutedulo estaacute flanqueado por sitios de restriccioacuten para que puedan ser
intercambiados de ser necesario El moacutedulo de promotores estaacute flanqueado por
los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI manteniendo a EcoRI como unidad neutral
para cuando sean necesario el intercambio de piezas Los elementos del moacutedulo
biosensor estaacuten flanqueados por los sitios BglII y BamHI y los elementos del
moacutedulo de bacteriocinas estaacuten rodeados por los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI
(Figura 4)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 58
Figura 4 Estrategia de construccioacuten in silico
El moacutedulo biosensor (seccioacuten A) estaacute constituido por el BglBrick RFC21 mientras que el moacutedulo bacteriocina
(seccioacuten C) estaacute representado por el BioBrick RFC10 La seccioacuten de promotores (seccioacuten B) fue colocado en
caso de que los promotores fueran cambiados Cada bloque contiene una regioacuten prefija y otra sufija y cada
bloque estaacute flanqueado en ambas direcciones por terminadores dobles de transcripcioacuten (BBa_B0015 ciacuterculos
rojos) La seccioacuten B estaacute bordeada por los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI (G-X) con la regioacuten EcoRI como
neutral La seccioacuten A EcoRI y BglII (E-G) estaacuten anclados como prefijos mientras que BamHI y XhoI (B-X)
estaacuten puestos como sufijos Los sitios de restriccioacuten BglII y BamHI fueron usados para construir el promotor
constitutivo J23110 en conjunto a su parte estructural (RBS-gen) para el moacutedulo de biosensor Por otro lado
para la seccioacuten C el prefijo estaacute compuesto por los sitios EcoRI-XbaI (E-X) y los sitios SpeI-PstI (S-P) son
colocados como prefijos Los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI fueron usados para construir el promotor
inducible P2 y en conjunto a su parte estructural (RBS-gene) para el moacutedulo de bacteriocina
El plaacutesmido pSB1A3 (AddGene no 116850) (Dupin amp Simmel 2019) sirvioacute como
plantilla para la construccioacuten de los moacutedulos geneacuteticos Las secciones prefijo y
sufijo fueron manualmente remplazados por cualquiera de los moacutedulos disentildeados
El replicoacuten y los genes de resistencia a antibioacutetico del plaacutesmido fueron retenidos
pero el terminador de transcripcioacuten fue remplazado por terminadores dobles
Finalmente un par de plaacutesmidos fueron construidos y cada uno contiene
individualmente del moacutedulo de biosensor o de bacteriocina respectivamente
Finalmente ambos plaacutesmidos fueron manualmente mezclados para crear un
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 59
plaacutesmido que contiene un par de moacutedulos que estaacuten en direcciones divergentes
Este vector de expresioacuten fue nombrado Dual Biosensor-Killer (Figura 5)
Figura 5 Representacioacuten esquemaacutetica del vector Dual Biosensor-Killer
El moacutedulo biosensor contiene los genes agrC y agrA y estaacute rodeado por los sitios de restriccioacuten EcoRI BglII y
XhoI mientras que el moacutedulo de bacteriocina contiene los genes del cluacutester lnqQBCDEF y el gen reportero gfp
y estaacute flanqueado por los sitios de restriccioacuten EcoRI XbaI SpeI y PstI Este plaacutesmido contiene un marcador
de resistencia a ampicilina y se compone de un total de 8904 pb
Parte de la estrategia de nuestro disentildeo consistioacute en que los promotores J23110 y
P2 fueran colocadas en sentidos opuestos para regular de manera independiente
la actividad de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina respectivamente La razoacuten
de aislar ambos moacutedulos es para evitar la expresioacuten por goteo que pudiera existir
por efecto de la fuerza de alguno de los promotores al mantenerse en la misma
direccioacuten transcripcional (Lubkowicz et al 2018) Todos los archivos generados
para la elaboracioacuten del vector de expresioacuten Dual Biosensor-Killer fueron
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 60
elaborados por SnapGene y estaacuten disponibles en los archivos anexos de esta
misma tesis
65 Optimizacioacuten de los codones nativos
De acuerdo con las observaciones (Tabla 1) todas las secuencias fueron
optimizadas para ser expresadas en E coli cepa tipo B Noacutetese que los sitios de
restriccioacuten tiacutepicos y los codones de paro de todas las secuencias utilizadas fueron
removidos El iacutendice CAI antes de la optimizacioacuten en AgrC AgrA LnqQ LnqB
LnqC LnqE LnqD y LnqQ era de 0407 0402 0532 0525 0518 0511 0503
and 0521 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores cambiaron a
0770 0766 0675 0735 0771 0773 0777 y 0747 respectivamente El valor
CAI para la GFP no pudo ser determinado por la aplicacioacuten antes de la
optimizacioacuten pero siacute despueacutes de la optimizacioacuten el cual correspondioacute a 0759 En
relacioacuten con el contenido de GC los valores antes de la optimizacioacuten fueron
282 272 333 225 231 305 y 245 respectivamente Despueacutes de
la optimizacioacuten los datos fueron 433 446 469 400 421 410
431 424 y 424 respectivamente El contenido GC para GFP despueacutes de
la optimizacioacuten fue de 491
Nuestros resultados el promedio del valor CAI y el promedio de contenido GC de
todas las secuencias aminoaciacutedicas antes de ser optimizadas era de 049 plusmn 005 y
2690 plusmn 371 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores
promedio fueron 075 plusmn 003 y 4361 plusmn 287 respectivamente Seguacuten las
especificaciones de la aplicacioacuten si el valor CAI es maacutes cercano a 1 eacuteste indica
que la secuencia de nucleoacutetidos utiliza los codones maacutes utilizados por el
organismo productor heteroacutelogo (Puigbograve et al 2008) Seguacuten los resultados los
valores CAI y el contenido GC de todas las proteiacutenas utilizadas como datos de
entrada fue substancialmente mejorados y estaacute optimizada para ser utilizado en E
coli heteroacuteloga La finalidad de optimizar el contenido nucleotiacutedico de las
secuencias utilizadas para disentildeo a las caracteriacutesticas requeridas del hospedero
es para incrementar el rendimiento de produccioacuten (Puigbograve et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 61
Tabla 1 Uso de codones previo y despueacutes de la optimizacioacuten
Paraacutemetros Previo a la optimizacioacuten Despueacutes de la optimizacioacuten
Gen Tamantildeo (pb) CAI GC CAI GC
agrC 1116 0407 282 0770 433
agrA 717 0402 272 0766 446
lnqQ 162 0532 333 0675 469
lnqB 240 0525 225 0735 400
lnqC 480 0518 231 0771 421
lnqE 1299 0511 259 0773 410
lnqD 678 0503 305 0777 431
lnqF 795 0521 245 0747 424
gfp NA NA NA 0759 491
El iacutendice de adaptacioacuten (CAI) y el contenido de guanidina y citosina (GC) La tabla se divide en dos
secciones previo a la optimizacioacuten y despueacutes de la optimizacioacuten La columna de gen representa el nombre del
dato de entrada y el tamantildeo que indica el total de nucleoacutetidos para cada entrada Los resultados en la tabla
representan la adaptabilidad de las secuencias de entrada usando a E coli como hospedero No fue posible
determinar el uso de codones antes de la optimizacioacuten para el gen gfp debido a que no hay suficiente
informacioacuten al computador el iacutendice CAI con esta tabla de referencia NA = No Aplica
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Es conocido que S aureus posee cuatro grandes variantes de clases de
moleacuteculas de AIP (desde I hasta IV) la cual difiere entre uno a dos residuos en la
seccioacuten madura del AIP (Ji et al 2005 B Wang amp Muir 2016) La diferencia
estructural entre las clases de AIP pueden actuar como inhibidores competitivos
del QS cuando interactuacutean con cepas filogeneacuteticamente relacionadas Este
fenoacutemeno bioloacutegico es conocido como comunicacioacuten cruzada (Everett amp
Rumbaugh 2014)
Para predecir la probabilidad de comunicacioacuten cruzada de nuestro biosensor
descargamos las secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro variantes maacutes
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 62
representativas de AgrD junto la informacioacuten anotada del AgrD de la cepa MRSA
estaacutendar Finalmente realizamos un alineamiento local bajo la herramienta
EMBOSS Water entre cada una de las secuencias aminoaciacutedicas representativas
contra la secuencia aminoaciacutedica de nuestra cepa Los resultados revelan (Tabla
2) que el AgrD de nuestro MRSA tuvo un porcentaje de identidad y de similitud con
el AgrD clase I de 478 y 652 respectivamente Para la clase II los
porcentajes fueron 100 y 100 respectivamente mientras que con la clase III
fueron de 326 y 500 respectivamente Finalmente con la clase IV los
porcentajes fueron de 457 y 609 respectivamente Seguacuten los resultados del
alineamiento podemos inferir que nuestro biosensor es uacutetil para detectar
moleacuteculas de QS producidos por S aureus N315 y por otros S aureus que sean
productores de AIP tipo II Al mismo tiempo nuestro sistema estariacutea limitado a no
detectar S aureus productores de AIP clases I III y IV
Bajo la prediccioacuten anterior nuestro biosensor completo de ceacutelulas estariacutea
capacitado para detectar ceacutelulas de S aureus N315 inclusive cepas de S aureus
USA100 las cuales son productoras naturales de moleacuteculas de AIP clase II
(Grundstad et al 2019) y estaacuten sentildealadas como entre las principales cepas tipo
MRSA que circulan a nivel mundial esta cepa es altamente letal y es una causa
de endocarditis infecciosa en la vaacutelvula nativa del corazoacuten A nivel in vitro se
reporta que es una productora de biopeliacuteculas fuertes (King Kulhankova Stach
Vu amp Salgado-Paboacuten 2016) A pesar de ser una cepa principalmente asociada a
infecciones adquiridas en hospitales (Limbago et al 2009 Tenover et al 2008)
tambieacuten se ha encontrado entre individuos que no han recibido cuidados meacutedicos
previos Noacutetese que esta cepa es resistente a vancomicina (Roberts 2013)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 63
Tabla 2 Prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Clase AIP Alineamiento de proteiacutenas Tamantildeo ID Similitud Gaps Score Ref
I MNTLFNLFFDFITGILKNIGNIAAYSTCDFIMDEVEVPKELTQLHE- 46 478 652 00 1700 1 2
II MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK 47 1000 100 00 24000 1 2
III MKKLLNKVIELLVDFFNSIGYRAAYINCDFLLDEAEVPKELTQLHE- 46 326 500 00 7200 1 2
IV MNTLYKSFFDFITGVLKNIGNVASYSTCYFIMDEVEIPKELTQLHE- 46 457 609 00 10500 2
MRSA MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK - - - - -
El alineamiento de proteiacutenas se realizoacute entre las cuatro clases mayoritarias de AIP contra el MRSA El alineamiento fue realizado en el programa Clustal Omega
mientras que la identificacioacuten (ID) similitud gaps y score fue determinado de la aplicacioacuten EMBOSS Water
1 (B Wang amp Muir 2016)
2 (Ji et al 2005)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 64
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
El anaacutelisis de solubilidad y localizacioacuten subcelular entre todas las secuencias
aminoaciacutedicas utilizadas para construir biosensor de ceacutelulas enteras es necesario
para obtener un alto rendimiento productivo (Ghosh et al 2004) Seguacuten los
resultados obtenidos por la aplicacioacuten Protein-Sol (Tabla 3) para prediccioacuten de
solubilidad eacutestos indican que LnqQ LnqF AgrA y GFP son considerados solubles
mientras que los datos obtenidos para LnqB LnqC y LnqE no pudieron ser
considerados ya que la aplicacioacuten los clasificoacute como proteiacutenas de membrana
Tabla 3 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
Gen Iacutendice Solubilidad
AgrC 0366 Invaacutelido
AgrA 0514 Soluble
LnqQ 0655 Soluble
LnqB 0655 Invaacutelido
LnqC 0644 Invaacutelido
LnqD 0388 Invaacutelido
LnqE 0609 Invaacutelido
LnqF 0607 Soluble
GFP 0592 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice superior de 045 es
porque se consideraron proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
De acuerdo con las predicciones de la aplicacioacuten BUSCA (Tabla 4) la localizacioacuten
subcelular de las proteiacutenas AgrA LnqQ LnqE y GFP es en el citoplasma mientras
que AgrC LnqB LnqC LnqD LnqE y LnqF son producidos en la membrana
plasmaacutetica Los caacutelculos predictivos en las proteiacutenas a sobreproducirse en E coli
concuerda con lo observado en la literatura para los elementos geneacuteticos del
moacutedulo biosensor el AgrC actuariacutea como una proteiacutena transmembranal con
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 65
actividad histidina quinasa mientras que AgrA actuariacutea como factor de
transcripcioacuten que se mueve a traveacutes del citoplasma para anclarse al promotor P2
(Gomes-Fernandes et al 2017) En los elementos del moacutedulo de bacteriocina se
espera que la LnqQ actuacutee como una proteiacutena soluble de bajo peso molecular que
es producido y excretado al medio extracelular (Fujita et al 2007) Para los demaacutes
elementos estructurales de este moacutedulo se sabe que LnqB es una proteiacutena
membranal tipo permeasa mientras que LnqC y LnqD son proteiacutenas con dominios
franqueados en membrana asiacute como LnqE y LnqF son proteiacutenas transportadoras
tipo ABC-2 y ABC respectivamente (Iwatani et al 2012) Por uacuteltimo los valores
de predictivos indican que la GFP seraacute producida como una proteiacutena soluble y
monomeacuterica (Zacharias et al 2002)
Tabla 4 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
Gen Valor Localizacioacuten subcelular
AgrC 075 Membrana plasmaacutetica
AgrA 07 Citoplasma
LnqQ 07 Citoplasma
LnqB 09 Membrana plasmaacutetica
LnqC 083 Membrana plasmaacutetica
LnqD 072 Membrana plasmaacutetica
LnqE 086 Membrana plasmaacutetica
LnqF 07 Citoplasma
GFP 07 Citoplasma
De acuerdo con la aplicacioacuten BUSCA las localizaciones subcelulares disponibles son membrana plasmaacutetica y
citoplasma
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
La determinacioacuten de la alergenicidad es un aspecto deseado durante la
construccioacuten del biosensor de ceacutelulas enteras debido a que nuestro sistema seriacutea
presentado en el futuro como un potencial candidato a agente terapeacuteutico Para
demostrar este punto fue necesario demostrar que la estructura tanto primaria
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 66
como secundaria de la LnqQ presentaba epiacutetopos para ceacutelulas tipo B dado que la
alergenicidad estaacute mediada tanto por ceacutelulas De acuerdo con los resultados de la
secuencia aminoaciacutedica de la LnqQ en su estructura en forma lineal (Tabla 5) se
indica que los potenciales residuos epiacutetopos corresponden a E13 S16-V19 y W21-
D31 Mientras tanto los anaacutelisis realizados por la aplicacioacuten Discotope 20 a la
secuencia aminoaciacutedica en su forma tridimensional indican que no se encontraron
residuos potencialmente epiacutetopos para ceacutelulas B ni se determinaron sitios de
alergenicidad
Tabla 5 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas B en LnqQ
Epiacutetopos EEEEEEEEEEEEEEEE
Secuencia lineal MAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIK
Estructura CCHHHHHHHHHHHHCCHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCC
Superficie EEEBEEBBEBBBEBEEEBBEBBBEEEEEBBEBBEBBBBBEBBBEEBEEEEEEE
La prediccioacuten fue resuelta en la aplicacioacuten BediPrep En la seccioacuten de epiacutetopos si la posicioacuten estaacute arriba de
05 entonces es marcado con una letra ldquoErdquo La aplicacioacuten anexa NetsurfP fue usada para la prediccioacuten
estructural a partir de secuencia lineal y se divide en tres categoriacuteas ldquoHrdquo para heacutelice ldquoErdquo para hoja y ldquoCrdquo para
cadena En la seccioacuten de superficie se divide en dos secciones ldquoBrdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el interior de la proteiacutena (burial) mientras que ldquoErdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el exterior de la proteiacutena (exposed)
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 67
610 Prediccioacuten de alergenicidad
De acuerdo con el reporte realizado por la aplicacioacuten AllerCatPro la bacteriocina
LnqQ no posee elementos alergeacutenicos
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
6111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE fue seleccionado porque se ha demostrado que los
primeros 33 residuos de la α-amilasa (AmyE) de B subtilis pueden ser acoplados
a la regioacuten N-terminal a una proteiacutena de intereacutes para su produccioacuten periplaacutesmica
en ceacutelulas de E coli (R M Papi et al 2005)
En primer lugar descargamos la secuencia nucleotiacutedica de la AmyE desde la base
de datos de GenBank Despueacutes utilizamos los dos oligonucleoacutetidos reportados
por Papi y sus colaboradores (R M Papi et al 2005) que estaacuten modificados con
extremos overhangs Cada oligonucleoacutetido estaacute compuesto por un sitio de
restriccioacuten en su extremo 3rsquo-terminal que corresponden a NdeI y BamHI
respectivamente
En la aplicacioacuten SnapGene el archivo geneacutetico del AmyE fue abierto y sobre eacutesta
se incorporaron los dos oligonucleoacutetidos mencionados arriba despueacutes se corrioacute un
ensayo de PCR in silico para extraer el peacuteptido sentildeal N-AmyE de la amilasa El
producto in silico resultante corresponde a un tamantildeo 117 pb que estaacute ordenado
de la siguiente manera 5rsquo-NdeI-(N-AmyE)-BamHI-3rsquo
En la misma aplicacioacuten realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten con
el producto de PCR in silico y el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)dnardquo Desde la
aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten pET-30a(+) y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten NdeI y BamHI
Posteriormente el producto de PCR compuesto con los extremos overhangs fue
cortado tambieacuten con el mismo conjunto de enzimas de restriccioacuten y procedimos a
clonar creando un vector de expresioacuten El vector fue nombrado y guardado como
ldquopET-30a(+)-N-AmyEdnardquo
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 68
6112 Disentildeo y construccioacuten de pETNL
En el extremo del peacuteptido sentildeal N-AmyE se le acoploacute la secuencia nucleotiacutedica de
la LnqQ por teacutecnicas de clonacioacuten molecular in silico Inicialmente el archivo
geneacutetico del gen lnqQ fue descargado (GenBank no AB2352011) y abierto en la
aplicacioacuten de SnapGene
A la secuencia nucleotiacutedica original de la lnqQ en el extremo 5rsquo-terminal
agregamos manualmente una secuencia que contiene el sitio de restriccioacuten BamHI
y riacuteo debajo de eacutesta agregamos un par de nucleoacutetidos (TT) Inmediatamente
despueacutes se colocoacute un codoacuten de inicio (ATG) y se antildeadieron los 52 residuos
restantes para un total de 53 de aminoaacutecidos que representan a LnqQ Justo en el
extremo C-terminal de esta bacteriocina se agregoacute una cola de polihistidina (H89-
H94) y un codoacuten de paro (TAG) En seguida se agregaron otro par de nucleoacutetidos
(TA) y se integroacute un sitio de restriccioacuten SalI Esta seccioacuten correspondioacute a un
fragmento lineal de 193 pb de la secuencia nucleotiacutedica que codifica para
LnqQ6xHis (Tabla 6)
Desde SnapGene realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten entre el
fragmento lineal de 193 pb con el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)N-AmyEdnardquo
Desde la aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten BamHI y SalI
Posteriormente el fragmento lineal fue cortado tambieacuten con el mismo conjunto de
enzimas de restriccioacuten y procedimos a clonar creando un vector de expresioacuten
nombrado y guardado como ldquopETNLdnardquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pETNL estaacute guardando en formato dna bajo el
nombre ldquopETNLdnardquo En este plaacutesmido se observan por los elementos geneacuteticos
propios de un vector pET30(a)+ en conjunto con los genes necesarios para la
construccioacuten N-AmyELnqQ
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Tabla 6 Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ (5rsquorarr3rsquo) Tamantildeo
pETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQL
LAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIKHH
HHHH
94
Los residuos subrayados representan el peacuteptido sentildeal Los residuos en negritas representan a LnqQ
6113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
Los resultados obtenidos del corte proteoliacutetico en el peacuteptido sentildeal N-AmyE fueron
contrastados con los datos de seis secuencias aminoaciacutedicas (Tabla 7) que teniacutean
el reporte de que este mismo peacuteptido sentildeal N-AmyE era cortado de manera
efectiva en cada una de ellas Tres de las secuencias corresponden a las
secuencias aminoaciacutedicas totales de tres α-amilasas reportadas en diferentes
cepas de B subtilis (Emori amp Maruo 1988 Kunst et al 1997 Yang et al 1983)
Dos de eacutestas corresponden a secuencias que se utilizaron para investigar queacute
aminoaacutecidos eran los necesarios para cortar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en ceacutelulas
de B subtilis o de E coli (Nakazawa et al 1986 Sakakibara et al 1993) La
uacuteltima corresponde a una construccioacuten sinteacutetica donde el peacuteptido sentildeal N-AmyE
fue utilizado para transportar liasa de pectina a la regioacuten periplaacutesmica de E coli (R
M Papi et al 2005)
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Tabla 7 Secuencias utilizadas para prediccioacuten de corte enzimaacutetico de N-
AmyELnqQ
Nombre Secuencia aminoaciacutedica
gtYang1983
(CAA234371)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPDDRRLRMEINSQSEKEIQFGKTYTIML
KGTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPAD
TDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtNakazawa1986
(PTUE33)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAQACPPETLVKVKDAEDQL
gtEmori1988
(CAA306431)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIEIRCNTFFQ
gtSakakibara1993
(PTUBE695)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASACAAPFNGTM
gtKunst1997
(NP_3881862)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPETAFKDGDQFTIGKGDPFGKTYTIMLK
GTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPADT
DTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtPapi2005 MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRIRMSYPESKLTGLTGFALAAKVTGGWAGPVVSITNLDQLKANIG
TVTPQVLVINSNISASSLTKVNMGANKTLIGSFQNRTLENIHLRATAQSQNIILQNLIFKHSANIKANDDIQVYLNY
GSKYWIDHCSFVGHSWSTTDGSEDKLLYIGEKADYATISNCFFGSHKYGLIFGHPADDNNAAFNGYPRLTLCHNRFD
NMEVRAPGLMRYGYFHVYNNYINKFHLGFTLAQNANILSESNYFGEGSQNNGMLDDKGSGTFTDTNSVPPITNQKSP
KAQWTATSNYAYTLKTAAQAKDFTQKNAGAQAAALVFGS
gtpETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWV
VSKIKQILGIKHHHHHH
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 71
En las bacterias existen dos mecanismos generales para la secrecioacuten de
proteiacutenas a traveacutes de la membrana citoplasmaacutetica En la viacutea de Secrecioacuten General
denominada como viacutea Sec las proteiacutenas son translocadas a la membrana en su
forma desnaturalizada y posteriormente son plegados en forma nativa en el lado
transversal de la membrana Mientras tanto en la viacutea de Translocacioacuten de
Gemelos Argininas conocida como viacutea Tat las proteiacutenas son translocadas en su
estado plegado nativo (Natale Bruumlser amp Driessen 2008)
De acuerdo con nuestros resultados (Tabla 8) el valor de calculado de prediccioacuten
de corte de peacuteptido sentildeal de las secuencias aminoaciacutedicas completas de tres α-
amilasas representan 09724 (Yang et al 1983) 09458 (Emori amp Maruo 1988) y
09724 (Kunst et al 1997) respectivamente De las secuencias parciales de
peacuteptidos sentildeales N-AmyE los resultados indican 08722 (Nakazawa et al 1986) y
06092 (Sakakibara et al 1993) Para la secuencia que se utilizoacute para exportar la
liasa de pectina al periplasma de E coli el valor calculado correspondioacute a 08262
(R M Papi et al 2005) en todas estas secuencias el mecanismo de secrecioacuten
general de proteiacutenas es el tipo Sec clase I Para nuestra proteiacutena N-AmyELnqQ
el valor calculado estimado fue de 04063 sin que fuera determinado su
mecanismo de corte predictivo Es decir nuestro valor calculado es mucho menor
a lo observado contra secuencias que habiacutean sido probados experimentalmente
Tabla 8 Prediccioacuten de corte enzimaacutetico de peacuteptido sentildeal N-AmyE
Identificacioacuten Prediccioacuten SecSPI TatSPI SecSPII Otro Pos
gtYang1983 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtNakazawa1986 SP(SecSPI) 08722 00359 00229 0069 33 y 34
gtEmori1988 SP(SecSPI) 09458 00122 0009 0033 33 y 34
gtSakakibara1993 SP(SecSPI) 06092 00428 01377 02103 31 y 32
gtKunst1997 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtPapi2005 SP(SecSPI) 08262 00183 00178 01377 31 y 32
gtpETNL Otro 04063 00249 00134 05554 Otro
SecSPI Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal I (Lep) TatSPI Translocoacuten Tat mediado por
Peptidasa de Sentildeal I (Lep) SecSPII Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal II (Lsp) Pos Sitio de
corte enzimaacutetico dentro de la estructura aminoaciacutedica lineal
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 72
612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
6121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo geneacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP estaacute guardado en formato dna
bajo el nombre ldquopET30a-SmbPdnardquo y estaacute flanqueado en el extremo 5rsquo-terminal
por el sitio de restriccioacuten NdeI y en el extremo 3rsquo-terminal por el sitio de restriccioacuten
NcoI El peacuteptido de fusioacuten estaacute dividido en dos secciones en el extremo N-terminal
estaacute compuesta por la regioacuten citoplasmaacutetica de la SmbP (SmbP) compuesta por
94 residuos seguido de dos residuos G95 y T96 riacuteo abajo inicia el extremo C-
terminal que estaacute compuesta por cinco residuos y representa al sitio de corte por
enteroquinasa (DDDDK)
6122 Disentildeo y construccioacuten de pSmbP-LnqQ
El archivo geneacutetico que contiene la bacteriocina LnqQ fue descargado de la base
de datos (GenBank no AB2352011) Inmediatamente en el extremo C-terminal
del peacuteptido de fusioacuten mediante la aplicacioacuten SnapGene antildeadimos manualmente
un residuo de alanina en la posicioacuten 102 y riacuteo debajo de eacutesta antildeadimos los 53
residuos que conforman el LnqQ iniciando con M103 En direccioacuten al extremo C-
terminal inmediatamente despueacutes del codoacuten de teacutermino (TAA) se agregoacute el sitio
de restriccioacuten XhoI Los elementos que componen la construccioacuten del pSmbP-
LnqQ (Tabla 9) estaacuten representados en el siguiente orden 5rsquo-NdeI-SmbP-DDDDK-
LnqQ-XhoI-3rsquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pSmbP-LnqQ estaacute guardado en formato dna bajo
el nombre ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01dnardquo En este plaacutesmido se observan por los
elementos geneacuteticos propios de un vector pET30(a)+
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 73
Tabla 9 Secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica del producto del vector de
expresioacuten (5rsquorarr3rsquo)
Tamantildeo
pSmbP-LnqQ MSGHTAHVDEAVKHAEEAVAHGKEGHTDQLLEHAKESLTHAKAAS
EAGGNTHVGHGIKHLEDAIKHGEEGHVGVATKHAQEAIEHLRASE
HKSHGTDDDDKAMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWL
NAGQAIDWVVSKIKQILGIK
155
Los residuos subrayados representan el peacuteptido de fusioacuten Los residuos resaltados representan el sitio de
corte de enteroquinasa Los residuos en negritas representan a LnqQ
6123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten de PeptideCutter se detectoacute un
uacutenico sitio de corte en la proteiacutena SmbP-LnqQ para la enzima enteroquinasa que
se encuentra ubicado en el residuo K101 lo cual coincide con lo esperado
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Los resultados sobre la identificacioacuten de codones de paro post disentildeo en la
construccioacuten de pETNL y pSmbP-LnqQ indicaron que no existe evidencia de
codones de paro ya que la aplicacioacuten en liacutenea logroacute identificar un marco de lectura
abierto con un tamantildeo de 285 pb que codifican para 94 aminoaacutecidos cuya
secuencia coincide con exactitud con la secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
para el caso de pETNL Mientras tanto un marco de lectura compuesto por un
tamantildeo molecular de 488 pb que se traducen para 155 aminoaacutecidos y cuya
secuencia coincide en su totalidad con la secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
De acuerdo con los resultados calculados por la aplicacioacuten de Compute pIMw tool
de ExPasy el peso molecular teoacuterico estimado del producto N-AmyELnqQ de
pETNL es de 1053468 Da con un punto isoeleacutectrico pi = 1063 mientras que para
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 74
el producto SmbP-LnqQ de pSmbP-LnqQ el peso estimado es de 1669771 Da
con punto isoeleacutectrico pI = 645
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
Seguacuten los resultados los iacutendices de solubilizacioacuten (Tabla 10) de N-AmyELnqQ y
del SmbP-LnqQ es de 0575 y 0865 respectivamente La aplicacioacuten sin embargo
clasifica a los productos del vector pETNL como invaacutelidos mientras que los
productos de pSmbP-LnqQ fueron considerados como solubles La razoacuten porque
la N-AmyELnqQ es considerado como invaacutelido se debe a que fue identificado
como proteiacutena de membrana En el caso de localizacioacuten celular (Tabla 11) los
pronoacutesticos indican que los productos producidos por pETNL y pSmbP-LnqQ se
encontraraacuten en membrana plasmaacutetica y en el citoplasma respectivamente
Tabla 10 Prediccioacuten de solubilidad N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Iacutendice Solubilidad
N-AmyELnqQ 0575 Invaacutelido
SmbP-LnqQ 0865 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice de solubilidad superior
a 045 es porque son considerados proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
Tabla 11 Prediccioacuten de localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Valor Localizacioacuten subcelular
N-AmyELnqQ 085 Membrana plasmaacutetica
SmbP-LnqQ 07 Citoplasma
Esto coincide con lo observado en los antecedentes ya que indican que las
proteiacutenas expresadas en E coli con el peacuteptido sentildeal N-AmyE en su regioacuten N-
terminal a menudo se localizan en el periplasma (Nakazawa et al 1986 R M
Papi et al 2005) Mientras que las proteiacutenas acopladas con el peacuteptido de fusioacuten
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 75
SmbP son reportadas para encontrarse en la regioacuten citoplasmaacutetica debido a que la
seccioacuten aminoaciacutedica que las orienta al periplasma fue removida de la secuencia
original de residuos quedaacutendose por tanto en el citoplasma celular de E coli
(Vargas-Cortez et al 2016)
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
El modelo estructural tanto en su forma secundaria (Figura 6) como tridimensional
(Figura 8) para N-AmyELnqQ asiacute como la presunta estructura secundaria (Figura
7) y tridimensional (Figura 10) para SmbP-LnqQ fueron revelados en este
documento En la estructura secundaria prevista para N-AmyELnqQ se espera
que el 96 de la secuencia esteacute compuesta por estructuras tipo α-heacutelices y se
estima que el 17 de la secuencia aminoaciacutedica total esteacuten embebidas en la
regioacuten transmembranal La evidencia predictiva de la N-AmyELnqQ (Figura 9) a
traveacutes de la aplicacioacuten Phyre2 indicoacute que los primeros 12 residuos del extremo N-
terminal estariacutean orientados en la regioacuten extracelular mientras que los residuos 15
al 30 estariacutean ubicados en regioacuten intermembranal entre el espacio extracelular y la
citoplasmaacutetica El resto de los residuos del extremo C-terminal estariacutean orientados
en la cara citoplasmaacutetica de la ceacutelula de E coli Mientras tanto la estructura
secundaria putativa para SmbP-LnqQ indica que el 85 de secuencia total estaacute
compuesta por α-heacutelices
En las estructuras tridimensionales putativas tanto para N-AmyELnqQ como en la
SmbP-LnqQ prevalece la formacioacuten de cuatro α-heacutelices Estos motivos
estructurales tipo α-heacutelices son comuacutenmente observados en bacteriocinas
similares a LnqQ (Lynch et al 2019) de manera que podemos predecir que la
estructura secundaria y tridimensional de la LnqQ no se ve afectada cuando estaacuten
acopladas tanto por N-AmyE como con SmbP
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Figura 6 Prediccioacuten de la estructura secundaria de N-AmyELnqQ
La estructura secundaria predicha del N-AmyELnqQ en Phyre2
Figura 7 Prediccioacuten de la estructura secundaria de SmbP-LnqQ
La estructura secundaria putativa del SmbP-LnqQ en Phyre2
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Figura 8 Prediccioacuten de estructura tridimensional de N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de N-
AmyELnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones
propuestas por modelo son de (Å) X29824 Y24988 Z25496
Figura 9 Prediccioacuten de heacutelices transmembranales para N-AmyELnqQ
La imagen es resultado de la prediccioacuten propuesta por Phyre2 para heacutelices transmembranales de N-
AmyELnqQ
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Figura 10 Prediccioacuten de estructura tridimensional de SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de SmbP-
LnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones propuestas
por modelo son de (Å) X32655 Y24988 Z25496
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
6171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Las ceacutelulas presuntamente transformadas fueron seleccionadas con kanamicina
De acuerdo con la evidencia presentada (Figura 11) los controles experimentales
cumplieron con su objetivo ya que no se registroacute crecimiento en placas de LB agar
esteacuteriles en el control negativo (Figura 11 a) en cuanto al control de viabilidad
eacuteste demostroacute que la electroporacioacuten no fue un factor significativo que causara la
muerte de ceacutelulas de E coli DH5α como BL21 (DE3) (Figura 11 b c) Por uacuteltimo
los controles con antibioacutetico demostraron que la kanamicina (50 microgml) era lo
suficientemente potente para seleccionar ceacutelulas (Figura 11 d e) Por uacuteltimo
demostramos bajo la teacutecnica de electroporacioacuten que las cepas de ceacutelulas de E
coli tanto BL21 (DE3) como DH5α fueron correctamente transformadas con los
vectores de expresioacuten pETNL (Figura 11 f g) pET30(a)+ (Figura 11 h j) y
pSmbP-LnqQ (Figura 11 i k) Los ensayos fueron realizados por triplicado
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Figura 11 Transformacioacuten de E coli DH5α y BL21 (DE3) con pET30a(+)
pETNL y pSmbP-LnqQ
Roacutetulo Descripcioacuten
a Control negativo
b Control viabilidad DH5α
c Control viabilidad BL21 (DE3)
d Control kanamicina + DH5α
e Control kanamicina + BL21 (DE3)
f DH5α + pETNL
g BL21 (DE3) + pETNL
h DH5α + pET30a(+)
i DH5α + pSmbP-LnqQ
j BL21 (DE3) + pET30a(+)
k BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ
Las placas rotuladas del a-c son placas LB con agar mientras que las placas d-k son placas LB
con agar suplementadas con kanamicina (50 microgml concentracioacuten final)
80
6172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Los ensayos para la extraccioacuten y purificacioacuten de los plaacutesmidos pET30(a)+ pETNL
y pSmbP-LnqQ de ceacutelulas de E coli que fueron observados en un gel de agarosa
1 (pv) Seguacuten la evidencia (Figura 12) nuestros controles demuestran que
tanto el plaacutesmido pETNL como el vector pSmbP-LnqQ se encontraban presentes
Los iacutendices de concentracioacuten y calidad de cada uno de los vectores fueron para
pET30(a)+ de 911 ngmicrol con A260A280 en 195 para el vector pETNL de 532 ngmicrol
con A260A280 en 194 y para el vector pSmbP-LnqQ de 2861 ngmicrol con A260A280 en
188 Seguacuten la literatura los iacutendices para considerar a un DNA plasmiacutedico como
puro deben tener valores espectrofotomeacutetricos de A260A280 entre 18-20 donde un
valor menor a 18 se considera como contaminacioacuten con proteiacutenas y un valor de
superior a 20 se considera contaminacioacuten por RNA (Koetsier Cantor amp Biolabs
sf) Podemos inferir que los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron recuperados en buena cantidad con un buen iacutendice de pureza
Figura 12 Gel de agarosa con plaacutesmidos
pETNL y pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer
TBE 1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Plaacutesmido pETNL
3 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
4 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli
BL21 (DE3) transformados con los vectores
de expresioacuten pETNL o pSmbP-LnqQ
El marcador de peso molecular corresponde
a 100-5000bp DNA Marker Plus Ready to
Use (Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
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6173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Seguacuten los resultados obtenidos por OligoAnalyzer Tool tras ajustar las
condiciones de los oligonucleoacutetidos a las especificaciones del fabricante del kit de
la polimerasa el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 promoter primer es de
20 pb con un contenido GC a 40 y un valor Tm = 591degC con un hairpin de -036
kcalmol a una Tm de 316degC y un valor homodiacutemero de -416 kcalmol Mientras
tanto el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 terminal primer es de 19 pb con
un contenido GC a 526 y un valor Tm = 61degC con un hairpin de 002 kcalmol a
una Tm de 248degC y un valor homodiacutemero de -474 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten NetPrimer el oligonucleoacutetido T7
promoter primer tiene un rating de eacutexito en 860 y presenta un valor de estabilidad
en su extremo 3rsquo-terminal de -87 kcalmol y no se identificoacute al hairpin el valor
homodiacutemero se registroacute en -759 kcalmol En el caso del oligonucleoacutetido T7
terminal primer este presenta un rating de eacutexito en 870 con un valor de
estabilidad en su extremo 3rsquo-terminal de -1142 kcalmol y tampoco se identificaron
hairpins el valor homodiacutemero se registroacute en -574 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los criterios habituales para seleccioacuten de oligonucleoacutetidos ambos
se mantuvieron en los estaacutendares ya que presentaron un tamantildeo entre 18 a 25 pb
con un hairpin cuyo valor de Tm fue menor a la Tm reportado para el
oligonucleoacutetido y los valores tanto de los homodiacutemeros y heterodiacutemeros nunca
fueron maacutes negativo o iguales a -9 kcalmol
En cuanto al caacutelculo de la Ta para ambos oligonucleoacutetidos utilizamos la regla
general de sustraer 5degC al Tm calculado para en ambos oligonucleoacutetidos Para el
caacutelculo de la Ta oacuteptimo para un par de oligonucleoacutetidos para un blanco en
particular se utilizoacute la siguiente foacutermula matemaacutetica TaOpt = 03 times (Tm de oligo) +
07 times (Tm producto) minus 149 donde el valor de Tm del oligonucleoacutetido es la
temperatura de fusioacuten del oligonucleoacutetido menos estable y la Tm es el valor del
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temperatura de fusioacuten del producto de PCR (Rychlik Spencer amp Rhoads 1990)
De esta manera promediamos el valor de la Tm de ambos oligonucleoacutetidos y el
resultado fue 60degC A este valor le sustrajimos 5degC para un Ta ajustado en 55degC
en los ensayos de PCR punto final para la identificacioacuten de los plaacutesmidos
Por uacuteltimo calculamos el total de ciclos y el tiempo de extensioacuten para los ensayos
de PCR punto final De acuerdo con las especificaciones del fabricante se debe
agregar 1 minuto por cada kb por sintetizar en los ensayos De esta manera
calculamos en primera instancia el tamantildeo molecular de los productos de los
ensayos de PCR de los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
para determinar el tiempo de extensioacuten Para lograr este objetivo realizamos una
reaccioacuten in silico de PCR punto final entre los dos oligonucleoacutetidos T7 con cada
uno de los vectores de expresioacuten utilizados
Los archivos geneacuteticos de los tres vectores de expresioacuten fueron abiertos desde la
aplicacioacuten de SnapGene y ejecutamos una PCR punto final in silico
Posteriormente corrimos una simulacioacuten de gel de agarosa al 1 De acuerdo con
los resultados de nuestra simulacioacuten (Figura 13) las bandas esperadas de los
productos lineales de PCR de los vectores de pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
se encontrariacutean entre 367 pb 488 pb y 651 pb respectivamente Con esto
confirmamos que ninguno de los productos de PCR esperados tendriacutea un tamantildeo
superior al 1 kb y procedimos a configurar la reaccioacuten para el ensayo de PCR
punto final
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Figura 13 Simulacioacuten de PCR para
vectores de expresioacuten
Gel de agarosa 10 generado desde
SnapGene
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Producto PCR de pET-30a(+)
2 Producto PCR de pETNL
3 Producto PCR de pSmbP-LnqQ
Las bandas corresponden a productos lineales
de PCR
El marcador de peso molecular in silico
corresponde a PCR DNA Ladder de GenScript
(Cat En desuso Estados Unidos) y fue tomado
desde la aplicacioacuten de SnapGene versioacuten 113
Asiacute pues configuramos las condiciones de corrida en el termociclador las cuales
fueron registradas de la siguiente manera una desnaturalizacioacuten inicial a 94degC por
180 s despueacutes 30 ciclos de desnaturalizacioacuten alineamiento y extensioacuten con
temperaturas en 94degC 55degC y 72degC respectivamente y sus respectivos tiempos de
reaccioacuten a 30 s 45 s y 30 s Finalmente se agregoacute una etapa de extensioacuten final
con una temperatura a 72degC por 420 s
6174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Despueacutes de realizar la teacutecnica de PCR punto final y una posterior corrida en un gel
de agarosa al 1 con buffer TBE 1X observamos una banda con tamantildeo de 367
pb para el producto de PCR obtenida del vector pET30(a)+ al tiempo que
recolectamos una banda de 488 pb para el producto de PCR del vector pETNL
(Figura 14) y finalmente encontramos una banda de 651 pb para el producto de
PCR del vector pSmbP-LnqQ (Figura 15) Dado que los valores predichos en la
simulacioacuten coinciden con los observado experimentalmente confirmamos que
nuestras cepas de E coli estaban efectivamente transformadas con su respectivo
vector de expresioacuten
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Figura 14 PCR de pETNL
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 PCR de pET30(a) virgen
3 PCR de pETNL
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
Figura 15 PCR de pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Control positivo pET30(a) vaciacuteo
3 Control positivo pETNL
4 Control negativo PCR pUC57-DPQ
5 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
6 Control negativo PCR pUC57-DPQ
7 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
Para los anaacutelisis de expresioacuten de proteiacutenas utilizamos algunos vectores de
expresioacuten que han sido exitosos en la produccioacuten de proteiacutenas Los vectores
pET30a-SmbP_LL-37 y pET30a-SmbP_MP1106 fueron amablemente compartidos
por David Antonio Peacuterez miembro del grupo de investigacioacuten PEP con sede en la
Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la UANL
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(Monterrey Nuevo Leoacuten) Similarmente el vector pET30NP-Hoc fue compartido
por Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros miembro del grupo de investigacioacuten
NBR con sede en el CIBYN (Apodaca Nuevo Leoacuten)
Dado que la informacioacuten de los tres plaacutesmidos se encuentra o se encontraba en
estado de revisioacuten al momento de redactar este documento por sus respectivos
comiteacutes de revisioacuten solo podemos limitarnos a mencionar los pesos moleculares
de los productos de cada vector de expresioacuten Para los dos vectores de David
Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) el peso molecular estimado de
ambos productos es 15 kDa mientras que el vector de Francisco Balderas el peso
molecular de su producto es de 95 kDa (F Balderas comunicacioacuten personal
2021)
6181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Para la induccioacuten por IPTG seguimos los protocolos preestablecidos para la
induccioacuten de proteiacutenas heteroacutelogas en ceacutelulas de E coli En nuestro ensayo la
concentracioacuten de IPTG elegida para la induccioacuten de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
correspondioacute a 01 mM Nosotros utilizamos esta concentracioacuten debido a que los
reportes indican que esta concentracioacuten es lo suficiente para saturar la reaccioacuten
bioloacutegica evitando la toxicidad celular por este compuesto (Malakar amp Venkatesh
2012) Los valores tiacutepicos de IPTG maacutes utilizados para la induccioacuten usualmente se
encuentran entre 05 mM y 10 mM (Mesa-Pereira et al 2018)
En nuestros cultivos el IPTG fue antildeadido en la fase exponencial tardiacutea (OD600 =
04-06) dado que el costo energeacutetico es maacutes alto durante la fase exponencial
temprana que en la tardiacutea (Malakar amp Venkatesh 2012) Ademaacutes se presume que
en esta fase el total de proteiacutenas producidas pueden alcanzar rendimientos
productivos superiores a 350 (Larentis et al 2014) Para nuestros ensayos
utilizamos dos temperaturas para inducir 37degC y 25degC y la razoacuten de utilizar una
temperatura maacutes baja es porque es un meacutetodo habitual para incrementar la
solubilidad de proteiacutenas recombinantes en E coli (Schein 1989)
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6182 SDS-PAGE de proteiacutenas periplaacutesmicas de E coli modificadas
con pETNL
Nuestros estudios preliminares bioinformaacuteticos indicaban que la proteiacutena N-
AmyELnqQ seriacutea insoluble (Tabla 10) y que tanto por sus antecedentes
(Nakazawa et al 1986 R M Papi et al 2005 Sjoumlstroumlm et al 1987) por sus
caracteriacutesticas moleculares estariacutea presuntamente ubicada en la regioacuten
periplaacutesmica de E coli (Tabla 11) Sin embargo nuestros resultados por ensayos
de SDS-PAGE indicaron que la induccioacuten por IPTG en ceacutelulas de E coli BL21
(DE3) transformados con el vector pETNL para la produccioacuten de N-AmyELnqQ
tanto en la fraccioacuten soluble como insoluble de proteiacutenas a una temperatura de
induccioacuten 25degC (Figura 16) como a 37degC (Figura 17) en la fraccioacuten periplaacutesmica
no fue posible en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) esta manifestacioacuten fue reportado
en muacuteltiples ocasiones De acuerdo con nuestros resultados no logramos
determinar la presencia de bandas de proteiacutenas en la regioacuten esperada que seguacuten
los anaacutelisis predictivos la proteiacutena N-AmyELnqQ debiacutea tener un peso molecular
cercano a 105 kDa
Es de mencionar que el valor de prediccioacuten de corte de peacuteptido sentildeal de la
proteiacutena N-AmyELnqQ fue muy inferior a los valores de prediccioacuten observados en
secuencias que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y que habiacutean sido previamente
validados experimentalmente (Tabla 8) Otro aspecto para considerar es que los
residuos reconocidos para el corte enzimaacutetico difieren entre los diferentes tipos de
bacterias (Nakazawa et al 1986) Esto quedoacute demostrado cuando observamos
que los residuos utilizados para el corte de este peacuteptido sentildeal podiacutean diferir
inclusive en el mismo tipo de bacteria Por ejemplo en la secuencia total de
aminoaacutecidos de la α-amilasa reportada por Yang y otros (Yang et al 1983) Emori
y otros (Emori amp Maruo 1988) y Kunst y otros (Kunst et al 1997) los residuos
observados corresponden al 33 y 34 mientras que para las secuencias de
aminoaacutecidos a los que se les fue acoplado el peacuteptido sentildeal en su regioacuten N-terminal
como las reportadas por Sakakibara y otros (Sakakibara et al 1993) y Papi y
otros (R M Papi et al 2005) los residuos de corte se ubicaron en la posicioacuten 31 y
32
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Figura 16 Gel de E coli BL21 (DE3) con pETNL inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
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Figura 17 Gel de E coli BL21 (DE3) pETNL inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
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6183 SDS-PAGE de proteiacutenas citoplaacutesmicas de E coli modificadas
con pSmbP-LnqQ
Los estudios preliminares predictivos para la produccioacuten heteroacuteloga de SmbP-
LnqQ en E coli indicaban que la presencia del peacuteptido de fusioacuten SmbP
aumentariacutea la solubilidad de la proteiacutena recombinante solubilidad (Tabla 10) y que
ademaacutes seriacutea localizado en el citoplasma celular (Tabla 11) con un peso
molecular aproximado de 167 kDa Nuestros resultados por ensayos de SDS-
PAGE indicaron que no hubo produccioacuten citoplasmaacutetica de una banda esperada
de 15 kDa tras inducir con IPTG a ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) transformados
con el vector pSmbP-LnqQ para la produccioacuten del peacuteptido SmbP-LnqQ tanto a
25degC como 37degC (Figura 18) Estos ensayos fueron realizados por triplicado
Esto nos orilloacute a plantearnos dos posibilidades con relacioacuten a la proteiacutena SmbP-
LnqQ la primera era que pudiera presentar problemas por plegamiento durante su
produccioacuten en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) y que la segunda fuera problemas
internos relacionados al IPTG Para demostrar la primera hipoacutetesis transformamos
ceacutelulas de E coli Origami con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ y utilizamos el
vector pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo este vector seguacuten su autor
produce una proteiacutena de un tamantildeo de 15 kDa en ceacutelulas de E coli Origami
debido a que es una proteiacutena problemaacutetica (datos no publicados) Nuestra
evidencia (Figura 19) sentildeala que el IPTG no es causa probable de la nula
produccioacuten debido a que se observoacute una banda muy definida en la regioacuten de los
15 kDa para las bacterias transformadas con el vector terminacioacuten MP1106 que
habiacutean sido inducidas por IPTG tanto a 25degC como 37degC Tampoco se observoacute
que la cepa Origami contuviera un factor bioloacutegico no considerado en la cepa
BL21 (DE3) que pudiera agilizar la produccioacuten de la proteiacutena SmbP-LnqQ ya que
no encontramos ninguna banda de un tamantildeo de 15 kDa en las ceacutelulas Origami
transformados
Ante los resultados previos consideramos posibilidad de que el problema se
encontrara especiacuteficamente en la cepa de E coli (DE3) presente en nuestro
laboratorio Para demostrar este punto procedimos a transformarla la cepa con el
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 90
vector de expresioacuten pET30NP-Hoc para fines de control positivo para nuestro
experimento Seguacuten su autor este vector de expresioacuten produce una proteiacutena lineal
de 95 kDa al inducirse por IPTG a 1 mM (datos no publicados) Nuestros
resultados en el gel SDS-PAGE muestran una banda de proteiacutenas extraiacutedas de E
coli transformados pET30NP-Hoc en la seccioacuten de 95 kDa y es producido tanto a
37degC (Figura 20) como a 25degC (Figura 21) Sin embargo no pudimos observar
ninguna banda sobre expresada de 10 kDa para las BL21 (DE3) transformadas
con pETNL ni una banda tampoco de 15 kDa para las bacterias transformadas con
pSmbP-LnqQ De esta manera descartamos la idea que existiera un problema
bioloacutegico procedente en la cepa de E coli BL21 (DE3) mantenida en nuestro
laboratorio
Se conoce que la bacteriocina LnqQ ya ha sido sujeta a modificaciones geneacuteticas
para incrementar su produccioacuten al ser clonada y expresada con eacutexito con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) registraacutendose
rendimientos hasta de 130 mg por litro de cultivo bacteriano (Ma et al 2012) Ante
la ausencia de una banda de proteiacutenas en la regioacuten de 15 kDa en nuestro vector
de expresioacuten con peacuteptido de fusioacuten SmbP-LnqQ se ha comentado que no existen
razones para suponer que todas las etiquetas de fusioacuten son aptas para todo tipo
de necesidades ya que es casi imposible determinar cuaacutel es el peacuteptido de fusioacuten
oacuteptimo para la produccioacuten Sin embargo una de las ventajas de utilizar peacuteptidos
de fusioacuten reconocidos es que son reconocidos sus ventajas y desventajas ya que
en algunos casos algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la solubilidad
de las proteiacutenas tales como TRX MBP NusA etc pero otros peacuteptidos sentildeales no
incrementan la solubilidad de la proteiacutena de intereacutes como GST BAP etc Incluso
algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la carga metaboacutelica en la ceacutelula
como GST MBP y NusA (Waugh 2005)
A pesar del buen registro experimental disponible sobre construcciones que
contienen el peacuteptido de fusioacuten SmbP (Vargas-Cortez et al 2016) suponemos en
nuestro caso en particular que dada las limitaciones de su corto historial
experimental auacuten no existe informacioacuten que determine las ventajas y desventajas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 91
pertinente al peacuteptido de fusioacuten SmbP para observar si son viables para la
produccioacuten solubilidad yo purificacioacuten de maacutes tipos de bacteriocinas
Figura 18 Gel de E coli BL21 (DE3) pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3)+ pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3) transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
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Figura 19 Gel de E coli Origami pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli Origami transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
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Figura 20 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 37degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 37degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 37degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 37degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 37degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 37degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 37degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 37degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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Figura 21 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 25degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 25degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 25degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 25degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 25degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 25degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 25degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 25degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de
proteiacutenas
Seguacuten el anaacutelisis fisicoquiacutemico de las secuencias aminoaciacutedicas que fueron
utilizadas en las construcciones para N-AmyE (Tabla 12) todas son de gran
tamantildeo y de alto peso molecular este peacuteptido se ha reportado para la
sobreexpresioacuten de AmyE en E coli (Nakazawa et al 1986) Asiacute como para la
sobreexpresioacuten de una regioacuten de 39 kDa que codifica para una regioacuten N-terminal
de una liasa de pectina (Pnl) en E coli (R Papi amp Kyriakidis 2003) a la fecha no
hemos visto alguacuten reporte de que este peacuteptido sentildeal haya sido utilizado para
producir proteiacutenas de bajo peso molecular
Por otro lado las secuencias que fueron exitosamente producidos con peacuteptido de
fusioacuten SmbP (Tabla 14) tambieacuten han mostrado ser uacutetil para producir proteiacutenas de
alto peso molecular o peacuteptidos de bajo peso molecular con actividad
antimicrobiana como VpDef (Montfort-Gardeazabal Claudio Casillas-Vega amp
Zarate 2020) Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al 2021) y muy recientemente LL-
37 (Perez-Perez et al 2021) el peacuteptido de fusioacuten tambieacuten ha demostrado ser
exitoso para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas de alto peso molecular como GFP y
RFP (Vargas-Cortez et al 2016) De esta manera consideramos que tanto el
tamantildeo como el peso molecular no son factores que intervengan durante el
proceso sobreproduccioacuten mediado tanto N-AmyE como con SmbP El punto
isoeleacutectrico tampoco parece ser un factor importante ya que el valor de AmyE es
aacutecido (561) mientras que Pnl es baacutesico (877) Situacioacuten similar sucede entre los
peacuteptidos microbianos puesto que VpDef es ligeramente aacutecido (686) en cambio el
resto de los peacuteptidos (Bin1b 949 LL-37 1061) son baacutesicos similar a LnqQ
Sin embargo observamos que tanto el iacutendice alifaacutetico (AI) como los valores del
iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) siacute son diferentes entre los distintos tipos de
peacuteptidos antimicrobianos Individualmente el valor AI de LnqQ es de 12115
(Tabla 12) y es superior al resto de los demaacutes peacuteptidos antimicrobianos con una
media de 5363 plusmn 3321) El valor AI para N-AmyELnqQ es de 11947 (Tabla 13) y
para SmbP-LnqQ es de 8323 (Tabla 15) respectivamente
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Tabla 12 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con N-AmyE
ID AmyE Pnl LnqQ
L 627 316 53
MW 6929711 3448665 589810
pI 561 877 1010
R(-) 69 21 2
R(+) 55 25 8
AI 6694 7636 12115
GRAVY -0648 -0291 +0300
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 13 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con N-AmyE
ID N-AmyEAmyE N-AmyEPnl N-AmyELnqQ
L 660 360 94
MW 7279942 3947961 1053468
pI 588 922 1063
R(-) 69 22 2
R(+) 58 30 12
AI 6982 8061 11947
GRAVY -0553 -0205 +0426
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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Tabla 14 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID VpDef Bin1b LL-37
L 49 45 37
MW 543498 520906 449332
pI 686 949 1061
R(-) 6 3 5
R(+) 6 9 11
AI 2388 4756 8946
GRAVY -0996 -0571 -0724
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 15 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID SmbP-VpDef SmbP-Bin1b SmbP-LL-37 SmbP-LnqQ
L 152 148 140 155
MW 1630268 1607675 1536102 1669471
pI 594 648 645 645
R(-) 26 23 25 22
R(+) 16 19 21 18
AI 5086 5878 1828 8323
GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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En cuanto al iacutendice de hidrofobicidad LnqQ mostroacute un valor GRAVY positivo
(+0300) mientras que el resto de los peacuteptidos antimicrobianos donde el valor
GRAVY promedio era de -073 plusmn 019 No es de sorprender que las bacteriocinas
del subgrupo de la familia de las aureocinas similares a A53 como LnqQ
aureocina A53 lacticina Z epidermicina NI01 lactolisterina BU y BHT-B tengan
valores GRAVY positivos (Perez Zendo amp Sonomoto 2018) Sin embargo cuando
LnqQ estaacute acoplado a N-AmyE el valor GRAVY se vuelve auacuten maacutes positivo con
+0426 (Tabla 13) y cuando estaacute fusionado con SmbP el valor GRAVY cambia a -
0514 (Tabla 15)
La literatura menciona que un peacuteptido o proteiacutena presenta un valor GRAVY
positivo debe considerarse como hidrofoacutebica mientras que un valor GRAVY
negativo significa que la proteiacutena es hidrofiacutelica (Kyte amp Doolittle 1982) De manera
que proteiacutenas con valores GRAVY negativos indican que la proteiacutena presenta una
estructura globular (hidrofiacutelicos) mientras que proteiacutenas con valores GRAVY
positivos indican la posibilidad que la proteiacutena guarde alguna relacioacuten con la
membrana (hidrofoacutebicos) (Enany 2014)
El valor GRAVY es considerado como el factor que maacutes influye en la movilidad de
las proteiacutenas en los geles de SDS-PAGE una proteiacutena con un valor GRAVY
negativo tiende a migrar maacutes lento que las proteiacutenas con valores positivos en los
geles para proteiacutenas (Shirai et al 2008) Las unioacuten de las moleacuteculas de SDS con
las proteiacutenas se produce a traveacutes de los aminoaacutecidos hidrofoacutebicos (Robinson amp
Tanford 2002) algunas estructuras hidrofoacutebicas son capaces de unir moleacuteculas
SDS hasta en un rango desde 34 a 10 g de SDS por 1 g de proteiacutena lo que
influiriacutea en una migracioacuten electroforeacutetica anoacutemala en los geles de SDS-PAGE
(Rath Glibowicka Nadeau Chen amp Deber 2009) LnqQ es una proteiacutena globular
(Acedo et al 2016) que utiliza la membrana especiacuteficamente para atacar
(Yoneyama Imura Ohno et al 2009) con lo que suponemos que el iacutendice de
hidrofobicidad pudiera estar afectando en el comportamiento electroforeacutetico de las
proteiacutenas Sin embargo tambieacuten la literatura sugiere que el comportamiento
anoacutemalo en las proteiacutenas de membrana en los geles de SDS-PAGE pudiera no
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 99
necesariamente relacionado a la carga neta de la proteiacutena ni a su iacutendice de
hidrofobicidad (Rath amp Deber 2013)
Al evaluar individualmente a LnqQ a traveacutes la escala Kyte-Doolittle observamos
que el peacuteptido posee dos secciones hidrofoacutebicas que se encuentran
aproximadamente entre los extremos del peacuteptido (entre residuos 5 al 15 y del 31 al
49) representando el 60 del total de la secuencia de LnqQ es hidrofoacutebica
(Figura 22) Si LnqQ estaacute acoplada con N-AmyE se observan las dos regiones
hidrofoacutebicas (entre residuos 9-50 y 66-85) que representa que el 6860 del total
de la secuencia sea hidrofoacutebica (Figura 23) Mientras tanto SmbP retiene sus dos
regiones hidrofoacutebicas que se ubican hacia la regioacuten C-terminal entre los residuos
103-117 y 133-151 componiendo el 2313 de total de la secuencia (Figura 24)
Dado que existe un reporte de produccioacuten exitosa entre la LnqQ acoplada con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO (Ma et al 2012) decidimos evaluar su valor AI GRAVY
y su escala Kyte-Doolittle Seguacuten los resultados de ProtParam para SUMO-LnqQ
los valores AI y GRAVY son de 8337 y -0516 respectivamente los cuales son
similares a lo reportado para SmbP-LnqQ Por otro lado seguacuten la escala Kyte-
Doolittle cinco regiones hidrofoacutebicas fueron descritas a lo largo de toda la
construccioacuten y estaacuten aproximadamente repartidas en toda la estructura lineal
entre los residuos 16-18 53-70 87-91 119-134 y 150-168 lo que representa el
28 del total de la secuencia (Figura 25) El valor GRAVY positivo y el alto
porcentaje de residuos hidrofoacutebicos para N-AmyELnqQ nos permite suponer que
estaacute proteiacutena se encontrariacutea anclada en la membrana celular lo que dificultariacutea su
solubilizacioacuten en los geles de proteiacutenas
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Figura 22 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la LnqQ
Figura 23 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de N-AmyELnqQ
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 10 20 30 40 50 60
Valo
r
Posicioacuten
LnqQ
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
N-AmyELnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 101
Figura 24 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SmbP-LnqQ
Figura 25 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SUMO-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SUMO-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Va
lor
Posicioacuten
SmbP-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Va
lor
Posicioacuten
SUMO-LnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 102
Ante la ausencia de una respuesta objetiva que explique la ausencia de bandas de
SmbP-LnqQ en los ensayos analizamos el perfil de aminoaacutecidos y detectamos
que la presencia de cisteiacutenas entre los peacuteptidos antimicrobianos tampoco fue un
factor determinante durante la sobreproduccioacuten con la SmbP ya que tanto VpDef
como Bin1b (que se caracterizan por ser abundantes en cisteiacutenas) como LL-37
(que no tiene cisteiacutenas) fueron exitosamente producidos El mapa de calor (Figura
26) sentildealoacute un alto porcentaje de Trp en LnqQ en comparacioacuten con los demaacutes
peacuteptidos antimicrobianos De acuerdo con la escala Kyte-Doolittle Trp es
considerado un residuo hidrofiacutelico (Kyte amp Doolittle 1982) cuando en realidad es
hidrofoacutebico por sus caracteriacutesticas uacutenicas (Mishra Choi Moon amp Baek 2018)
Este residuo funge como estabilizador de las proteiacutenas en la membranas anclaje
y orientacioacuten hacia el lado hidrofiacutelico de la bicapa lipiacutedica (Khemaissa Sagan amp
Walrant 2021) por eso son de alta importancia en proteiacutenas de membrana porque
apoyan en la estabilidad proteiacutena en la interfaz lipiacutedica por su forma riacutegida y plana
(Yau Wimley Gawrisch amp White 1998) Se presume que Trp permite que
peacuteptidos antimicrobianos similares a la aureocina A53 se mantengan unidos a la
membrana (Netz Bastos amp Sahl 2002) Sin embargo al analizar el porcentaje de
Trp entre N-AmyELnqQ SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ descubrimos que los
valores son muy similares 11 26 y 23 Por lo que Trp no seriacutea un factor
clave para que LnqQ sea producido en E coli
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
VpDef
Bin1b
LL37
LnqQ
Figura 26 Perfil aminoaciacutedico de los peacuteptidos antes de acoplarse con SmbPc
El mapa de calor representa la distribucioacuten de los residuos entre los peacuteptidos La intensidad del color negro
representa el porcentaje de residuos entre los peacuteptidos antes de ser acoplados con SmbP
Dada la similitud fisicoquiacutemica entre SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ abordamos el
problema desde el punto de vista analiacutetico otros autores demostraron que
proteiacutenas de peso molecular alto como N-AmyEPnl (R Papi amp Kyriakidis 2003) o
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 103
de peso molecular pequentildeo como SmbP-Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al
2021) SmbP-VpDef (Montfort-Gardeazabal et al 2020) SmbP-LL-37 (Perez-
Perez et al 2021) eran faacutecilmente observables mediante la teacutecnica de SDS-
PAGE hechos que utilizamos para la visualizacioacuten preliminar tanto N-AmyELnqQ
como de SmbP-LnqQ en los ensayos electroforeacuteticos Sin embargo en el reporte
de sobreproduccioacuten por SUMO-LnqQ los ensayos electroforeacuteticos preliminares
fueron realizados bajo la teacutecnica SDS-PAGE con Tricina (Ma et al 2012) Esta
variante es utilizada para resolver proteiacutenas con pesos moleculares pequentildeos que
oscilan entre 1 a 30 kDa (Haider Reid amp Sharp 2012) pero tambieacuten es uacutetil para
analizar proteiacutenas hidrofoacutebicas (Schaumlgger 2006) lo cual seriacutea un candidato ad
hoc a las caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas observadas de la LnqQ
Por uacuteltimo y no menos importante es tambieacuten de mencionar todas las
secuencias aminoaciacutedicas donde los peacuteptidos antimicrobianos tuvieron eacutexito con la
SmbP tienen su origen evolutivo en sistemas eucarioacuteticos las defensinas VpDef
(Zhang et al 2015) y Bin1b (Guo et al 2009) provienen del invertebrado
Venerupis philippinarum y del epidiacutedimo de la rata Rattus norvegicus
respectivamente mientras que la catelicidina LL-37 proviene del sistema inmune
de chimpanceacutes y humanos (Agerberth et al 1995) nuestra LnqQ posee un origen
procariota a traveacutes de Lactococcus lactis QU5 (Fujita et al 2007) Las defensinas
estaacuten compuestas por estructuras tipo beta plegadas mediadas por cisteiacutenas
conservadas mientras que los dominios antimicrobianos de las catelicidinas son
estructuralmente lineales carentes de puentes disulfuro y estaacuten compuestas por
varias heacutelices (Dorin McHugh Cox amp Davidson 2014) LnqQ es una estructura
lineal compuesta por dos heacutelices anfipaacuteticas (Perez et al 2014) por lo que el
factor estructural tampoco seriacutea un factor clave salvo por el hecho de que
provienen de oriacutegenes evolutivos distintos
A manera de conclusioacuten de acuerdo con la evidencia recolectada tanto a nivel
bioinformaacutetico como experimental encontramos que el marco de lectura de los
vectores para la produccioacuten de N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ estaban
correctamente orientados y dispuestos en sus marcos de lecturas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 104
correspondientes los geles de poliacrilamida siacute fueron efectivos para detectar
proteiacutenas con un peso similar (lisozima 144 kDa) a los peacuteptidos de nuestras
construcciones (N-AmyELnqQ= 1053 kDa y SmbP-LnqQ= 1669 kDa)
Confirmamos que el IPTG siacute es capaz de inducir la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
de control tanto en cepas de E coli BL21 (DE3) como de Origami tanto a 25degC
como a 37degC De manera que tanto N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ suponemos
que siacute son producidas pero por caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas propias de la LnqQ
es posible que 1) dado su alta hidrofobicidad es posible que N-AmyELnqQ se
mantenga acoplada en la membrana celular lo que dificultariacutea su solubilizacioacuten en
los geles de SDS-PAGE 2) desde el punto de vista analiacutetico es posible que SDS-
PAGE no sea la teacutecnica oacuteptima para la visualizacioacuten de las proteiacutenas hidrofoacutebicas
3) no existe informacioacuten conclusiva que respalde soacutelidamente porqueacute SmbP-LnqQ
no logroacute ser sobreproducida utilizando E coli como organismo heteroacutelogo
productor
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 105
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES
El biosensor disentildeado de ceacutelulas de E coli basado en la deteccioacuten de moleacuteculas
de QS es capaz de producir LnqQ en base a la concentracioacuten externa de AIP
excretada por MRSA La capacidad del biosensor estaacute mediada por un vector de
expresioacuten disentildeado que lleva por nombre Dual Biosensor-Killer Este plaacutesmido
ademaacutes puede ser utilizado para la construccioacuten de otros biosensores que
compartan el objetivo de detectar y destruir otros patoacutegenos productores de
sentildeales tipo QS Seguacuten nuestros anaacutelisis bioinformaacuteticos in silico nuestro
biosensor estaacute capacitado para detectar y destruir cepas de S aureus que sean
productoras de moleacuteculas de sentildealizacioacuten tipo AIP clase II De acuerdo con
nuestros pronoacutesticos nuestra cepa modificada seriacutea capaz de producir secretar y
ser capaz de ser resistente a la produccioacuten de LnqQ debido a que la maquinaria
geneacutetica se mantuvo intacto Nuestros resultados revelan indican que la LnqQ
seraacute lo suficientemente soluble cuando sea sobreexpresado Por uacuteltimo
determinamos que no existen epiacutetopos para ceacutelulas tipo B ni riesgo de
alergenicidad De esta manera la LnqQ producida por este sistema bioloacutegico es
aparentemente seguro para ser utilizado como un potencial candidato a agente
terapeacuteutico Los resultados in silico motivan al desarrollo y disentildeo de nuevos
agentes antimicrobianos a traveacutes de biosensores de ceacutelulas enteras para eliminar
patoacutegenos tanto sensibles como resistentes a los antibioacuteticos A pesar de los
favorables resultados reportados en publicaciones anteriores y la evidencia
predictiva sobre el peacuteptido sentildeal N-AmyE y con el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la
produccioacuten de proteiacutenas recombinantes como la bacteriocina LnqQ dichas
observaciones no pueden ser aplicadas para la produccioacuten expresioacuten y
purificacioacuten desde ceacutelulas de E coli BL21 (DE3)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 106
ANEXOS
Divulgacioacuten de la investigacioacuten
Publicaciones
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UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 107
Archivos de disentildeo
Todos los archivos gestionados para los disentildeos estaacuten guardados en su formato
correspondiente adentro de la carpeta de ldquoDoctoral ndash Anexosrdquo la cual fue anexada
propiamente en el disco compacto
Se elaboroacute una carpeta nombrada ldquoBioBricks and Modulesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 61 hasta 610 y estaacute subdivida
en cuatro subcarpetas nombradas como ldquoBioBricks (secuencias originales)rdquo
ldquoModulesrdquo ldquoPlasmidsrdquo ldquoTemplatesrdquo y el ldquoDual Biosensor Killerdnardquo Estos archivos
fueron elaborados a traveacutes de la aplicacioacuten de SnapGene 113 y estaacuten guardados
en formato dna Tambieacuten entregamos dos documentos en formato PDF que
contienen la secuencia nucleotiacutedica optimizada de todos genes usados para el
moacutedulo de biosensor y para el moacutedulo de bacteriocina
Se creoacute una carpeta nombrada ldquoSignal and fusion peptidesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 611 hasta 618 y en esta se
encontraraacute la subcarpeta ldquoMapa Geneacutetico de vectores de expresioacuten de expresioacuten
pETNL y pSmbP-LnqQrdquo Ademaacutes se entregaron tres archivos PDF donde dos de
eacutestos archivos contienen datos predictivos de la estructura secundaria y terciaria
de los productos de pETNL ldquoPhyre2 pETNLpdfrdquo y de pSmbP-LnqQ ldquoPhyre2
pSmbP-LnqQrdquo a traveacutes de la aplicacioacuten en liacutenea Phyre2 y el otro archivo PDF
ldquoSimulacioacuten agarosa 1pdfrdquo que contiene una simulacioacuten en gel de agarosa 1
(pv) de los productos lineales de los vectores de expresioacuten pET30a(+) pETNL y
pSmbP-LnqQ En la carpeta de este capiacutetulo tambieacuten se entregaron cinco archivos
en formato dna que contienen la informacioacuten nucleotiacutedica de la construccioacuten de
los vectores de expresioacuten cuyos nombres son ldquopET30(a)-NAmyE-LnqQ
pETNLpdfrdquo ldquopET-30a(+)pdfrdquo ldquopET-30a(+)-N-AmyEpdfrdquo ldquopET30a-SmbPpdfrdquo y
ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01pdfrdquo Todos los archivos estaacuten marcados con sus
respectivas caracteriacutesticas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 108
Resumen autobiograacutefico
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
Candidato para el grado de
Doctor en Ciencias con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Tesis Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing de
Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Edad 31 antildeos
Campo de estudio Desarrollo de agentes terapeacuteuticos y biologiacutea sinteacutetica
Biografiacutea Nacido en Monterrey Nuevo Leoacuten el diacutea 24 de julio de 1990 hijo de
Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas
Educacioacuten Egresado de Licenciado en Biotecnologiacutea Genoacutemica (UANL) en el
2013 y Maestro en Ciencias con Acentuacioacuten en Microbiologiacutea (UANL) en 2015
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 109
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UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 138
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada v
inteligentes que puedan atacar patoacutegenos de resistencia Con relacioacuten al
peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP observamos que nivel
predictivo ambos eran candidatos potenciales para la produccioacuten periplaacutesmica y
citoplaacutesmica de LnqQ en ceacutelulas de E coli respectivamente Sin embargo
nuestros resultados experimentales demostraron que la bacteriocina LnqQ no
logroacute ser producida ni purificada cuando estuvo acoplada con N-AmyE o SmbP
Estos resultados enriquecen la literatura sobre ambas etiquetas proteicas asiacute
como tambieacuten descubrimos puntos a consideracioacuten que pudieran ser
importantes en afectar la produccioacuten y purificacioacuten cuando LnqQ es acoplada
con diferentes etiquetas proteicas en ceacutelulas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vi
PRESENTACIOacuteN
CONTROL POBLACIONAL Y OSCILATORIO UTILIZANDO EL QUORUM
SENSING DE Staphylococcus aureus MEDIANTE UN CIRCUITO GENEacuteTICO
DE Escherichia coli
Presentado por
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
El presente proyecto fue mayormente realizado en las instalaciones del
Laboratorio de Biologiacutea Sinteacutetica y de Sistemas del Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con la asesoriacutea del Dr Joseacute Rubeacuten
Morones Ramiacuterez y en el menor medida en el Laboratorio de Expresioacuten y
Purificacioacuten de Proteiacutenas unidad perteneciente a la Facultad de Ciencias
Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con apoyo del Dr Xristo
Zaacuterate Kalfoacutepulos Este proyecto fue auspiciado por el Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) mediante el apoyo con el Beca Nacional de
Posgrado (nuacutemero de becario 289476)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vii
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) por el apoyo
brindado con la Beca Nacional de Posgrado con nuacutemero de becario 289476
(CVU no 516171) para la continuacioacuten de estudios
A la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) y a la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten (UANL) por el apoyo otorgado con la aprobacioacuten de becas y por el
uso directo e indirecto de sus instalaciones materiales y equipos
Al Dr Joseacute Rubeacuten Morones Ramiacuterez mi asesor a quien agradezco por la
oportunidad de colaborar en el equipo de investigacioacuten Nanobiotechnology
Research Group (NBR) Externo mi agradecimiento por las asesoriacuteas y el uso
de instalaciones equipos y materiales en el Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea (CIBYN) asiacute como el financiamiento para la
obtencioacuten de materiales de experimentacioacuten y ejecucioacuten de servicios y el
mejoramiento de mi vida profesional
Al MC Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros y al Dr Angel Leoacuten Buitimea
miembros del NBR y quienes fueron clave en la elaboracioacuten de este proyecto
asiacute como en los artiacuteculos cientiacuteficos redactados durante el proceso doctoral
Al Dr Xristo Zaacuterate Kalfoacutepulos miembro del comiteacute tutorial por su apoyo
teacutecnico y asesoriacutea por el equipo de investigacioacuten del Laboratorio de Expresioacuten y
Produccioacuten de Proteiacutenas (PEP) El agradecimiento se extiende a David Peacuterez
Bryan Santos y Jessica Goacutemez por sus importantes contribuciones
A los demaacutes miembros NBR asiacute como del comiteacute tutorial por sus comentarios
revisiones y asesoriacuteas en la elaboracioacuten de este proyecto
A mis padres Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas y a mi
hermano Angel Alejandro Beniacutetez Chao por su apoyo emocional e
incondicional en el transcurso de este proyecto
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada viii
DEDICATORIA
Para Dios iexclGracias por el don de pensar
Para mi mamaacute Lupita y mi papaacute Alejandro
Para mis hermanos Angel Alejandro y Jesuacutes Alejandro (+)
Para mis mejores amigos Esthela Maldonado Ricardo ldquoMankisrdquo Garciacutea Ricardo ldquoCiegordquo
Garciacutea Edgar ldquoBomboacutenrdquo Villareal Gerardo ldquoPepisrdquo Villarreal Mayela ldquoMonkeyrdquo Maldonado
Aniluacute Maldonado Eduardo Mendoza Alejandra Villarreal Isaac ldquoBebordquo Gonzaacutelez Cristy Llanes
Salma Alemaacuten iexclGracias por ser tan importantes para miacute
Para mis colegas del NBR muy en especial para Paco Balderas Angel Leoacuten Javier Garza
Paco ldquoNegrordquo Rodriacuteguez Dago Torres Luis Cepeda Albert Lerma Jordy Lerma Ceacutesar Garza
Alex de la Garza Isabel Caamal Gricelda Mendiola Fatemehalsadat Tabatabaeifar Hossein
Alishaharatobotni Nahid Rafiei y otros maacutes Se extiende la dedicatoria a mis colegas en PEP en
especial para David Peacuterez Jessica Goacutemez Brayan Santos Evelyn Martiacutenez
Para los que fueron mis estudiantes de verano o de servicio social con mencioacuten especial para
Montse Villegas Rauacutel Garciacutea Cinthia Castillo Sarai Fierros Jessica Ojeda y otros maacutes
Para mis colegas de generacioacuten de doctorado en especial para Paco Balderas David Peacuterez y
Gaby Quintanilla
Para el equipo administrativo del CIBYN con menciones especiales para Karla Islas y Mayra
Sandoval asiacute como de todo el equipo de intendencia muy en especial para la Sra Antonia
ldquoTontildeitardquo Sandoval y la Sra Martha Flores asiacute como para el guardia Nehemiacuteas y el chofer
Ernesto
Para el equipo administrativo de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
con mencioacuten especial para Karina Navarro y para la Sra Edmunda de intendencia
Para mis queridos perros muy en especial para Lucky Toby (+) y Pelusa (+)
Para mis ex alumnos de preparatoria del Centro Escolar Gante iexclLo logreacute
Para todos los que han trabajado como meseros y repartidores para continuar con sus estudios
yo sostener una familia iexclUstedes tienen mis maacutes sinceros respetos
Para todos los que han roto rompen y romperaacuten los liacutemites de lo conocido
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada ix
Si nos negamos categoacutericamente a reconocer que somos susceptibles de
cometer un error una equivocacioacuten profunda ndash nos acompantildearaacute siempre Pero
si somos capaces de evaluarnos con un poco de coraje por muy lamentables
que sean las reflexiones que podamos engendrarnos nuestras posibilidades
mejoran enormemente
Carl Sagan
El mundo y sus demonios La ciencia como una luz en la obscuridad (1995)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada x
TABLA DE CONTENIDO
PORTADA I
FIRMAS DE APROBACIOacuteN DE TESIS II
FIRMAS DE REVISIOacuteN DE TESIS III
CONTRAPORTADA IV
RESUMEN IV
PRESENTACIOacuteN VI
AGRADECIMIENTOS VII
DEDICATORIA VIII
TABLA DE CONTENIDO X
LISTA DE FIGURAS XIV
LISTA DE TABLAS XV
LISTA DE ABREVIATURAS XVI
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN 1
11 ERA DE LOS ANTIBIOacuteTICOS 1
12 INFECCIONES RESISTENTES A LOS ANTIBIOacuteTICOS AMENAZA MUNDIAL 2
13 PROBLEMA SANITARIO CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTES 4
14 TRATAMIENTOS ACTUALES PARA EL COMBATE A INFECCIONES RESISTENTES 5
15 TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS A LOS ANTIBIOacuteTICOS 6
CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES 8
21 CONTROL BIOLOacuteGICO POBLACIONAL POR MICROORGANISMOS 8
22 BIOLOGIacuteA SINTEacuteTICA Y SU PAPEL EN PRODUCCIOacuteN DE BACTERIOCINAS 8
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica 8
222 Definicioacuten de los biosensores 9
23 QUORUM SENSING COMUNICACIOacuteN ENTRE CEacuteLULAS 10
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus 11
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD 12
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA 12
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada 12
24 BIOSENSORES DE CEacuteLULAS ENTERAS BASADOS EN DETECCIOacuteN DE QS 13
25 LAS BACTERIOCINAS 15
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas 15
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos 17
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xi
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes 19
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos 19
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas 20
256 La bacteriocina Lacticina Q 21
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados 22
26 PRODUCCIOacuteN HETEROacuteLOGA DE BACTERIOCINAS 23
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE 24
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP 25
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS 26
31 Justificacioacuten 26
32 Hipoacutetesis 28
33 Objetivo General 28
34 Objetivos Especiacuteficos 28
35 Metas 29
36 Aportacioacuten cientiacutefica 29
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA 30
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 30
42 Cepas bacterianas 30
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina 31
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 33
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas 33
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 34
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 34
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 34
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 35
410 Prediccioacuten de alergenicidad 35
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 35
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 37
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 38
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 38
415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 39
418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 44
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en los geles 48
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xii
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS 50
51 Materiales y reactivos 50
52 Equipos de laboratorio 51
53 Lugares de experimentacioacuten 53
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos 53
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES 54
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 54
62 Cepas bacterianas 55
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina 55
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 57
65 Optimizacioacuten de los codones nativos 60
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 61
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 64
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 64
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 65
610 Prediccioacuten de alergenicidad 67
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 67
612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 72
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 73
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 73
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 74
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 75
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 78
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 84
619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de proteiacutenas 95
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES 105
ANEXOS 106
Divulgacioacuten de la investigacioacuten 106
Archivos de disentildeo 107
Resumen autobiograacutefico 108
REFERENCIAS 109
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiii
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 CONCEPTO DEL BIOSENSOR BASADO EN CEacuteLULAS ENTERAS 30
FIGURA 2 SISTEMA QS PARA DETECCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE S AUREUS 54
FIGURA 3 MOacuteDULOS BIOSENSOR Y DE BACTERIOCINA 55
FIGURA 4 ESTRATEGIA DE CONSTRUCCIOacuteN IN SILICO 58
FIGURA 5 REPRESENTACIOacuteN ESQUEMAacuteTICA DEL VECTOR DUAL BIOSENSOR-KILLER 59
FIGURA 6 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE N-AMYELNQQ 76
FIGURA 7 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE SMBP-LNQQ 76
FIGURA 8 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE N-AMYELNQQ 77
FIGURA 9 PREDICCIOacuteN DE HEacuteLICES TRANSMEMBRANALES PARA N-AMYELNQQ 77
FIGURA 10 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE SMBP-LNQQ 78
FIGURA 11 TRANSFORMACIOacuteN DE E COLI DH5Α Y BL21 (DE3) CON PET30A(+) PETNL Y PSMBP-LNQQ 79
FIGURA 12 GEL DE AGAROSA CON PLAacuteSMIDOS PETNL Y PSMBP-LNQQ 80
FIGURA 13 SIMULACIOacuteN DE PCR PARA VECTORES DE EXPRESIOacuteN 83
FIGURA 14 PCR DE PETNL 84
FIGURA 15 PCR DE PSMBP-LNQQ 84
FIGURA 16 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON PETNL INDUCIDO A 25degC 87
FIGURA 17 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PETNL INDUCIDO A 37degC 88
FIGURA 18 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 91
FIGURA 19 GEL DE E COLI ORIGAMI PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 92
FIGURA 20 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 37degC 93
FIGURA 21 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 25degC 94
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xv
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 USO DE CODONES PREVIO Y DESPUEacuteS DE LA OPTIMIZACIOacuteN 61
TABLA 2 PREDICCIOacuteN DE COMUNICACIOacuteN CRUZADA 63
TABLA 3 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD DE PROTEIacuteNAS 64
TABLA 4 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN SUBCELULAR DE PROTEIacuteNAS 65
TABLA 5 PREDICCIOacuteN DE EPIacuteTOPOS DE CEacuteLULAS B EN LNQQ 66
TABLA 6 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE N-AMYELNQQ 69
TABLA 7 SECUENCIAS UTILIZADAS PARA PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE N-AMYELNQQ 70
TABLA 8 PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE PEacutePTIDO SENtildeAL N-AMYE 71
TABLA 9 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE SMBP-LNQQ 73
TABLA 10 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
TABLA 11 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN CELULAR N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvi
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Significado
E coli Escherichia coli
S aureus Staphylococcus aureus
MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina
L lactis Lactococcus lactis
ESKAPE Acroacutenimo de seis especies bacterianas Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
QS Quorum Sensing (Percepcioacuten de Quoacuterum)
LnqQ Lacticina Q
agrBDCA Operoacuten agr de S aureus
agrB Gen que codifica AgrB
agrD Gen que codifica AgrD
HSL Moleacutecula homo serilactonado
AIP Moleacutecula autoinductora
agrC Gen que codifica AgrC
agrA Gen que codifica AgrA
AgrB Transportadora proteasa necesaria para la maduracioacuten de AgrD
AgrD Peacuteptido precursor a la moleacutecula autoinductora
AgrC Receptor transmembranal con actividad histidina quinasa
AgrA Proteiacutena reguladora de unioacuten al DNA de respuesta
AgrA-P AgrA fosforilado
pH Potencial de hidroacutegeno
pI Punto isoeleacutectrico
AMP Peacuteptidos antimicrobianos
kDA Kilo Dalton
MIC Concentracioacuten miacutenima inhibitoria
microM Micromolar
microgml Microgramo por mililitro
lnqRQBCDEF Cluacutester geneacutetico
AmyE Alfa-amilasa
N-AmyE Peacuteptido sentildeal de la AmyE
SmbP Proteiacutena pequentildea de unioacuten a metales
SmbP Regioacuten citoplaacutesmitica de la SmbP (peacuteptido de fusioacuten)
Ala33 Las letras indican el aminoaacutecido y los nuacutemeros la posicioacuten en la cadena
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranoacutesido
SBP Massachussets Institute of Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts
KEGG Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes
FPB FP Base
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvii
PDB Protein Data Bank
nm Nanoacutemetros
DBK Plaacutesmido Dual Biosensor Killer
CAI Caacutelculo de Iacutendice de Adaptacioacuten
CUD Codon Usage Database
BUSCA Bologna Unified Subcellular Component Annotador
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
pET30(+)a Plaacutesmido tipo pET30(+)a sin modificaciones
pETNL Plaacutesmido que contiene N-AmyELnqQ6xHis
pSmPc-LnqQ Plaacutesmido que contiene SmbP-LnqQ
LB Medio de cultivo LB
OD600 Densidad oacuteptica
microl Microlitros
microg Microgramos
degC Grados Celsius
h Hora
ml Mililitro
g Gramo
g Fuerza centriacutefuga relativa
rpm Revoluciones por minuto
min Minuto
dNTPs Trifosfatos de desoxinucleoacutetidos
V Volts
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
pv Peso volumen
NaCl Cloruro de sodio
Tris-HCl Solucioacuten de Tris ajustada con aacutecido clorhiacutedrico (HCl)
M Molar
SDS Dodecil Sulfato Soacutedico
APS Persulfato de amonio
TEMED Tetramethylethylenediamine
X Veces de concentracioacuten de trabajo
mm Miliacutemetros
lnqQ Gen de lacticina Q
P2 Promotor 2 inducible del operoacuten agr de S aureus
gfp Gen de GFP
GFP Proteiacutena verde fluorescente
J23110 Promotor J23110 constitutivo para E coli
AIP-I AIP clase I
AIP-II AIP clase 2
AIP-III AIP clase 3
AIP-IV AIP clase 4
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Ala Alanina (A)
Arg Arginina (R)
Asn Asparagina (N)
Asp Asparato (D)
Cys Cisteiacutena (C)
Gln Glutamina (Q)
Glu Glutamato (E)
Gly Glicina (G)
His Histidina (H)
Ile Isoleucina (I)
Leu Leucina (L)
Lys Lisina (K)
Met Metionina (M)
Phe Fenilalanina (F)
Pro Prolina (P)
Ser Serina (S)
Thr Treonina (T)
Trp Triptoacutefano (W)
Tyr Tirosina (Y)
Val Valina (V)
Pnl Liasa de pectina
AmyE Amilasa E
N-AmyEPnl Liasa de pectina asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
N-AmyEAmyE Amilasa E asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
VpDef Defensina de Venerupis philippinarum
Bin1b Defensina de Rattus norvegicus
LL-37 Catelicidina de humanoschimpanceacutes
SmbP-VpDef VpDef asociado con SmbP
SmbP-Bin1b Bin1b asociado con SmbP
SmbP-LL-37 LL-37 asociado con SmbP
SUMO-LnqQ LnqQ asociado con SUMO
AI Iacutendice alifaacutetico
GRAVY Iacutendice de hidrofobicidad
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN
A lo largo de nuestra historia los humanos hemos desarrollado soluciones a los
problemas del mundo que nos rodea No es extrantildeo que el combate a las
enfermedades sean uno de los temas maacutes recurrentes Existen referencias
histoacutericas entre las diferentes civilizaciones de la antiguumledad como los chinos
(Nicola amp Abagyan 2009) aztecas (Davidson amp De Montellano 1983) y los nubia-
sudaneses (Bassett Keith Armelagos Martin amp Villanueva 1980) del uso
empiacuterico de sustancias para tratar infecciones y enfermedades Hace unos
doscientos antildeos atraacutes se pensoacute que los subproductos de la revolucioacuten industrial
seriacutean tratamiento efectivo contra infecciones y aunque los resultados fueron
alentadores al principios los resultados observados ante otro tipo de infecciones
no tuvieron el mismo eacutexito (Gaynes 2017)
11 Era de los antibioacuteticos
En 1928 Alexander Fleming encontroacute una solucioacuten efectiva para contrarrestar las
infecciones al describir al hongo Penicillium notatum que teniacutea efectos antagoacutenicos
sobre diferentes cepas estafilocoacutecicas (Fleming 1929) inaugurando asiacute la
conocida era dorada en descubrimiento de los antibioacuteticos (Podolsky 2018) Las
virtudes observadas en los antibioacuteticos fueron raacutepidamente puestas en juicio
cuando el mismo Fleming vaticinoacute en su discurso de entrega al premio Nobel que
el abuso y uso excesivo de los antibioacuteticos podriacutea generar brotes de patoacutegenos
resistentes a los antibioacuteticos (Fleming 1945) Cada vez que un nuevo antibioacutetico
era liberado a los sistemas de salud puacuteblicos pronto se reportaba un brote de
resistencia relacionado a antibioacutetico (Clatworthy Pierson amp Hung 2007) Con el
boom de nuevas clases de antibioacuteticos desde los 1940s hasta principios de 1970s
la alerta por resistencia a los antibioacuteticos quedoacute praacutecticamente inadvertida De
hecho entre los 1960s y 1970s existe evidencia que la comunidad cientiacutefica
internacional fue apaacutetica y minimizoacute el hecho de que el abuso de los antibioacuteticos
fuera una causa de resistencia a los faacutermacos en las bacterias patoacutegenas
(Podolsky 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 2
El tema de la resistencia a los antibioacuteticos no tuvo impacto suficiente hasta que
con el paso de las deacutecadas surgieron de brotes de patoacutegenos resistentes de
importancia cliacutenica como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA
por sus siglas en ingleacutes) tanto en Reino Unido (Gardner Oxon Stamp Bowgen amp
Moore 1962) como en Estados Unidos (Barrett McGehee amp Finland 1968) y
ademaacutes las nuevas clases de antibioacuteticos empezaron a escasear desde los 1980s
hasta casi los 2000s Adicionalmente los inversionistas se motivaron a encontrar
nuevas clases antibioacuteticos al observar maacutes ganancias en descubrir compuestos
anticanceriacutegenos (Ventola 2015) los reglamentos sanitarios se volvieron maacutes
estrictos para la liberacioacuten de antibioacuteticos para prevenir la presentacioacuten de
infecciones multirresistentes emergentes (Davies 2006) Todos estos factores
incluyendo otros que tal vez no fueron mencionados allanaron el establecimiento
de poliacuteticas en salud puacuteblica para buscar o sintetizar alguacuten faacutermaco o sustancia
que contrarreste el avance de microorganismos patoacutegenos resistentes de
relevancia cliacutenica (World Health Organization 2017)
12 Infecciones resistentes a los antibioacuteticos amenaza mundial
Cifras de la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) mostraron el peligroso
ascenso de infecciones por bacterias resistentes en las uacuteltimas deacutecadas donde se
calcula un promedio de 700000 muertes anuales para el 2019 (World Health
Organization 2019b) y la advertencia de que si los gobiernos y organizaciones
responsables de la salud puacuteblica a nivel mundial no elaboran poliacuteticas efectivas
para el 2050 tendremos un promedio de 10 millones de muertes al antildeo por
consecuencias de este tipo de infecciones (Dadgostar 2019)
En Meacutexico carecemos de un sistema de recoleccioacuten de datos confiables en este
tipo de infecciones (Amabile-Cuevas 2010) pero en un estudio realizado durante
seis meses del 2019 se recuperaron 23000 cepas resistentes a faacutermacos en 47
centros de salud puacuteblicos de todo el paiacutes siendo algunas de las maacutes comunes E
coli Klebsiella sp Enterobacter sp Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter sp
Enterococcus faecium resistente a vancomicina y Staphylococccus aureus
resistente a meticilina (MRSA) (Vazquez-Rodriguez et al 2018)
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En todas las regiones del mundo las infecciones resistentes han tenido un
peligroso ascenso En Estados Unidos las muertas anuales por infecciones
resistentes pasaron de 23000 muertes en 2013 (Frieden 2013) a 35000 durante
el 2019 (CDC 2019) Por otro lado en Europa las muertes atribuibles a
infecciones resistentes aumentaron de 25000 en 2007 (European Centre for
Disease Prevention and Control 2009) a 33110 en 2015 (Cassini et al 2019) En
42 paiacuteses del continente africano se registraron 54000 casos atribuibles a
tuberculosis multirresistente (MDR multi-resistant) y en ocho paiacuteses se registraron
3200 muertes relacionadas a la variante extremadamente resistente (XDR
extreme resistant) en un periacuteodo del 2004 al 2011 (Ndihokubwayo et al 2013) En
el continente asiaacutetico en China por ejemplo el rango de bacterias aislados que
eran resistentes a los antibioacuteticos pasoacute de 22774 casos a 190610 de 2005 a
2017 respectivamente (Qu Huang amp Lv 2019) en la India un estudio reporta
que el 70 de aislados cliacutenicos tipo Gram negativos son resistentes a los
faacutermacos y entre ellos se podiacutean encontrar cepas de Escherichia coli Klebsiella
pneumoniae Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa (Taneja amp
Sharma 2019)
Las infecciones resistentes son material incluso de intereacutes para el sector
econoacutemico El Banco Mundial ha elaborado dos escenarios para predecir el
impacto econoacutemico de las infecciones resistentes para el 2050 en un escenario
de bajo impacto el Producto Interno Bruto (PIB) mundial podriacutea disminuir hasta un
11 Sin embargo en un escenario de alto impacto el dantildeo al PIB global podriacutea
representar hasta una disminucioacuten de 38 Los costos al sistema de salud
puacuteblico en el mundo podriacutean oscilar entre los $300 mil millones a $1 cuatrilloacuten
presentando incluso un serio riesgo para el sector ganadero ya que en el
escenario de bajo impacto esto representariacutea una disminucioacuten de 26 esperado
a un 75 en un escenario de alto impacto (The World Bank 2016)
Las infecciones resistentes representa un punto de intereacutes incluso para la
Organizacioacuten de la Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
Food and Agriculture Organization) ya que actualmente se presume que en 42
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paiacuteses donde existen datos confiables de consumo de antibioacuteticos en el sector
ganadero y de agricultura se estima que en el 2010 el consumo era de 63000
toneladas de antibioacuteticoantildeo mientras que para el 2030 se estima un consumo
105600 toneladas de antibioacuteticoantildeo representando un incremento de 67 Los
iacutendices de metabolizacioacuten de antibioacuteticos tanto en ganado como en produccioacuten
pesquera presentan una baja metabolizacioacuten ya que entre un 70-80 y un 75-
90 respectivamente son excretados a las fuentes acuiacuteferas La produccioacuten de
cultivos consume entre un 02 a 04 del total de antibioacuteticos en relacioacuten con la
produccioacuten ganadera (FAO sf)
La relevancia sanitaria mundial de S aureus es porque se trata de un miembro del
grupo ESKAPE un grupo de patoacutegenos localizados en infraestructuras
hospitalarias asilos o en equipos e instrumentos meacutedicos como ventiladores y
cateacuteteres y que son habitualmente resistentes a los antibioacuteticos (Rice 2008) Esta
bacteria es la primera causa nosocomial tanto en Latinoameacuterica (26)
Norteameacuterica (260) y la segunda causa nosocomial de Europa (195)
(Biedenbach Moet amp Jones 2004) Se presume que un 30 de la poblacioacuten total
de humanos estaacute colonizado con al menos una subespecie de S aureus
(Wertheim et al 2005) y esto podriacutea ser porque el haacutebitat de esta bacteria en los
humanos es la parte anterior de las fosas nasales (Mulcahy amp McLoughlin 2016)
13 Problema sanitario con Staphylococcus aureus resistentes
S aureus es una bacteria Gram positiva y es considerada una de las principales
causas de enfermedades en piel (Foster 1996) Ademaacutes es capaz de desarrollar
biopeliacuteculas en dispositivos implantados en seres humanos y cateacuteteres causando
infecciones croacutenicas y persistentes (Dunne 2002) La osteomielitis y periodontitis
tambieacuten son producto de la biopeliacutecula este patoacutegeno estaacute involucrado en heridas
croacutenicas en pacientes diabeacuteticos con uacutelceras y estaacute relacionado a infecciones al
endocardio oculares y en casos de rinosinusitis croacutenica (Archer et al 2011) Se
considera que es un patoacutegeno de alto riesgo para pacientes con Fibrosis Quiacutestica
ya que es el maacutes reportado entre personas con 11 a 15 antildeos con esta condicioacuten
(Razvi et al 2009)
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Ahora bien se estima que entre un 13 al 74 del total de infecciones resistentes
en el mundo son causados por una variante resistente de S aureus resistente a la
meticilina la cepa MRSA (Koumlck et al 2010) la cual estaacute es sentildealada desde el
2017 por la OMS como un patoacutegeno de alta prioridad al que debe encontrarse una
solucioacuten pronta y efectiva (World Health Organization 2017) Por ejemplo en
Estados Unidos el total de pacientes por infecciones nosocomiales tipo MRSA
ascendioacute de 24 en 1975 a un 29 en 1991 (Panlilio et al 1992) y hasta casi
57 para el antildeo 2000 (NNIS 2004) En la actualidad el MRSA es considerado
endeacutemico en ese paiacutes ya que se estima que el 2 de la poblacioacuten es acarreador
de este estafilococo (Kavanagh 2019)
En Meacutexico los primeros casos de MRSA asociado a comunidad (CA-MRSA) cepa
USA300 fueron reportados a inicios del 2008 (Mariacutea E Velazquez-Meza et al
2011) y durante el 2010 un estudio anuncioacute que la cepa de MRSA maacutes
frecuentemente aislada en nuestro paiacutes era la New YorkJapan (Rodriacuteguez-
Noriega et al 2010) Tambieacuten se conoce que cepas de MRSA en hospitales
puacuteblicos en nuestro paiacutes fluctuoacute entre un 7 al 30 en pacientes entre las
deacutecadas de 1980s a 2000s (M E Velazquez-Meza et al 2004) mientras que el
Instituto Nacional de Cancerologiacutea determinoacute que 17 de las cepas aisladas de
3000 hemocultivos recuperados entre el 2005 al 2015 de pacientes con caacutencer
correspondiacutean a MRSA (Velaacutezquez-Acosta Cornejo-Juaacuterez amp Volkow-Fernaacutendez
2018)
14 Tratamientos actuales para el combate a infecciones
resistentes
En la actualidad las clases maacutes comunes de antibioacuteticos para combatir
infecciones resistentes a los antibioacuteticos son las penicilinas cefalosporinas
quinolonas macroacutelidos tetraciclinas glucopeacuteptidos y monobactaacutemicos (Taylor
Stapleton amp Paul Luzio 2002) En las uacuteltimas dos deacutecadas se han aprobado una
gran variedad de antibioacuteticos para el tratamiento de infecciones causados por
bacterias tanto Gram positivos como Gram negativos Los antibioacuteticos maacutes
recientemente reportados para el tratamiento de bacterias multirresistentes Gram
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positivas incluyen β-lactaacutemicos (ceftarolina y ceftobiprol) glicopeacuteptidos
(dalbavancin oritavancin y telavancin) oxazolidinonas (tedizolid fosfato)
quinolonas (besifloxacina delafloxacin y ozenoxacina) y tetraciclinas
(omadaciclina) (Koulenti et al 2019) Seguacuten la OMS hasta el 2019 se sabe de 50
agentes antimicrobianos que se encuentran en desarrollo cliacutenico donde 32 son
antibioacuteticos activos contra patoacutegenos de prioridad de la OMS diez son agentes
bioloacutegicos 2 son clasificados como agentes novedosos y dos pertenecen al grupo
de bacterias Gram negativas multirresistentes (World Health Organization 2019a)
15 Tratamientos alternativos a los antibioacuteticos
Los patoacutegenos resisten a los antibioacuteticos bajo tres grandes mecanismos de
resistencia intriacutenseca adaptativa yo adquirida (Arzanlou Chai amp Venter 2017
Blair Webber Baylay Ogbolu amp Piddock 2015 Sandoval-Motta amp Aldana 2016)
Es por ello que urge desarrollar una solucioacuten pronta y efectiva para contrarrestar
las infecciones causadas por patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos los cuales
son uno de los puntos que la OMS ha declarado como prioritarios (OrsquoNeill 2016)
En la guerra contra la resistencia a los antibioacuteticos nuestro grupo de investigacioacuten
ha participado en la creacioacuten de compuestos que puedan combatirlos como
tratamientos mixtos de antibioacuteticos (Montelongo-Peralta Leoacuten-Buitimea Palma-
Nicolaacutes Gonzalez-Christen amp Morones-Ramiacuterez 2019) nanopartiacuteculas de plata
asociados con metales de transicioacuten (Javier A Garza-Cervantes et al 2017)
nanomateriales asociados con nanopartiacuteculas de plata sintetizados con poliacutemeros
sensibles al ambiente (Ruben Morones amp Frey 2007) o producidos de manera
sustentable (Escaacutercega-Gonzaacutelez et al 2018) o a partir de un exopolisacaacuterido
producido por una levadura que actuacutea como agente reductor y que estaacuten
capeados por agentes con actividad antimicrobiana y antibiopeliacutecula (Javier
Alberto Garza-Cervantes et al 2019)
Otros grupos de investigacioacuten tambieacuten han desarrollado otro tipo de armas contra
la resistencia a los antibioacuteticos como el uso de teacutecnicas de decorado en
bacterioacutefagos (phage display) para producir vacunas en la caacutepside de
bacterioacutefagos inhabilitados (Bao et al 2019) o uso de agentes de control bioloacutegico
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contra patoacutegenos de alimentos (Gutieacuterrez Fernaacutendez Rodriacuteguez amp Garciacutea 2019)
o para el tratamiento de aguas residuales (Jassim Limoges amp El-Cheikh 2016)
Los esfuerzos actuales se han focalizado en encontrar yo desarrollar nuevas
clases de antibioacuteticos y agentes antimicrobianos contra bacterias resistentes (Fair
amp Tor 2014) y de prioridad ante la OMS (World Health Organization 2017) Las
corrientes alternativas a los antibioacuteticos maacutes reconocidas en la actualidad estaacuten
clasificadas en dos grandes enfoques el enfoque de prevencioacuten a las
enfermedades donde se desarrollan y se utilizan vacunas probioacuteticos o
prebioacuteticos mientras que en el enfoque por tratamiento a las enfermedades se
utilizan la terapia de fagos la aplicacioacuten directa de endolisinas yo exolisinas el
uso de microorganismos depredadores vivos o el uso directo de bacteriocinas
(Allen Trachsel Looft amp Casey 2014) Tambieacuten la Biologiacutea Sinteacutetica se ha
involucrado en resolver la problemaacutetica de infecciones resistentes a los faacutermacos
al participar en el disentildeo de biosensores basados en ceacutelulas completas que sean
capaces de destruir patoacutegenos mediante la previa de deteccioacuten de moleacuteculas
excretadas por microrganismos de intereacutes (Beniacutetez‐Chao Balderas‐Cisneros
Leoacuten‐Buitimea amp Morones‐Ramiacuterez 2021)
La biosiacutentesis purificacioacuten y aplicacioacuten de bacteriocinas contra patoacutegenos Gram
negativos y Gram positivos ha sido punto central para diversos grupos de
investigacioacuten (Cabral Penumutchu Norris Morones-Ramirez amp Belenky 2018
McAuliffe et al 1998 Rea Ross Cotter amp Hill 2011 Sandiford amp Upton 2012
Wong et al 2015) asiacute como la siacutentesis de nanocompuestos como liposomas
quitosano y nanopartiacuteculas hechos a base de compuestos de plantas (Sidhu amp
Nehra 2017) o de nanofibras (Fahim Khairalla amp El-Gendy 2016) que esteacuten
acomplejados con bacteriocinas Maacutes adelante se describiraacuten detalles sobre las
bacteriocinas y su relacioacuten en el combate a las infecciones resistentes a los
antibioacuteticos
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CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES
21 Control bioloacutegico poblacional por microorganismos
En la Naturaleza todos los seres vivos estaacuten interactuando y compitiendo por
nichos ecoloacutegicos para sobrevivir crecer y reproducirse para una adaptacioacuten
efectiva en el ambiente donde se desarrollan Este fenoacutemeno es universal ya que
pueden encontrarse en estilos de vida unicelulares y multicelulares (Grice et al
2009) Para competir por los nutrientes los microorganismos contienen
compuestos que matan o limitan el crecimiento de otra poblacioacuten Estos
compuestos pueden ser antibioacuteticos peacuteptidos antimicrobianos moleacuteculas de bajo
peso molecular entre otros maacutes (Gonzalez et al 2011 2010)
Cuando microorganismos vivos por sus caracteriacutesticas bioloacutegicas son usados para
suprimir la densidad poblacional de un tipo especiacutefico de organismo hacieacutendolo
menos abundante o dantildeino se le conoce como control bioloacutegico Es importante
mencionar que esta definicioacuten solo incluye a especiacutemenes vivos como
depredadores paraacutesitos nemaacutetodos hongos bacterias protozoarios inclusive
virus Sin embargo genes sin un recipiente bioloacutegico o metabolitos producidos por
un organismo de control sin que eacuteste se encuentre presente durante el control
poblacional son excluidos de esta definicioacuten (Eilenberg Hajek amp Lomer 2001)
Por ejemplo cultivos de Candida albicans (Peters et al 2010) Pseudomonas
aeruginosa (Filkins et al 2015) Bacillus subtilis (Gonzalez et al 2011)
Enterococcus faecium (Viccedilosa et al 2018) Acanthamoeba polyphaga (de Souza
Soares Benitez amp Rott 2017) disminuyeron la expresioacuten de patogenicidad en S
aureus Incluso cultivos de E coli han mostrado actividad fungicida contra cultivos
de C albicans (Cabral et al 2018)
22 Biologiacutea Sinteacutetica y su papel en produccioacuten de bacteriocinas
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica
La Biologiacutea Sinteacutetica consiste en disentildear libreriacuteas de elementos geneacuteticos como
promotores secuencias codificadoras terminadores factores de transcripcioacuten
entre otras maacutes asiacute tambieacuten se enfoca en el ensamblaje de circuitos geneacuteticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 9
hasta en el disentildeo y creacioacuten de organismos completos Este campo utiliza datos
cuantitativos para crear modelos bioloacutegicos y matemaacuteticos que permitan predecir
el comportamiento de un sistema bioloacutegico (Cameron Bashor amp Collins 2014
Garciacutea-Granados Lerma-Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2019)
En la publicacioacuten de Brophy y Voigt se revisan los principios baacutesicos para el
disentildeo de circuitos geneacuteticos para que los sistemas bioloacutegicos sean emulados
para cumplir con tareas o puedan fabricar materiales es importante considerar la
correcta eleccioacuten de reguladores asiacute como puntos de control que cuantifiquen el
impacto en el rendimiento (Brophy amp Voigt 2014)
222 Definicioacuten de los biosensores
Un sensor quiacutemico es un dispositivo que transforma en una informacioacuten quiacutemica
en una sentildeal analiacutetica de utilidad y puede detectar desde la concentracioacuten de una
muestra especiacutefica hasta el anaacutelisis total de sus compuestos Este tipo de
sensores contiene dos unidades funcionales baacutesicas un receptor y un transductor
El receptor transforma la informacioacuten quiacutemica de la muestra en una forma de
energiacutea que puede ser medido por un transductor El transductor transforma la
energiacutea en una sentildeal analiacutetica uacutetil (Hulanicki Glab amp Ingman 1991) De esta
manera comprendemos que un biosensor es ldquoun dispositivo que a traveacutes de
reacciones especiacuteficas de enzimas aisladas sistemas inmunes tejidos organelos
o ceacutelulas enteras sirve para detectar compuestosrdquo (IUPAC 1992)
Asiacute en los biosensores basados en ceacutelulas completas un analito de intereacutes
ingresa al interior celular y es reconocido por un factor transcripcional el cual
controla la transcripcioacuten de un gen mediante el reconocimiento de un promotor
especiacutefico Estos biosensores pueden reconocer diferentes analitos como
hidrocarburos metales pesados antibioacuteticos (Garnier-Rocha 2019) Incluso
algunos modelos biosensores se han aprovechado del fenoacutemeno de quorum
sensing para crear sistemas de comunicacioacuten sinteacuteticos con la capacidad de
controlar poblaciones (Balagaddeacute et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 10
23 Quorum Sensing Comunicacioacuten entre ceacutelulas
El concepto QS refiere a que es un mecanismo de comunicacioacuten entre
microorganismos que dependen de sentildeales quiacutemicas (moleacuteculas sentildealizadoras)
que son excretadas al medio extracelular y que dependen la densidad celular
(Fuqua Winans amp Greenberg 1994) Las bacterias similares a organismos de
diferentes dominios se sostienen de mecanismos de comunicacioacuten y se valen de
diferentes moleacuteculas Esta interaccioacuten puede ser intriacutenseca (es decir intracelular o
adentro de la misma ceacutelula) o extriacutenseca (es decir extracelular o afuera de la
ceacutelula) y crea un fenotipo de respuesta en una poblacioacuten especiacutefica del mismo
(Fuqua et al 1994)
Mientras los cultivos productores de QS esteacuten creciendo eacutestos pueden producir
excretar acumular y detectar moleacuteculas de sentildealizacioacuten quiacutemicas externas
conocidas como autoinductores los cuales son producidos a niveles basales pero
que se acumulan en el exterior celular Cuando la densidad celular de bacterias y
la concentracioacuten de moleacuteculas autoinductoras alcanzan un umbral de
concentracioacuten especiacutefico el cultivo experimenta un cambio en su fenotipo (Garg
Manchanda amp Kumar 2014 Rutherford amp Bassler 2012) Esta respuesta variacutea
seguacuten el tipo de sentildeal emitido ya que su forma y composicioacuten quiacutemica es diferente
seguacuten la especie que la produzca (Fuqua et al 1994) siendo las respuestas maacutes
comunes la formulacioacuten de esporulados factores de virulencia asociados a
invasioacuten bioluminiscencia virulencia yo la creacioacuten biopeliacuteculas (Miller amp Bassler
2002)
El fenoacutemeno de QS sucede tanto en bacterias productoras Gram negativas y las
Gram positivas pero las moleacuteculas auto inductoras son de diferente composicioacuten
quiacutemica En las bacterias Gram negativas las moleacuteculas de sentildealizacioacuten son
conocidas como homoserina lactonada aciladas (HSL) mientras que en bacterias
Gram positivas el mecanismo es a traveacutes de peacuteptidos excretados (Miller amp
Bassler 2002)
En el modelo general de QS en Gram positivos en primera instancia el gen que
contiene el precursor de la moleacutecula sentildealizadora (tambieacuten conocido como
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 11
autoinductor inmaduro) es transcrito y traducido y eacutesta es posteriormente
parcialmente hidrolizada para crear un autoinductor maduro Eacuteste uacuteltimo es
enviado al exterior celular por un transportador tipo ABC Cuando la concentracioacuten
del autoinductor maduro alcanza un umbral miacutenimo de activacioacuten una proteiacutena
tipo quinasa sensor de histidina localizada en el exterior celular detecta la
presencia de eacutesta mediante un sistema a dos componentes El sensor quinasa se
auto fosforila en un residuo conservado de histidina (H) Despueacutes este grupo
fosforilo es transferido a una proteiacutena reguladora de respuesta adyacente la cual
es fosforilada en un residuo conservado de aspartato (D) La proteiacutena reguladora
de respuesta fosforilado activa la transcripcioacuten de los genes de intereacutes (Miller amp
Bassler 2002)
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus
En S aureus estaacute gobernado por el operoacuten agr que es de un tamantildeo nucleotiacutedico
de 35 kb y se compone de dos unidades transcriptoacutemicas divergentes conocidos
como RNAII y RNAIII los cuales estaacuten gobernados por los promotores P2 y P3
respectivamente (Le amp Otto 2015) El promotor P2 estaacute involucrado en actividades
del QS mientras que el promotor P3 se encarga de la expresioacuten de factores de
virulencia (Miller amp Bassler 2002) como produccioacuten de hemolisinas proteasas
lipasas e indirectamente participan en la liberacioacuten de biopeliacuteculas (Quave amp
Horswill 2014) A nivel geneacutetico la induccioacuten del operoacuten agr depende
parcialmente por la unioacuten de los productos geacutenicos del operoacuten sar en los dos
promotores disponibles del operoacuten agr (Manna Bayer amp Cheung 1998)
El promotor P2 es el de importancia para el sistema QS debido a que el transcrito
resultante agrBDCA produce cuatro proteiacutenas AgrB AgrD AgrC y AgrA los
cuales son los componentes principales del sistema de QS de S aureus A
manera de resumen podemos en global que AgrC y AgrA participan como
elementos biosensores mientras que AgrB y AgrD son los elementos necesarios
para la biosiacutentesis de AIP El AgrD es un peacuteptido precursor a la moleacutecula
autoinductora (AIP por sus siglas en ingleacutes) y el AgrB funciona transportadora
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como proteasa y estaacute involucrada en la maduracioacuten del AIP (Gomes-Fernandes
et al 2017 Horswill Stoodley Stewart amp Parsek 2007)
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD
El gen que produce AgrD se expresa y se traduce en una versioacuten propeacuteptido de la
moleacutecula AIP que sufre de una modificacioacuten postraduccionalmente para que sea
bioloacutegicamente activo La moleacutecula AIP inmadura se compone de tres secciones
conocidas como regioacuten del peacuteptido liacuteder regioacuten madura del AIP y secuencia de
reconocimiento que corresponden a las regiones N- central y C-terminales
respectivamente (B Wang amp Muir 2016)
El AgrD es inicialmente procesado en la regioacuten N-terminal (se compone de 32
residuos) y sirve de guiacutea Eacuteste es translocado a la cara externa de la membrana
celular Mientras la regioacuten peptidasa de la proteiacutena transmembranal AgrB
reconoce la regioacuten N-terminal del AIP inmaduro
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA
AgrC y AgrA funcionan en conjunto con un sistema claacutesico de dos componentes
Donde la proteiacutena transmembranal tipo receptor con actividad histidina quinasa
AgrC se encarga de que detectar las moleacuteculas AIP liberadas al exterior por S
aureus una vez acoplado el AIP con el receptor eacuteste uacuteltimo causa una
autofosforilacioacuten del dominio citoplasmaacutetico del AgrC seguido de la transferencia
del grupo fosfato de la proteiacutena reguladora de respuesta de unioacuten al DNA AgrA
Una vez que AgrA es fosforilado (AgrA-P) eacuteste se une a la regioacuten intergeacutenica de
los promotores P2 y P3 del operoacuten agr (Gomes-Fernandes et al 2017)
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada
Bioquiacutemicamente el AgrD inmaduro tiene un tamantildeo entre 46 a 47 residuos seguacuten
su clase Despueacutes de procesamiento AgrD maduro tiene un tamantildeo final entre 7 a
8 aminoaacutecidos (que variacutea seguacuten la clase) y contiene un anillo tiolactonado
producto de la condensacioacuten entre un grupo tiol de una cisteiacutena interna ubicada
cuatro aminoaacutecidos antes del uacuteltimo aminoaacutecido y el grupo carboxilo del uacuteltimo
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aminoaacutecido (que puede ser metionina o fenilalanina dependiendo la clase) (B
Wang Zhao Novick amp Muir 2015)
En AgrC el dominio que contiene los elementos para deteccioacuten del receptor de la
moleacutecula AIP produce diferentes formas de propeacuteptidos De esta manera se
deduce que cada moleacutecula de AIP producida depende de su propia proteiacutena
detectora AgrC Por tanto la presencia en el medio de moleacuteculas de AIP que no
estaacuten filogeneacuteticamente relacionadas resultan en la inhibicioacuten de QS Es decir
miembros productores del mismo tipo de AIP pueden inducir el comportamiento
tiacutepico por QS pero si los productores no pertenecen al mismo grupo se puede
inhibir su respuesta Este fenoacutemeno es conocido como comunicacioacuten cruzada
(Rutherford amp Bassler 2012) La regioacuten hipervariable del operoacuten agr estaacute ubicado
en el transcrito gobernado por el promotor P2 entre los genes agrC agrD y agrB
Consensualmente se ha determinado cuatro grandes clases de AIP y permite
clasificar a los tipos de S aureus en base a esta regioacuten (Shopsin et al 2003)
24 Biosensores de ceacutelulas enteras basados en deteccioacuten de QS
A continuacioacuten presentamos una compilacioacuten de publicaciones de diferentes
ceacutelulas que fueron modificadas para actuar como biosensores capaces de detectar
moleacuteculas producidas por organismos productores de sentildeales quiacutemicas tipo QS
algunos de los ejemplos mencionados cuentan con la capacidad de producir yo
liberar sustancias antimicrobianas capaces de destruir al productor de esas
sentildeales
Balagaddeacute y otros disentildearon un sistema de comunicacioacuten sinteacutetico conocido como
depredador y presa en la que dos ceacutelulas modificadas de E coli son capaces de
comunicarse -y matar a una de ellas- a traveacutes del sistema de QS En este modelo
las ceacutelulas asignadas como depredadoras producen y liberar moleacuteculas tipo QS
que se difunden en el medio y al llegar a la ceacutelula presa por sus mecanismos
internos activan la produccioacuten una toxina especiacutefica para la ceacutelula asignada como
presa provocaacutendoles la muerte celular Por otro lado las ceacutelulas presas para
evitar su muerte temprana deben producir constantemente una proteiacutena antitoxina
que anule la actividad de la toxina (Balagaddeacute et al 2008)
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Saeidi y sus colaboradores crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basados en la
deteccioacuten del QS al modificar ceacutelulas de E coli para que detectaran moleacuteculas
3OC12 HSL producidas por P aeruginosa En este sistema las moleacuteculas QS son
difundidas a traveacutes del medio y son reconocidas por un factor de transcripcioacuten en
E coli que activa una unidad transcripcional para producir piocianina un
antibioacutetico especiacutefico con actividad contra P aeruginosa y porina E7 un agente
liacutetico especiacutefico contra E coli a medida que aumenta la concentracioacuten de la
moleacutecula QS incrementa la concentracioacuten del antibioacutetico y de la porina Cuando
se acumula suficiente cantidad de porinas en el interior celular las ceacutelulas de E
coli son lisadas y se libera piocianina para finalmente atacar a las ceacutelulas de P
aeruginosa (Saeidi et al 2011) Dos antildeos maacutes tarde Gupta y sus colaboradores
modificaron este biosensor agregando un moacutedulo de excrecioacuten que libera una
sustancia antimicrobiana al exterior a traveacutes de un peacuteptido sentildeal y atacar
especiacuteficamente a P aeruginosa evitando la muerte de la ceacutelula productora de
antibioacutetico (S Gupta Bram amp Weiss 2013)
Marchand y sus colegas crearon un sistema de comunicacioacuten interespeciacutefico para
la interaccioacuten entre dos bacterias con oriacutegenes evolutivos diferentes Bacillus
megaterium (Gram positiva) y E coli (Gram negativa) utilizando el mecanismo del
operoacuten agr de S aureus En este reporte ceacutelulas de E coli fungieron como
productoras de moleacuteculas de QS al expresar las proteiacutenas AgrD y AgrB que en
condiciones nativas producen moleacuteculas de AIP en S aureus Mientras que
ceacutelulas de B megaterium fungieron como biosensores al producir las proteiacutenas
AgrC y AgrA que en condiciones nativas sirven como un sistema a dos
componentes que detectan la presencia externa de la moleacutecula de AIP y activan a
un factor de transcripcioacuten (Marchand amp Collins 2013)
Zeng y sus colaboradores crearon un modelo biomatemaacutetico a partir de una E coli
que funcionara como un biosensor de moleacuteculas de AIP producidas por S aureus
que seriacutea contrarrestado por accioacuten de la lisostafina una bacteriocina de actividad
contra S aureus La simulacioacuten del modelo indicoacute que una ceacutelula de E coli podriacutea
tardar hasta 25 horas en detectar las primeras moleacuteculas de AIP producidas de S
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aureus al tiempo que generariacutea la suficiente concentracioacuten de bacteriocinas para
matar a ceacutelulas de S aureus (Zeng et al 2013)
Borrero y sus colegas crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basado en la
deteccioacuten de moleacuteculas de QS para poder contrarrestar moleacuteculas de QS
producidos por un patoacutegeno de intereacutes cliacutenico resistente a los antibioacuteticos En este
caso ceacutelulas modificadas de Lactobacillus lactis fueron capaces de detectar las
moleacuteculas producidas por Enterococcus faecalis El lactobacilo modificado mostroacute
alta efectividad de tres bacteriocinas producidas para controlar el crecimiento de
este patoacutegeno incluyendo sus variedades multirresistentes (Borrero Chen Dunny
amp Kaznessis 2015)
Holowko y sus colegas desarrollaron ceacutelulas de E coli capaces de sentir
moleacuteculas de QS producidas por Vibrio cholerae (Holowko Wang Jayaraman amp
Poh 2016) Mientras que Lubkowicz y sus colaboradores modificaron ceacutelulas de
Lactobacillus reuteri con la capacidad para detectar moleacuteculas de AIP clase I
producidas por S aureus en rangos de concentracioacuten desde la escala nanomolar
hasta micromolar (Lubkowicz et al 2018)
25 Las Bacteriocinas
En contexto a la anterior seccioacuten una fraccioacuten del total de biosensores de ceacutelulas
enteras disentildeados son capaces de producir y excretar sustancias antimicrobianas
que afecten el crecimiento de ceacutelulas productoras de moleacuteculas QS Para fines de
este trabajo nos referimos a las bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
que pertenece a un grupo de peacuteptidos con actividad antimicrobiana con origen
evolutivo en bacterias los cuales seraacuten descritos a continuacioacuten
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas
Las bacteriocinas son un grupo de peacuteptidos de bajo peso molecular que son
producidos exclusivamente y excretados por bacterias y que tienen la capacidad
de inhibir el crecimiento de otra bacteria Las bacteriocinas pueden ser producidas
in situ por bacterias probioacuteticas Al ser de origen proteico las bacteriocinas son
sujetos a modificaciones por Ingenieriacutea Geneacutetica (Cotter Ross amp Hill 2013) Las
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bacteriocinas usualmente actuacutean por permeabilizacioacuten por membrana causada por
su naturaleza catioacutenica al interactuar con la membrana Usualmente las
bacteriocinas son de caraacutecter hidrofoacutebico y anfipaacutetico Su estructura quiacutemica son
generalmente peacuteptidos acoplados con glicoproteiacutenas y lipoproteiacutenas Su punto
isoeleacutectrico estaacute habituado a 81 a 101 usualmente son termoestables y tiene un
rango de pH amplio entre 30 a 90 (Heredia-Castro Heacuternaacutendez-Mendoza
Gonzaacutelez-Coacuterdova amp Vallejo-Cordoba 2017) En la Naturaleza cuando las
bacterias comparten el mismo nicho ecoloacutegicos eacutestas deben luchar y defenderse
de otros y las bacteriocinas son uno de los mecanismos bioloacutegicos reconocidos
(Duffy Schouten amp Raaijmakers 2003)
La disponibilidad de datos en bacteriocinas en la Naturaleza es muy amplio ya que
se presume que un 99 del total de bacterias son productoras de al menos un tipo
de bacteriocina y muchos de ellos permanecen auacuten sin ser descubiertos
(Klaenhammer 1988) Hasta la fecha de acuerdo con datos de bases de datos
sobre bacteriocinas de calidad mundial (actualizado hasta la uacuteltima versioacuten 25 de
junio de 2021) indican que el University of Nebraska Medical Centerrsquos
Antimicrobial Peptide Database (ADP por sus siglas en ingleacutes)
(httpswangapd3commainphp) se mantienen registrados un total de 3257
peacuteptidos antimicrobianos de los seis reinos bioloacutegicos existentes de los cuales
181 son peacuteptidos con actividad anti-MRSA (G Wang Li amp Wang 2016) Aunque
Bactibase (httpbactibasehammamilaborgmainphp) es una base de datos de
bacteriocinas que no se ha actualizado desde 2017 sus datos siguen siendo muy
valiosos ya que nos ofrece una realidad en la ciencia de las bacteriocinas puesto
que la mayoriacutea de las bacteriocinas descubiertas han sido aisladas de bacterias
Gram positivas donde 206 pertenecen a este grupo y 19 a las cepas Gram
negativas El geacutenero maacutes reportado para las bacteriocinas de origen en Gram
positivas son los Lactobacillus seguido de Enterococcus Streptococcus
Lactococcus y el geacutenero Bacillus mientras que el geacutenero maacutes reportado para las
bacteriocinas de origen en Gram negativas es Escherichia El tamantildeo promedio de
las bacteriocinas es de 43 residuos (Hammami Zouhir Le Lay Ben Hamida amp
Fliss 2010)
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Un buen nuacutemero de bacteriocinas han sido previamente reportadas como agentes
terapeacuteuticos puesto que se han utilizado en dosis hasta cien veces superiores al
valor de concentracioacuten miacutenima inhibitoria reportado sin presentar efectos
citotoacutexicos en liacuteneas celulares eucarioacuteticas (Hols Ledesma-Garciacutea Gabant amp
Mignolet 2019) ni en tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Por
ejemplo la nisina la bacteriocina maacutes famosa en la industria y en el mundo ha
sido declarado por la Administracioacuten de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA por sus siglas en ingleacutes) como sustancia Generalmente Reconocida
como Segura (GRAS por sus siglas en ingleacutes) para su uso como conservador de
alimentos (Cotter Hill amp Ross 2005) Se sabe que la mayoriacutea de las bacteriocinas
han tenido un largo historial de seguridad (Silva Silva amp Ribeiro 2018) Sin
embargo a pesar de la gran disponibilidad de datos de ensayos en bacteriocinas
recientemente se ha manifestado la urgencia de incrementar y explorar su uso en
modelos in vivo para evaluar su eficacia como agentes antimicrobianos y evaluar
los posibles efectos secundarios los cuales son necesarios para asegurar su eacutexito
como candidatos potenciales a agentes terapeacuteuticos en su lucha contra
infecciones resistentes a los antibioacuteticos (Beniacutetez-Chao Leoacuten-Buitimea Lerma-
Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2021)
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos
Los peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos son sustancias de origen
bioloacutegico que cumplen con el mismo papel de defensa lo cierto es que existen
claras diferencias entre ellas que dependen de su origen composicioacuten quiacutemica
entre maacutes factores A continuacioacuten se ofrece una breve explicacioacuten entre los
diferentes tipos de sustancias antimicrobianas
Los Peacuteptidos Antimicrobianos (AMP antimicrobial peptides) tambieacuten conocidos
como peacuteptidos de autodefensa (HDP host defense peptide) son peacuteptidos
producidos por un hospedero y son parte del sistema inmune al conferirles
capacidades defensivas Son de un rango de tamantildeo entre 10 a 60 residuos en
promedio 3326 residuos que estaacuten compuestas mayoritariamente por α-heacutelices
con cargas positivas (catioacutenicas) o anfipaacuteticas (cargas hidrofoacutebicas e hidrofiacutelicas)
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tambieacuten existen referentes con carga anioacutenica Los AMP estaacuten clasificados seguacuten
su origen ya que estaacuten ubicuamente presentes en todos los reinos bioloacutegicos
como mamiacuteferos plantas microorganismos acuaacuteticos insectos yo anfibios
seguacuten su actividad ya que pueden ser antibacterianos antifuacutengicos
antiinflamatorios antivirales antiparasitarios yo anticanceriacutegenos seguacuten su
estructura como tipo lineal con estructurales secundarias con α-heacutelices y β-tiras
plegadas y por seguacuten por el tipo dominante de aminoaacutecidos como glicina arginina
prolina histidina y triptoacutefano (Huan Kong Mou amp Yi 2020 Lei et al 2019)
Si el AMP es de origen evolutivo bacteriano se les conoce como bacteriocinas Los
oriacutegenes pueden ser por bacterias Gram positivas como negativas incluyendo
miembros del dominio de las Archaea (Chikindas Weeks Drider Chistyakov amp
Dicks 2018) Sin embargo cuando el AMP es de origen eucarioacutetico existen tres
clasificaciones defensinas (Shafee Lay Hulett amp Anderson 2016) histatinas o
catelicidinas (De Smet amp Contreras 2005) Existen intermediarios evolutivos como
las bacteriocinas tipo defensina que son un grupo de bacteriocinas que comparte
los puentes de disulfuro en las mismas posiciones que podriacutean observarse en las
defensinas (Baindara et al 2016 Sugrue OrsquoConnor Hill Stanton amp Paul Ross
2020)
Tanto las bacteriocinas como los antibioacuteticos comparten funcionalidad bioloacutegica al
ser ambas sustancias que nulifican o matan a otras poblaciones pero existen
diferencias muy marcadas entre ellas puesto que las bacteriocinas son
sintetizadas como metabolitos primarios mientras que los antibioacuteticos son
secundarios El espectro de accioacuten de las bacteriocinas es mucho maacutes reducido
que los antibioacuteticos eacutestos uacuteltimos son muy amplios El grado de actividad es
mucho maacutes intenso entre bacteriocinas ya que su rango de accioacuten se encuentra
en el orden de los nano a micro molar mientras que los antibioacuteticos son rango de
accioacuten estaacute ranqueado entre los micro y milimolar Debido a su origen proteico las
bacteriocinas son altamente propensas a ser degradados por enzimas Sin
embargo las bacteriocinas son maacutes termodinaacutemicamente estables y con una
actividad maacutes amplia de pH que los antibioacuteticos Las bacteriocinas atacan
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generalmente la membrana extracelular generando poros mientras que los
antibioacuteticos pueden atacar la membrana tambieacuten yo atacar blancos intracelulares
Se conoce que las bacteriocinas presentan baja o nula toxicidad en comparacioacuten
con los antibioacuteticos (Perez Zendo amp Sonomoto 2014)
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes
En la actualidad diversos estudios enfocados en bacteriocinas se han enfocado
en su actividad contra cepas de S aureus resistentes a los antibioacuteticos Por
ejemplo la lisostafina fue utilizado el control de S aureus ATCC 29740 (Oldham amp
Daley 1991) mientras que la pentocina JL-1 ha sido efectivo para el control de S
aureus multirresistente (Jiang Zou Cheng Fang amp Huang 2017) La bacteriocina
entianina mostroacute actividad contra MRSA (ATCC 43300) (S W Fuchs et al 2011)
La epidermicina NI01 mostroacute actividad contra MRSA (Sandiford amp Upton 2012)
Asiacute tambieacuten como las enterocinas DD28 y DD93 con actividad anti estafilocoacutecica
contra ceacutelulas MRSA (Al Atya et al 2016)
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos
Las bacteriocinas son un grupo muy bien definido de peacuteptidos antimicrobianos que
tienen su origen evolutivo en bacterias y en algunas arqueobacterias Por sus
caracteriacutesticas proteicas las bacteriocinas son elementos geneacuteticos que pueden
ser faacutecilmente modificados por teacutecnicas de Ingenieriacutea geneacutetica (Cotter et al
2013) Las caracteriacutesticas generales de las bacteriocinas son que su espectro de
accioacuten es actuar tanto en las bacterias Gram positivas como negativas Su modo
de actividad por actividad bactericida o bacteriostaacutetico Su mecanismo de accioacuten
es por permeabilizacioacuten de membrana creando lisis celular Su estructura
bioquiacutemica es muy variada que pueden ser peacuteptidos glicoproteiacutenas y
lipoproteiacutenas Son de peso molecular variable sin embargo las bacteriocinas de
origen en Gram positivas son de tamantildeo pequentildeo Debido a su naturaleza
proteica las bacteriocinas son susceptibles al corte proteoliacutetico y altamente
estables a altas temperaturas (Heredia-Castro et al 2017)
Entre algunas de las bacteriocinas que se han utilizado para el control de
patoacutegenos resistentes estaacute la bacteriocina AS-48 la cual ha sido ampliamente
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utilizado contra cepas de referencia y cliacutenicos para Mycobacterium tuberculosis
(Aguilar-Peacuterez et al 2018) Otro ejemplo es la pentocina JL-1 ha demostrado
tener actividad contra diferentes cepas bacterianas (Jiang et al 2017) Entianina
ha mostrado actividad contra Enterococcus faecalis resistente a vancomicina
(ATCC 51299) (S W Fuchs et al 2011) Las klebcinas poseen actividad contra
especies resistentes y multirresistentes de cepas del geacutenero Klebsiella
(Denkovskienė et al 2019) La lista de bacteriocinas reportadas como efectivas
contra patoacutegenos resistentes de relevancia cliacutenica es muy larga y que puede ser
observada en la literatura correspondiente (Cui et al 2012 Gabrielsen Brede
Nes amp Diep 2014 Newstead Varjonen Nuttall amp Paterson 2020 Perez et al
2014)
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas
Las bacteriocinas pueden ser producidos tanto por microorganismos Gram
positivos como negativos inclusive por miembros del dominio Archaea (Chikindas
et al 2018)
Hasta el diacutea de hoy no hemos encontrado un oacutergano internacional que regule la
clasificacioacuten de las bacteriocinas maacutes que lo propuesto en grupos de investigacioacuten
ligados a la ciencia de las bacteriocinas Las bacteriocinas con origen evolutivo en
organismos Gram positivos estaacuten actualmente clasificados en cuatro grandes
clases la clase I corresponde a bacteriocinas modificadas postraduccionalmente
de muy bajo peso molecular (lt5 kDa) la clase II se refiere a bacteriocinas
termoestables no modificadas de bajo peso molecular (lt10 kDa) la clase III
contiene bacteriocinas termosensibles de alto peso molecular (gt10 kDa) y por
uacuteltimo la clase IV se compone de proteiacutenas acomplejadas con carbohidratos o
liacutepidos (Newstead et al 2020 Perez et al 2014)
Dada la diversidad de bacteriocinas para fines de este trabajo solo nos
enfocaremos en las bacteriocinas tipo II de las Gram positivas ya que se clasifican
en cuatro grandes subclases La clase IIa representa la familia de las
bacteriocinas con actividad antilisteria por su actividad especiacutefica contra cepas de
Listeria monocytogenes y ademaacutes porque se mantiene un dominio conservado
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YGNGV conocido como la caja de pediocina y que ubica en extremo N-terminal
Uno de los ejemplos maacutes reconocidos es la enterocina NKR-5-3C La clase IIb
representa a las bacteriocinas compuestas por dos peacuteptidos que en siacute son dos
peacuteptidos diferentes que actuacutean sineacutergicamente para atacar a un blanco como
lactococcin Q que se compone de los peacuteptidos lactococcina Qα y lactococcin Qβ
La clase IIc se relaciona con las bacteriocinas circularizadas que estaacuten unidas de
extremo a extremo como lactociclina Q y leucociclina Q La clase IId se compone
de bacteriocinas sin peacuteptido liacuteder y que se sintetizan sin una secuencia liacuteder en su
extremo N-terminal Algunos ejemplos son la weissllicina Y weissllicina M
leucocina Q leucocina N lacticina Z y lacticina Q (Perez et al 2014)
256 La bacteriocina Lacticina Q
La lacticina Q (LnqQ) es una bacteriocina que fue por vez descubierta por Fujita y
sus colaboradores en el 2007 Esta bacteriocina fue aislada por primera vez por
Lactococcus lactis QU5 una cepa Gram positiva que fue aislada de una muestra
de maiacutez fresco recolectado en campos agriacutecolas de la comunidad de Aso en
Kumamoto Japoacuten La composicioacuten bioquiacutemica de LnqQ es que se trata de peacuteptido
lineal compuesto por 53 residuos y con un peso molecular de 592050 Da (Fujita
et al 2007) La estructura tridimensional descubierta por Acedo y otros revela
que es una proteiacutena globular que se compone de cuatro α-heacutelices cuya superficie
es altamente catioacutenica y su nuacutecleo hidrofoacutebico Esta secuencia presenta una
carga neta +6 y su pI = 108 (Acedo et al 2016)
Esta bacteriocina ha mostrado ser un peacuteptido antimicrobiano con alta efectividad
contra bacterias Gram positivas siendo antagonista de uno los principales
patoacutegenos reportados en cliacutenicas como S aureus Por ejemplo se han registrado
diversos rangos de concentracioacuten miacutenima inhibitoria (MIC) de la LnqQ como 8 microM
contra S aureus ATCC 6538 y 32 microM contra S aureus ATCC 29213 (Acedo et al
2016) Tambieacuten se ha reportado 18 microM (Fujita et al 2007) o 10 microgml (Ma Yu
Han Wang amp Zhang 2012) contra S aureus ATCC 12600
Se conoce que la LnqQ genera alta permeabilidad en la membrana sin necesidad
de anclarse sobre moleacuteculas especiacuteficas como el Liacutepido II (Yoneyama Imura
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Ichimasa et al 2009) Posteriormente se determinoacute que el mecanismo de accioacuten
es a traveacutes de un modelo conocido como Poro Toroidal Enorme (HTP huge
toroidal pore) donde las estructuras α-heacutelices cargadas positivamente y presentes
en la LnqQ se unen covalentemente hacia la membrana celular que estaacute cargada
negativamente y entonces genera un poro en forma de toroide enorme de 46 a
66 nm de diaacutemetro generando una estructura conocida como lipid flip-flop lo que
permite el goteo de moleacuteculas intercelular de manera que la ceacutelula muere La
translocacioacuten del peacuteptido desde el exterior a la cara interna de la ceacutelula ocurre
sincroacutenicamente con la formacioacuten del poro toroidal (Yoneyama Imura Ohno
et al 2009) En un estudio a nivel in vitro se determinoacute que cuando LnqQ es
agregado a niveles MIC sobre cultivos bacterianos sensibles aumenta la
acumulacioacuten de radicales libres tipo hidroxilos y por consecuencia la ceacutelula muere
(Li et al 2013)
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados
Las bacteriocinas son sustancias toacutexicas que pueden atacar a su microorganismo
productor si eacuteste no cuenta con caracteriacutesticas que le permitan resistir (Ishibashi
et al 2014 Iwatani et al 2012 Ladjouzi Lucau-Danila Benachour amp Drider
2020 Mesa-Pereira et al 2017 Nascimento et al 2012) De manera que todos
los operones de las bacteriocinas se componen habitualmente de los siguientes
elementos geneacuteticos promotor gen estructural (bacteriocina) genes de
inmunidad genes de transporte una proteiacutena accesoria y un terminador de la
transcripcioacuten (Mesa-Pereira et al 2017)
La LnqQ no es ninguna excepcioacuten a la regla ya que similar a otras bacteriocinas
la produccioacuten secrecioacuten y autoinmunidad estaacute regulado por el cluacutester geneacutetico
lnqRQBCDEF que se encuentra en Lactococcus lactis QU5 y que descubierto por
Iwatani y otros en el 2012 (Iwatani et al 2012) Al diacutea de hoy auacuten no estaacute del todo
bien determinado la funcionalidad de los elementos que conforman el operoacuten pero
se sabe que el cluacutester lnqQBCDEF es esencial para la completa produccioacuten de
LnqQ mientras que los productos LnqEF son esenciales y los productos LnqBCD
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estaacuten parcialmente involucrados en la inmunidad y secrecioacuten de la bacteriocina
(Iwatani Horikiri Zendo Nakayama amp Sonomoto 2013)
26 Produccioacuten heteroacuteloga de bacteriocinas
Entre las virtudes observadas en las bacteriocinas estaacuten en que gozan de una
excelente reputacioacuten en seguridad bioloacutegica (Silva et al 2018) y de una gran
diversidad de bancos de datos sobre bacteriocinas (Hammami et al 2010 G
Wang et al 2016) Estos datos pueden apoyar para el disentildeo y construccioacuten de
bacteriocinas de novo (Fields et al 2020) Sin embargo a la fecha una cantidad
raquiacutetica de bacteriocinas han sido capaces de ser producidos en masa siendo la
nisina y la pediocina PA-1 las uacutenicas bacteriocinas en destacar industrialmente
Una de las hipoacutetesis que maacutes planteada supone que las bacteriocinas no han
destacado en el mercado porque eacutestas deben de producirse en altas cantidades y
con suficiente actividad bioloacutegica y en los organismos nativos este proceso se
considera que es un desgaste energeacutetico significativo ya que el rendimiento
productivo es usualmente bajo (Mesa-Pereira Rea Cotter Hill amp Ross 2018)
Desde la fundacioacuten de la Ingenieriacutea Geneacutetica las proteiacutenas han sido objeto de
muacuteltiples modificaciones para aumentar su produccioacuten y purificacioacuten utilizando
diversos sistemas bioloacutegicos productores desde sistemas procariotas como E coli
hasta sistemas eucariotas como ceacutelulas de levaduras o inclusive en liacuteneas
celulares eucariotas A pesar del avance actual que existen ya en estas teacutecnicas
la produccioacuten de proteiacutenas puede presentar incluso problemas de rutina en
laboratorios dedicados a este campo como la formacioacuten de cuerpos de inclusioacuten
toxicidad o baja produccioacuten de proteiacutenas (Bell Engleka Malik amp Strickler 2013)
En este trabajo nos hemos enfocado en la exploracioacuten de un peacuteptido sentildeal N-
AmyE y un peacuteptido de fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de la bacteriocina
LnqQ tanto en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica de ceacutelulas de E coli Nuestro
objetivo es que la aplicacioacuten de las etiquetas en la produccioacuten de la bacteriocina
permita la produccioacuten y purificacioacuten de LnqQ en ceacutelulas de E coli mientras
mantiene su funcionalidad bioloacutegica bactericida contra cultivos de S aureus En
este capiacutetulo presentaremos antecedentes relacionados al peacuteptido sentildeal N-AmyE
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y al peacuteptido de fusioacuten SmbP asiacute como los disentildeos bioinformaacuteticos utilizados para
la construccioacuten de las etiquetas con la bacteriocina se incluyen ensayos in silico
predictivos para estimar la estructura tridimensional de la bacteriocina con su
etiqueta asiacute como ensayos para estimar el corte
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE es un dominio proteico localizado en la regioacuten N-terminal
de la α-amilasa (AmyE) (Yang Galiii amp Henner 1983) Bioquiacutemicamente la AmyE
es una enzima (1 4-α-D-glucano-glucanohidrolasa EC 3211) cuya funcioacuten es
catalizar la hidroacutelisis de enlaces glicosiacutedicos (α-14) del almidoacuten para producir
glucosa y dextrinas (R Gupta Gigras Mohapatra Goswami amp Chauhan 2003)
La secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica de algunas AmyE fueron reportadas
desde hace varias deacutecadas Por ejemplo en 1983 Yang y sus colaboradores
reportaron la secuencia nucleotiacutedica del AmyE de la cepa Bacillus subtilis 1A289
(Yang et al 1983) Antildeos maacutes tarde en 1988 Emori y sus colegas tambieacuten
reportaron la secuencia nucleotiacutedica completa de la variante producida por la cepa
de B subtilis 2633 (Emori amp Maruo 1988)
La existencia del peacuteptido sentildeal N-AmyE de la α-amilasa fue propuesta por Yang y
sus colaboradores cuando develaron la secuencia nucleotiacutedica completa del
mismo argumentando que el presunto peacuteptido sentildeal debiacutea tener un tamantildeo de 32
aminoaacutecidos Tambieacuten observaron que AmyE podriacutea expresarse en ceacutelulas de
otras especies como E coli manteniendo su actividad bioloacutegica (Yang et al 1983)
La utilidad biotecnoloacutegica del peacuteptido sentildeal N-AmyE es porque se ha reportado
que es funcionalmente activo tanto en Bacillus subtilis como en E coli ya que al
fusionarse eacutesta con la regioacuten N-terminal de una proteiacutena de intereacutes biotecnoloacutegico
estaacute puede ser liberado al medio extracelular Por ejemplo al fusionar el peacuteptido
sentildeal N-AmyE con una β-lactamasa eacutesta es capaz de excretarse al medio
extracelular tanto en ceacutelulas de B subtilis como de E coli Sin embargo el sitio de
reconocimiento para el corte del peacuteptido sentildeal difiere entre ambos tipos de ceacutelulas
(Nakazawa Takano Sohma amp Yamane 1986) Un anaacutelisis multivariado de datos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 25
determinoacute que las secuencias nucleotiacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en su seccioacuten N-terminal tienden a ser excretados en el periplasma y en la
seccioacuten extracelular de E coli (Sjoumlstroumlm Wold Wieslander amp Rilfors 1987)
El mecanismo de corte hidroliacutetico por el que el peacuteptido sentildeal N-AmyE se separa de
la amilasa AmyE es debido a su estructura secundaria y a la presencia de un
dominio rico en alaninas (aminoaacutecido apolar) en el extremo C-terminal de del
peacuteptido N-AmyE Sin embargo el patroacuten de corte enzimaacutetico difiere seguacuten el tipo
organismo donde sea expresado ya que el sitio de corte oacuteptimo de este peacuteptido
se encuentra entre Ala33 y X34 cuando se expresa en B subtilis pero en E coli la
AmyE tiende a cortarse entre Ala31 y un aminoaacutecido cual sea (X) (Sakakibara
Tsutsumi Nakamura amp Yamane 1993)
En el 2005 el peacuteptido sentildeal N-AmyE reportado por Yang y otros fue acoplado en
la regioacuten N-terminal de una liasa de pectina para permitir su expresioacuten en ceacutelulas
de E coli (DE3) en la regioacuten periplaacutesmica Los resultados de ese estudio indicaron
que se logroacute la excrecioacuten efectiva de la liasa de pectina al medio extracelular
espacio periplaacutesmico citoplasma y a nivel membranal de E coli despueacutes de haber
sido inducido por con IPTG (R M Papi Chaitidou Trikka amp Kyriakidis 2005)
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP
La mayoriacutea de peacuteptidos de fusioacuten utilizados para la expresioacuten de proteiacutenas
recombinantes son el Dominio de Unioacuten a Celulosa (CBDcenA) Glutatioacuten-S-
Transferasa (GST) Proteiacutena de Unioacuten a Maltosa (MBP) tiorredoxina (TRX) y las
Proteiacutenas Modificadoras tipo Ubiquitina de Tamantildeo Pequentildeo (SUMO) (Mesa-
Pereira et al 2018) o la regioacuten citoplasmaacutetica del proteiacutena pequentildea de unioacuten a
metales SmbP (Vargas-Cortez Morones-Ramirez Balderas-Renteria amp Zarate
2016) a continuacioacuten ofrecemos maacutes informacioacuten relacionada al uacuteltimo peacuteptido de
fusioacuten
En el 2004 Barney y sus colaboradores describieron a la Proteiacutena Pequentildea de
Unioacuten a Metales en el periplasma de Nitrosomonas europaea Esta proteiacutena posee
un peso molecular de 99 kDa y presenta una inusual cantidad de residuos de
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 26
histidina (17) seguido de alanina (16) glutamato (14) glicina (11) y lisina
(9) los cuales componen el 67 de la composicioacuten total de residuos Esta
proteiacutena carece naturalmente de metionina y de cisteiacutenas Estructuralmente se
trata de una unidad monomeacuterica compuesta por 93 residuos cuya principal
caracteriacutestica es una regioacuten compuesta de 10 repeticiones secuenciales cada una
con motivo de siete aminoaacutecidos donde el cuarto residuo es una histidina
conservada estos motivos permiten la estabilizacioacuten de un nuacutecleo hidrofoacutebico
Como su nombre lo establece esta proteiacutena posee alta afinidad a metales
divalentes como Cu2+ Ni2+ Zn2+ y de otras valencias como Fe3+ (Barney LoBrutto
amp Francisco 2004) Esta proteiacutena ha sido utilizada para la expresioacuten periplaacutesmica
y posterior purificacioacuten de Hormona de Crecimiento Humano (hGH)
bioloacutegicamente activa (Perez-Perez et al 2020)
En 2015 el dominio periplaacutesmico de la SmbP que corresponde a la seccioacuten maacutes
proacutexima al extremo N-terminal en la estructura lineal del mismo fue removido por
Vargas y sus colaboradores manteniendo uacutenicamente el dominio citoplasmaacutetico
de la SmbP citoplasmaacutetica (SmbP) Eacutesta uacuteltima es uacutetil como etiqueta de afinidad
para teacutecnicas de cromatografiacutea de afinidad con iones metaacutelicos inmovilizados
(IMAC por sus siglas en ingleacutes) Esta proteiacutena fue reportada como efectiva para la
expresioacuten citoplaacutesmica de proteiacutenas en E coli como RFP GFP SHY2 NDPK2 y
LovR (Vargas-Cortez et al 2016)
Recientemente la SmbP fue utilizada por primera vez para la produccioacuten del
peacuteptido antimicrobiano Bin1b utilizando E coli como hospedero para la
sobreproduccioacuten El peacuteptido fue sobre producido y purificado mostrando actividad
antimicrobiana contra E coli y S aureus (Montfort-Gardeazabal Balderas-
Renteria Casillas-Vega amp Zarate 2021)
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS
31 Justificacioacuten
La idea de disentildear y utilizar un biosensor de ceacutelula para controlar cultivos de
MRSA es porque las moleacuteculas sentildealizadoras del QS se han reportado como
estiacutemulos quiacutemicos para ser reconocidos como ceacutelulas enteras vivas modificadas
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para su reconocimiento Ademaacutes de que ya se han reportado diversos biosensores
completos de ceacutelulas que pueden producir y excretar bacteriocinas capaces de
matar a microorganismos multirresistentes productores de sentildeales QS
La decisioacuten de inclinarnos hacia las bacteriocinas como patoacutegenos es porque
atacan un espectro limitado de bacterias dentro de una comunidad microbioloacutegica
y no ocurre de manera simultaacutenea en un espectro amplio como ocurre
habitualmente con los antibioacuteticos lo que promueve una mayor probabilidad de
seleccioacuten de mutantes que puedan conferir resistencia Ademaacutes las bacteriocinas
estaacuten constantemente evolucionando y permiten a sus productores combatir
contra patoacutegenos de resistencia emergentes (Riley et al 2012)
Las bacteriocinas han mostrado ademaacutes ser potenciales agentes terapeacuteuticos ya
que no afectan tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Incluso las
bacteriocinas se han administrado en concentraciones tan altas como 100 veces
superiores al MIC originalmente reportado con nulos efectos citotoacutexicos en liacuteneas
celulares eucarioacuteticas (Hols et al 2019) Ademaacutes la mayoriacutea de los productores
nativos en bacteriocinas poseen un excelente historial en seguridad (Silva et al
2018)
La propuesta de etiquetar bacteriocinas con un peacuteptido sentildeal es porque durante el
proceso de recuperacioacuten previo a la purificacioacuten es comuacuten encontrar una baja
cantidad de proteiacutenas y ademaacutes proteasas que disminuyen el rendimiento
productivo Con el peacuteptido sentildeal la purificacioacuten de las proteiacutenas se simplifica
porque son faacutecilmente recuperadas de la fraccioacuten periplaacutesmica seguido un choque
osmoacutetico sin la necesidad de lisar toda la ceacutelula (Ramanan et al 2010) mientras
que la decisioacuten de antildeadir peacuteptidos de fusioacuten en los disentildeos geneacuteticos es porque se
trata de etiquetas que se colocan en la regioacuten N-terminal o C-terminal de una
proteiacutena con intereacutes biotecnoloacutegico Estos peacuteptidos representan un meacutetodo
recurrente en la sobreexpresioacuten de bacteriocinas porque ayudan en la purificacioacuten
aumentan la expresioacuten proteica mejoran la solubilidad permiten que la proteiacutena
sea producida en un estado similar al nativo incrementan el rendimiento de
produccioacuten y disminuyen su degradacioacuten (Mesa-Pereira et al 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 28
32 Hipoacutetesis
El disentildeo de un biosensor construido a base de ceacutelulas enteras E coli modificadas
pronostica indica que funcionaraacute como alarma bioloacutegica al detectar moleacuteculas de
QS de S aureus En consecuencia liberaraacute un compuesto antimicrobiano con
actividad especiacutefica contra el organismo blanco El peacuteptido antimicrobiano seraacute
validado experimentalmente a traveacutes del peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de
fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de LnqQ en E coli que seraacute producido
en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica respectivamente
33 Objetivo General
Presentar el disentildeo in silico de un mecanismo biosensor basado en el sistema de
quorum sensing de S aureus para producir Lacticina Q y producir
experimentalmente este peacuteptido antimicrobiano tanto en la regioacuten periplaacutesmica
como citoplaacutesmica de E coli
34 Objetivos Especiacuteficos
1 Disentildear el moacutedulo geneacutetico biosensor para detectar la presencia externa de
moleacuteculas autoinductoras (AIP) producidos por MRSA
2 Disentildear el moacutedulo geneacutetico de bacteriocinas para liberar lacticina Q (LnqQ)
en funcioacuten a la concentracioacuten externa de moleacuteculas AIP producidos por
MRSA
3 Disentildear un vector de expresioacuten que contenga ambos moacutedulos geneacuteticos
tanto biosensor como de bacteriocinas
4 Predecir la especificidad teoacuterica del biosensor completo de ceacutelulas enteras
entre diferentes sentildeales de QS
5 Predecir la solubilidad y localizacioacuten subcelular de cada una de las
proteiacutenas utilizadas para el disentildeo del moacutedulo biosensor y el moacutedulo de
bacteriocina
6 Predecir la existencia de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B y nivel de alergenicidad
en la LnqQ producida en E coli
7 Disentildear el vector de expresioacuten pETNL que contenga el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en conjunto con el LnqQ acoplado con una etiqueta de polihistidina
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8 Disentildear el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ que contenga el peacuteptido de
fusioacuten SmbP en conjunto con el LnqQ
9 Construir los vectores de expresioacuten pETNL y pSmbP-LnqQ y transformar
ceacutelulas de E coli
10 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten periplaacutesmica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pETNL
11 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten citoplasmaacutetica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ
35 Metas
En un periacuteodo a tres antildeos nos propusimos alcanzar las siguientes metas
bull Disentildear in silico un sistema biosensor en E coli capaz de sentir moleacuteculas
de Quorum Sensing producidas por S aureus y producir una sustancia
antimicrobiana en funcioacuten a la concentracioacuten externa de las moleacuteculas QS
bull Predecir la capacidad del peacuteptido sentildeal N-AmyE y del peacuteptido de fusioacuten
SmbP para producir bacteriocinas en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica
de E coli respectivamente
bull Presentar los resultados obtenidos en al menos un artiacuteculo de investigacioacuten
con arbitraje internacional
bull Cumplir con eacutexito el examen predoctoral
bull Obtener el grado de Doctor en Ciencias con Orientacioacuten en Microbiologiacutea
36 Aportacioacuten cientiacutefica
Nuestra aportacioacuten consiste en presentar el disentildeo y el trabajo teoacuterico necesario
para la construccioacuten de un biosensor de ceacutelulas enteras basado en quorum
sensing capaz de producir bacteriocinas en funcioacuten a la concentracioacuten disponible
de moleacuteculas tipo QS evitando asiacute la sobreproduccioacuten yo goteo de bacteriocinas
que pueden contribuir a la resistencia en patoacutegenos Asiacute tambieacuten experimentamos
en peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP para validarlos como una
herramienta bioloacutegica para la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas en ceacutelulas
modificadas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 30
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
La idea de disentildear un biosensor basado en ceacutelulas enteras surge al yuxtaponer
dos enfoques usados para tratar enfermedades resistentes a los antibioacuteticos que
es mediante el uso de organismos bioloacutegicamente activos con bacteriocinas (Allen
et al 2014)
En este sentido tenemos dos ceacutelulas independientes que son reconocidas como α
y β respectivamente (Figura 1) las ceacutelulas α que corresponden a un productor
de sentildeales tipo QS liberan moleacuteculas de sentildealizacioacuten al medio externo mientras
que las ceacutelulas β que corresponden al biosensor son emulados para detectar
moleacuteculas de QS de las ceacutelulas α En respuesta a esta deteccioacuten los mecanismos
internos de las ceacutelulas β producen y excretan una toxina especiacutefica contra las
ceacutelulas α y asiacute controlar su crecimiento poblacional
Figura 1 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
Ceacutelulas β fungen como sistema de deteccioacuten y destruccioacuten al reconocer moleacuteculas de reconocimiento tipo QS
producidos por ceacutelulas α y causar su muerte
42 Cepas bacterianas
Nosotros designamos a E coli (BL21) DE3 como chasis bioloacutegico porque ha sido
ampliamente reconocido para la sobreproduccioacuten de bacteriocinas recombinantes
(Mesa-Pereira et al 2018) Para el disentildeo del moacutedulo biosensor optamos por
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 31
utilizar los datos anotados del genoma de la cepa S aureus N315 una cepa
reconocida como MRSA y que ha sido reportado como unas de las principales
causas de infecciones resistentes a meticilina asociado a comunidad (CA-MRSA)
y a hospitales (HA-MRSA) (Kuroda et al 2001) Para el disentildeo del moacutedulo de
bacteriocina utilizamos los datos bioinformaacuteticos del cluacutester de genes lnqQBCDEF
de L lactis QU5 que permiten la produccioacuten y excrecioacuten la LnqQ asiacute como para su
autoinmunidad (Fujita et al 2007 Iwatani et al 2012) Abajo se presentan los
disentildeos de ambos moacutedulos asiacute como la estrategia general para su ensamblado en
un vector de expresioacuten
La cepa de E coli BL21 (DE3) fue seleccionada para ensayos de expresioacuten
proteica con el peacuteptido sentildeal N-AmyE o con el peacuteptido de fusioacuten SmbP La cepa E
coli DH5 fue utilizada para ensayos de clonacioacuten La cepa E coli Origami fue
escogida para produccioacuten de proteiacutenas problemaacuteticas
Un cultivo de E coli BL21 (DE3) fue amablemente donado por el Instituto
Tecnoloacutegico de Monterrey (Monterrey Nuevo Leoacuten) La cepa de E coli DH5α fue
recuperada de un stock de cultivos de nuestro laboratorio en el CIBYN (Apodaca
Nuevo Leoacuten) La cepa E coli Origami fue compartida por el Dr Xristo Zaacuterate de la
UANL (Monterrey Nuevo Leoacuten) Todas las cepas fueron mantenidas y crecidas en
caldo LB o suplementado con agar (2) a 37degC en condiciones aeroacutebicas
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina
Tanto los moacutedulos biosensor como el de bacteriocina fueron disentildeados de la
siguiente manera contienen un promotor un sitio de unioacuten al ribosoma gen
estructural y un terminador doble de transcripcioacuten Los disentildeos fueron elaborados
bajo la herramienta bioinformaacutetica SnapGene 113 en el formato correspondiente
Todos los datos bioinformaacuteticos utilizados para ambos disentildeos fueron recuperados
de alguna de las siguientes bases de datos Massachussets Institute of
Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts (SBP) (httppartsigemorg)
(Galdzicki Rodriguez Chandran Sauro amp Gennari 2011) Kyoto Encyclopedia
Genes and Genomes (KEGG) (httpswwwgenomejpkegg) (Kanehisa amp Goto
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2000) FP Base (FPB) (httpswwwfpbaseorg) (Lambert 2019) y GenBank
(httpswwwncbinlmnihgovgenbank) (Clark Karsch-Mizrachi Lipman Ostell amp
Sayers 2016) y Protein Data Bank (PDB) (httpswwwrcsborg) (Berman et al
2000)
Para el disentildeo del moacutedulo biosensor usamos los datos del promotor constitutivo
de E coli J23110 (SBP no BBa_J23110) como regulador transcripcional de los
genes del operoacuten agrC y agrA Nosotros utilizamos la secuencia nucleotiacutedica y
aminoaciacutedica del agrC (KEGG no SA1843) que se compone de 1116 nucleoacutetidos
y 371 residuos respectivamente y tambieacuten de la informacioacuten disponible para la
agrA (KEGG no SA1844) que se compone de 717 nucleoacutetidos y 238 residuos Los
sitios de unioacuten a ribosoma (SBP no BBa_B0034) fueron colocados entre cada gen
estructural y al final de la unidad transcriptoacutemica se colocoacute un doble terminador de
transcripcioacuten (SBP no BBa_B0015) tanto el moacutedulo biosensor como en moacutedulo
de bacteriocina
Para el disentildeo del moacutedulo de bacteriocina utilizamos los datos del promotor
inducible P2 del MRSA para regular la expresioacuten del cluacutester geneacutetico lnqQBCDEF
y el gen reportero gfp Debido a que la secuencia del promotor P2 no se
encontraba disponible de manera que primero tuvimos que localizar la regioacuten en
el archivo genoacutemico de la MRSA (GenBank no BA0000183) los resultados de
este punto seraacuten explicados maacutes a fondo en la seccioacuten correspondiente
Para la seccioacuten estructural del moacutedulo de bacteriocina buscamos el archivo
bioinformaacutetico que contuviera los genes estructurales secrecioacuten y de auto
inmunidad del cluacutester lnqQBCDEF (GenBank no AB7123931) El archivo original
fue manipulado para seccionar los elementos geneacuteticos que pertenecen al cluacutester
esta informacioacuten seraacute explicada con maacutes detalle
Por uacuteltimo usamos la secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica del gen monomeacuterico
gfp (FPBase no QKFJN) como reportero de Aequorea victoria (Zacharias Violin
Newton amp Tsien 2002) Esta proteiacutena es monomeacuterica posee un peso molecular
en 270 kDa El valor maacuteximo de excitacioacuten es λ = 488 nm mientras que el valor
maacuteximo de emisioacuten es λ = 507 nm El coeficiente de extincioacuten es 56000 M-1cm-1
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 33
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
El plaacutesmido de AddGene (httpswwwaddgeneorg) (AddGene no 116850) fue
utilizado para la construccioacuten in silico de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
dentro de un plaacutesmido al cual nos referiremos a partir de ahora como plaacutesmido
Dual Biosensor Killer (DBK) Este plaacutesmido fue disentildeado en la aplicacioacuten
SnapGene versioacuten 113
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas
Para la optimizacioacuten de los codones de todas las secuencias nucleotiacutedicas se
utilizoacute la herramienta bioinformaacutetica GenSmart Codon Optimization Tool
(httpswwwgenscriptcomtoolsgensmart-codon-optimization) versioacuten Beta 10
Las secuencias nucleotiacutedicas yo aminoaciacutedicas recolectadas para el disentildeo de los
moacutedulos geneacuteticos funcionaron como datos de entrada La aplicacioacuten fue
configurada para ldquoEscherichia colirdquo como organismo para expresioacuten de proteiacutenas
Es importante mencionar que solicitamos la exclusioacuten de sitios de restriccioacuten
habitualmente localizados en la regioacuten muacuteltiple de clonacioacuten del vector de
expresioacuten pET30a(+) como BamHI (GGATCC) BglII (AGATCT) ClaI (ATCGAT)
EcoRI (GAATTC) HindIII (AAGCTT) KpnI (GGTACC) NcoI (CCATGG) NdeI
(CATATG) NheI (GCTAGC) NotI (GCGGCCGC) PstI (CTGCAG) SacI (GAGCTC) SacII
(CCGCGG) SalI (GTCGAC) SmaI (CCCGGG) SpeI (ACTAGT) SphI (GCATGC) XbaI
(TCTAGA) XhoI (CTCGAG) XmaI (CCCGGG)
Una vez optimizadas usamos CAI Tool (httpgenomesurvesCAIcal) para el
Caacutelculo del Iacutendice de Adaptacioacuten (CAI por sus siglas en ingleacutes) para determinar el
iacutendice de adaptacioacuten de las secuencias nucleotiacutedicas antes y despueacutes de la
optimizacioacuten Esta herramienta utiliza la secuencia nucleotiacutedica y el uso de
codones tanto del organismo nativo como el organismo productor heteroacutelogo (u
organismo recipiente) como entradas para la optimizacioacuten De acuerdo a los
autores el iacutendice tiene un rango de respuesta que oscila entre 0 hasta 1 donde el
valor correspondiente 1 indica si la secuencia de entrada usa los codones maacutes
frecuentemente utilizados por el organismo recipiente (Puigbograve Bravo amp Garcia-
Vallve 2008) Para esta aplicacioacuten los iacutendices de uso de codones de cada
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organismo los datos de entrada deben ser descargados y posteriormente deben
ingresarse manualmente Todos los iacutendices fueron descargados de la base de
datos Codon Usage Database (httpswwwkazusaorjpcodon) y se descargaron
para los organismos E coli B (CUD no 413997) S aureus N315 (CUD
no158879) L lactis subsp cremoris (CUD no 1359) and A victoria (CUD no
6100)
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Se realizoacute un alineamiento local entre pares probando de manera independiente
cada una las cuatro clases maacutes comunes de AgrD contra la secuencia
aminoaciacutedica del AgrD del MRSA seleccionada para determinar la especificidad
del biosensor y en consecuencia la existencia de un comportamiento de
comunicacioacuten cruzada El alineamiento se realizoacute en la aplicacioacuten EMBOSS Water
(httpswwwebiacukToolspsaemboss_water) (Madeira et al 2019) Las
secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro clases maacutes representativas de AgrD
fueron descargadas de los datos publicados por Wang y otros (B Wang amp Muir
2016) mientras que la secuencia de AgrD de la cepa MRSA que seleccionamos
fue recuperada de una base de datos (KEGG no SAS066)
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
La solubilidad de las proteiacutenas seleccionadas para su expresioacuten en E coli fue
predicha por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk)
(Hebditch Carballo-Amador Charonis Curtis amp Warwicker 2017) La precisioacuten
general de la herramienta fue estimada en 706 De acuerdo con los autores
cualquier valor de solubilidad superior a 045 se considera que es soluble De esta
manera cualquier proteiacutena con valor inferior a 045 se infiere que no son solubles
Es importante mencionar que esta herramienta no es uacutetil para determinar el iacutendice
de solubilidad en proteiacutenas membranales
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
La herramienta bioinformaacutetica BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo
Martelli Fariselli Profiti amp Casadio 2018) predice la localizacioacuten subcelular de
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una proteiacutena en E coli Esta aplicacioacuten nos permite distinguir entre proteiacutenas
globulares de proteiacutenas membranales Para fines de nuestro proyecto nosotros
configuramos a la aplicacioacuten para identificar ldquoProkarya ndash Gram negativerdquo debido a
que eacuteste es el origen taxonoacutemico de nuestro organismo productor heteroacutelogo
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
410 Prediccioacuten de alergenicidad
La alergenicidad de la LnqQ fue evaluada en la herramienta bioinformaacutetica
AllerCatPro versioacuten 17 (httpsallercatprobiia-staredusg) la cual permite
predecir si el componente es capaz de crear una respuesta aleacutergica tipo I mediada
a la inmunoglobulina tipo E (IgE) basada en el anaacutelisis estructural lineal y
tridimensional de la proteiacutena (Maurer-Stroh et al 2019)
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
4111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica de la amilasa AmyE fue
descargado del cataacutelogo de GenBank (GenBank no V001011) El peacuteptido sentildeal
de este archivo fue manualmente extraiacutedo con la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 113 siguiendo las recomendaciones de la publicacioacuten de Papi y sus
colaboradores (R M Papi et al 2005)
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4112 Disentildeo y acoplamiento del peacuteptido sentildeal N-AmyE con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo nucleotiacutedico de la LnqQ (GenBank no AB2352011) El
acoplamiento fue manualmente resuelto utilizando la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 110 agregando sitios de restriccioacuten y algunos nucleoacutetidos tomando
en cuenta las recomendaciones de AddGene de dejar un espacio para asistir en la
clonacioacuten molecular por PCR (httpswwwaddgeneorgprotocolspcr-cloning)
Dos vectores de expresioacuten basados en pET-30a(+) fueron disentildeados in silico
donde uno de los vectores contiene exclusivamente el peacuteptido sentildeal N-AmyE y en
el siguiente estaacute el N-AmyE acoplado con la LnqQ
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pETNL fue
elaborado en SnapGene 113 y guardado en formato dna y enviado a BioBasic
Inc (Canadaacute) a traveacutes del tercero autorizado Productos y Equipos
Biotecnoloacutegicos SA de CV (Probiotek Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
4113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido sentildeal N-AmyE del
conjunto LnqQ con etiqueta de polihistidina fue evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea
SignalP 50 (httpwwwcbsdtudkservicesSignalP) el cual es un servidor que
determina la presencia de peacuteptidos sentildeales y la localizacioacuten de sus sitios de corte
proteoliacutetico en proteiacutenas de origen en Archaea bacterias Gram positivas y
negativas y organismos eucarioacuteticos (Armenteros et al 2019)
Esta herramienta puede distinguir entre tres tipos de peacuteptidos sentildeales tiacutepicos El
primer mecanismo es a traveacutes la viacutea Sec tipo I (SPI) que es conocido como el
mecanismo estaacutendar de excrecioacuten donde los peacuteptidos sentildeales son transportados
por el translocoacuten Sec y son escindidos por accioacuten de la Peptidasa de Sentildeal tipo I
(Lep) El segundo mecanismo corresponde a la viacutea Sec tipo II (SPII) donde los
peacuteptidos sentildeales lipoproteiacutecos son transportados por el translocoacuten Sec y cortados
mediante la Peptidasa de Sentildeal tipo II (Lsp) El uacuteltimo mecanismo corresponde a
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la viacutea Tat donde los peacuteptidos sentildeales son transportados por el translocoacuten Tat tipo
y son escindidos por la Peptidasa de Sentildeal tipo I (Lep) (Armenteros et al 2019)
En la aplicacioacuten se puede elegir entre cuatro grupos de organismos para el
anaacutelisis de corte predictivo los cuales corresponden a organismos eucarioacuteticos
organismos Gram positivos organismos Gram negativos y en tipo Archaea Para
fines de nuestro proyecto dado que esta construccioacuten fue intencionada para ser
producida en ceacutelulas de E coli se eligioacute la opcioacuten para organismos Gram
negativos
Para comparar la probabilidad de corte enzimaacutetico de nuestra construccioacuten in silico
de N-AmyELnqQ6xHis se descargoacute los datos bioinformaacuteticos de seis secuencias
aminoaciacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y cuyo corte proteoliacutetico fue
demostrado experimentalmente
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
4121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica del peacuteptido de fusioacuten SmbP fue
amablemente cedido por el Dr Xristo Zaacuterate de la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten La secuencia nucleotiacutedica del SmbP estaacute contenida en un vector de
expresioacuten tipo pET30a(+) y guardado en formato dna
4122 Disentildeo y acoplamiento de peacuteptido de fusioacuten SmbP con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido de fusioacuten con la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo geneacutetico desde la base de datos biotecnoloacutegicos Este
acoplamiento fue manualmente resulto a traveacutes de SnapGene
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pSmbP-
LnqQ fueron elaborado en SnapGene 113 guardados en formato dna y enviado
a Gene Universal Inc (Estados Unidos) a traveacutes del tercero autorizado
Distribuidora Bakterlab SA de CV (Bakterlab Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 38
4123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP del
conjunto LnqQ evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea PeptideCutter
(httpswebexpasyorgpeptide_cutter) la cual predice sitios potenciales para ser
cortados por proteasas o por sustancias quiacutemicas en una secuencia de proteiacutena
determinada (Gasteiger et al 2005) Esta aplicacioacuten contiene una lista extensa de
reacciones enzimaacuteticas y quiacutemicas Para fines de nuestro proyecto se eligioacute la
opcioacuten de ldquoEnterokinaserdquo ya que nuestra construccioacuten contiene este dominio
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Para descartar que la existencia de alguacuten codoacuten de paro no observado durante la
fase de post disentildeo optamos por analizar la secuencia nucleotiacutedica de la regioacuten
de intereacutes de pETNL y pSmbP-LnqQ en la aplicacioacuten en liacutenea ORF Finder
(httpswwwncbinlmnihgovorffinder) la cual es una aplicacioacuten que encuentra
marcos de lectura abiertos en una secuencia de nucleoacutetidos Los paraacutemetros
seleccionados correspondieron a ldquoATGrdquo exclusivamente como codoacuten de inicio y
como coacutedigo geneacutetico se utilizoacute la opcioacuten 1 correspondiente a ldquoStandardrdquo Esta
aplicacioacuten realiza una traduccioacuten de la secuencia nucleotiacutedica a partir de la
traduccioacuten de seis marcos de lectura y devuelve un graacutefico que indica la ubicacioacuten
donde se encuentra cada marco de lectura identificado (Wheeler et al 2003)
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
El peso molecular estimado de los productos de los vectores pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron estimado a traveacutes de la aplicacioacuten Compute pIMW de ExPasy
(httpswebexpasyorgcompute_pi) la cual permite estimar el punto isoeleacutectrico
(pI) teoacuterico y el peso molecular (MW) teoacuterico a partir de secuencias reportadas o
secuencias de aminoaacutecidos ingresados por el usuario (Gasteiger et al 2005)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 39
415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
La solubilidad de los productos de los pETNL y pSmbP-LnqQ fueron analizados
por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk) (Hebditch et al
2017) mientras que la localizacioacuten subcelular de las proteiacutenas fue determinada por
la herramienta BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo et al 2018)
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
Phyre2 (httpwwwsbgbioicacukphyre2htmlpagecgiid=index) es una
aplicacioacuten en liacutenea para el anaacutelisis de modelado para estructuras secundarias y
tridimensionales Esta herramienta permite predecir y analizar la estructura de la
proteiacutena asiacute como funciones y mutaciones haciendo maacutes faacutecil la interfaz al usuario
para interpretar la estructura secundaria y terciaria de los modelos asiacute como la
composicioacuten de dominios y la calidad del modelo (Kelley Mezulis Yates Wass amp
Sternberg 2015)
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
4171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Para transformar las ceacutelulas de E coli con el vector de expresioacuten pET30a(+)
pETNL o pSmbP-LnqQ se utilizoacute la teacutecnica de electroporacioacuten (Potter amp Heller
2003) que consiste en la introduccioacuten de DNA exoacutegeno al interior de las ceacutelulas
por meacutetodos fiacutesico-quiacutemicos A continuacioacuten describimos la teacutecnica
Se preparoacute un cultivo overnight de E coli en un tubo con caldo LB esteacuteril y se
incuboacute por 37degC en agitacioacuten constante por 18 h Al diacutea siguiente 20 microl del cultivo
preinoacuteculo fueron retirados y depositados en un microtubo con 1 ml de caldo LB
esteacuteril este proceso se realizoacute en seis tubos donde tres son etiquetados ldquoMuestrardquo
(M) ldquoAntibioacuteticordquo (A) ldquoViabilidadrdquo (V) y tres maacutes fueron reservados para anaacutelisis
espectrofotomeacutetricos Se incubaron todos los tubos a 37degC durante
aproximadamente 15 h (OD600 entre 04-06) en agitacioacuten constante Todos los
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 40
tubos asignados para anaacutelisis espectrofotomeacutetricos fueron usados para monitoreo
Una vez alcanzado el tiempo establecido los tubos M A y V fueron centrifugados
a 9000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente El sobrenadante de los tubos
fue descartado y las ceacutelulas fueron resuspendidas en 1 ml de agua ultrapura
esteacuteril a temperatura ambiente Los tubos fueron centrifugados a 9000 rpm
durante 2 min a temperatura ambiente Este paso se repitioacute una vez El precipitado
celular en los tubos M A y V fue resuspendido en 35 microl de agua ultrapura esteacuteril y
se agregoacute al menos 2 a 3 microl de plaacutesmido (asymp 500 microg totales) o de agua seguacuten el
caso Finalmente se mezcloacute cuidadosamente con la micropipeta
En el tubo de viabilidad no se agregoacute plaacutesmido y fue sembrado en una placa LB
En el tubo etiquetado como antibioacutetico no se agregoacute plaacutesmido y el precipitado fue
sembrado en una placa de LB suplementado con kanamicina (50 microgml) Al tubo
de control positivo se agregoacute un plaacutesmido resistente a la kanamicina y eacutesta fue
sometida a electroporacioacuten y sembrada en una placa con LB con kanamicina En
la muestra se agregoacute alguno de los siguientes plaacutesmidos pET30a(+) pETNL o
pSmbP-LnqQ y posteriormente fue sometido a electroporacioacuten y sembrado en una
placa de LB con kanamicina
El volumen total de los tubos fue transferido a una celda de electroporacioacuten en el
espacio de 2 mm El equipo de electroporacioacuten (previamente irradiado con luz UV
por 15 min) fue encendido y configurado para electroporar a 2500 V
Posteriormente se agregoacute 1 ml de caldo LB esteacuteril a la celda de electroporacioacuten y
cuidadosamente mezclado (para evitar estresar a la ceacutelula) La mezcla es tomada
con mucho cuidado desde la celda y transferido a un tubo de 15 ml esteacuteril El tubo
fue incubado a 37degC por 1 h en agitacioacuten muy baja Cumplido el tiempo
establecido el tubo fue centrifugado a 9000 rpm durante 2 min Se retiroacute la mayor
parte del sobrenadante (asymp 950 ml) y el restante fue mezclado suavemente con el
precipitado celular hasta suspender la solucioacuten El volumen total resuspendido fue
sembrado en placas de LB agar o LB agar suplementado con kanamicina (50
microgml) dependiendo el caso Las placas fueron incubadas a 37degC en condiciones
de aerobiosis durante 16 h Al terminar las placas fueron revisadas y
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 41
seleccionadas Las ceacutelulas efectivamente transformadas con los plaacutesmidos fueron
resistentes a la accioacuten de la kanamicina mientras que las no transformadas fueron
eliminadas Las ceacutelulas transformadas fueron validadas posteriormente por
teacutecnicas moleculares como extraccioacuten de DNA plasmiacutedico yo identificacioacuten por
producto de PCR punto final
4172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Para la extraccioacuten y purificacioacuten utilizamos el Isolate II Plasmid Mini Kit de
Meridian Biosciencereg (Estados Unidos Cat BIO-52056) Se preparoacute un cultivo
overnight de E coli en un tubo 5 ml de caldo LB esteacuteril y se incuboacute por 37degC en
agitacioacuten constante por no maacutes ni menos de 16 h Al diacutea siguiente previo al
ensayo de extraccioacuten se precalentoacute la solucioacuten de buffer de lavado PW1 a 50degC y
la temperatura se mantuvo a esta temperatura hasta su uso Se verificoacute que el
buffer de lavado PW2 estuviera suplementado con etanol
El cultivo overnight fue centrifugado a 11000 x g por 30 minutos El volumen se
retiroacute y se mantuvo el precipitado celular al cual se agregoacute 250 microl del buffer de
resuspensioacuten P1 y el precipitado se resuspendioacute por completo por voacutertex Es
importante que no quede masa celular adherida en los tubos Posteriormente se
agregaron 250 microl de buffer de lisis P2 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas
6 a 8 veces El tubo fue incubado a temperatura ambiente por 5 min o hasta que el
lisado celular se tornara claro Cumplido el tiempo anterior se adicionaron 300 microl
de buffer de neutralizacioacuten P3 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas 6 a 8
veces Este procedimiento fue para evitar el rompimiento del DNA genoacutemico Los
tubos fueron centrifugados a 11000 x g durante 5 min a temperatura ambiente
Este paso fue repetido hasta que el sobrenadante quedara lo maacutes claro posible
Posteriormente se tomoacute una columna tipo spin y sobre eacutesta se agregoacute un tubo
colector y sobre eacutesta se antildeadioacute el volumen recuperado del paso anterior El tubo
con el volumen fue centrifugado a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Sobre el tubo colector se
agregoacute 500 microl de buffer de lavado PW1 precalentado y se centrifugoacute a 11000 x g
por 5 min a temperatura ambiente El sobrenadante del tubo fue eliminado por
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 42
decantacioacuten Se adicionoacute 600 microl de buffer de lavado PW2 (suplementado con
etanol) y se centrifugoacute a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Centrifugar de nuevo el tubo
colector a 11000 x g por 2 min a temperatura ambiente para remover etanol
residual
Debajo del tubo colector se colocoacute un tubo de 15 ml esteacuteril y se agregoacute 50 microl de
buffer de elucioacuten P directamente sobre la membrana de siacutelice Se incuboacute a
temperatura ambiente y se centrifugoacute a 11000 x g por 2 min a temperatura
ambiente Del tubo con DNA purificado se tomaron 2 microl y se analizaron por nano-
espectrofotometriacutea para el caacutelculo de concentracioacuten y de pureza del DNA
plasmiacutedico
4173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Para comprobar que las ceacutelulas de E coli fueran efectivamente transformadas con
el vector de expresioacuten pET30a(+) pETNL y pSmbP-LnqQ se realizoacute un
experimento de PCR punto final para identificar al plaacutesmido recuperado de las
ceacutelulas de E coli Para ello nos enfocamos en primer lugar a elegir un par de
oligonucleoacutetidos que cumplieran de identificar los vectores de expresioacuten
El par de oligonucleoacutetidos elegidos para el anaacutelisis de las construcciones
corresponden al T7 promoter primer (5rsquo- TAATACGACTCACTATAGGG-3rsquo) y al T7
terminal primer (5rsquo- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3rsquo) los cuales son oligonucleoacutetidos
especiacuteficos para vectores construidos basados en pET30a(+) La secuencia de
ambos oligonucleoacutetidos fue recuperada de una compilacioacuten de AddGene para
ldquoSequencing Primersrdquo (httpswwwaddgeneorgmol-bio-referencesequencing-
primers)
Para determinar la temperatura de fusioacuten oacuteptima del par de oligonucleoacutetidos
utilizamos dos herramientas bioinformaacuteticas en liacutenea La primera aplicacioacuten fue
OligoAnalyzertrade (httpswwwidtdnacomcalcanalyzer) de la compantildeiacutea Integrated
DNA Technologies Inc (Estados Unidos) donde se ajustaron paraacutemetros como la
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 43
concentracioacuten de oligonucleoacutetido las concentraciones de iones monovalentes
(Na+) y divalentes (Mg2+) asiacute como la concentracioacuten de nucleoacutetidos (dNTPs) en la
reaccioacuten para el caacutelculo de formacioacuten de hairpin homodiacutemeros y heterodiacutemeros
La otra aplicacioacuten es Net Primer (httpswwwpremierbiosoftcomnetprimer) de
Premier Biosoft que tambieacuten contiene puntos como la aplicacioacuten anteriormente
mencionada pero contiene opciones como el caacutelculo de rating de eacutexito y
estabilidad en el extremo 3rsquo-terminal
Para realizacioacuten del ensayo de PCR punto final utilizamos el High-Stability PCR
kit (Cat No L00342 Manual No 0285 Versioacuten 08272013) de GenScript Inc
(Estados Unidos) De esta manera ajustamos las condiciones de reaccioacuten de PCR
seguacuten lo determinado por el fabricante para por la DNA polimerasa Green Taq La
reaccioacuten de PCR punto final se ajustoacute a una concentracioacuten de oligonucleoacutetidos de
trabajo para 10 microM concentracioacuten de monovalentes (Na+K+) a 500 mM
concentracioacuten de divalentes (Mg2+) a 15 mM y concentracioacuten de dNTPs a 05 mM
El protocolo general para ensayo de PCR punto final de acuerdo con el fabricante
consistioacute en que por cada 50 microl de volumen de reaccioacuten se agregariacutean 5 microl de 10
X de Reaction Buffer 10 microl de 10 mM de dNTPs 10 microl por el oligonucleoacutetido 5rsquo-
terminal a 20 microM 10 microl por el oligonucleoacutetido 3rsquo-terminal a 20 microM 20 microl de
plaacutesmido (de al menos 100 ngmicrol) 395 microl de agua ultrapura esteacuteril y 05 microl de la
DNA polimerasa Green Taq
4174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Las muestras obtenidas fueron procesadas en un gel de agarosa (1 pv)
adicionada con Eco-Stain ready to use (Cat No DT81413) de BioBasic Inc
(Canadaacute) el cual es una sustancia que tiene un pico de excitacioacuten a λ = 490 nm y
dos picos de emisioacuten λ = 520 nm y λ = 635 nm y esta solucioacuten se agrega al gel en
una relacioacuten de 1 microl por 20 ml de solucioacuten de agarosa Las muestras fueron
corridas durante 1 h a 100 V en caacutemara para electroforesis Al terminar el tiempo
establecido el gel fue retirado e iluminado con luz UV en el transiluminador y se
tomoacute una fotografiacutea como evidencia Todos los geles fueron elaborados con su
respectivos controles positivos negativos y muestras
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418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
4181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Brevemente cultivos con diferentes cepas de E coli transformados con
pET30a(+) pETNL o pSmbP-LnqQ fueron inducidos con IPTG Se realizoacute un
cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado en un matraz con 25 ml de
caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50 microgml) a 37degC en agitacioacuten
constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se registroacute el valor de OD600 del
cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo preinoacuteculo en un matraz
esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina hasta llegar a un valor
inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado a 37degC en agitacioacuten constante
hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de OD600 asymp 04
Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue inoculado con
IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos diferentes
temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue distribuido en
tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten Todos los tubos
usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los tubos fueron
propiamente etiquetados
4182 Extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pETNL
Los cultivos de E coli transformados ya fuera con pET30a(+) pETNL o pSmbP-
LnqQ fueron inducidos por IPTG para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
Brevemente se realizoacute un cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado
en un matraz con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50
microgml) a 37degC en agitacioacuten constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se
registroacute el valor de OD600 del cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo
preinoacuteculo en un matraz esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con
kanamicina hasta llegar a un valor inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado
a 37degC en agitacioacuten constante hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de
OD600 asymp 04 Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue
inoculado con IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 45
diferentes temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue
distribuido en tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten
Todos los tubos usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los
tubos fueron propiamente etiquetados
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten periplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Santos y sus colaboradores (BD Santos et al 2019) que es un
procedimiento en un ensayo de lisozima con choque osmoacutetico Se descongeloacute los
tubos a baja temperatura y posteriormente fueron centrifugados a 8000 times g
durante 15 min a 4degC El sobrenadante de cada tubo fue eliminado y lavado dos
veces con buffer PBS 1X pH 74 (Gibco) friacuteo (8000 times g durante 10 min a 4degC) En
el uacuteltimo lavado los tubos con precipitado celular fueron pesados y sus pesos se
registraron Por uacuteltimo se calculoacute la diferencia entre los tubos con precipitado
celular contra los tubos cuando estaban vaciacuteos A cada uno de los tubos con
precipitado celular se le agregoacute solucioacuten hipertoacutenica friacuteo (sacarosa 20 trizma 20
mM EDTA 2 mM y lisozima 20 mgml pH 80) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten
hipertoacutenica por cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido
de cada tubo fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el
tiempo el cultivo fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC
El sobrenadante fue recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten
periplaacutesmica hipertoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El
precipitado celular es reservado Una vez retirada la fraccioacuten anterior los tubos
con precipitado celular remanentes fueron pesados de nuevo y se agregoacute solucioacuten
hipotoacutenica (agua ultrapura esteacuteril) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten hipotoacutenica por
cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido de cada tubo
fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el tiempo el cultivo
fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC El sobrenadante fue
recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten periplaacutesmica
hipotoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El precipitado celular se
eliminado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 46
4183 Extraccioacuten de proteiacutenas citoplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pSmbP-LnqQ
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten citoplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Vargas y sus colaboradores (Vargas-Cortez et al 2016) junto con
recomendaciones de Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) que es un
procedimiento basado en perlas de vidrio
Se descongelaron los tubos a baja temperatura y posteriormente centrifugados a
8000 times g durante 15 min a 4degC El precipitado celular de los tubos fueron
resuspendidos en buffer de lisis friacuteo (Tris-HCl 50 mM NaCl 500 mM pH 80) y se
agregaron 150 mg de perlas de vidrio limpios de 01 mm Los precipitados
celulares resuspendidos en perlas fueron mezclados por voacutertex durante 1 min Los
tubos fueron centrifugados a maacutexima velocidad por 15 min a 4degC El sobrenadante
fue recuperado con cuidado de cada tubo y fue etiquetado como ldquoFraccioacuten
citoplaacutesmicardquo
4184 Obtencioacuten de fracciones solubles e insolubles para SDS-PAGE
Para obtener las fracciones solubles e insolubles seguimos el protocolo de Santos
(Byran Santos 2017) Para la fraccioacuten soluble a partir del sedimento celular eacutesta
es resuspendida en 120 microl de agua ultrapura esteacuteril y despueacutes se le agregan 40 microl
de solucioacuten amortiguadora de carga SDS-PAGE 4X suplementado con β-
mercaptoetanol para una concentracioacuten final al 1X La solucioacuten fue hervida durante
10 min y posteriormente centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante
fue separado y guardado como ldquoFraccioacuten solublerdquo Luego al sedimento restante
se le agregaron 120 microl de solucioacuten de urea 8 M y se hierve de nuevo durante otros
10 min para solubilizacioacuten de los cuerpos de inclusioacuten Finalmente la solucioacuten fue
centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante fue separado y guardado
como ldquoFraccioacuten insolublerdquo Ambas fracciones fueron visualizadas posteriormente
en los geles de SDS-PAGE
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4185 Preparacioacuten de gel de SDS-PAGE 16
Los geles de SDS-PAGE fueron preparados bajo las siguientes condiciones se
prepararon dos geles en dos tubos nuevos e independientes conocidos como
lower y upper con suficiente capacidad para almacenar el volumen de cada gel
Primero se preparoacute el lower gel y solo hasta haber terminado ese gel se procedioacute
a preparar el upper gel
Para preparar el lower gel a 16 preparamos una reaccioacuten considerando un
volumen de 10 ml Para ello mezclamos 350 ml de agua destilada 400 ml de
solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) 250 ml de lower buffer (para 25 ml Tris
1515 g SDS 01 g pH 68) 200 microl de APS 10 (pv) y TEMED 20 microl Para el
upper gel a 4 estaacute reaccioacuten fue montada con un volumen de 5 ml Para ello
mezclamos 325 ml de agua destilada 050 ml de solucioacuten de BisAcrilamida 40
(291) 125 ml de upper buffer (para 25 ml Tris 454 g SDS 01 g pH 88) 100 microl
de APS 10 (pv) y 20 microl de TEMED
Tanto la solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) del upper buffer y el lower buffer
fueron retirados del refrigerador y atemperados a temperatura ambiente cuando
menos unos 15 min antes de uso La solucioacuten de APS a una relacioacuten de 01 g por
1 ml (10 pv) debioacute prepararse al momento con agua destilada limpia Toda la
cristaleriacutea usada para preparar el gel de poliacrilamida debioacute ser lavada con agua
destilada limpia y secarse con suficiencia evitando rayar los vidrios
Una vez agregado el TEMED a la mezcla la solucioacuten fue inmediatamente vertido
sobre placas de vidrio Fue necesario esperar entre 20 a 30 minutos para que
completar el proceso de polimerizacioacuten En el lower gel se agregaron 200 microl de
isobutanol para el upper gel en la parte superior se agregoacute un molde para
pocillos Terminado el tiempo de polimerizacioacuten se agregaron las muestras de
proteiacutenas en los pocillos del gel de SDS-PAGE Los geles fueron puestos sobre
una caacutemara de electroforesis vertical y sumergidos en un buffer de corrida a 1X
(para 1000 ml Tris 3 g Glicina 144 g y SDS 1 g) El gel fue corrido a 150 V
durante 1 a 15 h dependiendo de la liacutenea de corrida de la solucioacuten
amortiguadora
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 48
4186 Tincioacuten de gel SDS-PAGE
Previo a tentildeir los geles se prepararon dos soluciones Para la solucioacuten de tincioacuten
se pesaron cuidadosamente y con guantes 50 mg de Coomasie Blue R-250 en un
tubo plaacutestico limpio para un volumen de 50 ml Despueacutes se agregaron 25 ml de
metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta
50 ml con agua destilada limpia Mantener a temperatura ambiente y en
condiciones de obscuridad hasta su uso Mientras que para la solucioacuten de
destincioacuten se midieron 75 ml de metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico
absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta 50 ml con agua destilada limpia
Mantener a temperatura ambiente hasta su uso
Cuando terminado el paso de corrida por electroforesis los geles fueron
cuidadosamente separados de los vidrios El gel fue tentildeido con la solucioacuten de
tincioacuten durante toda la noche en agitacioacuten constante a temperatura ambiente y
posteriormente fue destentildeido con la solucioacuten de destincioacuten durante el resto del diacutea
siguiente bajo las mismas condiciones previas El gel fue puesto sobre un fondo
blanco y se fotografioacute como evidencia
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en
los geles
La presente seccioacuten fue desarrollada posterior a la conclusioacuten de la fase
experimental con el objetivo de explicar la ausencia de bandas tanto de N-
AmyELnqQ como de SmbP-LnqQ en los geles de SDS-PAGE Para abordar el
problema exploramos las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas por el
anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle un anaacutelisis de perfil
aminoaciacutedico y finalmente a traveacutes de diferencias por su origen evolutivo
Las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas como el tamantildeo de proteiacutenas
peso molecular punto isoeleacutectrico nuacutemero total de residuos con carga positiva y
negativa iacutendice alifaacutetico (AI) e iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) fueron calculadas
a traveacutes de ProtParam de ExPasy (httpswebexpasyorgprotparamprotparam-
dochtml) (Gasteiger et al 2005) El iacutendice alifaacutetico (AI) estaacute principalmente
afectado por los cuatro aminoaacutecidos con cadena lateral alifaacutetico alanina valina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 49
leucina e isoleucina El incremento del AI es directamente proporcional a la
termoestabilidad en proteiacutenas globulares (Atsushi 1980) El iacutendice de
hidrofobicidad (GRAVY) es el resultado del promedio que representa la suma total
de los valores de hidropatiacutea de cada uno de los residuos dentro de una cadena
lineal de aminoaacutecidos dividido por el tamantildeo del peacuteptidoproteiacutena Una proteiacutena
con valor GRAVY negativo una proteiacutena hidrofiacutelica mientras que una proteiacutena con
valor GRAVY positivo es hidrofoacutebica (Kyte amp Doolittle 1982)
El anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle fue elaborado a
partir de ProtScale de ExPasy (httpswebexpasyorgprotscale) (Gasteiger et al
2005) Esta herramienta permite elaborar un perfil producido por cualquier escala
aminoaciacutedica a partir de una secuencia aminoaciacutedica Existen 57 escalas de
hidrofobicidad yo hidrofilicidad para fines de nuestro experimento utilizamos la
opcioacuten ldquoHphob Kyte amp Doolittlerdquo
El mapa de calor representa el porcentaje de aminoaacutecidos dada en una secuencia
lineal de aminoaacutecidos con el fin de elaborar un perfil aminoaciacutedico entre los
diferentes peacuteptidos antimicrobianos que fueron efectivamente sobreproducidos por
SmbP La graacutefica fue elaborada a traveacutes de Excel con datos descargados desde la
aplicacioacuten ProtParam de ExPasy
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 50
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS
Las actividades del proyecto fueron realizadas en los Laboratorios de Biologiacutea y de
Sistemas del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea y el
Laboratorio de Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas ubicado en la Divisioacuten de
Estudios de Posgrado ambas infraestructuras pertenecientes a la Facultad de
Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
A continuacioacuten se presenta un listado completo de los materiales y equipos
utilizado
51 Materiales y reactivos
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Microtubos de 15 ml 15 ml y 50 ml Distintas marcas No especificado
Cajas Petri de plaacutestico o vidrio Distintas marcas No especificado
Matraces tipo Erlenmeyer Distintas marcas No especificado
Celdas para espectrofotoacutemetro No especificado No especificado
Celdas de electroporacioacuten No especificado No especificado
Micropipetas (varios voluacutemenes) Distintas marcas No especificado
Medio de cultivo LB Difco 244620
Agar bacterioloacutegico MCD-LAB 9011
Agua grado Biologiacutea Molecular Invitrogen 10977-015
Kanamicina sulfato AG Scientific K-1022
Ampicilina soacutedica Sigma Aldrich A0166
Perlas de vidrio 01 mm Biospec 11079101
IPTG Bioline BIO-37036
LDS Sample Buffer 4X GenScript M00676-10
SDS IBI Scientific IB07062
Persulfato de Amonio (APS) BioBasic AB0072
TEMED Merck 110732
Glicina BioBasic GB0235
Bis-Acrilamida 40 (29109) Merck 100641
Coomasie Briliant Blue BioBasic CB0038
2-mercaptoetanol BioBasic MB0338
Isopropanol 100 DEQ No especificado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 51
Aacutecido fosfoacuterico 85 Jalmek A1825-13
Hidroacutexido de sodio DEQ No especificado
Aacutecido clorhiacutedrico DEQ No especificado
Alcohol metiacutelico DEQ No especificado
Aacutecido aceacutetico glacial Jalmek A0925-13
Etanol anhidro Jalmek E5325-18
Urea BioBasic UB0148
Buffer de fosfatos salinos 1X (PBS) Gibco 10010-023
Cloruro de sodio Jalmek S2325-05
Tris BioBasic TB0196
Glicerol DEQ No especificado
Guantes de nitrilo Ambiderm No especificado
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S657-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 7 J T Baker S656-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S655-02
QuickClean II Plasmid Miniprep kit GenScript L00420-100
QuickClean II Gel Extraction Kit GenScript L00418-100
QuickClean II PCR Purification Kit GenScript L00419-50
52 Equipos de laboratorio
USO PERSONAL
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Computadora personal Acer Aspire A515-51
LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA Y DE SISTEMAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Incubadora estaacutetica Lab Companion IB-11E
Incubadora de piso con agitacioacuten Lab Companion IS-971
Incubadora de agitacioacuten (microtubos) Eppendorf ThermoMixer C
Horno de secado Shel Lab SGO 6E
Horno de microondas Everstar P90D23AL-XF
Concentrador Thermo Fisher SpeedVac SPD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 52
Bantildeo de ultrasonido VMR Symphony 97043-996
Contador de colonias Reichert 3327
Agitador orbital Labnet Orbit 1000
Agitador vertical Thermo Scientific Compact Digital Rocket
Termociclador miniPCR Mini8
Termociclador Techne 3Prime
Refrigerador de puertas deslizantes Thermo Scientific MH45PA-GAEE-TS GPR Series
Refrigerador a dos puertas Norlake Scientific LRF 201WW
Congelador de -20 degC MetalFrio Solutions
No especificado
Espectrofotoacutemetro UV-Vis Optizen 2120 UV Plus
Nanoespectrofotoacutemetro BioSpec Shimadzu
Gabinete bioseguridad clase II Labconco Delta Series
Centriacutefuga para microtubos Ohaus Frontier 5515
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
Voacutertex Scientific Industries
Genie 2
Plancha de calentamiento con agitacioacuten magneacutetica
Lab Companion HP-3000L
Microscopio oacuteptico Fisher Scientific Micromaster
Autoclave Lab Companion ST-G Series
Caacutemara profesional Canon EOS M10
Transiluminador Maestro No especificado
Balanza analiacutetica AND GR-200
Balanza semianaliacutetica Ohaus Traveler
Electroporador Eppendorf Eppendorf
Fuente de Poder BioRad PowerPac Basic
Potencioacutemetro Ohaus Starter 5000
LABORATORIO DE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Cromatoacutegrafo GE Life Sciences Aumlktaprime Plus
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 53
53 Lugares de experimentacioacuten
Nuestro proyecto fue elaborado entre Febrero de 2018 a Mayo de 2021 y fue
mayoritariamente realizado en las instalaciones del Laboratorio de Biologiacutea
Sinteacutetica y de Sistemas (LBSS) a cargo del Dr Heacutector Javier Ameacutezquita Garciacutea
encontraacutendose en el interior del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y
Nanotecnologiacutea (CIBYN) dependencia de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
(FCQ) de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten El centro estaacute ubicado en la
autopista al Aeropuerto ldquoMariano Escobedordquo Km 10 Parque de Investigacioacuten e
Innovacioacuten Tecnoloacutegica (PIIT) CP 66628 en Apodaca Nuevo Leoacuten Meacutexico
En menor proporcioacuten nuestro trabajo tambieacuten fue realizado en el Laboratorio de
Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas (PEP) a cargo del Dr Xristo Zaacuterate
Kalfoacutepulos Esta unidad estaacute localizada en el interior de la Divisioacuten de Estudios de
Posgrado (DEP) de Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la Universidad
Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) La ubicacioacuten de la divisioacuten estaacute en la calle
Vicente Guerrero sn Col Trevintildeo CP 64570 en Monterrey Nuevo Leoacuten
Meacutexico
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos
Declaracioacuten de manejo y disposicioacuten de residuos
Todos residuos generados durante la realizacioacuten del proyecto de investigacioacuten
fueron gestionados de acuerdo con las caracteriacutesticas de estos siguiendo los
lineamientos establecidos por el Departamento de Medio Ambiente y Seguridad de
la Facultad de Ciencias Quiacutemicas utilizando los recipientes proporcionados por
este departamento en base a la Norma PR-CLB-SRR-000
Los residuos bioloacutegico-quiacutemicos fueron dispuestos en los contenedores
correspondientes en el interior de los laboratorios
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 54
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
En esta seccioacuten nos centramos en el disentildeo in silico de ceacutelulas de E coli
configuradas para detectar moleacuteculas de AIP producidos por el sistema nativo de
QS de ceacutelulas de MRSA De acuerdo con nuestro disentildeo (Figura 2) las ceacutelulas α
corresponden a ceacutelulas de S aureus productoras de moleacuteculas AIP mientras que
las ceacutelulas β corresponden a ceacutelulas de E coli que han sido modificadas con un
par de moacutedulos geneacuteticos biosensor y bacteriocina que le permiten detectar
moleacuteculas de AIP y en respuesta destruyen ceacutelulas de S aureus en el medio A
manera de resumen las ceacutelulas de E coli modificadas producen y excretan LnqQ
en funcioacuten de la concentracioacuten externa de moleacuteculas de AIP
Nuestra determinacioacuten por elegir bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
para nuestro sistema biosensor se explica en la siguiente numeracioacuten en primer
lugar consideramos que debido a su origen proteico son susceptibles a
modificaciones geneacuteticas (Cotter et al 2013)
Figura 2 Sistema QS para deteccioacuten y eliminacioacuten de S aureus
El moacutedulo biosensor conformado por agrC y agrA (azul marino y azul celeste respectivamente) estaacute regulado
por el promotor constitutivo J23110 La deteccioacuten del AIP-II (pentaacutegonos naranja) estaacute regulado por AgrC la
cual activa la fosforilacioacuten (ciacuterculos amarillo) de AgrA y activa la expresioacuten del moacutedulo bacteriocina a traveacutes
de la lnqQ lnqBCEDF y gfp (rojo amarillo y verde respectivamente) regulado por el promotor P2 LnqQ
destruye ceacutelulas de S aureus
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 55
62 Cepas bacterianas
La razoacuten de escoger a E coli como chasis bioloacutegico de produccioacuten es porque ya
ha sido reportado previamente como biosensor de ceacutelulas enteras basados en
deteccioacuten del QS (Sedlmayer Hell Muumlller Auslaumlnder amp Fussenegger 2018) y
ademaacutes porque es el organismo de produccioacuten heteroacuteloga maacutes usado en el campo
de las bacteriocinas (Mesa-Pereira et al 2018) Nuestro modelo estaacute disentildeado
para ser aplicado en E coli BL21 (DE3) ya que ha sido efectivamente reportado
para producir y secretar bacteriocinas de las clases IIa y IId eacuteste uacuteltimo es
importante ya que esta es la clase a la que pertenece la bacteriocina LnqQ (Mesa-
Pereira et al 2017)
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
Para determinar el comportamiento in silico de nuestra ceacutelula de E coli fue
necesario disentildear un vector de expresioacuten con dos moacutedulos geneacuteticos y eacutestos
fueron referidos como moacutedulo biosensor y moacutedulo de bacteriocina
respectivamente Ambos moacutedulos fueron disentildeados de la siguiente manera
promotor-RBS-gene(s) estructural(es)-doble terminador (Figura 3)
Figura 3 Moacutedulos biosensor y de bacteriocina
El moacutedulo biosensor es configurado con agrC y agrA y estaacuten regulados transcripcionalmente por el promotor
J23110 (A) El moacutedulo de bacteriocina estaacute armado con los genes lnqQ y gfp y estaacuten regulados
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 56
transcripcionalmente por el promotor P2 (B) Por uacuteltimo se muestra el disentildeo del sistema detectar y destruir
con los promotores divergentes J23110 y P2 (C)
En primera instancia se debioacute localizar el locus geneacutetico del promotor P2 de
nuestra MRSA fue manualmente localizado puesto que no existiacutea informacioacuten
relacionada al mismo De acuerdo con Shao y otros el locus de un promotor se
encuentra evolutivamente conservado entre especies que estaacuten relacionadas
(Shao Price Deutschbauer Romine amp Arkin 2014) De esta manera utilizamos
la anterior premisa para localizar el promotor P2 en un primer enfoque
localizamos la secuencia nucleotiacutedica del agrB en el archivo genoacutemico de la
MRSA (564 nucleoacutetidos KEGG no SA1842) como referencia ya que se conoce
que este gen es conocido que eacutesta es la primera unidad transcripcional ubicada riacuteo
abajo del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Para el segundo
enfoque usamos la informacioacuten disponible del promotor P2 de S aureus NCTC
8325 (Rajasree Fasim amp Gopal 2016 Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) una
cepa catalogada como estaacutendar para estudios bioinformaacuteticos (S Fuchs et al
2017 Herbert et al 2010) Al combinar lo mejor de ambos enfoques logramos
localizar la composicioacuten nucleotiacutedica del promotor P2 y su tamantildeo a traveacutes de la
identificacioacuten de los dominios
A continuacioacuten explicamos el principio del disentildeo de ambos moacutedulos En primer
lugar el moacutedulo designado como biosensor los genes agrC y agrA son
constitutivamente expresados por accioacuten del promotor J23110 Brevemente se
describe el principio del disentildeo donde inicialmente el AgrC anclado a membrana
de E coli detecta la presencia de moleacuteculas de AIP externas (Marchand amp Collins
2013) De esta manera AgrC sufre de un cambio conformacional y fosforila al
factor de transcripcioacuten AgrA Despueacutes el AgrA fosforilado (AgrA) actuacutea como
factor de transcripcioacuten del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Una
vez que AgrA-P se ha acoplado al promotor P2 el moacutedulo de bacteriocina es
expresado incluyendo los genes tipo estructural (lnqQ) excrecioacuten y
autoinmunidad (lnqBCEDF) del operoacuten lnq asiacute como del gen reportero gfp
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 57
Algunos autores han demostrado que mantener intacto el operoacuten nativo de una
bacteriocina cualesquiera (es decir que contenga los elementos geneacuteticos de su
estructura para su secrecioacuten y para autoinmunidad) en E coli eacutesta ceacutelula
modificada es capaz de excretar bacteriocinas Gram positivos al medio
extracelular (Mesa-Pereira et al 2017)
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
Los moacutedulos geneacuteticos fueron disentildeados para operar en el mismo sentido que el
ensamble por tipo BioBrick al yuxtaponer las propiedades del BioBrick (RFC 10) y
el BglBrick (RFC 21) La intencioacuten del disentildeo es que nuestros moacutedulos geneacuteticos
sean faacutecilmente ensamblados o removidos por teacutecnicas como In-Fusion (Sleight
Bartley Lieviant amp Sauro 2010) o ensamblado por clonacioacuten in vivo (Garciacutea-
Nafriacutea Watson amp Greger 2016) dado que los sitios de restriccioacuten actuacutean como
sitios homoacutelogos para la clonacioacuten
Cada moacutedulo estaacute flanqueado por sitios de restriccioacuten para que puedan ser
intercambiados de ser necesario El moacutedulo de promotores estaacute flanqueado por
los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI manteniendo a EcoRI como unidad neutral
para cuando sean necesario el intercambio de piezas Los elementos del moacutedulo
biosensor estaacuten flanqueados por los sitios BglII y BamHI y los elementos del
moacutedulo de bacteriocinas estaacuten rodeados por los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI
(Figura 4)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 58
Figura 4 Estrategia de construccioacuten in silico
El moacutedulo biosensor (seccioacuten A) estaacute constituido por el BglBrick RFC21 mientras que el moacutedulo bacteriocina
(seccioacuten C) estaacute representado por el BioBrick RFC10 La seccioacuten de promotores (seccioacuten B) fue colocado en
caso de que los promotores fueran cambiados Cada bloque contiene una regioacuten prefija y otra sufija y cada
bloque estaacute flanqueado en ambas direcciones por terminadores dobles de transcripcioacuten (BBa_B0015 ciacuterculos
rojos) La seccioacuten B estaacute bordeada por los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI (G-X) con la regioacuten EcoRI como
neutral La seccioacuten A EcoRI y BglII (E-G) estaacuten anclados como prefijos mientras que BamHI y XhoI (B-X)
estaacuten puestos como sufijos Los sitios de restriccioacuten BglII y BamHI fueron usados para construir el promotor
constitutivo J23110 en conjunto a su parte estructural (RBS-gen) para el moacutedulo de biosensor Por otro lado
para la seccioacuten C el prefijo estaacute compuesto por los sitios EcoRI-XbaI (E-X) y los sitios SpeI-PstI (S-P) son
colocados como prefijos Los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI fueron usados para construir el promotor
inducible P2 y en conjunto a su parte estructural (RBS-gene) para el moacutedulo de bacteriocina
El plaacutesmido pSB1A3 (AddGene no 116850) (Dupin amp Simmel 2019) sirvioacute como
plantilla para la construccioacuten de los moacutedulos geneacuteticos Las secciones prefijo y
sufijo fueron manualmente remplazados por cualquiera de los moacutedulos disentildeados
El replicoacuten y los genes de resistencia a antibioacutetico del plaacutesmido fueron retenidos
pero el terminador de transcripcioacuten fue remplazado por terminadores dobles
Finalmente un par de plaacutesmidos fueron construidos y cada uno contiene
individualmente del moacutedulo de biosensor o de bacteriocina respectivamente
Finalmente ambos plaacutesmidos fueron manualmente mezclados para crear un
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 59
plaacutesmido que contiene un par de moacutedulos que estaacuten en direcciones divergentes
Este vector de expresioacuten fue nombrado Dual Biosensor-Killer (Figura 5)
Figura 5 Representacioacuten esquemaacutetica del vector Dual Biosensor-Killer
El moacutedulo biosensor contiene los genes agrC y agrA y estaacute rodeado por los sitios de restriccioacuten EcoRI BglII y
XhoI mientras que el moacutedulo de bacteriocina contiene los genes del cluacutester lnqQBCDEF y el gen reportero gfp
y estaacute flanqueado por los sitios de restriccioacuten EcoRI XbaI SpeI y PstI Este plaacutesmido contiene un marcador
de resistencia a ampicilina y se compone de un total de 8904 pb
Parte de la estrategia de nuestro disentildeo consistioacute en que los promotores J23110 y
P2 fueran colocadas en sentidos opuestos para regular de manera independiente
la actividad de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina respectivamente La razoacuten
de aislar ambos moacutedulos es para evitar la expresioacuten por goteo que pudiera existir
por efecto de la fuerza de alguno de los promotores al mantenerse en la misma
direccioacuten transcripcional (Lubkowicz et al 2018) Todos los archivos generados
para la elaboracioacuten del vector de expresioacuten Dual Biosensor-Killer fueron
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 60
elaborados por SnapGene y estaacuten disponibles en los archivos anexos de esta
misma tesis
65 Optimizacioacuten de los codones nativos
De acuerdo con las observaciones (Tabla 1) todas las secuencias fueron
optimizadas para ser expresadas en E coli cepa tipo B Noacutetese que los sitios de
restriccioacuten tiacutepicos y los codones de paro de todas las secuencias utilizadas fueron
removidos El iacutendice CAI antes de la optimizacioacuten en AgrC AgrA LnqQ LnqB
LnqC LnqE LnqD y LnqQ era de 0407 0402 0532 0525 0518 0511 0503
and 0521 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores cambiaron a
0770 0766 0675 0735 0771 0773 0777 y 0747 respectivamente El valor
CAI para la GFP no pudo ser determinado por la aplicacioacuten antes de la
optimizacioacuten pero siacute despueacutes de la optimizacioacuten el cual correspondioacute a 0759 En
relacioacuten con el contenido de GC los valores antes de la optimizacioacuten fueron
282 272 333 225 231 305 y 245 respectivamente Despueacutes de
la optimizacioacuten los datos fueron 433 446 469 400 421 410
431 424 y 424 respectivamente El contenido GC para GFP despueacutes de
la optimizacioacuten fue de 491
Nuestros resultados el promedio del valor CAI y el promedio de contenido GC de
todas las secuencias aminoaciacutedicas antes de ser optimizadas era de 049 plusmn 005 y
2690 plusmn 371 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores
promedio fueron 075 plusmn 003 y 4361 plusmn 287 respectivamente Seguacuten las
especificaciones de la aplicacioacuten si el valor CAI es maacutes cercano a 1 eacuteste indica
que la secuencia de nucleoacutetidos utiliza los codones maacutes utilizados por el
organismo productor heteroacutelogo (Puigbograve et al 2008) Seguacuten los resultados los
valores CAI y el contenido GC de todas las proteiacutenas utilizadas como datos de
entrada fue substancialmente mejorados y estaacute optimizada para ser utilizado en E
coli heteroacuteloga La finalidad de optimizar el contenido nucleotiacutedico de las
secuencias utilizadas para disentildeo a las caracteriacutesticas requeridas del hospedero
es para incrementar el rendimiento de produccioacuten (Puigbograve et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 61
Tabla 1 Uso de codones previo y despueacutes de la optimizacioacuten
Paraacutemetros Previo a la optimizacioacuten Despueacutes de la optimizacioacuten
Gen Tamantildeo (pb) CAI GC CAI GC
agrC 1116 0407 282 0770 433
agrA 717 0402 272 0766 446
lnqQ 162 0532 333 0675 469
lnqB 240 0525 225 0735 400
lnqC 480 0518 231 0771 421
lnqE 1299 0511 259 0773 410
lnqD 678 0503 305 0777 431
lnqF 795 0521 245 0747 424
gfp NA NA NA 0759 491
El iacutendice de adaptacioacuten (CAI) y el contenido de guanidina y citosina (GC) La tabla se divide en dos
secciones previo a la optimizacioacuten y despueacutes de la optimizacioacuten La columna de gen representa el nombre del
dato de entrada y el tamantildeo que indica el total de nucleoacutetidos para cada entrada Los resultados en la tabla
representan la adaptabilidad de las secuencias de entrada usando a E coli como hospedero No fue posible
determinar el uso de codones antes de la optimizacioacuten para el gen gfp debido a que no hay suficiente
informacioacuten al computador el iacutendice CAI con esta tabla de referencia NA = No Aplica
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Es conocido que S aureus posee cuatro grandes variantes de clases de
moleacuteculas de AIP (desde I hasta IV) la cual difiere entre uno a dos residuos en la
seccioacuten madura del AIP (Ji et al 2005 B Wang amp Muir 2016) La diferencia
estructural entre las clases de AIP pueden actuar como inhibidores competitivos
del QS cuando interactuacutean con cepas filogeneacuteticamente relacionadas Este
fenoacutemeno bioloacutegico es conocido como comunicacioacuten cruzada (Everett amp
Rumbaugh 2014)
Para predecir la probabilidad de comunicacioacuten cruzada de nuestro biosensor
descargamos las secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro variantes maacutes
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 62
representativas de AgrD junto la informacioacuten anotada del AgrD de la cepa MRSA
estaacutendar Finalmente realizamos un alineamiento local bajo la herramienta
EMBOSS Water entre cada una de las secuencias aminoaciacutedicas representativas
contra la secuencia aminoaciacutedica de nuestra cepa Los resultados revelan (Tabla
2) que el AgrD de nuestro MRSA tuvo un porcentaje de identidad y de similitud con
el AgrD clase I de 478 y 652 respectivamente Para la clase II los
porcentajes fueron 100 y 100 respectivamente mientras que con la clase III
fueron de 326 y 500 respectivamente Finalmente con la clase IV los
porcentajes fueron de 457 y 609 respectivamente Seguacuten los resultados del
alineamiento podemos inferir que nuestro biosensor es uacutetil para detectar
moleacuteculas de QS producidos por S aureus N315 y por otros S aureus que sean
productores de AIP tipo II Al mismo tiempo nuestro sistema estariacutea limitado a no
detectar S aureus productores de AIP clases I III y IV
Bajo la prediccioacuten anterior nuestro biosensor completo de ceacutelulas estariacutea
capacitado para detectar ceacutelulas de S aureus N315 inclusive cepas de S aureus
USA100 las cuales son productoras naturales de moleacuteculas de AIP clase II
(Grundstad et al 2019) y estaacuten sentildealadas como entre las principales cepas tipo
MRSA que circulan a nivel mundial esta cepa es altamente letal y es una causa
de endocarditis infecciosa en la vaacutelvula nativa del corazoacuten A nivel in vitro se
reporta que es una productora de biopeliacuteculas fuertes (King Kulhankova Stach
Vu amp Salgado-Paboacuten 2016) A pesar de ser una cepa principalmente asociada a
infecciones adquiridas en hospitales (Limbago et al 2009 Tenover et al 2008)
tambieacuten se ha encontrado entre individuos que no han recibido cuidados meacutedicos
previos Noacutetese que esta cepa es resistente a vancomicina (Roberts 2013)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 63
Tabla 2 Prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Clase AIP Alineamiento de proteiacutenas Tamantildeo ID Similitud Gaps Score Ref
I MNTLFNLFFDFITGILKNIGNIAAYSTCDFIMDEVEVPKELTQLHE- 46 478 652 00 1700 1 2
II MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK 47 1000 100 00 24000 1 2
III MKKLLNKVIELLVDFFNSIGYRAAYINCDFLLDEAEVPKELTQLHE- 46 326 500 00 7200 1 2
IV MNTLYKSFFDFITGVLKNIGNVASYSTCYFIMDEVEIPKELTQLHE- 46 457 609 00 10500 2
MRSA MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK - - - - -
El alineamiento de proteiacutenas se realizoacute entre las cuatro clases mayoritarias de AIP contra el MRSA El alineamiento fue realizado en el programa Clustal Omega
mientras que la identificacioacuten (ID) similitud gaps y score fue determinado de la aplicacioacuten EMBOSS Water
1 (B Wang amp Muir 2016)
2 (Ji et al 2005)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 64
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
El anaacutelisis de solubilidad y localizacioacuten subcelular entre todas las secuencias
aminoaciacutedicas utilizadas para construir biosensor de ceacutelulas enteras es necesario
para obtener un alto rendimiento productivo (Ghosh et al 2004) Seguacuten los
resultados obtenidos por la aplicacioacuten Protein-Sol (Tabla 3) para prediccioacuten de
solubilidad eacutestos indican que LnqQ LnqF AgrA y GFP son considerados solubles
mientras que los datos obtenidos para LnqB LnqC y LnqE no pudieron ser
considerados ya que la aplicacioacuten los clasificoacute como proteiacutenas de membrana
Tabla 3 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
Gen Iacutendice Solubilidad
AgrC 0366 Invaacutelido
AgrA 0514 Soluble
LnqQ 0655 Soluble
LnqB 0655 Invaacutelido
LnqC 0644 Invaacutelido
LnqD 0388 Invaacutelido
LnqE 0609 Invaacutelido
LnqF 0607 Soluble
GFP 0592 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice superior de 045 es
porque se consideraron proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
De acuerdo con las predicciones de la aplicacioacuten BUSCA (Tabla 4) la localizacioacuten
subcelular de las proteiacutenas AgrA LnqQ LnqE y GFP es en el citoplasma mientras
que AgrC LnqB LnqC LnqD LnqE y LnqF son producidos en la membrana
plasmaacutetica Los caacutelculos predictivos en las proteiacutenas a sobreproducirse en E coli
concuerda con lo observado en la literatura para los elementos geneacuteticos del
moacutedulo biosensor el AgrC actuariacutea como una proteiacutena transmembranal con
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 65
actividad histidina quinasa mientras que AgrA actuariacutea como factor de
transcripcioacuten que se mueve a traveacutes del citoplasma para anclarse al promotor P2
(Gomes-Fernandes et al 2017) En los elementos del moacutedulo de bacteriocina se
espera que la LnqQ actuacutee como una proteiacutena soluble de bajo peso molecular que
es producido y excretado al medio extracelular (Fujita et al 2007) Para los demaacutes
elementos estructurales de este moacutedulo se sabe que LnqB es una proteiacutena
membranal tipo permeasa mientras que LnqC y LnqD son proteiacutenas con dominios
franqueados en membrana asiacute como LnqE y LnqF son proteiacutenas transportadoras
tipo ABC-2 y ABC respectivamente (Iwatani et al 2012) Por uacuteltimo los valores
de predictivos indican que la GFP seraacute producida como una proteiacutena soluble y
monomeacuterica (Zacharias et al 2002)
Tabla 4 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
Gen Valor Localizacioacuten subcelular
AgrC 075 Membrana plasmaacutetica
AgrA 07 Citoplasma
LnqQ 07 Citoplasma
LnqB 09 Membrana plasmaacutetica
LnqC 083 Membrana plasmaacutetica
LnqD 072 Membrana plasmaacutetica
LnqE 086 Membrana plasmaacutetica
LnqF 07 Citoplasma
GFP 07 Citoplasma
De acuerdo con la aplicacioacuten BUSCA las localizaciones subcelulares disponibles son membrana plasmaacutetica y
citoplasma
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
La determinacioacuten de la alergenicidad es un aspecto deseado durante la
construccioacuten del biosensor de ceacutelulas enteras debido a que nuestro sistema seriacutea
presentado en el futuro como un potencial candidato a agente terapeacuteutico Para
demostrar este punto fue necesario demostrar que la estructura tanto primaria
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 66
como secundaria de la LnqQ presentaba epiacutetopos para ceacutelulas tipo B dado que la
alergenicidad estaacute mediada tanto por ceacutelulas De acuerdo con los resultados de la
secuencia aminoaciacutedica de la LnqQ en su estructura en forma lineal (Tabla 5) se
indica que los potenciales residuos epiacutetopos corresponden a E13 S16-V19 y W21-
D31 Mientras tanto los anaacutelisis realizados por la aplicacioacuten Discotope 20 a la
secuencia aminoaciacutedica en su forma tridimensional indican que no se encontraron
residuos potencialmente epiacutetopos para ceacutelulas B ni se determinaron sitios de
alergenicidad
Tabla 5 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas B en LnqQ
Epiacutetopos EEEEEEEEEEEEEEEE
Secuencia lineal MAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIK
Estructura CCHHHHHHHHHHHHCCHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCC
Superficie EEEBEEBBEBBBEBEEEBBEBBBEEEEEBBEBBEBBBBBEBBBEEBEEEEEEE
La prediccioacuten fue resuelta en la aplicacioacuten BediPrep En la seccioacuten de epiacutetopos si la posicioacuten estaacute arriba de
05 entonces es marcado con una letra ldquoErdquo La aplicacioacuten anexa NetsurfP fue usada para la prediccioacuten
estructural a partir de secuencia lineal y se divide en tres categoriacuteas ldquoHrdquo para heacutelice ldquoErdquo para hoja y ldquoCrdquo para
cadena En la seccioacuten de superficie se divide en dos secciones ldquoBrdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el interior de la proteiacutena (burial) mientras que ldquoErdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el exterior de la proteiacutena (exposed)
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 67
610 Prediccioacuten de alergenicidad
De acuerdo con el reporte realizado por la aplicacioacuten AllerCatPro la bacteriocina
LnqQ no posee elementos alergeacutenicos
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
6111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE fue seleccionado porque se ha demostrado que los
primeros 33 residuos de la α-amilasa (AmyE) de B subtilis pueden ser acoplados
a la regioacuten N-terminal a una proteiacutena de intereacutes para su produccioacuten periplaacutesmica
en ceacutelulas de E coli (R M Papi et al 2005)
En primer lugar descargamos la secuencia nucleotiacutedica de la AmyE desde la base
de datos de GenBank Despueacutes utilizamos los dos oligonucleoacutetidos reportados
por Papi y sus colaboradores (R M Papi et al 2005) que estaacuten modificados con
extremos overhangs Cada oligonucleoacutetido estaacute compuesto por un sitio de
restriccioacuten en su extremo 3rsquo-terminal que corresponden a NdeI y BamHI
respectivamente
En la aplicacioacuten SnapGene el archivo geneacutetico del AmyE fue abierto y sobre eacutesta
se incorporaron los dos oligonucleoacutetidos mencionados arriba despueacutes se corrioacute un
ensayo de PCR in silico para extraer el peacuteptido sentildeal N-AmyE de la amilasa El
producto in silico resultante corresponde a un tamantildeo 117 pb que estaacute ordenado
de la siguiente manera 5rsquo-NdeI-(N-AmyE)-BamHI-3rsquo
En la misma aplicacioacuten realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten con
el producto de PCR in silico y el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)dnardquo Desde la
aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten pET-30a(+) y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten NdeI y BamHI
Posteriormente el producto de PCR compuesto con los extremos overhangs fue
cortado tambieacuten con el mismo conjunto de enzimas de restriccioacuten y procedimos a
clonar creando un vector de expresioacuten El vector fue nombrado y guardado como
ldquopET-30a(+)-N-AmyEdnardquo
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 68
6112 Disentildeo y construccioacuten de pETNL
En el extremo del peacuteptido sentildeal N-AmyE se le acoploacute la secuencia nucleotiacutedica de
la LnqQ por teacutecnicas de clonacioacuten molecular in silico Inicialmente el archivo
geneacutetico del gen lnqQ fue descargado (GenBank no AB2352011) y abierto en la
aplicacioacuten de SnapGene
A la secuencia nucleotiacutedica original de la lnqQ en el extremo 5rsquo-terminal
agregamos manualmente una secuencia que contiene el sitio de restriccioacuten BamHI
y riacuteo debajo de eacutesta agregamos un par de nucleoacutetidos (TT) Inmediatamente
despueacutes se colocoacute un codoacuten de inicio (ATG) y se antildeadieron los 52 residuos
restantes para un total de 53 de aminoaacutecidos que representan a LnqQ Justo en el
extremo C-terminal de esta bacteriocina se agregoacute una cola de polihistidina (H89-
H94) y un codoacuten de paro (TAG) En seguida se agregaron otro par de nucleoacutetidos
(TA) y se integroacute un sitio de restriccioacuten SalI Esta seccioacuten correspondioacute a un
fragmento lineal de 193 pb de la secuencia nucleotiacutedica que codifica para
LnqQ6xHis (Tabla 6)
Desde SnapGene realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten entre el
fragmento lineal de 193 pb con el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)N-AmyEdnardquo
Desde la aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten BamHI y SalI
Posteriormente el fragmento lineal fue cortado tambieacuten con el mismo conjunto de
enzimas de restriccioacuten y procedimos a clonar creando un vector de expresioacuten
nombrado y guardado como ldquopETNLdnardquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pETNL estaacute guardando en formato dna bajo el
nombre ldquopETNLdnardquo En este plaacutesmido se observan por los elementos geneacuteticos
propios de un vector pET30(a)+ en conjunto con los genes necesarios para la
construccioacuten N-AmyELnqQ
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Tabla 6 Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ (5rsquorarr3rsquo) Tamantildeo
pETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQL
LAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIKHH
HHHH
94
Los residuos subrayados representan el peacuteptido sentildeal Los residuos en negritas representan a LnqQ
6113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
Los resultados obtenidos del corte proteoliacutetico en el peacuteptido sentildeal N-AmyE fueron
contrastados con los datos de seis secuencias aminoaciacutedicas (Tabla 7) que teniacutean
el reporte de que este mismo peacuteptido sentildeal N-AmyE era cortado de manera
efectiva en cada una de ellas Tres de las secuencias corresponden a las
secuencias aminoaciacutedicas totales de tres α-amilasas reportadas en diferentes
cepas de B subtilis (Emori amp Maruo 1988 Kunst et al 1997 Yang et al 1983)
Dos de eacutestas corresponden a secuencias que se utilizaron para investigar queacute
aminoaacutecidos eran los necesarios para cortar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en ceacutelulas
de B subtilis o de E coli (Nakazawa et al 1986 Sakakibara et al 1993) La
uacuteltima corresponde a una construccioacuten sinteacutetica donde el peacuteptido sentildeal N-AmyE
fue utilizado para transportar liasa de pectina a la regioacuten periplaacutesmica de E coli (R
M Papi et al 2005)
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Tabla 7 Secuencias utilizadas para prediccioacuten de corte enzimaacutetico de N-
AmyELnqQ
Nombre Secuencia aminoaciacutedica
gtYang1983
(CAA234371)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPDDRRLRMEINSQSEKEIQFGKTYTIML
KGTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPAD
TDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtNakazawa1986
(PTUE33)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAQACPPETLVKVKDAEDQL
gtEmori1988
(CAA306431)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIEIRCNTFFQ
gtSakakibara1993
(PTUBE695)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASACAAPFNGTM
gtKunst1997
(NP_3881862)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPETAFKDGDQFTIGKGDPFGKTYTIMLK
GTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPADT
DTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtPapi2005 MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRIRMSYPESKLTGLTGFALAAKVTGGWAGPVVSITNLDQLKANIG
TVTPQVLVINSNISASSLTKVNMGANKTLIGSFQNRTLENIHLRATAQSQNIILQNLIFKHSANIKANDDIQVYLNY
GSKYWIDHCSFVGHSWSTTDGSEDKLLYIGEKADYATISNCFFGSHKYGLIFGHPADDNNAAFNGYPRLTLCHNRFD
NMEVRAPGLMRYGYFHVYNNYINKFHLGFTLAQNANILSESNYFGEGSQNNGMLDDKGSGTFTDTNSVPPITNQKSP
KAQWTATSNYAYTLKTAAQAKDFTQKNAGAQAAALVFGS
gtpETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWV
VSKIKQILGIKHHHHHH
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 71
En las bacterias existen dos mecanismos generales para la secrecioacuten de
proteiacutenas a traveacutes de la membrana citoplasmaacutetica En la viacutea de Secrecioacuten General
denominada como viacutea Sec las proteiacutenas son translocadas a la membrana en su
forma desnaturalizada y posteriormente son plegados en forma nativa en el lado
transversal de la membrana Mientras tanto en la viacutea de Translocacioacuten de
Gemelos Argininas conocida como viacutea Tat las proteiacutenas son translocadas en su
estado plegado nativo (Natale Bruumlser amp Driessen 2008)
De acuerdo con nuestros resultados (Tabla 8) el valor de calculado de prediccioacuten
de corte de peacuteptido sentildeal de las secuencias aminoaciacutedicas completas de tres α-
amilasas representan 09724 (Yang et al 1983) 09458 (Emori amp Maruo 1988) y
09724 (Kunst et al 1997) respectivamente De las secuencias parciales de
peacuteptidos sentildeales N-AmyE los resultados indican 08722 (Nakazawa et al 1986) y
06092 (Sakakibara et al 1993) Para la secuencia que se utilizoacute para exportar la
liasa de pectina al periplasma de E coli el valor calculado correspondioacute a 08262
(R M Papi et al 2005) en todas estas secuencias el mecanismo de secrecioacuten
general de proteiacutenas es el tipo Sec clase I Para nuestra proteiacutena N-AmyELnqQ
el valor calculado estimado fue de 04063 sin que fuera determinado su
mecanismo de corte predictivo Es decir nuestro valor calculado es mucho menor
a lo observado contra secuencias que habiacutean sido probados experimentalmente
Tabla 8 Prediccioacuten de corte enzimaacutetico de peacuteptido sentildeal N-AmyE
Identificacioacuten Prediccioacuten SecSPI TatSPI SecSPII Otro Pos
gtYang1983 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtNakazawa1986 SP(SecSPI) 08722 00359 00229 0069 33 y 34
gtEmori1988 SP(SecSPI) 09458 00122 0009 0033 33 y 34
gtSakakibara1993 SP(SecSPI) 06092 00428 01377 02103 31 y 32
gtKunst1997 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtPapi2005 SP(SecSPI) 08262 00183 00178 01377 31 y 32
gtpETNL Otro 04063 00249 00134 05554 Otro
SecSPI Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal I (Lep) TatSPI Translocoacuten Tat mediado por
Peptidasa de Sentildeal I (Lep) SecSPII Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal II (Lsp) Pos Sitio de
corte enzimaacutetico dentro de la estructura aminoaciacutedica lineal
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 72
612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
6121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo geneacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP estaacute guardado en formato dna
bajo el nombre ldquopET30a-SmbPdnardquo y estaacute flanqueado en el extremo 5rsquo-terminal
por el sitio de restriccioacuten NdeI y en el extremo 3rsquo-terminal por el sitio de restriccioacuten
NcoI El peacuteptido de fusioacuten estaacute dividido en dos secciones en el extremo N-terminal
estaacute compuesta por la regioacuten citoplasmaacutetica de la SmbP (SmbP) compuesta por
94 residuos seguido de dos residuos G95 y T96 riacuteo abajo inicia el extremo C-
terminal que estaacute compuesta por cinco residuos y representa al sitio de corte por
enteroquinasa (DDDDK)
6122 Disentildeo y construccioacuten de pSmbP-LnqQ
El archivo geneacutetico que contiene la bacteriocina LnqQ fue descargado de la base
de datos (GenBank no AB2352011) Inmediatamente en el extremo C-terminal
del peacuteptido de fusioacuten mediante la aplicacioacuten SnapGene antildeadimos manualmente
un residuo de alanina en la posicioacuten 102 y riacuteo debajo de eacutesta antildeadimos los 53
residuos que conforman el LnqQ iniciando con M103 En direccioacuten al extremo C-
terminal inmediatamente despueacutes del codoacuten de teacutermino (TAA) se agregoacute el sitio
de restriccioacuten XhoI Los elementos que componen la construccioacuten del pSmbP-
LnqQ (Tabla 9) estaacuten representados en el siguiente orden 5rsquo-NdeI-SmbP-DDDDK-
LnqQ-XhoI-3rsquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pSmbP-LnqQ estaacute guardado en formato dna bajo
el nombre ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01dnardquo En este plaacutesmido se observan por los
elementos geneacuteticos propios de un vector pET30(a)+
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 73
Tabla 9 Secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica del producto del vector de
expresioacuten (5rsquorarr3rsquo)
Tamantildeo
pSmbP-LnqQ MSGHTAHVDEAVKHAEEAVAHGKEGHTDQLLEHAKESLTHAKAAS
EAGGNTHVGHGIKHLEDAIKHGEEGHVGVATKHAQEAIEHLRASE
HKSHGTDDDDKAMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWL
NAGQAIDWVVSKIKQILGIK
155
Los residuos subrayados representan el peacuteptido de fusioacuten Los residuos resaltados representan el sitio de
corte de enteroquinasa Los residuos en negritas representan a LnqQ
6123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten de PeptideCutter se detectoacute un
uacutenico sitio de corte en la proteiacutena SmbP-LnqQ para la enzima enteroquinasa que
se encuentra ubicado en el residuo K101 lo cual coincide con lo esperado
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Los resultados sobre la identificacioacuten de codones de paro post disentildeo en la
construccioacuten de pETNL y pSmbP-LnqQ indicaron que no existe evidencia de
codones de paro ya que la aplicacioacuten en liacutenea logroacute identificar un marco de lectura
abierto con un tamantildeo de 285 pb que codifican para 94 aminoaacutecidos cuya
secuencia coincide con exactitud con la secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
para el caso de pETNL Mientras tanto un marco de lectura compuesto por un
tamantildeo molecular de 488 pb que se traducen para 155 aminoaacutecidos y cuya
secuencia coincide en su totalidad con la secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
De acuerdo con los resultados calculados por la aplicacioacuten de Compute pIMw tool
de ExPasy el peso molecular teoacuterico estimado del producto N-AmyELnqQ de
pETNL es de 1053468 Da con un punto isoeleacutectrico pi = 1063 mientras que para
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 74
el producto SmbP-LnqQ de pSmbP-LnqQ el peso estimado es de 1669771 Da
con punto isoeleacutectrico pI = 645
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
Seguacuten los resultados los iacutendices de solubilizacioacuten (Tabla 10) de N-AmyELnqQ y
del SmbP-LnqQ es de 0575 y 0865 respectivamente La aplicacioacuten sin embargo
clasifica a los productos del vector pETNL como invaacutelidos mientras que los
productos de pSmbP-LnqQ fueron considerados como solubles La razoacuten porque
la N-AmyELnqQ es considerado como invaacutelido se debe a que fue identificado
como proteiacutena de membrana En el caso de localizacioacuten celular (Tabla 11) los
pronoacutesticos indican que los productos producidos por pETNL y pSmbP-LnqQ se
encontraraacuten en membrana plasmaacutetica y en el citoplasma respectivamente
Tabla 10 Prediccioacuten de solubilidad N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Iacutendice Solubilidad
N-AmyELnqQ 0575 Invaacutelido
SmbP-LnqQ 0865 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice de solubilidad superior
a 045 es porque son considerados proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
Tabla 11 Prediccioacuten de localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Valor Localizacioacuten subcelular
N-AmyELnqQ 085 Membrana plasmaacutetica
SmbP-LnqQ 07 Citoplasma
Esto coincide con lo observado en los antecedentes ya que indican que las
proteiacutenas expresadas en E coli con el peacuteptido sentildeal N-AmyE en su regioacuten N-
terminal a menudo se localizan en el periplasma (Nakazawa et al 1986 R M
Papi et al 2005) Mientras que las proteiacutenas acopladas con el peacuteptido de fusioacuten
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 75
SmbP son reportadas para encontrarse en la regioacuten citoplasmaacutetica debido a que la
seccioacuten aminoaciacutedica que las orienta al periplasma fue removida de la secuencia
original de residuos quedaacutendose por tanto en el citoplasma celular de E coli
(Vargas-Cortez et al 2016)
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
El modelo estructural tanto en su forma secundaria (Figura 6) como tridimensional
(Figura 8) para N-AmyELnqQ asiacute como la presunta estructura secundaria (Figura
7) y tridimensional (Figura 10) para SmbP-LnqQ fueron revelados en este
documento En la estructura secundaria prevista para N-AmyELnqQ se espera
que el 96 de la secuencia esteacute compuesta por estructuras tipo α-heacutelices y se
estima que el 17 de la secuencia aminoaciacutedica total esteacuten embebidas en la
regioacuten transmembranal La evidencia predictiva de la N-AmyELnqQ (Figura 9) a
traveacutes de la aplicacioacuten Phyre2 indicoacute que los primeros 12 residuos del extremo N-
terminal estariacutean orientados en la regioacuten extracelular mientras que los residuos 15
al 30 estariacutean ubicados en regioacuten intermembranal entre el espacio extracelular y la
citoplasmaacutetica El resto de los residuos del extremo C-terminal estariacutean orientados
en la cara citoplasmaacutetica de la ceacutelula de E coli Mientras tanto la estructura
secundaria putativa para SmbP-LnqQ indica que el 85 de secuencia total estaacute
compuesta por α-heacutelices
En las estructuras tridimensionales putativas tanto para N-AmyELnqQ como en la
SmbP-LnqQ prevalece la formacioacuten de cuatro α-heacutelices Estos motivos
estructurales tipo α-heacutelices son comuacutenmente observados en bacteriocinas
similares a LnqQ (Lynch et al 2019) de manera que podemos predecir que la
estructura secundaria y tridimensional de la LnqQ no se ve afectada cuando estaacuten
acopladas tanto por N-AmyE como con SmbP
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Figura 6 Prediccioacuten de la estructura secundaria de N-AmyELnqQ
La estructura secundaria predicha del N-AmyELnqQ en Phyre2
Figura 7 Prediccioacuten de la estructura secundaria de SmbP-LnqQ
La estructura secundaria putativa del SmbP-LnqQ en Phyre2
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Figura 8 Prediccioacuten de estructura tridimensional de N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de N-
AmyELnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones
propuestas por modelo son de (Å) X29824 Y24988 Z25496
Figura 9 Prediccioacuten de heacutelices transmembranales para N-AmyELnqQ
La imagen es resultado de la prediccioacuten propuesta por Phyre2 para heacutelices transmembranales de N-
AmyELnqQ
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Figura 10 Prediccioacuten de estructura tridimensional de SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de SmbP-
LnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones propuestas
por modelo son de (Å) X32655 Y24988 Z25496
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
6171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Las ceacutelulas presuntamente transformadas fueron seleccionadas con kanamicina
De acuerdo con la evidencia presentada (Figura 11) los controles experimentales
cumplieron con su objetivo ya que no se registroacute crecimiento en placas de LB agar
esteacuteriles en el control negativo (Figura 11 a) en cuanto al control de viabilidad
eacuteste demostroacute que la electroporacioacuten no fue un factor significativo que causara la
muerte de ceacutelulas de E coli DH5α como BL21 (DE3) (Figura 11 b c) Por uacuteltimo
los controles con antibioacutetico demostraron que la kanamicina (50 microgml) era lo
suficientemente potente para seleccionar ceacutelulas (Figura 11 d e) Por uacuteltimo
demostramos bajo la teacutecnica de electroporacioacuten que las cepas de ceacutelulas de E
coli tanto BL21 (DE3) como DH5α fueron correctamente transformadas con los
vectores de expresioacuten pETNL (Figura 11 f g) pET30(a)+ (Figura 11 h j) y
pSmbP-LnqQ (Figura 11 i k) Los ensayos fueron realizados por triplicado
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Figura 11 Transformacioacuten de E coli DH5α y BL21 (DE3) con pET30a(+)
pETNL y pSmbP-LnqQ
Roacutetulo Descripcioacuten
a Control negativo
b Control viabilidad DH5α
c Control viabilidad BL21 (DE3)
d Control kanamicina + DH5α
e Control kanamicina + BL21 (DE3)
f DH5α + pETNL
g BL21 (DE3) + pETNL
h DH5α + pET30a(+)
i DH5α + pSmbP-LnqQ
j BL21 (DE3) + pET30a(+)
k BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ
Las placas rotuladas del a-c son placas LB con agar mientras que las placas d-k son placas LB
con agar suplementadas con kanamicina (50 microgml concentracioacuten final)
80
6172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Los ensayos para la extraccioacuten y purificacioacuten de los plaacutesmidos pET30(a)+ pETNL
y pSmbP-LnqQ de ceacutelulas de E coli que fueron observados en un gel de agarosa
1 (pv) Seguacuten la evidencia (Figura 12) nuestros controles demuestran que
tanto el plaacutesmido pETNL como el vector pSmbP-LnqQ se encontraban presentes
Los iacutendices de concentracioacuten y calidad de cada uno de los vectores fueron para
pET30(a)+ de 911 ngmicrol con A260A280 en 195 para el vector pETNL de 532 ngmicrol
con A260A280 en 194 y para el vector pSmbP-LnqQ de 2861 ngmicrol con A260A280 en
188 Seguacuten la literatura los iacutendices para considerar a un DNA plasmiacutedico como
puro deben tener valores espectrofotomeacutetricos de A260A280 entre 18-20 donde un
valor menor a 18 se considera como contaminacioacuten con proteiacutenas y un valor de
superior a 20 se considera contaminacioacuten por RNA (Koetsier Cantor amp Biolabs
sf) Podemos inferir que los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron recuperados en buena cantidad con un buen iacutendice de pureza
Figura 12 Gel de agarosa con plaacutesmidos
pETNL y pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer
TBE 1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Plaacutesmido pETNL
3 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
4 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli
BL21 (DE3) transformados con los vectores
de expresioacuten pETNL o pSmbP-LnqQ
El marcador de peso molecular corresponde
a 100-5000bp DNA Marker Plus Ready to
Use (Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
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6173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Seguacuten los resultados obtenidos por OligoAnalyzer Tool tras ajustar las
condiciones de los oligonucleoacutetidos a las especificaciones del fabricante del kit de
la polimerasa el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 promoter primer es de
20 pb con un contenido GC a 40 y un valor Tm = 591degC con un hairpin de -036
kcalmol a una Tm de 316degC y un valor homodiacutemero de -416 kcalmol Mientras
tanto el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 terminal primer es de 19 pb con
un contenido GC a 526 y un valor Tm = 61degC con un hairpin de 002 kcalmol a
una Tm de 248degC y un valor homodiacutemero de -474 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten NetPrimer el oligonucleoacutetido T7
promoter primer tiene un rating de eacutexito en 860 y presenta un valor de estabilidad
en su extremo 3rsquo-terminal de -87 kcalmol y no se identificoacute al hairpin el valor
homodiacutemero se registroacute en -759 kcalmol En el caso del oligonucleoacutetido T7
terminal primer este presenta un rating de eacutexito en 870 con un valor de
estabilidad en su extremo 3rsquo-terminal de -1142 kcalmol y tampoco se identificaron
hairpins el valor homodiacutemero se registroacute en -574 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los criterios habituales para seleccioacuten de oligonucleoacutetidos ambos
se mantuvieron en los estaacutendares ya que presentaron un tamantildeo entre 18 a 25 pb
con un hairpin cuyo valor de Tm fue menor a la Tm reportado para el
oligonucleoacutetido y los valores tanto de los homodiacutemeros y heterodiacutemeros nunca
fueron maacutes negativo o iguales a -9 kcalmol
En cuanto al caacutelculo de la Ta para ambos oligonucleoacutetidos utilizamos la regla
general de sustraer 5degC al Tm calculado para en ambos oligonucleoacutetidos Para el
caacutelculo de la Ta oacuteptimo para un par de oligonucleoacutetidos para un blanco en
particular se utilizoacute la siguiente foacutermula matemaacutetica TaOpt = 03 times (Tm de oligo) +
07 times (Tm producto) minus 149 donde el valor de Tm del oligonucleoacutetido es la
temperatura de fusioacuten del oligonucleoacutetido menos estable y la Tm es el valor del
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temperatura de fusioacuten del producto de PCR (Rychlik Spencer amp Rhoads 1990)
De esta manera promediamos el valor de la Tm de ambos oligonucleoacutetidos y el
resultado fue 60degC A este valor le sustrajimos 5degC para un Ta ajustado en 55degC
en los ensayos de PCR punto final para la identificacioacuten de los plaacutesmidos
Por uacuteltimo calculamos el total de ciclos y el tiempo de extensioacuten para los ensayos
de PCR punto final De acuerdo con las especificaciones del fabricante se debe
agregar 1 minuto por cada kb por sintetizar en los ensayos De esta manera
calculamos en primera instancia el tamantildeo molecular de los productos de los
ensayos de PCR de los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
para determinar el tiempo de extensioacuten Para lograr este objetivo realizamos una
reaccioacuten in silico de PCR punto final entre los dos oligonucleoacutetidos T7 con cada
uno de los vectores de expresioacuten utilizados
Los archivos geneacuteticos de los tres vectores de expresioacuten fueron abiertos desde la
aplicacioacuten de SnapGene y ejecutamos una PCR punto final in silico
Posteriormente corrimos una simulacioacuten de gel de agarosa al 1 De acuerdo con
los resultados de nuestra simulacioacuten (Figura 13) las bandas esperadas de los
productos lineales de PCR de los vectores de pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
se encontrariacutean entre 367 pb 488 pb y 651 pb respectivamente Con esto
confirmamos que ninguno de los productos de PCR esperados tendriacutea un tamantildeo
superior al 1 kb y procedimos a configurar la reaccioacuten para el ensayo de PCR
punto final
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Figura 13 Simulacioacuten de PCR para
vectores de expresioacuten
Gel de agarosa 10 generado desde
SnapGene
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Producto PCR de pET-30a(+)
2 Producto PCR de pETNL
3 Producto PCR de pSmbP-LnqQ
Las bandas corresponden a productos lineales
de PCR
El marcador de peso molecular in silico
corresponde a PCR DNA Ladder de GenScript
(Cat En desuso Estados Unidos) y fue tomado
desde la aplicacioacuten de SnapGene versioacuten 113
Asiacute pues configuramos las condiciones de corrida en el termociclador las cuales
fueron registradas de la siguiente manera una desnaturalizacioacuten inicial a 94degC por
180 s despueacutes 30 ciclos de desnaturalizacioacuten alineamiento y extensioacuten con
temperaturas en 94degC 55degC y 72degC respectivamente y sus respectivos tiempos de
reaccioacuten a 30 s 45 s y 30 s Finalmente se agregoacute una etapa de extensioacuten final
con una temperatura a 72degC por 420 s
6174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Despueacutes de realizar la teacutecnica de PCR punto final y una posterior corrida en un gel
de agarosa al 1 con buffer TBE 1X observamos una banda con tamantildeo de 367
pb para el producto de PCR obtenida del vector pET30(a)+ al tiempo que
recolectamos una banda de 488 pb para el producto de PCR del vector pETNL
(Figura 14) y finalmente encontramos una banda de 651 pb para el producto de
PCR del vector pSmbP-LnqQ (Figura 15) Dado que los valores predichos en la
simulacioacuten coinciden con los observado experimentalmente confirmamos que
nuestras cepas de E coli estaban efectivamente transformadas con su respectivo
vector de expresioacuten
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Figura 14 PCR de pETNL
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 PCR de pET30(a) virgen
3 PCR de pETNL
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
Figura 15 PCR de pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Control positivo pET30(a) vaciacuteo
3 Control positivo pETNL
4 Control negativo PCR pUC57-DPQ
5 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
6 Control negativo PCR pUC57-DPQ
7 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
Para los anaacutelisis de expresioacuten de proteiacutenas utilizamos algunos vectores de
expresioacuten que han sido exitosos en la produccioacuten de proteiacutenas Los vectores
pET30a-SmbP_LL-37 y pET30a-SmbP_MP1106 fueron amablemente compartidos
por David Antonio Peacuterez miembro del grupo de investigacioacuten PEP con sede en la
Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la UANL
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(Monterrey Nuevo Leoacuten) Similarmente el vector pET30NP-Hoc fue compartido
por Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros miembro del grupo de investigacioacuten
NBR con sede en el CIBYN (Apodaca Nuevo Leoacuten)
Dado que la informacioacuten de los tres plaacutesmidos se encuentra o se encontraba en
estado de revisioacuten al momento de redactar este documento por sus respectivos
comiteacutes de revisioacuten solo podemos limitarnos a mencionar los pesos moleculares
de los productos de cada vector de expresioacuten Para los dos vectores de David
Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) el peso molecular estimado de
ambos productos es 15 kDa mientras que el vector de Francisco Balderas el peso
molecular de su producto es de 95 kDa (F Balderas comunicacioacuten personal
2021)
6181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Para la induccioacuten por IPTG seguimos los protocolos preestablecidos para la
induccioacuten de proteiacutenas heteroacutelogas en ceacutelulas de E coli En nuestro ensayo la
concentracioacuten de IPTG elegida para la induccioacuten de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
correspondioacute a 01 mM Nosotros utilizamos esta concentracioacuten debido a que los
reportes indican que esta concentracioacuten es lo suficiente para saturar la reaccioacuten
bioloacutegica evitando la toxicidad celular por este compuesto (Malakar amp Venkatesh
2012) Los valores tiacutepicos de IPTG maacutes utilizados para la induccioacuten usualmente se
encuentran entre 05 mM y 10 mM (Mesa-Pereira et al 2018)
En nuestros cultivos el IPTG fue antildeadido en la fase exponencial tardiacutea (OD600 =
04-06) dado que el costo energeacutetico es maacutes alto durante la fase exponencial
temprana que en la tardiacutea (Malakar amp Venkatesh 2012) Ademaacutes se presume que
en esta fase el total de proteiacutenas producidas pueden alcanzar rendimientos
productivos superiores a 350 (Larentis et al 2014) Para nuestros ensayos
utilizamos dos temperaturas para inducir 37degC y 25degC y la razoacuten de utilizar una
temperatura maacutes baja es porque es un meacutetodo habitual para incrementar la
solubilidad de proteiacutenas recombinantes en E coli (Schein 1989)
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6182 SDS-PAGE de proteiacutenas periplaacutesmicas de E coli modificadas
con pETNL
Nuestros estudios preliminares bioinformaacuteticos indicaban que la proteiacutena N-
AmyELnqQ seriacutea insoluble (Tabla 10) y que tanto por sus antecedentes
(Nakazawa et al 1986 R M Papi et al 2005 Sjoumlstroumlm et al 1987) por sus
caracteriacutesticas moleculares estariacutea presuntamente ubicada en la regioacuten
periplaacutesmica de E coli (Tabla 11) Sin embargo nuestros resultados por ensayos
de SDS-PAGE indicaron que la induccioacuten por IPTG en ceacutelulas de E coli BL21
(DE3) transformados con el vector pETNL para la produccioacuten de N-AmyELnqQ
tanto en la fraccioacuten soluble como insoluble de proteiacutenas a una temperatura de
induccioacuten 25degC (Figura 16) como a 37degC (Figura 17) en la fraccioacuten periplaacutesmica
no fue posible en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) esta manifestacioacuten fue reportado
en muacuteltiples ocasiones De acuerdo con nuestros resultados no logramos
determinar la presencia de bandas de proteiacutenas en la regioacuten esperada que seguacuten
los anaacutelisis predictivos la proteiacutena N-AmyELnqQ debiacutea tener un peso molecular
cercano a 105 kDa
Es de mencionar que el valor de prediccioacuten de corte de peacuteptido sentildeal de la
proteiacutena N-AmyELnqQ fue muy inferior a los valores de prediccioacuten observados en
secuencias que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y que habiacutean sido previamente
validados experimentalmente (Tabla 8) Otro aspecto para considerar es que los
residuos reconocidos para el corte enzimaacutetico difieren entre los diferentes tipos de
bacterias (Nakazawa et al 1986) Esto quedoacute demostrado cuando observamos
que los residuos utilizados para el corte de este peacuteptido sentildeal podiacutean diferir
inclusive en el mismo tipo de bacteria Por ejemplo en la secuencia total de
aminoaacutecidos de la α-amilasa reportada por Yang y otros (Yang et al 1983) Emori
y otros (Emori amp Maruo 1988) y Kunst y otros (Kunst et al 1997) los residuos
observados corresponden al 33 y 34 mientras que para las secuencias de
aminoaacutecidos a los que se les fue acoplado el peacuteptido sentildeal en su regioacuten N-terminal
como las reportadas por Sakakibara y otros (Sakakibara et al 1993) y Papi y
otros (R M Papi et al 2005) los residuos de corte se ubicaron en la posicioacuten 31 y
32
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Figura 16 Gel de E coli BL21 (DE3) con pETNL inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
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Figura 17 Gel de E coli BL21 (DE3) pETNL inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
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6183 SDS-PAGE de proteiacutenas citoplaacutesmicas de E coli modificadas
con pSmbP-LnqQ
Los estudios preliminares predictivos para la produccioacuten heteroacuteloga de SmbP-
LnqQ en E coli indicaban que la presencia del peacuteptido de fusioacuten SmbP
aumentariacutea la solubilidad de la proteiacutena recombinante solubilidad (Tabla 10) y que
ademaacutes seriacutea localizado en el citoplasma celular (Tabla 11) con un peso
molecular aproximado de 167 kDa Nuestros resultados por ensayos de SDS-
PAGE indicaron que no hubo produccioacuten citoplasmaacutetica de una banda esperada
de 15 kDa tras inducir con IPTG a ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) transformados
con el vector pSmbP-LnqQ para la produccioacuten del peacuteptido SmbP-LnqQ tanto a
25degC como 37degC (Figura 18) Estos ensayos fueron realizados por triplicado
Esto nos orilloacute a plantearnos dos posibilidades con relacioacuten a la proteiacutena SmbP-
LnqQ la primera era que pudiera presentar problemas por plegamiento durante su
produccioacuten en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) y que la segunda fuera problemas
internos relacionados al IPTG Para demostrar la primera hipoacutetesis transformamos
ceacutelulas de E coli Origami con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ y utilizamos el
vector pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo este vector seguacuten su autor
produce una proteiacutena de un tamantildeo de 15 kDa en ceacutelulas de E coli Origami
debido a que es una proteiacutena problemaacutetica (datos no publicados) Nuestra
evidencia (Figura 19) sentildeala que el IPTG no es causa probable de la nula
produccioacuten debido a que se observoacute una banda muy definida en la regioacuten de los
15 kDa para las bacterias transformadas con el vector terminacioacuten MP1106 que
habiacutean sido inducidas por IPTG tanto a 25degC como 37degC Tampoco se observoacute
que la cepa Origami contuviera un factor bioloacutegico no considerado en la cepa
BL21 (DE3) que pudiera agilizar la produccioacuten de la proteiacutena SmbP-LnqQ ya que
no encontramos ninguna banda de un tamantildeo de 15 kDa en las ceacutelulas Origami
transformados
Ante los resultados previos consideramos posibilidad de que el problema se
encontrara especiacuteficamente en la cepa de E coli (DE3) presente en nuestro
laboratorio Para demostrar este punto procedimos a transformarla la cepa con el
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 90
vector de expresioacuten pET30NP-Hoc para fines de control positivo para nuestro
experimento Seguacuten su autor este vector de expresioacuten produce una proteiacutena lineal
de 95 kDa al inducirse por IPTG a 1 mM (datos no publicados) Nuestros
resultados en el gel SDS-PAGE muestran una banda de proteiacutenas extraiacutedas de E
coli transformados pET30NP-Hoc en la seccioacuten de 95 kDa y es producido tanto a
37degC (Figura 20) como a 25degC (Figura 21) Sin embargo no pudimos observar
ninguna banda sobre expresada de 10 kDa para las BL21 (DE3) transformadas
con pETNL ni una banda tampoco de 15 kDa para las bacterias transformadas con
pSmbP-LnqQ De esta manera descartamos la idea que existiera un problema
bioloacutegico procedente en la cepa de E coli BL21 (DE3) mantenida en nuestro
laboratorio
Se conoce que la bacteriocina LnqQ ya ha sido sujeta a modificaciones geneacuteticas
para incrementar su produccioacuten al ser clonada y expresada con eacutexito con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) registraacutendose
rendimientos hasta de 130 mg por litro de cultivo bacteriano (Ma et al 2012) Ante
la ausencia de una banda de proteiacutenas en la regioacuten de 15 kDa en nuestro vector
de expresioacuten con peacuteptido de fusioacuten SmbP-LnqQ se ha comentado que no existen
razones para suponer que todas las etiquetas de fusioacuten son aptas para todo tipo
de necesidades ya que es casi imposible determinar cuaacutel es el peacuteptido de fusioacuten
oacuteptimo para la produccioacuten Sin embargo una de las ventajas de utilizar peacuteptidos
de fusioacuten reconocidos es que son reconocidos sus ventajas y desventajas ya que
en algunos casos algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la solubilidad
de las proteiacutenas tales como TRX MBP NusA etc pero otros peacuteptidos sentildeales no
incrementan la solubilidad de la proteiacutena de intereacutes como GST BAP etc Incluso
algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la carga metaboacutelica en la ceacutelula
como GST MBP y NusA (Waugh 2005)
A pesar del buen registro experimental disponible sobre construcciones que
contienen el peacuteptido de fusioacuten SmbP (Vargas-Cortez et al 2016) suponemos en
nuestro caso en particular que dada las limitaciones de su corto historial
experimental auacuten no existe informacioacuten que determine las ventajas y desventajas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 91
pertinente al peacuteptido de fusioacuten SmbP para observar si son viables para la
produccioacuten solubilidad yo purificacioacuten de maacutes tipos de bacteriocinas
Figura 18 Gel de E coli BL21 (DE3) pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3)+ pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3) transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
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Figura 19 Gel de E coli Origami pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli Origami transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
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Figura 20 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 37degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 37degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 37degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 37degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 37degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 37degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 37degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 37degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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Figura 21 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 25degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 25degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 25degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 25degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 25degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 25degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 25degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 25degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de
proteiacutenas
Seguacuten el anaacutelisis fisicoquiacutemico de las secuencias aminoaciacutedicas que fueron
utilizadas en las construcciones para N-AmyE (Tabla 12) todas son de gran
tamantildeo y de alto peso molecular este peacuteptido se ha reportado para la
sobreexpresioacuten de AmyE en E coli (Nakazawa et al 1986) Asiacute como para la
sobreexpresioacuten de una regioacuten de 39 kDa que codifica para una regioacuten N-terminal
de una liasa de pectina (Pnl) en E coli (R Papi amp Kyriakidis 2003) a la fecha no
hemos visto alguacuten reporte de que este peacuteptido sentildeal haya sido utilizado para
producir proteiacutenas de bajo peso molecular
Por otro lado las secuencias que fueron exitosamente producidos con peacuteptido de
fusioacuten SmbP (Tabla 14) tambieacuten han mostrado ser uacutetil para producir proteiacutenas de
alto peso molecular o peacuteptidos de bajo peso molecular con actividad
antimicrobiana como VpDef (Montfort-Gardeazabal Claudio Casillas-Vega amp
Zarate 2020) Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al 2021) y muy recientemente LL-
37 (Perez-Perez et al 2021) el peacuteptido de fusioacuten tambieacuten ha demostrado ser
exitoso para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas de alto peso molecular como GFP y
RFP (Vargas-Cortez et al 2016) De esta manera consideramos que tanto el
tamantildeo como el peso molecular no son factores que intervengan durante el
proceso sobreproduccioacuten mediado tanto N-AmyE como con SmbP El punto
isoeleacutectrico tampoco parece ser un factor importante ya que el valor de AmyE es
aacutecido (561) mientras que Pnl es baacutesico (877) Situacioacuten similar sucede entre los
peacuteptidos microbianos puesto que VpDef es ligeramente aacutecido (686) en cambio el
resto de los peacuteptidos (Bin1b 949 LL-37 1061) son baacutesicos similar a LnqQ
Sin embargo observamos que tanto el iacutendice alifaacutetico (AI) como los valores del
iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) siacute son diferentes entre los distintos tipos de
peacuteptidos antimicrobianos Individualmente el valor AI de LnqQ es de 12115
(Tabla 12) y es superior al resto de los demaacutes peacuteptidos antimicrobianos con una
media de 5363 plusmn 3321) El valor AI para N-AmyELnqQ es de 11947 (Tabla 13) y
para SmbP-LnqQ es de 8323 (Tabla 15) respectivamente
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Tabla 12 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con N-AmyE
ID AmyE Pnl LnqQ
L 627 316 53
MW 6929711 3448665 589810
pI 561 877 1010
R(-) 69 21 2
R(+) 55 25 8
AI 6694 7636 12115
GRAVY -0648 -0291 +0300
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 13 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con N-AmyE
ID N-AmyEAmyE N-AmyEPnl N-AmyELnqQ
L 660 360 94
MW 7279942 3947961 1053468
pI 588 922 1063
R(-) 69 22 2
R(+) 58 30 12
AI 6982 8061 11947
GRAVY -0553 -0205 +0426
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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Tabla 14 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID VpDef Bin1b LL-37
L 49 45 37
MW 543498 520906 449332
pI 686 949 1061
R(-) 6 3 5
R(+) 6 9 11
AI 2388 4756 8946
GRAVY -0996 -0571 -0724
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 15 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID SmbP-VpDef SmbP-Bin1b SmbP-LL-37 SmbP-LnqQ
L 152 148 140 155
MW 1630268 1607675 1536102 1669471
pI 594 648 645 645
R(-) 26 23 25 22
R(+) 16 19 21 18
AI 5086 5878 1828 8323
GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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En cuanto al iacutendice de hidrofobicidad LnqQ mostroacute un valor GRAVY positivo
(+0300) mientras que el resto de los peacuteptidos antimicrobianos donde el valor
GRAVY promedio era de -073 plusmn 019 No es de sorprender que las bacteriocinas
del subgrupo de la familia de las aureocinas similares a A53 como LnqQ
aureocina A53 lacticina Z epidermicina NI01 lactolisterina BU y BHT-B tengan
valores GRAVY positivos (Perez Zendo amp Sonomoto 2018) Sin embargo cuando
LnqQ estaacute acoplado a N-AmyE el valor GRAVY se vuelve auacuten maacutes positivo con
+0426 (Tabla 13) y cuando estaacute fusionado con SmbP el valor GRAVY cambia a -
0514 (Tabla 15)
La literatura menciona que un peacuteptido o proteiacutena presenta un valor GRAVY
positivo debe considerarse como hidrofoacutebica mientras que un valor GRAVY
negativo significa que la proteiacutena es hidrofiacutelica (Kyte amp Doolittle 1982) De manera
que proteiacutenas con valores GRAVY negativos indican que la proteiacutena presenta una
estructura globular (hidrofiacutelicos) mientras que proteiacutenas con valores GRAVY
positivos indican la posibilidad que la proteiacutena guarde alguna relacioacuten con la
membrana (hidrofoacutebicos) (Enany 2014)
El valor GRAVY es considerado como el factor que maacutes influye en la movilidad de
las proteiacutenas en los geles de SDS-PAGE una proteiacutena con un valor GRAVY
negativo tiende a migrar maacutes lento que las proteiacutenas con valores positivos en los
geles para proteiacutenas (Shirai et al 2008) Las unioacuten de las moleacuteculas de SDS con
las proteiacutenas se produce a traveacutes de los aminoaacutecidos hidrofoacutebicos (Robinson amp
Tanford 2002) algunas estructuras hidrofoacutebicas son capaces de unir moleacuteculas
SDS hasta en un rango desde 34 a 10 g de SDS por 1 g de proteiacutena lo que
influiriacutea en una migracioacuten electroforeacutetica anoacutemala en los geles de SDS-PAGE
(Rath Glibowicka Nadeau Chen amp Deber 2009) LnqQ es una proteiacutena globular
(Acedo et al 2016) que utiliza la membrana especiacuteficamente para atacar
(Yoneyama Imura Ohno et al 2009) con lo que suponemos que el iacutendice de
hidrofobicidad pudiera estar afectando en el comportamiento electroforeacutetico de las
proteiacutenas Sin embargo tambieacuten la literatura sugiere que el comportamiento
anoacutemalo en las proteiacutenas de membrana en los geles de SDS-PAGE pudiera no
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 99
necesariamente relacionado a la carga neta de la proteiacutena ni a su iacutendice de
hidrofobicidad (Rath amp Deber 2013)
Al evaluar individualmente a LnqQ a traveacutes la escala Kyte-Doolittle observamos
que el peacuteptido posee dos secciones hidrofoacutebicas que se encuentran
aproximadamente entre los extremos del peacuteptido (entre residuos 5 al 15 y del 31 al
49) representando el 60 del total de la secuencia de LnqQ es hidrofoacutebica
(Figura 22) Si LnqQ estaacute acoplada con N-AmyE se observan las dos regiones
hidrofoacutebicas (entre residuos 9-50 y 66-85) que representa que el 6860 del total
de la secuencia sea hidrofoacutebica (Figura 23) Mientras tanto SmbP retiene sus dos
regiones hidrofoacutebicas que se ubican hacia la regioacuten C-terminal entre los residuos
103-117 y 133-151 componiendo el 2313 de total de la secuencia (Figura 24)
Dado que existe un reporte de produccioacuten exitosa entre la LnqQ acoplada con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO (Ma et al 2012) decidimos evaluar su valor AI GRAVY
y su escala Kyte-Doolittle Seguacuten los resultados de ProtParam para SUMO-LnqQ
los valores AI y GRAVY son de 8337 y -0516 respectivamente los cuales son
similares a lo reportado para SmbP-LnqQ Por otro lado seguacuten la escala Kyte-
Doolittle cinco regiones hidrofoacutebicas fueron descritas a lo largo de toda la
construccioacuten y estaacuten aproximadamente repartidas en toda la estructura lineal
entre los residuos 16-18 53-70 87-91 119-134 y 150-168 lo que representa el
28 del total de la secuencia (Figura 25) El valor GRAVY positivo y el alto
porcentaje de residuos hidrofoacutebicos para N-AmyELnqQ nos permite suponer que
estaacute proteiacutena se encontrariacutea anclada en la membrana celular lo que dificultariacutea su
solubilizacioacuten en los geles de proteiacutenas
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Figura 22 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la LnqQ
Figura 23 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de N-AmyELnqQ
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 10 20 30 40 50 60
Valo
r
Posicioacuten
LnqQ
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
N-AmyELnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 101
Figura 24 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SmbP-LnqQ
Figura 25 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SUMO-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SUMO-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Va
lor
Posicioacuten
SmbP-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Va
lor
Posicioacuten
SUMO-LnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 102
Ante la ausencia de una respuesta objetiva que explique la ausencia de bandas de
SmbP-LnqQ en los ensayos analizamos el perfil de aminoaacutecidos y detectamos
que la presencia de cisteiacutenas entre los peacuteptidos antimicrobianos tampoco fue un
factor determinante durante la sobreproduccioacuten con la SmbP ya que tanto VpDef
como Bin1b (que se caracterizan por ser abundantes en cisteiacutenas) como LL-37
(que no tiene cisteiacutenas) fueron exitosamente producidos El mapa de calor (Figura
26) sentildealoacute un alto porcentaje de Trp en LnqQ en comparacioacuten con los demaacutes
peacuteptidos antimicrobianos De acuerdo con la escala Kyte-Doolittle Trp es
considerado un residuo hidrofiacutelico (Kyte amp Doolittle 1982) cuando en realidad es
hidrofoacutebico por sus caracteriacutesticas uacutenicas (Mishra Choi Moon amp Baek 2018)
Este residuo funge como estabilizador de las proteiacutenas en la membranas anclaje
y orientacioacuten hacia el lado hidrofiacutelico de la bicapa lipiacutedica (Khemaissa Sagan amp
Walrant 2021) por eso son de alta importancia en proteiacutenas de membrana porque
apoyan en la estabilidad proteiacutena en la interfaz lipiacutedica por su forma riacutegida y plana
(Yau Wimley Gawrisch amp White 1998) Se presume que Trp permite que
peacuteptidos antimicrobianos similares a la aureocina A53 se mantengan unidos a la
membrana (Netz Bastos amp Sahl 2002) Sin embargo al analizar el porcentaje de
Trp entre N-AmyELnqQ SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ descubrimos que los
valores son muy similares 11 26 y 23 Por lo que Trp no seriacutea un factor
clave para que LnqQ sea producido en E coli
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
VpDef
Bin1b
LL37
LnqQ
Figura 26 Perfil aminoaciacutedico de los peacuteptidos antes de acoplarse con SmbPc
El mapa de calor representa la distribucioacuten de los residuos entre los peacuteptidos La intensidad del color negro
representa el porcentaje de residuos entre los peacuteptidos antes de ser acoplados con SmbP
Dada la similitud fisicoquiacutemica entre SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ abordamos el
problema desde el punto de vista analiacutetico otros autores demostraron que
proteiacutenas de peso molecular alto como N-AmyEPnl (R Papi amp Kyriakidis 2003) o
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 103
de peso molecular pequentildeo como SmbP-Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al
2021) SmbP-VpDef (Montfort-Gardeazabal et al 2020) SmbP-LL-37 (Perez-
Perez et al 2021) eran faacutecilmente observables mediante la teacutecnica de SDS-
PAGE hechos que utilizamos para la visualizacioacuten preliminar tanto N-AmyELnqQ
como de SmbP-LnqQ en los ensayos electroforeacuteticos Sin embargo en el reporte
de sobreproduccioacuten por SUMO-LnqQ los ensayos electroforeacuteticos preliminares
fueron realizados bajo la teacutecnica SDS-PAGE con Tricina (Ma et al 2012) Esta
variante es utilizada para resolver proteiacutenas con pesos moleculares pequentildeos que
oscilan entre 1 a 30 kDa (Haider Reid amp Sharp 2012) pero tambieacuten es uacutetil para
analizar proteiacutenas hidrofoacutebicas (Schaumlgger 2006) lo cual seriacutea un candidato ad
hoc a las caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas observadas de la LnqQ
Por uacuteltimo y no menos importante es tambieacuten de mencionar todas las
secuencias aminoaciacutedicas donde los peacuteptidos antimicrobianos tuvieron eacutexito con la
SmbP tienen su origen evolutivo en sistemas eucarioacuteticos las defensinas VpDef
(Zhang et al 2015) y Bin1b (Guo et al 2009) provienen del invertebrado
Venerupis philippinarum y del epidiacutedimo de la rata Rattus norvegicus
respectivamente mientras que la catelicidina LL-37 proviene del sistema inmune
de chimpanceacutes y humanos (Agerberth et al 1995) nuestra LnqQ posee un origen
procariota a traveacutes de Lactococcus lactis QU5 (Fujita et al 2007) Las defensinas
estaacuten compuestas por estructuras tipo beta plegadas mediadas por cisteiacutenas
conservadas mientras que los dominios antimicrobianos de las catelicidinas son
estructuralmente lineales carentes de puentes disulfuro y estaacuten compuestas por
varias heacutelices (Dorin McHugh Cox amp Davidson 2014) LnqQ es una estructura
lineal compuesta por dos heacutelices anfipaacuteticas (Perez et al 2014) por lo que el
factor estructural tampoco seriacutea un factor clave salvo por el hecho de que
provienen de oriacutegenes evolutivos distintos
A manera de conclusioacuten de acuerdo con la evidencia recolectada tanto a nivel
bioinformaacutetico como experimental encontramos que el marco de lectura de los
vectores para la produccioacuten de N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ estaban
correctamente orientados y dispuestos en sus marcos de lecturas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 104
correspondientes los geles de poliacrilamida siacute fueron efectivos para detectar
proteiacutenas con un peso similar (lisozima 144 kDa) a los peacuteptidos de nuestras
construcciones (N-AmyELnqQ= 1053 kDa y SmbP-LnqQ= 1669 kDa)
Confirmamos que el IPTG siacute es capaz de inducir la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
de control tanto en cepas de E coli BL21 (DE3) como de Origami tanto a 25degC
como a 37degC De manera que tanto N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ suponemos
que siacute son producidas pero por caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas propias de la LnqQ
es posible que 1) dado su alta hidrofobicidad es posible que N-AmyELnqQ se
mantenga acoplada en la membrana celular lo que dificultariacutea su solubilizacioacuten en
los geles de SDS-PAGE 2) desde el punto de vista analiacutetico es posible que SDS-
PAGE no sea la teacutecnica oacuteptima para la visualizacioacuten de las proteiacutenas hidrofoacutebicas
3) no existe informacioacuten conclusiva que respalde soacutelidamente porqueacute SmbP-LnqQ
no logroacute ser sobreproducida utilizando E coli como organismo heteroacutelogo
productor
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 105
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES
El biosensor disentildeado de ceacutelulas de E coli basado en la deteccioacuten de moleacuteculas
de QS es capaz de producir LnqQ en base a la concentracioacuten externa de AIP
excretada por MRSA La capacidad del biosensor estaacute mediada por un vector de
expresioacuten disentildeado que lleva por nombre Dual Biosensor-Killer Este plaacutesmido
ademaacutes puede ser utilizado para la construccioacuten de otros biosensores que
compartan el objetivo de detectar y destruir otros patoacutegenos productores de
sentildeales tipo QS Seguacuten nuestros anaacutelisis bioinformaacuteticos in silico nuestro
biosensor estaacute capacitado para detectar y destruir cepas de S aureus que sean
productoras de moleacuteculas de sentildealizacioacuten tipo AIP clase II De acuerdo con
nuestros pronoacutesticos nuestra cepa modificada seriacutea capaz de producir secretar y
ser capaz de ser resistente a la produccioacuten de LnqQ debido a que la maquinaria
geneacutetica se mantuvo intacto Nuestros resultados revelan indican que la LnqQ
seraacute lo suficientemente soluble cuando sea sobreexpresado Por uacuteltimo
determinamos que no existen epiacutetopos para ceacutelulas tipo B ni riesgo de
alergenicidad De esta manera la LnqQ producida por este sistema bioloacutegico es
aparentemente seguro para ser utilizado como un potencial candidato a agente
terapeacuteutico Los resultados in silico motivan al desarrollo y disentildeo de nuevos
agentes antimicrobianos a traveacutes de biosensores de ceacutelulas enteras para eliminar
patoacutegenos tanto sensibles como resistentes a los antibioacuteticos A pesar de los
favorables resultados reportados en publicaciones anteriores y la evidencia
predictiva sobre el peacuteptido sentildeal N-AmyE y con el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la
produccioacuten de proteiacutenas recombinantes como la bacteriocina LnqQ dichas
observaciones no pueden ser aplicadas para la produccioacuten expresioacuten y
purificacioacuten desde ceacutelulas de E coli BL21 (DE3)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 106
ANEXOS
Divulgacioacuten de la investigacioacuten
Publicaciones
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UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 107
Archivos de disentildeo
Todos los archivos gestionados para los disentildeos estaacuten guardados en su formato
correspondiente adentro de la carpeta de ldquoDoctoral ndash Anexosrdquo la cual fue anexada
propiamente en el disco compacto
Se elaboroacute una carpeta nombrada ldquoBioBricks and Modulesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 61 hasta 610 y estaacute subdivida
en cuatro subcarpetas nombradas como ldquoBioBricks (secuencias originales)rdquo
ldquoModulesrdquo ldquoPlasmidsrdquo ldquoTemplatesrdquo y el ldquoDual Biosensor Killerdnardquo Estos archivos
fueron elaborados a traveacutes de la aplicacioacuten de SnapGene 113 y estaacuten guardados
en formato dna Tambieacuten entregamos dos documentos en formato PDF que
contienen la secuencia nucleotiacutedica optimizada de todos genes usados para el
moacutedulo de biosensor y para el moacutedulo de bacteriocina
Se creoacute una carpeta nombrada ldquoSignal and fusion peptidesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 611 hasta 618 y en esta se
encontraraacute la subcarpeta ldquoMapa Geneacutetico de vectores de expresioacuten de expresioacuten
pETNL y pSmbP-LnqQrdquo Ademaacutes se entregaron tres archivos PDF donde dos de
eacutestos archivos contienen datos predictivos de la estructura secundaria y terciaria
de los productos de pETNL ldquoPhyre2 pETNLpdfrdquo y de pSmbP-LnqQ ldquoPhyre2
pSmbP-LnqQrdquo a traveacutes de la aplicacioacuten en liacutenea Phyre2 y el otro archivo PDF
ldquoSimulacioacuten agarosa 1pdfrdquo que contiene una simulacioacuten en gel de agarosa 1
(pv) de los productos lineales de los vectores de expresioacuten pET30a(+) pETNL y
pSmbP-LnqQ En la carpeta de este capiacutetulo tambieacuten se entregaron cinco archivos
en formato dna que contienen la informacioacuten nucleotiacutedica de la construccioacuten de
los vectores de expresioacuten cuyos nombres son ldquopET30(a)-NAmyE-LnqQ
pETNLpdfrdquo ldquopET-30a(+)pdfrdquo ldquopET-30a(+)-N-AmyEpdfrdquo ldquopET30a-SmbPpdfrdquo y
ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01pdfrdquo Todos los archivos estaacuten marcados con sus
respectivas caracteriacutesticas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 108
Resumen autobiograacutefico
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
Candidato para el grado de
Doctor en Ciencias con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Tesis Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing de
Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Edad 31 antildeos
Campo de estudio Desarrollo de agentes terapeacuteuticos y biologiacutea sinteacutetica
Biografiacutea Nacido en Monterrey Nuevo Leoacuten el diacutea 24 de julio de 1990 hijo de
Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas
Educacioacuten Egresado de Licenciado en Biotecnologiacutea Genoacutemica (UANL) en el
2013 y Maestro en Ciencias con Acentuacioacuten en Microbiologiacutea (UANL) en 2015
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 109
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UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 138
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vi
PRESENTACIOacuteN
CONTROL POBLACIONAL Y OSCILATORIO UTILIZANDO EL QUORUM
SENSING DE Staphylococcus aureus MEDIANTE UN CIRCUITO GENEacuteTICO
DE Escherichia coli
Presentado por
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
El presente proyecto fue mayormente realizado en las instalaciones del
Laboratorio de Biologiacutea Sinteacutetica y de Sistemas del Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas de la
Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con la asesoriacutea del Dr Joseacute Rubeacuten
Morones Ramiacuterez y en el menor medida en el Laboratorio de Expresioacuten y
Purificacioacuten de Proteiacutenas unidad perteneciente a la Facultad de Ciencias
Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten con apoyo del Dr Xristo
Zaacuterate Kalfoacutepulos Este proyecto fue auspiciado por el Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) mediante el apoyo con el Beca Nacional de
Posgrado (nuacutemero de becario 289476)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vii
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) por el apoyo
brindado con la Beca Nacional de Posgrado con nuacutemero de becario 289476
(CVU no 516171) para la continuacioacuten de estudios
A la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) y a la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten (UANL) por el apoyo otorgado con la aprobacioacuten de becas y por el
uso directo e indirecto de sus instalaciones materiales y equipos
Al Dr Joseacute Rubeacuten Morones Ramiacuterez mi asesor a quien agradezco por la
oportunidad de colaborar en el equipo de investigacioacuten Nanobiotechnology
Research Group (NBR) Externo mi agradecimiento por las asesoriacuteas y el uso
de instalaciones equipos y materiales en el Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea (CIBYN) asiacute como el financiamiento para la
obtencioacuten de materiales de experimentacioacuten y ejecucioacuten de servicios y el
mejoramiento de mi vida profesional
Al MC Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros y al Dr Angel Leoacuten Buitimea
miembros del NBR y quienes fueron clave en la elaboracioacuten de este proyecto
asiacute como en los artiacuteculos cientiacuteficos redactados durante el proceso doctoral
Al Dr Xristo Zaacuterate Kalfoacutepulos miembro del comiteacute tutorial por su apoyo
teacutecnico y asesoriacutea por el equipo de investigacioacuten del Laboratorio de Expresioacuten y
Produccioacuten de Proteiacutenas (PEP) El agradecimiento se extiende a David Peacuterez
Bryan Santos y Jessica Goacutemez por sus importantes contribuciones
A los demaacutes miembros NBR asiacute como del comiteacute tutorial por sus comentarios
revisiones y asesoriacuteas en la elaboracioacuten de este proyecto
A mis padres Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas y a mi
hermano Angel Alejandro Beniacutetez Chao por su apoyo emocional e
incondicional en el transcurso de este proyecto
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada viii
DEDICATORIA
Para Dios iexclGracias por el don de pensar
Para mi mamaacute Lupita y mi papaacute Alejandro
Para mis hermanos Angel Alejandro y Jesuacutes Alejandro (+)
Para mis mejores amigos Esthela Maldonado Ricardo ldquoMankisrdquo Garciacutea Ricardo ldquoCiegordquo
Garciacutea Edgar ldquoBomboacutenrdquo Villareal Gerardo ldquoPepisrdquo Villarreal Mayela ldquoMonkeyrdquo Maldonado
Aniluacute Maldonado Eduardo Mendoza Alejandra Villarreal Isaac ldquoBebordquo Gonzaacutelez Cristy Llanes
Salma Alemaacuten iexclGracias por ser tan importantes para miacute
Para mis colegas del NBR muy en especial para Paco Balderas Angel Leoacuten Javier Garza
Paco ldquoNegrordquo Rodriacuteguez Dago Torres Luis Cepeda Albert Lerma Jordy Lerma Ceacutesar Garza
Alex de la Garza Isabel Caamal Gricelda Mendiola Fatemehalsadat Tabatabaeifar Hossein
Alishaharatobotni Nahid Rafiei y otros maacutes Se extiende la dedicatoria a mis colegas en PEP en
especial para David Peacuterez Jessica Goacutemez Brayan Santos Evelyn Martiacutenez
Para los que fueron mis estudiantes de verano o de servicio social con mencioacuten especial para
Montse Villegas Rauacutel Garciacutea Cinthia Castillo Sarai Fierros Jessica Ojeda y otros maacutes
Para mis colegas de generacioacuten de doctorado en especial para Paco Balderas David Peacuterez y
Gaby Quintanilla
Para el equipo administrativo del CIBYN con menciones especiales para Karla Islas y Mayra
Sandoval asiacute como de todo el equipo de intendencia muy en especial para la Sra Antonia
ldquoTontildeitardquo Sandoval y la Sra Martha Flores asiacute como para el guardia Nehemiacuteas y el chofer
Ernesto
Para el equipo administrativo de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
con mencioacuten especial para Karina Navarro y para la Sra Edmunda de intendencia
Para mis queridos perros muy en especial para Lucky Toby (+) y Pelusa (+)
Para mis ex alumnos de preparatoria del Centro Escolar Gante iexclLo logreacute
Para todos los que han trabajado como meseros y repartidores para continuar con sus estudios
yo sostener una familia iexclUstedes tienen mis maacutes sinceros respetos
Para todos los que han roto rompen y romperaacuten los liacutemites de lo conocido
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada ix
Si nos negamos categoacutericamente a reconocer que somos susceptibles de
cometer un error una equivocacioacuten profunda ndash nos acompantildearaacute siempre Pero
si somos capaces de evaluarnos con un poco de coraje por muy lamentables
que sean las reflexiones que podamos engendrarnos nuestras posibilidades
mejoran enormemente
Carl Sagan
El mundo y sus demonios La ciencia como una luz en la obscuridad (1995)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada x
TABLA DE CONTENIDO
PORTADA I
FIRMAS DE APROBACIOacuteN DE TESIS II
FIRMAS DE REVISIOacuteN DE TESIS III
CONTRAPORTADA IV
RESUMEN IV
PRESENTACIOacuteN VI
AGRADECIMIENTOS VII
DEDICATORIA VIII
TABLA DE CONTENIDO X
LISTA DE FIGURAS XIV
LISTA DE TABLAS XV
LISTA DE ABREVIATURAS XVI
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN 1
11 ERA DE LOS ANTIBIOacuteTICOS 1
12 INFECCIONES RESISTENTES A LOS ANTIBIOacuteTICOS AMENAZA MUNDIAL 2
13 PROBLEMA SANITARIO CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTES 4
14 TRATAMIENTOS ACTUALES PARA EL COMBATE A INFECCIONES RESISTENTES 5
15 TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS A LOS ANTIBIOacuteTICOS 6
CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES 8
21 CONTROL BIOLOacuteGICO POBLACIONAL POR MICROORGANISMOS 8
22 BIOLOGIacuteA SINTEacuteTICA Y SU PAPEL EN PRODUCCIOacuteN DE BACTERIOCINAS 8
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica 8
222 Definicioacuten de los biosensores 9
23 QUORUM SENSING COMUNICACIOacuteN ENTRE CEacuteLULAS 10
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus 11
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD 12
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA 12
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada 12
24 BIOSENSORES DE CEacuteLULAS ENTERAS BASADOS EN DETECCIOacuteN DE QS 13
25 LAS BACTERIOCINAS 15
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas 15
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos 17
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xi
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes 19
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos 19
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas 20
256 La bacteriocina Lacticina Q 21
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados 22
26 PRODUCCIOacuteN HETEROacuteLOGA DE BACTERIOCINAS 23
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE 24
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP 25
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS 26
31 Justificacioacuten 26
32 Hipoacutetesis 28
33 Objetivo General 28
34 Objetivos Especiacuteficos 28
35 Metas 29
36 Aportacioacuten cientiacutefica 29
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA 30
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 30
42 Cepas bacterianas 30
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina 31
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 33
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas 33
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 34
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 34
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 34
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 35
410 Prediccioacuten de alergenicidad 35
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 35
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 37
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 38
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 38
415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 39
418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 44
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en los geles 48
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xii
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS 50
51 Materiales y reactivos 50
52 Equipos de laboratorio 51
53 Lugares de experimentacioacuten 53
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos 53
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES 54
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 54
62 Cepas bacterianas 55
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina 55
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 57
65 Optimizacioacuten de los codones nativos 60
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 61
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 64
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 64
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 65
610 Prediccioacuten de alergenicidad 67
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 67
612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 72
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 73
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 73
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 74
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 75
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 78
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 84
619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de proteiacutenas 95
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES 105
ANEXOS 106
Divulgacioacuten de la investigacioacuten 106
Archivos de disentildeo 107
Resumen autobiograacutefico 108
REFERENCIAS 109
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiii
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 CONCEPTO DEL BIOSENSOR BASADO EN CEacuteLULAS ENTERAS 30
FIGURA 2 SISTEMA QS PARA DETECCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE S AUREUS 54
FIGURA 3 MOacuteDULOS BIOSENSOR Y DE BACTERIOCINA 55
FIGURA 4 ESTRATEGIA DE CONSTRUCCIOacuteN IN SILICO 58
FIGURA 5 REPRESENTACIOacuteN ESQUEMAacuteTICA DEL VECTOR DUAL BIOSENSOR-KILLER 59
FIGURA 6 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE N-AMYELNQQ 76
FIGURA 7 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE SMBP-LNQQ 76
FIGURA 8 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE N-AMYELNQQ 77
FIGURA 9 PREDICCIOacuteN DE HEacuteLICES TRANSMEMBRANALES PARA N-AMYELNQQ 77
FIGURA 10 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE SMBP-LNQQ 78
FIGURA 11 TRANSFORMACIOacuteN DE E COLI DH5Α Y BL21 (DE3) CON PET30A(+) PETNL Y PSMBP-LNQQ 79
FIGURA 12 GEL DE AGAROSA CON PLAacuteSMIDOS PETNL Y PSMBP-LNQQ 80
FIGURA 13 SIMULACIOacuteN DE PCR PARA VECTORES DE EXPRESIOacuteN 83
FIGURA 14 PCR DE PETNL 84
FIGURA 15 PCR DE PSMBP-LNQQ 84
FIGURA 16 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON PETNL INDUCIDO A 25degC 87
FIGURA 17 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PETNL INDUCIDO A 37degC 88
FIGURA 18 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 91
FIGURA 19 GEL DE E COLI ORIGAMI PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 92
FIGURA 20 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 37degC 93
FIGURA 21 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 25degC 94
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xv
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 USO DE CODONES PREVIO Y DESPUEacuteS DE LA OPTIMIZACIOacuteN 61
TABLA 2 PREDICCIOacuteN DE COMUNICACIOacuteN CRUZADA 63
TABLA 3 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD DE PROTEIacuteNAS 64
TABLA 4 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN SUBCELULAR DE PROTEIacuteNAS 65
TABLA 5 PREDICCIOacuteN DE EPIacuteTOPOS DE CEacuteLULAS B EN LNQQ 66
TABLA 6 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE N-AMYELNQQ 69
TABLA 7 SECUENCIAS UTILIZADAS PARA PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE N-AMYELNQQ 70
TABLA 8 PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE PEacutePTIDO SENtildeAL N-AMYE 71
TABLA 9 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE SMBP-LNQQ 73
TABLA 10 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
TABLA 11 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN CELULAR N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvi
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Significado
E coli Escherichia coli
S aureus Staphylococcus aureus
MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina
L lactis Lactococcus lactis
ESKAPE Acroacutenimo de seis especies bacterianas Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
QS Quorum Sensing (Percepcioacuten de Quoacuterum)
LnqQ Lacticina Q
agrBDCA Operoacuten agr de S aureus
agrB Gen que codifica AgrB
agrD Gen que codifica AgrD
HSL Moleacutecula homo serilactonado
AIP Moleacutecula autoinductora
agrC Gen que codifica AgrC
agrA Gen que codifica AgrA
AgrB Transportadora proteasa necesaria para la maduracioacuten de AgrD
AgrD Peacuteptido precursor a la moleacutecula autoinductora
AgrC Receptor transmembranal con actividad histidina quinasa
AgrA Proteiacutena reguladora de unioacuten al DNA de respuesta
AgrA-P AgrA fosforilado
pH Potencial de hidroacutegeno
pI Punto isoeleacutectrico
AMP Peacuteptidos antimicrobianos
kDA Kilo Dalton
MIC Concentracioacuten miacutenima inhibitoria
microM Micromolar
microgml Microgramo por mililitro
lnqRQBCDEF Cluacutester geneacutetico
AmyE Alfa-amilasa
N-AmyE Peacuteptido sentildeal de la AmyE
SmbP Proteiacutena pequentildea de unioacuten a metales
SmbP Regioacuten citoplaacutesmitica de la SmbP (peacuteptido de fusioacuten)
Ala33 Las letras indican el aminoaacutecido y los nuacutemeros la posicioacuten en la cadena
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranoacutesido
SBP Massachussets Institute of Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts
KEGG Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes
FPB FP Base
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvii
PDB Protein Data Bank
nm Nanoacutemetros
DBK Plaacutesmido Dual Biosensor Killer
CAI Caacutelculo de Iacutendice de Adaptacioacuten
CUD Codon Usage Database
BUSCA Bologna Unified Subcellular Component Annotador
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
pET30(+)a Plaacutesmido tipo pET30(+)a sin modificaciones
pETNL Plaacutesmido que contiene N-AmyELnqQ6xHis
pSmPc-LnqQ Plaacutesmido que contiene SmbP-LnqQ
LB Medio de cultivo LB
OD600 Densidad oacuteptica
microl Microlitros
microg Microgramos
degC Grados Celsius
h Hora
ml Mililitro
g Gramo
g Fuerza centriacutefuga relativa
rpm Revoluciones por minuto
min Minuto
dNTPs Trifosfatos de desoxinucleoacutetidos
V Volts
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
pv Peso volumen
NaCl Cloruro de sodio
Tris-HCl Solucioacuten de Tris ajustada con aacutecido clorhiacutedrico (HCl)
M Molar
SDS Dodecil Sulfato Soacutedico
APS Persulfato de amonio
TEMED Tetramethylethylenediamine
X Veces de concentracioacuten de trabajo
mm Miliacutemetros
lnqQ Gen de lacticina Q
P2 Promotor 2 inducible del operoacuten agr de S aureus
gfp Gen de GFP
GFP Proteiacutena verde fluorescente
J23110 Promotor J23110 constitutivo para E coli
AIP-I AIP clase I
AIP-II AIP clase 2
AIP-III AIP clase 3
AIP-IV AIP clase 4
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xviii
Ala Alanina (A)
Arg Arginina (R)
Asn Asparagina (N)
Asp Asparato (D)
Cys Cisteiacutena (C)
Gln Glutamina (Q)
Glu Glutamato (E)
Gly Glicina (G)
His Histidina (H)
Ile Isoleucina (I)
Leu Leucina (L)
Lys Lisina (K)
Met Metionina (M)
Phe Fenilalanina (F)
Pro Prolina (P)
Ser Serina (S)
Thr Treonina (T)
Trp Triptoacutefano (W)
Tyr Tirosina (Y)
Val Valina (V)
Pnl Liasa de pectina
AmyE Amilasa E
N-AmyEPnl Liasa de pectina asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
N-AmyEAmyE Amilasa E asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
VpDef Defensina de Venerupis philippinarum
Bin1b Defensina de Rattus norvegicus
LL-37 Catelicidina de humanoschimpanceacutes
SmbP-VpDef VpDef asociado con SmbP
SmbP-Bin1b Bin1b asociado con SmbP
SmbP-LL-37 LL-37 asociado con SmbP
SUMO-LnqQ LnqQ asociado con SUMO
AI Iacutendice alifaacutetico
GRAVY Iacutendice de hidrofobicidad
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN
A lo largo de nuestra historia los humanos hemos desarrollado soluciones a los
problemas del mundo que nos rodea No es extrantildeo que el combate a las
enfermedades sean uno de los temas maacutes recurrentes Existen referencias
histoacutericas entre las diferentes civilizaciones de la antiguumledad como los chinos
(Nicola amp Abagyan 2009) aztecas (Davidson amp De Montellano 1983) y los nubia-
sudaneses (Bassett Keith Armelagos Martin amp Villanueva 1980) del uso
empiacuterico de sustancias para tratar infecciones y enfermedades Hace unos
doscientos antildeos atraacutes se pensoacute que los subproductos de la revolucioacuten industrial
seriacutean tratamiento efectivo contra infecciones y aunque los resultados fueron
alentadores al principios los resultados observados ante otro tipo de infecciones
no tuvieron el mismo eacutexito (Gaynes 2017)
11 Era de los antibioacuteticos
En 1928 Alexander Fleming encontroacute una solucioacuten efectiva para contrarrestar las
infecciones al describir al hongo Penicillium notatum que teniacutea efectos antagoacutenicos
sobre diferentes cepas estafilocoacutecicas (Fleming 1929) inaugurando asiacute la
conocida era dorada en descubrimiento de los antibioacuteticos (Podolsky 2018) Las
virtudes observadas en los antibioacuteticos fueron raacutepidamente puestas en juicio
cuando el mismo Fleming vaticinoacute en su discurso de entrega al premio Nobel que
el abuso y uso excesivo de los antibioacuteticos podriacutea generar brotes de patoacutegenos
resistentes a los antibioacuteticos (Fleming 1945) Cada vez que un nuevo antibioacutetico
era liberado a los sistemas de salud puacuteblicos pronto se reportaba un brote de
resistencia relacionado a antibioacutetico (Clatworthy Pierson amp Hung 2007) Con el
boom de nuevas clases de antibioacuteticos desde los 1940s hasta principios de 1970s
la alerta por resistencia a los antibioacuteticos quedoacute praacutecticamente inadvertida De
hecho entre los 1960s y 1970s existe evidencia que la comunidad cientiacutefica
internacional fue apaacutetica y minimizoacute el hecho de que el abuso de los antibioacuteticos
fuera una causa de resistencia a los faacutermacos en las bacterias patoacutegenas
(Podolsky 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 2
El tema de la resistencia a los antibioacuteticos no tuvo impacto suficiente hasta que
con el paso de las deacutecadas surgieron de brotes de patoacutegenos resistentes de
importancia cliacutenica como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA
por sus siglas en ingleacutes) tanto en Reino Unido (Gardner Oxon Stamp Bowgen amp
Moore 1962) como en Estados Unidos (Barrett McGehee amp Finland 1968) y
ademaacutes las nuevas clases de antibioacuteticos empezaron a escasear desde los 1980s
hasta casi los 2000s Adicionalmente los inversionistas se motivaron a encontrar
nuevas clases antibioacuteticos al observar maacutes ganancias en descubrir compuestos
anticanceriacutegenos (Ventola 2015) los reglamentos sanitarios se volvieron maacutes
estrictos para la liberacioacuten de antibioacuteticos para prevenir la presentacioacuten de
infecciones multirresistentes emergentes (Davies 2006) Todos estos factores
incluyendo otros que tal vez no fueron mencionados allanaron el establecimiento
de poliacuteticas en salud puacuteblica para buscar o sintetizar alguacuten faacutermaco o sustancia
que contrarreste el avance de microorganismos patoacutegenos resistentes de
relevancia cliacutenica (World Health Organization 2017)
12 Infecciones resistentes a los antibioacuteticos amenaza mundial
Cifras de la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) mostraron el peligroso
ascenso de infecciones por bacterias resistentes en las uacuteltimas deacutecadas donde se
calcula un promedio de 700000 muertes anuales para el 2019 (World Health
Organization 2019b) y la advertencia de que si los gobiernos y organizaciones
responsables de la salud puacuteblica a nivel mundial no elaboran poliacuteticas efectivas
para el 2050 tendremos un promedio de 10 millones de muertes al antildeo por
consecuencias de este tipo de infecciones (Dadgostar 2019)
En Meacutexico carecemos de un sistema de recoleccioacuten de datos confiables en este
tipo de infecciones (Amabile-Cuevas 2010) pero en un estudio realizado durante
seis meses del 2019 se recuperaron 23000 cepas resistentes a faacutermacos en 47
centros de salud puacuteblicos de todo el paiacutes siendo algunas de las maacutes comunes E
coli Klebsiella sp Enterobacter sp Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter sp
Enterococcus faecium resistente a vancomicina y Staphylococccus aureus
resistente a meticilina (MRSA) (Vazquez-Rodriguez et al 2018)
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En todas las regiones del mundo las infecciones resistentes han tenido un
peligroso ascenso En Estados Unidos las muertas anuales por infecciones
resistentes pasaron de 23000 muertes en 2013 (Frieden 2013) a 35000 durante
el 2019 (CDC 2019) Por otro lado en Europa las muertes atribuibles a
infecciones resistentes aumentaron de 25000 en 2007 (European Centre for
Disease Prevention and Control 2009) a 33110 en 2015 (Cassini et al 2019) En
42 paiacuteses del continente africano se registraron 54000 casos atribuibles a
tuberculosis multirresistente (MDR multi-resistant) y en ocho paiacuteses se registraron
3200 muertes relacionadas a la variante extremadamente resistente (XDR
extreme resistant) en un periacuteodo del 2004 al 2011 (Ndihokubwayo et al 2013) En
el continente asiaacutetico en China por ejemplo el rango de bacterias aislados que
eran resistentes a los antibioacuteticos pasoacute de 22774 casos a 190610 de 2005 a
2017 respectivamente (Qu Huang amp Lv 2019) en la India un estudio reporta
que el 70 de aislados cliacutenicos tipo Gram negativos son resistentes a los
faacutermacos y entre ellos se podiacutean encontrar cepas de Escherichia coli Klebsiella
pneumoniae Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa (Taneja amp
Sharma 2019)
Las infecciones resistentes son material incluso de intereacutes para el sector
econoacutemico El Banco Mundial ha elaborado dos escenarios para predecir el
impacto econoacutemico de las infecciones resistentes para el 2050 en un escenario
de bajo impacto el Producto Interno Bruto (PIB) mundial podriacutea disminuir hasta un
11 Sin embargo en un escenario de alto impacto el dantildeo al PIB global podriacutea
representar hasta una disminucioacuten de 38 Los costos al sistema de salud
puacuteblico en el mundo podriacutean oscilar entre los $300 mil millones a $1 cuatrilloacuten
presentando incluso un serio riesgo para el sector ganadero ya que en el
escenario de bajo impacto esto representariacutea una disminucioacuten de 26 esperado
a un 75 en un escenario de alto impacto (The World Bank 2016)
Las infecciones resistentes representa un punto de intereacutes incluso para la
Organizacioacuten de la Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
Food and Agriculture Organization) ya que actualmente se presume que en 42
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paiacuteses donde existen datos confiables de consumo de antibioacuteticos en el sector
ganadero y de agricultura se estima que en el 2010 el consumo era de 63000
toneladas de antibioacuteticoantildeo mientras que para el 2030 se estima un consumo
105600 toneladas de antibioacuteticoantildeo representando un incremento de 67 Los
iacutendices de metabolizacioacuten de antibioacuteticos tanto en ganado como en produccioacuten
pesquera presentan una baja metabolizacioacuten ya que entre un 70-80 y un 75-
90 respectivamente son excretados a las fuentes acuiacuteferas La produccioacuten de
cultivos consume entre un 02 a 04 del total de antibioacuteticos en relacioacuten con la
produccioacuten ganadera (FAO sf)
La relevancia sanitaria mundial de S aureus es porque se trata de un miembro del
grupo ESKAPE un grupo de patoacutegenos localizados en infraestructuras
hospitalarias asilos o en equipos e instrumentos meacutedicos como ventiladores y
cateacuteteres y que son habitualmente resistentes a los antibioacuteticos (Rice 2008) Esta
bacteria es la primera causa nosocomial tanto en Latinoameacuterica (26)
Norteameacuterica (260) y la segunda causa nosocomial de Europa (195)
(Biedenbach Moet amp Jones 2004) Se presume que un 30 de la poblacioacuten total
de humanos estaacute colonizado con al menos una subespecie de S aureus
(Wertheim et al 2005) y esto podriacutea ser porque el haacutebitat de esta bacteria en los
humanos es la parte anterior de las fosas nasales (Mulcahy amp McLoughlin 2016)
13 Problema sanitario con Staphylococcus aureus resistentes
S aureus es una bacteria Gram positiva y es considerada una de las principales
causas de enfermedades en piel (Foster 1996) Ademaacutes es capaz de desarrollar
biopeliacuteculas en dispositivos implantados en seres humanos y cateacuteteres causando
infecciones croacutenicas y persistentes (Dunne 2002) La osteomielitis y periodontitis
tambieacuten son producto de la biopeliacutecula este patoacutegeno estaacute involucrado en heridas
croacutenicas en pacientes diabeacuteticos con uacutelceras y estaacute relacionado a infecciones al
endocardio oculares y en casos de rinosinusitis croacutenica (Archer et al 2011) Se
considera que es un patoacutegeno de alto riesgo para pacientes con Fibrosis Quiacutestica
ya que es el maacutes reportado entre personas con 11 a 15 antildeos con esta condicioacuten
(Razvi et al 2009)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 5
Ahora bien se estima que entre un 13 al 74 del total de infecciones resistentes
en el mundo son causados por una variante resistente de S aureus resistente a la
meticilina la cepa MRSA (Koumlck et al 2010) la cual estaacute es sentildealada desde el
2017 por la OMS como un patoacutegeno de alta prioridad al que debe encontrarse una
solucioacuten pronta y efectiva (World Health Organization 2017) Por ejemplo en
Estados Unidos el total de pacientes por infecciones nosocomiales tipo MRSA
ascendioacute de 24 en 1975 a un 29 en 1991 (Panlilio et al 1992) y hasta casi
57 para el antildeo 2000 (NNIS 2004) En la actualidad el MRSA es considerado
endeacutemico en ese paiacutes ya que se estima que el 2 de la poblacioacuten es acarreador
de este estafilococo (Kavanagh 2019)
En Meacutexico los primeros casos de MRSA asociado a comunidad (CA-MRSA) cepa
USA300 fueron reportados a inicios del 2008 (Mariacutea E Velazquez-Meza et al
2011) y durante el 2010 un estudio anuncioacute que la cepa de MRSA maacutes
frecuentemente aislada en nuestro paiacutes era la New YorkJapan (Rodriacuteguez-
Noriega et al 2010) Tambieacuten se conoce que cepas de MRSA en hospitales
puacuteblicos en nuestro paiacutes fluctuoacute entre un 7 al 30 en pacientes entre las
deacutecadas de 1980s a 2000s (M E Velazquez-Meza et al 2004) mientras que el
Instituto Nacional de Cancerologiacutea determinoacute que 17 de las cepas aisladas de
3000 hemocultivos recuperados entre el 2005 al 2015 de pacientes con caacutencer
correspondiacutean a MRSA (Velaacutezquez-Acosta Cornejo-Juaacuterez amp Volkow-Fernaacutendez
2018)
14 Tratamientos actuales para el combate a infecciones
resistentes
En la actualidad las clases maacutes comunes de antibioacuteticos para combatir
infecciones resistentes a los antibioacuteticos son las penicilinas cefalosporinas
quinolonas macroacutelidos tetraciclinas glucopeacuteptidos y monobactaacutemicos (Taylor
Stapleton amp Paul Luzio 2002) En las uacuteltimas dos deacutecadas se han aprobado una
gran variedad de antibioacuteticos para el tratamiento de infecciones causados por
bacterias tanto Gram positivos como Gram negativos Los antibioacuteticos maacutes
recientemente reportados para el tratamiento de bacterias multirresistentes Gram
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positivas incluyen β-lactaacutemicos (ceftarolina y ceftobiprol) glicopeacuteptidos
(dalbavancin oritavancin y telavancin) oxazolidinonas (tedizolid fosfato)
quinolonas (besifloxacina delafloxacin y ozenoxacina) y tetraciclinas
(omadaciclina) (Koulenti et al 2019) Seguacuten la OMS hasta el 2019 se sabe de 50
agentes antimicrobianos que se encuentran en desarrollo cliacutenico donde 32 son
antibioacuteticos activos contra patoacutegenos de prioridad de la OMS diez son agentes
bioloacutegicos 2 son clasificados como agentes novedosos y dos pertenecen al grupo
de bacterias Gram negativas multirresistentes (World Health Organization 2019a)
15 Tratamientos alternativos a los antibioacuteticos
Los patoacutegenos resisten a los antibioacuteticos bajo tres grandes mecanismos de
resistencia intriacutenseca adaptativa yo adquirida (Arzanlou Chai amp Venter 2017
Blair Webber Baylay Ogbolu amp Piddock 2015 Sandoval-Motta amp Aldana 2016)
Es por ello que urge desarrollar una solucioacuten pronta y efectiva para contrarrestar
las infecciones causadas por patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos los cuales
son uno de los puntos que la OMS ha declarado como prioritarios (OrsquoNeill 2016)
En la guerra contra la resistencia a los antibioacuteticos nuestro grupo de investigacioacuten
ha participado en la creacioacuten de compuestos que puedan combatirlos como
tratamientos mixtos de antibioacuteticos (Montelongo-Peralta Leoacuten-Buitimea Palma-
Nicolaacutes Gonzalez-Christen amp Morones-Ramiacuterez 2019) nanopartiacuteculas de plata
asociados con metales de transicioacuten (Javier A Garza-Cervantes et al 2017)
nanomateriales asociados con nanopartiacuteculas de plata sintetizados con poliacutemeros
sensibles al ambiente (Ruben Morones amp Frey 2007) o producidos de manera
sustentable (Escaacutercega-Gonzaacutelez et al 2018) o a partir de un exopolisacaacuterido
producido por una levadura que actuacutea como agente reductor y que estaacuten
capeados por agentes con actividad antimicrobiana y antibiopeliacutecula (Javier
Alberto Garza-Cervantes et al 2019)
Otros grupos de investigacioacuten tambieacuten han desarrollado otro tipo de armas contra
la resistencia a los antibioacuteticos como el uso de teacutecnicas de decorado en
bacterioacutefagos (phage display) para producir vacunas en la caacutepside de
bacterioacutefagos inhabilitados (Bao et al 2019) o uso de agentes de control bioloacutegico
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contra patoacutegenos de alimentos (Gutieacuterrez Fernaacutendez Rodriacuteguez amp Garciacutea 2019)
o para el tratamiento de aguas residuales (Jassim Limoges amp El-Cheikh 2016)
Los esfuerzos actuales se han focalizado en encontrar yo desarrollar nuevas
clases de antibioacuteticos y agentes antimicrobianos contra bacterias resistentes (Fair
amp Tor 2014) y de prioridad ante la OMS (World Health Organization 2017) Las
corrientes alternativas a los antibioacuteticos maacutes reconocidas en la actualidad estaacuten
clasificadas en dos grandes enfoques el enfoque de prevencioacuten a las
enfermedades donde se desarrollan y se utilizan vacunas probioacuteticos o
prebioacuteticos mientras que en el enfoque por tratamiento a las enfermedades se
utilizan la terapia de fagos la aplicacioacuten directa de endolisinas yo exolisinas el
uso de microorganismos depredadores vivos o el uso directo de bacteriocinas
(Allen Trachsel Looft amp Casey 2014) Tambieacuten la Biologiacutea Sinteacutetica se ha
involucrado en resolver la problemaacutetica de infecciones resistentes a los faacutermacos
al participar en el disentildeo de biosensores basados en ceacutelulas completas que sean
capaces de destruir patoacutegenos mediante la previa de deteccioacuten de moleacuteculas
excretadas por microrganismos de intereacutes (Beniacutetez‐Chao Balderas‐Cisneros
Leoacuten‐Buitimea amp Morones‐Ramiacuterez 2021)
La biosiacutentesis purificacioacuten y aplicacioacuten de bacteriocinas contra patoacutegenos Gram
negativos y Gram positivos ha sido punto central para diversos grupos de
investigacioacuten (Cabral Penumutchu Norris Morones-Ramirez amp Belenky 2018
McAuliffe et al 1998 Rea Ross Cotter amp Hill 2011 Sandiford amp Upton 2012
Wong et al 2015) asiacute como la siacutentesis de nanocompuestos como liposomas
quitosano y nanopartiacuteculas hechos a base de compuestos de plantas (Sidhu amp
Nehra 2017) o de nanofibras (Fahim Khairalla amp El-Gendy 2016) que esteacuten
acomplejados con bacteriocinas Maacutes adelante se describiraacuten detalles sobre las
bacteriocinas y su relacioacuten en el combate a las infecciones resistentes a los
antibioacuteticos
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CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES
21 Control bioloacutegico poblacional por microorganismos
En la Naturaleza todos los seres vivos estaacuten interactuando y compitiendo por
nichos ecoloacutegicos para sobrevivir crecer y reproducirse para una adaptacioacuten
efectiva en el ambiente donde se desarrollan Este fenoacutemeno es universal ya que
pueden encontrarse en estilos de vida unicelulares y multicelulares (Grice et al
2009) Para competir por los nutrientes los microorganismos contienen
compuestos que matan o limitan el crecimiento de otra poblacioacuten Estos
compuestos pueden ser antibioacuteticos peacuteptidos antimicrobianos moleacuteculas de bajo
peso molecular entre otros maacutes (Gonzalez et al 2011 2010)
Cuando microorganismos vivos por sus caracteriacutesticas bioloacutegicas son usados para
suprimir la densidad poblacional de un tipo especiacutefico de organismo hacieacutendolo
menos abundante o dantildeino se le conoce como control bioloacutegico Es importante
mencionar que esta definicioacuten solo incluye a especiacutemenes vivos como
depredadores paraacutesitos nemaacutetodos hongos bacterias protozoarios inclusive
virus Sin embargo genes sin un recipiente bioloacutegico o metabolitos producidos por
un organismo de control sin que eacuteste se encuentre presente durante el control
poblacional son excluidos de esta definicioacuten (Eilenberg Hajek amp Lomer 2001)
Por ejemplo cultivos de Candida albicans (Peters et al 2010) Pseudomonas
aeruginosa (Filkins et al 2015) Bacillus subtilis (Gonzalez et al 2011)
Enterococcus faecium (Viccedilosa et al 2018) Acanthamoeba polyphaga (de Souza
Soares Benitez amp Rott 2017) disminuyeron la expresioacuten de patogenicidad en S
aureus Incluso cultivos de E coli han mostrado actividad fungicida contra cultivos
de C albicans (Cabral et al 2018)
22 Biologiacutea Sinteacutetica y su papel en produccioacuten de bacteriocinas
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica
La Biologiacutea Sinteacutetica consiste en disentildear libreriacuteas de elementos geneacuteticos como
promotores secuencias codificadoras terminadores factores de transcripcioacuten
entre otras maacutes asiacute tambieacuten se enfoca en el ensamblaje de circuitos geneacuteticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 9
hasta en el disentildeo y creacioacuten de organismos completos Este campo utiliza datos
cuantitativos para crear modelos bioloacutegicos y matemaacuteticos que permitan predecir
el comportamiento de un sistema bioloacutegico (Cameron Bashor amp Collins 2014
Garciacutea-Granados Lerma-Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2019)
En la publicacioacuten de Brophy y Voigt se revisan los principios baacutesicos para el
disentildeo de circuitos geneacuteticos para que los sistemas bioloacutegicos sean emulados
para cumplir con tareas o puedan fabricar materiales es importante considerar la
correcta eleccioacuten de reguladores asiacute como puntos de control que cuantifiquen el
impacto en el rendimiento (Brophy amp Voigt 2014)
222 Definicioacuten de los biosensores
Un sensor quiacutemico es un dispositivo que transforma en una informacioacuten quiacutemica
en una sentildeal analiacutetica de utilidad y puede detectar desde la concentracioacuten de una
muestra especiacutefica hasta el anaacutelisis total de sus compuestos Este tipo de
sensores contiene dos unidades funcionales baacutesicas un receptor y un transductor
El receptor transforma la informacioacuten quiacutemica de la muestra en una forma de
energiacutea que puede ser medido por un transductor El transductor transforma la
energiacutea en una sentildeal analiacutetica uacutetil (Hulanicki Glab amp Ingman 1991) De esta
manera comprendemos que un biosensor es ldquoun dispositivo que a traveacutes de
reacciones especiacuteficas de enzimas aisladas sistemas inmunes tejidos organelos
o ceacutelulas enteras sirve para detectar compuestosrdquo (IUPAC 1992)
Asiacute en los biosensores basados en ceacutelulas completas un analito de intereacutes
ingresa al interior celular y es reconocido por un factor transcripcional el cual
controla la transcripcioacuten de un gen mediante el reconocimiento de un promotor
especiacutefico Estos biosensores pueden reconocer diferentes analitos como
hidrocarburos metales pesados antibioacuteticos (Garnier-Rocha 2019) Incluso
algunos modelos biosensores se han aprovechado del fenoacutemeno de quorum
sensing para crear sistemas de comunicacioacuten sinteacuteticos con la capacidad de
controlar poblaciones (Balagaddeacute et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 10
23 Quorum Sensing Comunicacioacuten entre ceacutelulas
El concepto QS refiere a que es un mecanismo de comunicacioacuten entre
microorganismos que dependen de sentildeales quiacutemicas (moleacuteculas sentildealizadoras)
que son excretadas al medio extracelular y que dependen la densidad celular
(Fuqua Winans amp Greenberg 1994) Las bacterias similares a organismos de
diferentes dominios se sostienen de mecanismos de comunicacioacuten y se valen de
diferentes moleacuteculas Esta interaccioacuten puede ser intriacutenseca (es decir intracelular o
adentro de la misma ceacutelula) o extriacutenseca (es decir extracelular o afuera de la
ceacutelula) y crea un fenotipo de respuesta en una poblacioacuten especiacutefica del mismo
(Fuqua et al 1994)
Mientras los cultivos productores de QS esteacuten creciendo eacutestos pueden producir
excretar acumular y detectar moleacuteculas de sentildealizacioacuten quiacutemicas externas
conocidas como autoinductores los cuales son producidos a niveles basales pero
que se acumulan en el exterior celular Cuando la densidad celular de bacterias y
la concentracioacuten de moleacuteculas autoinductoras alcanzan un umbral de
concentracioacuten especiacutefico el cultivo experimenta un cambio en su fenotipo (Garg
Manchanda amp Kumar 2014 Rutherford amp Bassler 2012) Esta respuesta variacutea
seguacuten el tipo de sentildeal emitido ya que su forma y composicioacuten quiacutemica es diferente
seguacuten la especie que la produzca (Fuqua et al 1994) siendo las respuestas maacutes
comunes la formulacioacuten de esporulados factores de virulencia asociados a
invasioacuten bioluminiscencia virulencia yo la creacioacuten biopeliacuteculas (Miller amp Bassler
2002)
El fenoacutemeno de QS sucede tanto en bacterias productoras Gram negativas y las
Gram positivas pero las moleacuteculas auto inductoras son de diferente composicioacuten
quiacutemica En las bacterias Gram negativas las moleacuteculas de sentildealizacioacuten son
conocidas como homoserina lactonada aciladas (HSL) mientras que en bacterias
Gram positivas el mecanismo es a traveacutes de peacuteptidos excretados (Miller amp
Bassler 2002)
En el modelo general de QS en Gram positivos en primera instancia el gen que
contiene el precursor de la moleacutecula sentildealizadora (tambieacuten conocido como
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autoinductor inmaduro) es transcrito y traducido y eacutesta es posteriormente
parcialmente hidrolizada para crear un autoinductor maduro Eacuteste uacuteltimo es
enviado al exterior celular por un transportador tipo ABC Cuando la concentracioacuten
del autoinductor maduro alcanza un umbral miacutenimo de activacioacuten una proteiacutena
tipo quinasa sensor de histidina localizada en el exterior celular detecta la
presencia de eacutesta mediante un sistema a dos componentes El sensor quinasa se
auto fosforila en un residuo conservado de histidina (H) Despueacutes este grupo
fosforilo es transferido a una proteiacutena reguladora de respuesta adyacente la cual
es fosforilada en un residuo conservado de aspartato (D) La proteiacutena reguladora
de respuesta fosforilado activa la transcripcioacuten de los genes de intereacutes (Miller amp
Bassler 2002)
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus
En S aureus estaacute gobernado por el operoacuten agr que es de un tamantildeo nucleotiacutedico
de 35 kb y se compone de dos unidades transcriptoacutemicas divergentes conocidos
como RNAII y RNAIII los cuales estaacuten gobernados por los promotores P2 y P3
respectivamente (Le amp Otto 2015) El promotor P2 estaacute involucrado en actividades
del QS mientras que el promotor P3 se encarga de la expresioacuten de factores de
virulencia (Miller amp Bassler 2002) como produccioacuten de hemolisinas proteasas
lipasas e indirectamente participan en la liberacioacuten de biopeliacuteculas (Quave amp
Horswill 2014) A nivel geneacutetico la induccioacuten del operoacuten agr depende
parcialmente por la unioacuten de los productos geacutenicos del operoacuten sar en los dos
promotores disponibles del operoacuten agr (Manna Bayer amp Cheung 1998)
El promotor P2 es el de importancia para el sistema QS debido a que el transcrito
resultante agrBDCA produce cuatro proteiacutenas AgrB AgrD AgrC y AgrA los
cuales son los componentes principales del sistema de QS de S aureus A
manera de resumen podemos en global que AgrC y AgrA participan como
elementos biosensores mientras que AgrB y AgrD son los elementos necesarios
para la biosiacutentesis de AIP El AgrD es un peacuteptido precursor a la moleacutecula
autoinductora (AIP por sus siglas en ingleacutes) y el AgrB funciona transportadora
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como proteasa y estaacute involucrada en la maduracioacuten del AIP (Gomes-Fernandes
et al 2017 Horswill Stoodley Stewart amp Parsek 2007)
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD
El gen que produce AgrD se expresa y se traduce en una versioacuten propeacuteptido de la
moleacutecula AIP que sufre de una modificacioacuten postraduccionalmente para que sea
bioloacutegicamente activo La moleacutecula AIP inmadura se compone de tres secciones
conocidas como regioacuten del peacuteptido liacuteder regioacuten madura del AIP y secuencia de
reconocimiento que corresponden a las regiones N- central y C-terminales
respectivamente (B Wang amp Muir 2016)
El AgrD es inicialmente procesado en la regioacuten N-terminal (se compone de 32
residuos) y sirve de guiacutea Eacuteste es translocado a la cara externa de la membrana
celular Mientras la regioacuten peptidasa de la proteiacutena transmembranal AgrB
reconoce la regioacuten N-terminal del AIP inmaduro
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA
AgrC y AgrA funcionan en conjunto con un sistema claacutesico de dos componentes
Donde la proteiacutena transmembranal tipo receptor con actividad histidina quinasa
AgrC se encarga de que detectar las moleacuteculas AIP liberadas al exterior por S
aureus una vez acoplado el AIP con el receptor eacuteste uacuteltimo causa una
autofosforilacioacuten del dominio citoplasmaacutetico del AgrC seguido de la transferencia
del grupo fosfato de la proteiacutena reguladora de respuesta de unioacuten al DNA AgrA
Una vez que AgrA es fosforilado (AgrA-P) eacuteste se une a la regioacuten intergeacutenica de
los promotores P2 y P3 del operoacuten agr (Gomes-Fernandes et al 2017)
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada
Bioquiacutemicamente el AgrD inmaduro tiene un tamantildeo entre 46 a 47 residuos seguacuten
su clase Despueacutes de procesamiento AgrD maduro tiene un tamantildeo final entre 7 a
8 aminoaacutecidos (que variacutea seguacuten la clase) y contiene un anillo tiolactonado
producto de la condensacioacuten entre un grupo tiol de una cisteiacutena interna ubicada
cuatro aminoaacutecidos antes del uacuteltimo aminoaacutecido y el grupo carboxilo del uacuteltimo
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aminoaacutecido (que puede ser metionina o fenilalanina dependiendo la clase) (B
Wang Zhao Novick amp Muir 2015)
En AgrC el dominio que contiene los elementos para deteccioacuten del receptor de la
moleacutecula AIP produce diferentes formas de propeacuteptidos De esta manera se
deduce que cada moleacutecula de AIP producida depende de su propia proteiacutena
detectora AgrC Por tanto la presencia en el medio de moleacuteculas de AIP que no
estaacuten filogeneacuteticamente relacionadas resultan en la inhibicioacuten de QS Es decir
miembros productores del mismo tipo de AIP pueden inducir el comportamiento
tiacutepico por QS pero si los productores no pertenecen al mismo grupo se puede
inhibir su respuesta Este fenoacutemeno es conocido como comunicacioacuten cruzada
(Rutherford amp Bassler 2012) La regioacuten hipervariable del operoacuten agr estaacute ubicado
en el transcrito gobernado por el promotor P2 entre los genes agrC agrD y agrB
Consensualmente se ha determinado cuatro grandes clases de AIP y permite
clasificar a los tipos de S aureus en base a esta regioacuten (Shopsin et al 2003)
24 Biosensores de ceacutelulas enteras basados en deteccioacuten de QS
A continuacioacuten presentamos una compilacioacuten de publicaciones de diferentes
ceacutelulas que fueron modificadas para actuar como biosensores capaces de detectar
moleacuteculas producidas por organismos productores de sentildeales quiacutemicas tipo QS
algunos de los ejemplos mencionados cuentan con la capacidad de producir yo
liberar sustancias antimicrobianas capaces de destruir al productor de esas
sentildeales
Balagaddeacute y otros disentildearon un sistema de comunicacioacuten sinteacutetico conocido como
depredador y presa en la que dos ceacutelulas modificadas de E coli son capaces de
comunicarse -y matar a una de ellas- a traveacutes del sistema de QS En este modelo
las ceacutelulas asignadas como depredadoras producen y liberar moleacuteculas tipo QS
que se difunden en el medio y al llegar a la ceacutelula presa por sus mecanismos
internos activan la produccioacuten una toxina especiacutefica para la ceacutelula asignada como
presa provocaacutendoles la muerte celular Por otro lado las ceacutelulas presas para
evitar su muerte temprana deben producir constantemente una proteiacutena antitoxina
que anule la actividad de la toxina (Balagaddeacute et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 14
Saeidi y sus colaboradores crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basados en la
deteccioacuten del QS al modificar ceacutelulas de E coli para que detectaran moleacuteculas
3OC12 HSL producidas por P aeruginosa En este sistema las moleacuteculas QS son
difundidas a traveacutes del medio y son reconocidas por un factor de transcripcioacuten en
E coli que activa una unidad transcripcional para producir piocianina un
antibioacutetico especiacutefico con actividad contra P aeruginosa y porina E7 un agente
liacutetico especiacutefico contra E coli a medida que aumenta la concentracioacuten de la
moleacutecula QS incrementa la concentracioacuten del antibioacutetico y de la porina Cuando
se acumula suficiente cantidad de porinas en el interior celular las ceacutelulas de E
coli son lisadas y se libera piocianina para finalmente atacar a las ceacutelulas de P
aeruginosa (Saeidi et al 2011) Dos antildeos maacutes tarde Gupta y sus colaboradores
modificaron este biosensor agregando un moacutedulo de excrecioacuten que libera una
sustancia antimicrobiana al exterior a traveacutes de un peacuteptido sentildeal y atacar
especiacuteficamente a P aeruginosa evitando la muerte de la ceacutelula productora de
antibioacutetico (S Gupta Bram amp Weiss 2013)
Marchand y sus colegas crearon un sistema de comunicacioacuten interespeciacutefico para
la interaccioacuten entre dos bacterias con oriacutegenes evolutivos diferentes Bacillus
megaterium (Gram positiva) y E coli (Gram negativa) utilizando el mecanismo del
operoacuten agr de S aureus En este reporte ceacutelulas de E coli fungieron como
productoras de moleacuteculas de QS al expresar las proteiacutenas AgrD y AgrB que en
condiciones nativas producen moleacuteculas de AIP en S aureus Mientras que
ceacutelulas de B megaterium fungieron como biosensores al producir las proteiacutenas
AgrC y AgrA que en condiciones nativas sirven como un sistema a dos
componentes que detectan la presencia externa de la moleacutecula de AIP y activan a
un factor de transcripcioacuten (Marchand amp Collins 2013)
Zeng y sus colaboradores crearon un modelo biomatemaacutetico a partir de una E coli
que funcionara como un biosensor de moleacuteculas de AIP producidas por S aureus
que seriacutea contrarrestado por accioacuten de la lisostafina una bacteriocina de actividad
contra S aureus La simulacioacuten del modelo indicoacute que una ceacutelula de E coli podriacutea
tardar hasta 25 horas en detectar las primeras moleacuteculas de AIP producidas de S
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 15
aureus al tiempo que generariacutea la suficiente concentracioacuten de bacteriocinas para
matar a ceacutelulas de S aureus (Zeng et al 2013)
Borrero y sus colegas crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basado en la
deteccioacuten de moleacuteculas de QS para poder contrarrestar moleacuteculas de QS
producidos por un patoacutegeno de intereacutes cliacutenico resistente a los antibioacuteticos En este
caso ceacutelulas modificadas de Lactobacillus lactis fueron capaces de detectar las
moleacuteculas producidas por Enterococcus faecalis El lactobacilo modificado mostroacute
alta efectividad de tres bacteriocinas producidas para controlar el crecimiento de
este patoacutegeno incluyendo sus variedades multirresistentes (Borrero Chen Dunny
amp Kaznessis 2015)
Holowko y sus colegas desarrollaron ceacutelulas de E coli capaces de sentir
moleacuteculas de QS producidas por Vibrio cholerae (Holowko Wang Jayaraman amp
Poh 2016) Mientras que Lubkowicz y sus colaboradores modificaron ceacutelulas de
Lactobacillus reuteri con la capacidad para detectar moleacuteculas de AIP clase I
producidas por S aureus en rangos de concentracioacuten desde la escala nanomolar
hasta micromolar (Lubkowicz et al 2018)
25 Las Bacteriocinas
En contexto a la anterior seccioacuten una fraccioacuten del total de biosensores de ceacutelulas
enteras disentildeados son capaces de producir y excretar sustancias antimicrobianas
que afecten el crecimiento de ceacutelulas productoras de moleacuteculas QS Para fines de
este trabajo nos referimos a las bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
que pertenece a un grupo de peacuteptidos con actividad antimicrobiana con origen
evolutivo en bacterias los cuales seraacuten descritos a continuacioacuten
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas
Las bacteriocinas son un grupo de peacuteptidos de bajo peso molecular que son
producidos exclusivamente y excretados por bacterias y que tienen la capacidad
de inhibir el crecimiento de otra bacteria Las bacteriocinas pueden ser producidas
in situ por bacterias probioacuteticas Al ser de origen proteico las bacteriocinas son
sujetos a modificaciones por Ingenieriacutea Geneacutetica (Cotter Ross amp Hill 2013) Las
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bacteriocinas usualmente actuacutean por permeabilizacioacuten por membrana causada por
su naturaleza catioacutenica al interactuar con la membrana Usualmente las
bacteriocinas son de caraacutecter hidrofoacutebico y anfipaacutetico Su estructura quiacutemica son
generalmente peacuteptidos acoplados con glicoproteiacutenas y lipoproteiacutenas Su punto
isoeleacutectrico estaacute habituado a 81 a 101 usualmente son termoestables y tiene un
rango de pH amplio entre 30 a 90 (Heredia-Castro Heacuternaacutendez-Mendoza
Gonzaacutelez-Coacuterdova amp Vallejo-Cordoba 2017) En la Naturaleza cuando las
bacterias comparten el mismo nicho ecoloacutegicos eacutestas deben luchar y defenderse
de otros y las bacteriocinas son uno de los mecanismos bioloacutegicos reconocidos
(Duffy Schouten amp Raaijmakers 2003)
La disponibilidad de datos en bacteriocinas en la Naturaleza es muy amplio ya que
se presume que un 99 del total de bacterias son productoras de al menos un tipo
de bacteriocina y muchos de ellos permanecen auacuten sin ser descubiertos
(Klaenhammer 1988) Hasta la fecha de acuerdo con datos de bases de datos
sobre bacteriocinas de calidad mundial (actualizado hasta la uacuteltima versioacuten 25 de
junio de 2021) indican que el University of Nebraska Medical Centerrsquos
Antimicrobial Peptide Database (ADP por sus siglas en ingleacutes)
(httpswangapd3commainphp) se mantienen registrados un total de 3257
peacuteptidos antimicrobianos de los seis reinos bioloacutegicos existentes de los cuales
181 son peacuteptidos con actividad anti-MRSA (G Wang Li amp Wang 2016) Aunque
Bactibase (httpbactibasehammamilaborgmainphp) es una base de datos de
bacteriocinas que no se ha actualizado desde 2017 sus datos siguen siendo muy
valiosos ya que nos ofrece una realidad en la ciencia de las bacteriocinas puesto
que la mayoriacutea de las bacteriocinas descubiertas han sido aisladas de bacterias
Gram positivas donde 206 pertenecen a este grupo y 19 a las cepas Gram
negativas El geacutenero maacutes reportado para las bacteriocinas de origen en Gram
positivas son los Lactobacillus seguido de Enterococcus Streptococcus
Lactococcus y el geacutenero Bacillus mientras que el geacutenero maacutes reportado para las
bacteriocinas de origen en Gram negativas es Escherichia El tamantildeo promedio de
las bacteriocinas es de 43 residuos (Hammami Zouhir Le Lay Ben Hamida amp
Fliss 2010)
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Un buen nuacutemero de bacteriocinas han sido previamente reportadas como agentes
terapeacuteuticos puesto que se han utilizado en dosis hasta cien veces superiores al
valor de concentracioacuten miacutenima inhibitoria reportado sin presentar efectos
citotoacutexicos en liacuteneas celulares eucarioacuteticas (Hols Ledesma-Garciacutea Gabant amp
Mignolet 2019) ni en tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Por
ejemplo la nisina la bacteriocina maacutes famosa en la industria y en el mundo ha
sido declarado por la Administracioacuten de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA por sus siglas en ingleacutes) como sustancia Generalmente Reconocida
como Segura (GRAS por sus siglas en ingleacutes) para su uso como conservador de
alimentos (Cotter Hill amp Ross 2005) Se sabe que la mayoriacutea de las bacteriocinas
han tenido un largo historial de seguridad (Silva Silva amp Ribeiro 2018) Sin
embargo a pesar de la gran disponibilidad de datos de ensayos en bacteriocinas
recientemente se ha manifestado la urgencia de incrementar y explorar su uso en
modelos in vivo para evaluar su eficacia como agentes antimicrobianos y evaluar
los posibles efectos secundarios los cuales son necesarios para asegurar su eacutexito
como candidatos potenciales a agentes terapeacuteuticos en su lucha contra
infecciones resistentes a los antibioacuteticos (Beniacutetez-Chao Leoacuten-Buitimea Lerma-
Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2021)
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos
Los peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos son sustancias de origen
bioloacutegico que cumplen con el mismo papel de defensa lo cierto es que existen
claras diferencias entre ellas que dependen de su origen composicioacuten quiacutemica
entre maacutes factores A continuacioacuten se ofrece una breve explicacioacuten entre los
diferentes tipos de sustancias antimicrobianas
Los Peacuteptidos Antimicrobianos (AMP antimicrobial peptides) tambieacuten conocidos
como peacuteptidos de autodefensa (HDP host defense peptide) son peacuteptidos
producidos por un hospedero y son parte del sistema inmune al conferirles
capacidades defensivas Son de un rango de tamantildeo entre 10 a 60 residuos en
promedio 3326 residuos que estaacuten compuestas mayoritariamente por α-heacutelices
con cargas positivas (catioacutenicas) o anfipaacuteticas (cargas hidrofoacutebicas e hidrofiacutelicas)
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tambieacuten existen referentes con carga anioacutenica Los AMP estaacuten clasificados seguacuten
su origen ya que estaacuten ubicuamente presentes en todos los reinos bioloacutegicos
como mamiacuteferos plantas microorganismos acuaacuteticos insectos yo anfibios
seguacuten su actividad ya que pueden ser antibacterianos antifuacutengicos
antiinflamatorios antivirales antiparasitarios yo anticanceriacutegenos seguacuten su
estructura como tipo lineal con estructurales secundarias con α-heacutelices y β-tiras
plegadas y por seguacuten por el tipo dominante de aminoaacutecidos como glicina arginina
prolina histidina y triptoacutefano (Huan Kong Mou amp Yi 2020 Lei et al 2019)
Si el AMP es de origen evolutivo bacteriano se les conoce como bacteriocinas Los
oriacutegenes pueden ser por bacterias Gram positivas como negativas incluyendo
miembros del dominio de las Archaea (Chikindas Weeks Drider Chistyakov amp
Dicks 2018) Sin embargo cuando el AMP es de origen eucarioacutetico existen tres
clasificaciones defensinas (Shafee Lay Hulett amp Anderson 2016) histatinas o
catelicidinas (De Smet amp Contreras 2005) Existen intermediarios evolutivos como
las bacteriocinas tipo defensina que son un grupo de bacteriocinas que comparte
los puentes de disulfuro en las mismas posiciones que podriacutean observarse en las
defensinas (Baindara et al 2016 Sugrue OrsquoConnor Hill Stanton amp Paul Ross
2020)
Tanto las bacteriocinas como los antibioacuteticos comparten funcionalidad bioloacutegica al
ser ambas sustancias que nulifican o matan a otras poblaciones pero existen
diferencias muy marcadas entre ellas puesto que las bacteriocinas son
sintetizadas como metabolitos primarios mientras que los antibioacuteticos son
secundarios El espectro de accioacuten de las bacteriocinas es mucho maacutes reducido
que los antibioacuteticos eacutestos uacuteltimos son muy amplios El grado de actividad es
mucho maacutes intenso entre bacteriocinas ya que su rango de accioacuten se encuentra
en el orden de los nano a micro molar mientras que los antibioacuteticos son rango de
accioacuten estaacute ranqueado entre los micro y milimolar Debido a su origen proteico las
bacteriocinas son altamente propensas a ser degradados por enzimas Sin
embargo las bacteriocinas son maacutes termodinaacutemicamente estables y con una
actividad maacutes amplia de pH que los antibioacuteticos Las bacteriocinas atacan
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 19
generalmente la membrana extracelular generando poros mientras que los
antibioacuteticos pueden atacar la membrana tambieacuten yo atacar blancos intracelulares
Se conoce que las bacteriocinas presentan baja o nula toxicidad en comparacioacuten
con los antibioacuteticos (Perez Zendo amp Sonomoto 2014)
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes
En la actualidad diversos estudios enfocados en bacteriocinas se han enfocado
en su actividad contra cepas de S aureus resistentes a los antibioacuteticos Por
ejemplo la lisostafina fue utilizado el control de S aureus ATCC 29740 (Oldham amp
Daley 1991) mientras que la pentocina JL-1 ha sido efectivo para el control de S
aureus multirresistente (Jiang Zou Cheng Fang amp Huang 2017) La bacteriocina
entianina mostroacute actividad contra MRSA (ATCC 43300) (S W Fuchs et al 2011)
La epidermicina NI01 mostroacute actividad contra MRSA (Sandiford amp Upton 2012)
Asiacute tambieacuten como las enterocinas DD28 y DD93 con actividad anti estafilocoacutecica
contra ceacutelulas MRSA (Al Atya et al 2016)
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos
Las bacteriocinas son un grupo muy bien definido de peacuteptidos antimicrobianos que
tienen su origen evolutivo en bacterias y en algunas arqueobacterias Por sus
caracteriacutesticas proteicas las bacteriocinas son elementos geneacuteticos que pueden
ser faacutecilmente modificados por teacutecnicas de Ingenieriacutea geneacutetica (Cotter et al
2013) Las caracteriacutesticas generales de las bacteriocinas son que su espectro de
accioacuten es actuar tanto en las bacterias Gram positivas como negativas Su modo
de actividad por actividad bactericida o bacteriostaacutetico Su mecanismo de accioacuten
es por permeabilizacioacuten de membrana creando lisis celular Su estructura
bioquiacutemica es muy variada que pueden ser peacuteptidos glicoproteiacutenas y
lipoproteiacutenas Son de peso molecular variable sin embargo las bacteriocinas de
origen en Gram positivas son de tamantildeo pequentildeo Debido a su naturaleza
proteica las bacteriocinas son susceptibles al corte proteoliacutetico y altamente
estables a altas temperaturas (Heredia-Castro et al 2017)
Entre algunas de las bacteriocinas que se han utilizado para el control de
patoacutegenos resistentes estaacute la bacteriocina AS-48 la cual ha sido ampliamente
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 20
utilizado contra cepas de referencia y cliacutenicos para Mycobacterium tuberculosis
(Aguilar-Peacuterez et al 2018) Otro ejemplo es la pentocina JL-1 ha demostrado
tener actividad contra diferentes cepas bacterianas (Jiang et al 2017) Entianina
ha mostrado actividad contra Enterococcus faecalis resistente a vancomicina
(ATCC 51299) (S W Fuchs et al 2011) Las klebcinas poseen actividad contra
especies resistentes y multirresistentes de cepas del geacutenero Klebsiella
(Denkovskienė et al 2019) La lista de bacteriocinas reportadas como efectivas
contra patoacutegenos resistentes de relevancia cliacutenica es muy larga y que puede ser
observada en la literatura correspondiente (Cui et al 2012 Gabrielsen Brede
Nes amp Diep 2014 Newstead Varjonen Nuttall amp Paterson 2020 Perez et al
2014)
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas
Las bacteriocinas pueden ser producidos tanto por microorganismos Gram
positivos como negativos inclusive por miembros del dominio Archaea (Chikindas
et al 2018)
Hasta el diacutea de hoy no hemos encontrado un oacutergano internacional que regule la
clasificacioacuten de las bacteriocinas maacutes que lo propuesto en grupos de investigacioacuten
ligados a la ciencia de las bacteriocinas Las bacteriocinas con origen evolutivo en
organismos Gram positivos estaacuten actualmente clasificados en cuatro grandes
clases la clase I corresponde a bacteriocinas modificadas postraduccionalmente
de muy bajo peso molecular (lt5 kDa) la clase II se refiere a bacteriocinas
termoestables no modificadas de bajo peso molecular (lt10 kDa) la clase III
contiene bacteriocinas termosensibles de alto peso molecular (gt10 kDa) y por
uacuteltimo la clase IV se compone de proteiacutenas acomplejadas con carbohidratos o
liacutepidos (Newstead et al 2020 Perez et al 2014)
Dada la diversidad de bacteriocinas para fines de este trabajo solo nos
enfocaremos en las bacteriocinas tipo II de las Gram positivas ya que se clasifican
en cuatro grandes subclases La clase IIa representa la familia de las
bacteriocinas con actividad antilisteria por su actividad especiacutefica contra cepas de
Listeria monocytogenes y ademaacutes porque se mantiene un dominio conservado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 21
YGNGV conocido como la caja de pediocina y que ubica en extremo N-terminal
Uno de los ejemplos maacutes reconocidos es la enterocina NKR-5-3C La clase IIb
representa a las bacteriocinas compuestas por dos peacuteptidos que en siacute son dos
peacuteptidos diferentes que actuacutean sineacutergicamente para atacar a un blanco como
lactococcin Q que se compone de los peacuteptidos lactococcina Qα y lactococcin Qβ
La clase IIc se relaciona con las bacteriocinas circularizadas que estaacuten unidas de
extremo a extremo como lactociclina Q y leucociclina Q La clase IId se compone
de bacteriocinas sin peacuteptido liacuteder y que se sintetizan sin una secuencia liacuteder en su
extremo N-terminal Algunos ejemplos son la weissllicina Y weissllicina M
leucocina Q leucocina N lacticina Z y lacticina Q (Perez et al 2014)
256 La bacteriocina Lacticina Q
La lacticina Q (LnqQ) es una bacteriocina que fue por vez descubierta por Fujita y
sus colaboradores en el 2007 Esta bacteriocina fue aislada por primera vez por
Lactococcus lactis QU5 una cepa Gram positiva que fue aislada de una muestra
de maiacutez fresco recolectado en campos agriacutecolas de la comunidad de Aso en
Kumamoto Japoacuten La composicioacuten bioquiacutemica de LnqQ es que se trata de peacuteptido
lineal compuesto por 53 residuos y con un peso molecular de 592050 Da (Fujita
et al 2007) La estructura tridimensional descubierta por Acedo y otros revela
que es una proteiacutena globular que se compone de cuatro α-heacutelices cuya superficie
es altamente catioacutenica y su nuacutecleo hidrofoacutebico Esta secuencia presenta una
carga neta +6 y su pI = 108 (Acedo et al 2016)
Esta bacteriocina ha mostrado ser un peacuteptido antimicrobiano con alta efectividad
contra bacterias Gram positivas siendo antagonista de uno los principales
patoacutegenos reportados en cliacutenicas como S aureus Por ejemplo se han registrado
diversos rangos de concentracioacuten miacutenima inhibitoria (MIC) de la LnqQ como 8 microM
contra S aureus ATCC 6538 y 32 microM contra S aureus ATCC 29213 (Acedo et al
2016) Tambieacuten se ha reportado 18 microM (Fujita et al 2007) o 10 microgml (Ma Yu
Han Wang amp Zhang 2012) contra S aureus ATCC 12600
Se conoce que la LnqQ genera alta permeabilidad en la membrana sin necesidad
de anclarse sobre moleacuteculas especiacuteficas como el Liacutepido II (Yoneyama Imura
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 22
Ichimasa et al 2009) Posteriormente se determinoacute que el mecanismo de accioacuten
es a traveacutes de un modelo conocido como Poro Toroidal Enorme (HTP huge
toroidal pore) donde las estructuras α-heacutelices cargadas positivamente y presentes
en la LnqQ se unen covalentemente hacia la membrana celular que estaacute cargada
negativamente y entonces genera un poro en forma de toroide enorme de 46 a
66 nm de diaacutemetro generando una estructura conocida como lipid flip-flop lo que
permite el goteo de moleacuteculas intercelular de manera que la ceacutelula muere La
translocacioacuten del peacuteptido desde el exterior a la cara interna de la ceacutelula ocurre
sincroacutenicamente con la formacioacuten del poro toroidal (Yoneyama Imura Ohno
et al 2009) En un estudio a nivel in vitro se determinoacute que cuando LnqQ es
agregado a niveles MIC sobre cultivos bacterianos sensibles aumenta la
acumulacioacuten de radicales libres tipo hidroxilos y por consecuencia la ceacutelula muere
(Li et al 2013)
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados
Las bacteriocinas son sustancias toacutexicas que pueden atacar a su microorganismo
productor si eacuteste no cuenta con caracteriacutesticas que le permitan resistir (Ishibashi
et al 2014 Iwatani et al 2012 Ladjouzi Lucau-Danila Benachour amp Drider
2020 Mesa-Pereira et al 2017 Nascimento et al 2012) De manera que todos
los operones de las bacteriocinas se componen habitualmente de los siguientes
elementos geneacuteticos promotor gen estructural (bacteriocina) genes de
inmunidad genes de transporte una proteiacutena accesoria y un terminador de la
transcripcioacuten (Mesa-Pereira et al 2017)
La LnqQ no es ninguna excepcioacuten a la regla ya que similar a otras bacteriocinas
la produccioacuten secrecioacuten y autoinmunidad estaacute regulado por el cluacutester geneacutetico
lnqRQBCDEF que se encuentra en Lactococcus lactis QU5 y que descubierto por
Iwatani y otros en el 2012 (Iwatani et al 2012) Al diacutea de hoy auacuten no estaacute del todo
bien determinado la funcionalidad de los elementos que conforman el operoacuten pero
se sabe que el cluacutester lnqQBCDEF es esencial para la completa produccioacuten de
LnqQ mientras que los productos LnqEF son esenciales y los productos LnqBCD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 23
estaacuten parcialmente involucrados en la inmunidad y secrecioacuten de la bacteriocina
(Iwatani Horikiri Zendo Nakayama amp Sonomoto 2013)
26 Produccioacuten heteroacuteloga de bacteriocinas
Entre las virtudes observadas en las bacteriocinas estaacuten en que gozan de una
excelente reputacioacuten en seguridad bioloacutegica (Silva et al 2018) y de una gran
diversidad de bancos de datos sobre bacteriocinas (Hammami et al 2010 G
Wang et al 2016) Estos datos pueden apoyar para el disentildeo y construccioacuten de
bacteriocinas de novo (Fields et al 2020) Sin embargo a la fecha una cantidad
raquiacutetica de bacteriocinas han sido capaces de ser producidos en masa siendo la
nisina y la pediocina PA-1 las uacutenicas bacteriocinas en destacar industrialmente
Una de las hipoacutetesis que maacutes planteada supone que las bacteriocinas no han
destacado en el mercado porque eacutestas deben de producirse en altas cantidades y
con suficiente actividad bioloacutegica y en los organismos nativos este proceso se
considera que es un desgaste energeacutetico significativo ya que el rendimiento
productivo es usualmente bajo (Mesa-Pereira Rea Cotter Hill amp Ross 2018)
Desde la fundacioacuten de la Ingenieriacutea Geneacutetica las proteiacutenas han sido objeto de
muacuteltiples modificaciones para aumentar su produccioacuten y purificacioacuten utilizando
diversos sistemas bioloacutegicos productores desde sistemas procariotas como E coli
hasta sistemas eucariotas como ceacutelulas de levaduras o inclusive en liacuteneas
celulares eucariotas A pesar del avance actual que existen ya en estas teacutecnicas
la produccioacuten de proteiacutenas puede presentar incluso problemas de rutina en
laboratorios dedicados a este campo como la formacioacuten de cuerpos de inclusioacuten
toxicidad o baja produccioacuten de proteiacutenas (Bell Engleka Malik amp Strickler 2013)
En este trabajo nos hemos enfocado en la exploracioacuten de un peacuteptido sentildeal N-
AmyE y un peacuteptido de fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de la bacteriocina
LnqQ tanto en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica de ceacutelulas de E coli Nuestro
objetivo es que la aplicacioacuten de las etiquetas en la produccioacuten de la bacteriocina
permita la produccioacuten y purificacioacuten de LnqQ en ceacutelulas de E coli mientras
mantiene su funcionalidad bioloacutegica bactericida contra cultivos de S aureus En
este capiacutetulo presentaremos antecedentes relacionados al peacuteptido sentildeal N-AmyE
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 24
y al peacuteptido de fusioacuten SmbP asiacute como los disentildeos bioinformaacuteticos utilizados para
la construccioacuten de las etiquetas con la bacteriocina se incluyen ensayos in silico
predictivos para estimar la estructura tridimensional de la bacteriocina con su
etiqueta asiacute como ensayos para estimar el corte
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE es un dominio proteico localizado en la regioacuten N-terminal
de la α-amilasa (AmyE) (Yang Galiii amp Henner 1983) Bioquiacutemicamente la AmyE
es una enzima (1 4-α-D-glucano-glucanohidrolasa EC 3211) cuya funcioacuten es
catalizar la hidroacutelisis de enlaces glicosiacutedicos (α-14) del almidoacuten para producir
glucosa y dextrinas (R Gupta Gigras Mohapatra Goswami amp Chauhan 2003)
La secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica de algunas AmyE fueron reportadas
desde hace varias deacutecadas Por ejemplo en 1983 Yang y sus colaboradores
reportaron la secuencia nucleotiacutedica del AmyE de la cepa Bacillus subtilis 1A289
(Yang et al 1983) Antildeos maacutes tarde en 1988 Emori y sus colegas tambieacuten
reportaron la secuencia nucleotiacutedica completa de la variante producida por la cepa
de B subtilis 2633 (Emori amp Maruo 1988)
La existencia del peacuteptido sentildeal N-AmyE de la α-amilasa fue propuesta por Yang y
sus colaboradores cuando develaron la secuencia nucleotiacutedica completa del
mismo argumentando que el presunto peacuteptido sentildeal debiacutea tener un tamantildeo de 32
aminoaacutecidos Tambieacuten observaron que AmyE podriacutea expresarse en ceacutelulas de
otras especies como E coli manteniendo su actividad bioloacutegica (Yang et al 1983)
La utilidad biotecnoloacutegica del peacuteptido sentildeal N-AmyE es porque se ha reportado
que es funcionalmente activo tanto en Bacillus subtilis como en E coli ya que al
fusionarse eacutesta con la regioacuten N-terminal de una proteiacutena de intereacutes biotecnoloacutegico
estaacute puede ser liberado al medio extracelular Por ejemplo al fusionar el peacuteptido
sentildeal N-AmyE con una β-lactamasa eacutesta es capaz de excretarse al medio
extracelular tanto en ceacutelulas de B subtilis como de E coli Sin embargo el sitio de
reconocimiento para el corte del peacuteptido sentildeal difiere entre ambos tipos de ceacutelulas
(Nakazawa Takano Sohma amp Yamane 1986) Un anaacutelisis multivariado de datos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 25
determinoacute que las secuencias nucleotiacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en su seccioacuten N-terminal tienden a ser excretados en el periplasma y en la
seccioacuten extracelular de E coli (Sjoumlstroumlm Wold Wieslander amp Rilfors 1987)
El mecanismo de corte hidroliacutetico por el que el peacuteptido sentildeal N-AmyE se separa de
la amilasa AmyE es debido a su estructura secundaria y a la presencia de un
dominio rico en alaninas (aminoaacutecido apolar) en el extremo C-terminal de del
peacuteptido N-AmyE Sin embargo el patroacuten de corte enzimaacutetico difiere seguacuten el tipo
organismo donde sea expresado ya que el sitio de corte oacuteptimo de este peacuteptido
se encuentra entre Ala33 y X34 cuando se expresa en B subtilis pero en E coli la
AmyE tiende a cortarse entre Ala31 y un aminoaacutecido cual sea (X) (Sakakibara
Tsutsumi Nakamura amp Yamane 1993)
En el 2005 el peacuteptido sentildeal N-AmyE reportado por Yang y otros fue acoplado en
la regioacuten N-terminal de una liasa de pectina para permitir su expresioacuten en ceacutelulas
de E coli (DE3) en la regioacuten periplaacutesmica Los resultados de ese estudio indicaron
que se logroacute la excrecioacuten efectiva de la liasa de pectina al medio extracelular
espacio periplaacutesmico citoplasma y a nivel membranal de E coli despueacutes de haber
sido inducido por con IPTG (R M Papi Chaitidou Trikka amp Kyriakidis 2005)
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP
La mayoriacutea de peacuteptidos de fusioacuten utilizados para la expresioacuten de proteiacutenas
recombinantes son el Dominio de Unioacuten a Celulosa (CBDcenA) Glutatioacuten-S-
Transferasa (GST) Proteiacutena de Unioacuten a Maltosa (MBP) tiorredoxina (TRX) y las
Proteiacutenas Modificadoras tipo Ubiquitina de Tamantildeo Pequentildeo (SUMO) (Mesa-
Pereira et al 2018) o la regioacuten citoplasmaacutetica del proteiacutena pequentildea de unioacuten a
metales SmbP (Vargas-Cortez Morones-Ramirez Balderas-Renteria amp Zarate
2016) a continuacioacuten ofrecemos maacutes informacioacuten relacionada al uacuteltimo peacuteptido de
fusioacuten
En el 2004 Barney y sus colaboradores describieron a la Proteiacutena Pequentildea de
Unioacuten a Metales en el periplasma de Nitrosomonas europaea Esta proteiacutena posee
un peso molecular de 99 kDa y presenta una inusual cantidad de residuos de
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 26
histidina (17) seguido de alanina (16) glutamato (14) glicina (11) y lisina
(9) los cuales componen el 67 de la composicioacuten total de residuos Esta
proteiacutena carece naturalmente de metionina y de cisteiacutenas Estructuralmente se
trata de una unidad monomeacuterica compuesta por 93 residuos cuya principal
caracteriacutestica es una regioacuten compuesta de 10 repeticiones secuenciales cada una
con motivo de siete aminoaacutecidos donde el cuarto residuo es una histidina
conservada estos motivos permiten la estabilizacioacuten de un nuacutecleo hidrofoacutebico
Como su nombre lo establece esta proteiacutena posee alta afinidad a metales
divalentes como Cu2+ Ni2+ Zn2+ y de otras valencias como Fe3+ (Barney LoBrutto
amp Francisco 2004) Esta proteiacutena ha sido utilizada para la expresioacuten periplaacutesmica
y posterior purificacioacuten de Hormona de Crecimiento Humano (hGH)
bioloacutegicamente activa (Perez-Perez et al 2020)
En 2015 el dominio periplaacutesmico de la SmbP que corresponde a la seccioacuten maacutes
proacutexima al extremo N-terminal en la estructura lineal del mismo fue removido por
Vargas y sus colaboradores manteniendo uacutenicamente el dominio citoplasmaacutetico
de la SmbP citoplasmaacutetica (SmbP) Eacutesta uacuteltima es uacutetil como etiqueta de afinidad
para teacutecnicas de cromatografiacutea de afinidad con iones metaacutelicos inmovilizados
(IMAC por sus siglas en ingleacutes) Esta proteiacutena fue reportada como efectiva para la
expresioacuten citoplaacutesmica de proteiacutenas en E coli como RFP GFP SHY2 NDPK2 y
LovR (Vargas-Cortez et al 2016)
Recientemente la SmbP fue utilizada por primera vez para la produccioacuten del
peacuteptido antimicrobiano Bin1b utilizando E coli como hospedero para la
sobreproduccioacuten El peacuteptido fue sobre producido y purificado mostrando actividad
antimicrobiana contra E coli y S aureus (Montfort-Gardeazabal Balderas-
Renteria Casillas-Vega amp Zarate 2021)
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS
31 Justificacioacuten
La idea de disentildear y utilizar un biosensor de ceacutelula para controlar cultivos de
MRSA es porque las moleacuteculas sentildealizadoras del QS se han reportado como
estiacutemulos quiacutemicos para ser reconocidos como ceacutelulas enteras vivas modificadas
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para su reconocimiento Ademaacutes de que ya se han reportado diversos biosensores
completos de ceacutelulas que pueden producir y excretar bacteriocinas capaces de
matar a microorganismos multirresistentes productores de sentildeales QS
La decisioacuten de inclinarnos hacia las bacteriocinas como patoacutegenos es porque
atacan un espectro limitado de bacterias dentro de una comunidad microbioloacutegica
y no ocurre de manera simultaacutenea en un espectro amplio como ocurre
habitualmente con los antibioacuteticos lo que promueve una mayor probabilidad de
seleccioacuten de mutantes que puedan conferir resistencia Ademaacutes las bacteriocinas
estaacuten constantemente evolucionando y permiten a sus productores combatir
contra patoacutegenos de resistencia emergentes (Riley et al 2012)
Las bacteriocinas han mostrado ademaacutes ser potenciales agentes terapeacuteuticos ya
que no afectan tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Incluso las
bacteriocinas se han administrado en concentraciones tan altas como 100 veces
superiores al MIC originalmente reportado con nulos efectos citotoacutexicos en liacuteneas
celulares eucarioacuteticas (Hols et al 2019) Ademaacutes la mayoriacutea de los productores
nativos en bacteriocinas poseen un excelente historial en seguridad (Silva et al
2018)
La propuesta de etiquetar bacteriocinas con un peacuteptido sentildeal es porque durante el
proceso de recuperacioacuten previo a la purificacioacuten es comuacuten encontrar una baja
cantidad de proteiacutenas y ademaacutes proteasas que disminuyen el rendimiento
productivo Con el peacuteptido sentildeal la purificacioacuten de las proteiacutenas se simplifica
porque son faacutecilmente recuperadas de la fraccioacuten periplaacutesmica seguido un choque
osmoacutetico sin la necesidad de lisar toda la ceacutelula (Ramanan et al 2010) mientras
que la decisioacuten de antildeadir peacuteptidos de fusioacuten en los disentildeos geneacuteticos es porque se
trata de etiquetas que se colocan en la regioacuten N-terminal o C-terminal de una
proteiacutena con intereacutes biotecnoloacutegico Estos peacuteptidos representan un meacutetodo
recurrente en la sobreexpresioacuten de bacteriocinas porque ayudan en la purificacioacuten
aumentan la expresioacuten proteica mejoran la solubilidad permiten que la proteiacutena
sea producida en un estado similar al nativo incrementan el rendimiento de
produccioacuten y disminuyen su degradacioacuten (Mesa-Pereira et al 2018)
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32 Hipoacutetesis
El disentildeo de un biosensor construido a base de ceacutelulas enteras E coli modificadas
pronostica indica que funcionaraacute como alarma bioloacutegica al detectar moleacuteculas de
QS de S aureus En consecuencia liberaraacute un compuesto antimicrobiano con
actividad especiacutefica contra el organismo blanco El peacuteptido antimicrobiano seraacute
validado experimentalmente a traveacutes del peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de
fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de LnqQ en E coli que seraacute producido
en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica respectivamente
33 Objetivo General
Presentar el disentildeo in silico de un mecanismo biosensor basado en el sistema de
quorum sensing de S aureus para producir Lacticina Q y producir
experimentalmente este peacuteptido antimicrobiano tanto en la regioacuten periplaacutesmica
como citoplaacutesmica de E coli
34 Objetivos Especiacuteficos
1 Disentildear el moacutedulo geneacutetico biosensor para detectar la presencia externa de
moleacuteculas autoinductoras (AIP) producidos por MRSA
2 Disentildear el moacutedulo geneacutetico de bacteriocinas para liberar lacticina Q (LnqQ)
en funcioacuten a la concentracioacuten externa de moleacuteculas AIP producidos por
MRSA
3 Disentildear un vector de expresioacuten que contenga ambos moacutedulos geneacuteticos
tanto biosensor como de bacteriocinas
4 Predecir la especificidad teoacuterica del biosensor completo de ceacutelulas enteras
entre diferentes sentildeales de QS
5 Predecir la solubilidad y localizacioacuten subcelular de cada una de las
proteiacutenas utilizadas para el disentildeo del moacutedulo biosensor y el moacutedulo de
bacteriocina
6 Predecir la existencia de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B y nivel de alergenicidad
en la LnqQ producida en E coli
7 Disentildear el vector de expresioacuten pETNL que contenga el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en conjunto con el LnqQ acoplado con una etiqueta de polihistidina
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8 Disentildear el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ que contenga el peacuteptido de
fusioacuten SmbP en conjunto con el LnqQ
9 Construir los vectores de expresioacuten pETNL y pSmbP-LnqQ y transformar
ceacutelulas de E coli
10 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten periplaacutesmica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pETNL
11 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten citoplasmaacutetica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ
35 Metas
En un periacuteodo a tres antildeos nos propusimos alcanzar las siguientes metas
bull Disentildear in silico un sistema biosensor en E coli capaz de sentir moleacuteculas
de Quorum Sensing producidas por S aureus y producir una sustancia
antimicrobiana en funcioacuten a la concentracioacuten externa de las moleacuteculas QS
bull Predecir la capacidad del peacuteptido sentildeal N-AmyE y del peacuteptido de fusioacuten
SmbP para producir bacteriocinas en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica
de E coli respectivamente
bull Presentar los resultados obtenidos en al menos un artiacuteculo de investigacioacuten
con arbitraje internacional
bull Cumplir con eacutexito el examen predoctoral
bull Obtener el grado de Doctor en Ciencias con Orientacioacuten en Microbiologiacutea
36 Aportacioacuten cientiacutefica
Nuestra aportacioacuten consiste en presentar el disentildeo y el trabajo teoacuterico necesario
para la construccioacuten de un biosensor de ceacutelulas enteras basado en quorum
sensing capaz de producir bacteriocinas en funcioacuten a la concentracioacuten disponible
de moleacuteculas tipo QS evitando asiacute la sobreproduccioacuten yo goteo de bacteriocinas
que pueden contribuir a la resistencia en patoacutegenos Asiacute tambieacuten experimentamos
en peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP para validarlos como una
herramienta bioloacutegica para la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas en ceacutelulas
modificadas de E coli
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CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
La idea de disentildear un biosensor basado en ceacutelulas enteras surge al yuxtaponer
dos enfoques usados para tratar enfermedades resistentes a los antibioacuteticos que
es mediante el uso de organismos bioloacutegicamente activos con bacteriocinas (Allen
et al 2014)
En este sentido tenemos dos ceacutelulas independientes que son reconocidas como α
y β respectivamente (Figura 1) las ceacutelulas α que corresponden a un productor
de sentildeales tipo QS liberan moleacuteculas de sentildealizacioacuten al medio externo mientras
que las ceacutelulas β que corresponden al biosensor son emulados para detectar
moleacuteculas de QS de las ceacutelulas α En respuesta a esta deteccioacuten los mecanismos
internos de las ceacutelulas β producen y excretan una toxina especiacutefica contra las
ceacutelulas α y asiacute controlar su crecimiento poblacional
Figura 1 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
Ceacutelulas β fungen como sistema de deteccioacuten y destruccioacuten al reconocer moleacuteculas de reconocimiento tipo QS
producidos por ceacutelulas α y causar su muerte
42 Cepas bacterianas
Nosotros designamos a E coli (BL21) DE3 como chasis bioloacutegico porque ha sido
ampliamente reconocido para la sobreproduccioacuten de bacteriocinas recombinantes
(Mesa-Pereira et al 2018) Para el disentildeo del moacutedulo biosensor optamos por
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utilizar los datos anotados del genoma de la cepa S aureus N315 una cepa
reconocida como MRSA y que ha sido reportado como unas de las principales
causas de infecciones resistentes a meticilina asociado a comunidad (CA-MRSA)
y a hospitales (HA-MRSA) (Kuroda et al 2001) Para el disentildeo del moacutedulo de
bacteriocina utilizamos los datos bioinformaacuteticos del cluacutester de genes lnqQBCDEF
de L lactis QU5 que permiten la produccioacuten y excrecioacuten la LnqQ asiacute como para su
autoinmunidad (Fujita et al 2007 Iwatani et al 2012) Abajo se presentan los
disentildeos de ambos moacutedulos asiacute como la estrategia general para su ensamblado en
un vector de expresioacuten
La cepa de E coli BL21 (DE3) fue seleccionada para ensayos de expresioacuten
proteica con el peacuteptido sentildeal N-AmyE o con el peacuteptido de fusioacuten SmbP La cepa E
coli DH5 fue utilizada para ensayos de clonacioacuten La cepa E coli Origami fue
escogida para produccioacuten de proteiacutenas problemaacuteticas
Un cultivo de E coli BL21 (DE3) fue amablemente donado por el Instituto
Tecnoloacutegico de Monterrey (Monterrey Nuevo Leoacuten) La cepa de E coli DH5α fue
recuperada de un stock de cultivos de nuestro laboratorio en el CIBYN (Apodaca
Nuevo Leoacuten) La cepa E coli Origami fue compartida por el Dr Xristo Zaacuterate de la
UANL (Monterrey Nuevo Leoacuten) Todas las cepas fueron mantenidas y crecidas en
caldo LB o suplementado con agar (2) a 37degC en condiciones aeroacutebicas
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina
Tanto los moacutedulos biosensor como el de bacteriocina fueron disentildeados de la
siguiente manera contienen un promotor un sitio de unioacuten al ribosoma gen
estructural y un terminador doble de transcripcioacuten Los disentildeos fueron elaborados
bajo la herramienta bioinformaacutetica SnapGene 113 en el formato correspondiente
Todos los datos bioinformaacuteticos utilizados para ambos disentildeos fueron recuperados
de alguna de las siguientes bases de datos Massachussets Institute of
Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts (SBP) (httppartsigemorg)
(Galdzicki Rodriguez Chandran Sauro amp Gennari 2011) Kyoto Encyclopedia
Genes and Genomes (KEGG) (httpswwwgenomejpkegg) (Kanehisa amp Goto
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2000) FP Base (FPB) (httpswwwfpbaseorg) (Lambert 2019) y GenBank
(httpswwwncbinlmnihgovgenbank) (Clark Karsch-Mizrachi Lipman Ostell amp
Sayers 2016) y Protein Data Bank (PDB) (httpswwwrcsborg) (Berman et al
2000)
Para el disentildeo del moacutedulo biosensor usamos los datos del promotor constitutivo
de E coli J23110 (SBP no BBa_J23110) como regulador transcripcional de los
genes del operoacuten agrC y agrA Nosotros utilizamos la secuencia nucleotiacutedica y
aminoaciacutedica del agrC (KEGG no SA1843) que se compone de 1116 nucleoacutetidos
y 371 residuos respectivamente y tambieacuten de la informacioacuten disponible para la
agrA (KEGG no SA1844) que se compone de 717 nucleoacutetidos y 238 residuos Los
sitios de unioacuten a ribosoma (SBP no BBa_B0034) fueron colocados entre cada gen
estructural y al final de la unidad transcriptoacutemica se colocoacute un doble terminador de
transcripcioacuten (SBP no BBa_B0015) tanto el moacutedulo biosensor como en moacutedulo
de bacteriocina
Para el disentildeo del moacutedulo de bacteriocina utilizamos los datos del promotor
inducible P2 del MRSA para regular la expresioacuten del cluacutester geneacutetico lnqQBCDEF
y el gen reportero gfp Debido a que la secuencia del promotor P2 no se
encontraba disponible de manera que primero tuvimos que localizar la regioacuten en
el archivo genoacutemico de la MRSA (GenBank no BA0000183) los resultados de
este punto seraacuten explicados maacutes a fondo en la seccioacuten correspondiente
Para la seccioacuten estructural del moacutedulo de bacteriocina buscamos el archivo
bioinformaacutetico que contuviera los genes estructurales secrecioacuten y de auto
inmunidad del cluacutester lnqQBCDEF (GenBank no AB7123931) El archivo original
fue manipulado para seccionar los elementos geneacuteticos que pertenecen al cluacutester
esta informacioacuten seraacute explicada con maacutes detalle
Por uacuteltimo usamos la secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica del gen monomeacuterico
gfp (FPBase no QKFJN) como reportero de Aequorea victoria (Zacharias Violin
Newton amp Tsien 2002) Esta proteiacutena es monomeacuterica posee un peso molecular
en 270 kDa El valor maacuteximo de excitacioacuten es λ = 488 nm mientras que el valor
maacuteximo de emisioacuten es λ = 507 nm El coeficiente de extincioacuten es 56000 M-1cm-1
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44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
El plaacutesmido de AddGene (httpswwwaddgeneorg) (AddGene no 116850) fue
utilizado para la construccioacuten in silico de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
dentro de un plaacutesmido al cual nos referiremos a partir de ahora como plaacutesmido
Dual Biosensor Killer (DBK) Este plaacutesmido fue disentildeado en la aplicacioacuten
SnapGene versioacuten 113
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas
Para la optimizacioacuten de los codones de todas las secuencias nucleotiacutedicas se
utilizoacute la herramienta bioinformaacutetica GenSmart Codon Optimization Tool
(httpswwwgenscriptcomtoolsgensmart-codon-optimization) versioacuten Beta 10
Las secuencias nucleotiacutedicas yo aminoaciacutedicas recolectadas para el disentildeo de los
moacutedulos geneacuteticos funcionaron como datos de entrada La aplicacioacuten fue
configurada para ldquoEscherichia colirdquo como organismo para expresioacuten de proteiacutenas
Es importante mencionar que solicitamos la exclusioacuten de sitios de restriccioacuten
habitualmente localizados en la regioacuten muacuteltiple de clonacioacuten del vector de
expresioacuten pET30a(+) como BamHI (GGATCC) BglII (AGATCT) ClaI (ATCGAT)
EcoRI (GAATTC) HindIII (AAGCTT) KpnI (GGTACC) NcoI (CCATGG) NdeI
(CATATG) NheI (GCTAGC) NotI (GCGGCCGC) PstI (CTGCAG) SacI (GAGCTC) SacII
(CCGCGG) SalI (GTCGAC) SmaI (CCCGGG) SpeI (ACTAGT) SphI (GCATGC) XbaI
(TCTAGA) XhoI (CTCGAG) XmaI (CCCGGG)
Una vez optimizadas usamos CAI Tool (httpgenomesurvesCAIcal) para el
Caacutelculo del Iacutendice de Adaptacioacuten (CAI por sus siglas en ingleacutes) para determinar el
iacutendice de adaptacioacuten de las secuencias nucleotiacutedicas antes y despueacutes de la
optimizacioacuten Esta herramienta utiliza la secuencia nucleotiacutedica y el uso de
codones tanto del organismo nativo como el organismo productor heteroacutelogo (u
organismo recipiente) como entradas para la optimizacioacuten De acuerdo a los
autores el iacutendice tiene un rango de respuesta que oscila entre 0 hasta 1 donde el
valor correspondiente 1 indica si la secuencia de entrada usa los codones maacutes
frecuentemente utilizados por el organismo recipiente (Puigbograve Bravo amp Garcia-
Vallve 2008) Para esta aplicacioacuten los iacutendices de uso de codones de cada
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organismo los datos de entrada deben ser descargados y posteriormente deben
ingresarse manualmente Todos los iacutendices fueron descargados de la base de
datos Codon Usage Database (httpswwwkazusaorjpcodon) y se descargaron
para los organismos E coli B (CUD no 413997) S aureus N315 (CUD
no158879) L lactis subsp cremoris (CUD no 1359) and A victoria (CUD no
6100)
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Se realizoacute un alineamiento local entre pares probando de manera independiente
cada una las cuatro clases maacutes comunes de AgrD contra la secuencia
aminoaciacutedica del AgrD del MRSA seleccionada para determinar la especificidad
del biosensor y en consecuencia la existencia de un comportamiento de
comunicacioacuten cruzada El alineamiento se realizoacute en la aplicacioacuten EMBOSS Water
(httpswwwebiacukToolspsaemboss_water) (Madeira et al 2019) Las
secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro clases maacutes representativas de AgrD
fueron descargadas de los datos publicados por Wang y otros (B Wang amp Muir
2016) mientras que la secuencia de AgrD de la cepa MRSA que seleccionamos
fue recuperada de una base de datos (KEGG no SAS066)
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
La solubilidad de las proteiacutenas seleccionadas para su expresioacuten en E coli fue
predicha por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk)
(Hebditch Carballo-Amador Charonis Curtis amp Warwicker 2017) La precisioacuten
general de la herramienta fue estimada en 706 De acuerdo con los autores
cualquier valor de solubilidad superior a 045 se considera que es soluble De esta
manera cualquier proteiacutena con valor inferior a 045 se infiere que no son solubles
Es importante mencionar que esta herramienta no es uacutetil para determinar el iacutendice
de solubilidad en proteiacutenas membranales
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
La herramienta bioinformaacutetica BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo
Martelli Fariselli Profiti amp Casadio 2018) predice la localizacioacuten subcelular de
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una proteiacutena en E coli Esta aplicacioacuten nos permite distinguir entre proteiacutenas
globulares de proteiacutenas membranales Para fines de nuestro proyecto nosotros
configuramos a la aplicacioacuten para identificar ldquoProkarya ndash Gram negativerdquo debido a
que eacuteste es el origen taxonoacutemico de nuestro organismo productor heteroacutelogo
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
410 Prediccioacuten de alergenicidad
La alergenicidad de la LnqQ fue evaluada en la herramienta bioinformaacutetica
AllerCatPro versioacuten 17 (httpsallercatprobiia-staredusg) la cual permite
predecir si el componente es capaz de crear una respuesta aleacutergica tipo I mediada
a la inmunoglobulina tipo E (IgE) basada en el anaacutelisis estructural lineal y
tridimensional de la proteiacutena (Maurer-Stroh et al 2019)
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
4111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica de la amilasa AmyE fue
descargado del cataacutelogo de GenBank (GenBank no V001011) El peacuteptido sentildeal
de este archivo fue manualmente extraiacutedo con la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 113 siguiendo las recomendaciones de la publicacioacuten de Papi y sus
colaboradores (R M Papi et al 2005)
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4112 Disentildeo y acoplamiento del peacuteptido sentildeal N-AmyE con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo nucleotiacutedico de la LnqQ (GenBank no AB2352011) El
acoplamiento fue manualmente resuelto utilizando la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 110 agregando sitios de restriccioacuten y algunos nucleoacutetidos tomando
en cuenta las recomendaciones de AddGene de dejar un espacio para asistir en la
clonacioacuten molecular por PCR (httpswwwaddgeneorgprotocolspcr-cloning)
Dos vectores de expresioacuten basados en pET-30a(+) fueron disentildeados in silico
donde uno de los vectores contiene exclusivamente el peacuteptido sentildeal N-AmyE y en
el siguiente estaacute el N-AmyE acoplado con la LnqQ
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pETNL fue
elaborado en SnapGene 113 y guardado en formato dna y enviado a BioBasic
Inc (Canadaacute) a traveacutes del tercero autorizado Productos y Equipos
Biotecnoloacutegicos SA de CV (Probiotek Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
4113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido sentildeal N-AmyE del
conjunto LnqQ con etiqueta de polihistidina fue evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea
SignalP 50 (httpwwwcbsdtudkservicesSignalP) el cual es un servidor que
determina la presencia de peacuteptidos sentildeales y la localizacioacuten de sus sitios de corte
proteoliacutetico en proteiacutenas de origen en Archaea bacterias Gram positivas y
negativas y organismos eucarioacuteticos (Armenteros et al 2019)
Esta herramienta puede distinguir entre tres tipos de peacuteptidos sentildeales tiacutepicos El
primer mecanismo es a traveacutes la viacutea Sec tipo I (SPI) que es conocido como el
mecanismo estaacutendar de excrecioacuten donde los peacuteptidos sentildeales son transportados
por el translocoacuten Sec y son escindidos por accioacuten de la Peptidasa de Sentildeal tipo I
(Lep) El segundo mecanismo corresponde a la viacutea Sec tipo II (SPII) donde los
peacuteptidos sentildeales lipoproteiacutecos son transportados por el translocoacuten Sec y cortados
mediante la Peptidasa de Sentildeal tipo II (Lsp) El uacuteltimo mecanismo corresponde a
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la viacutea Tat donde los peacuteptidos sentildeales son transportados por el translocoacuten Tat tipo
y son escindidos por la Peptidasa de Sentildeal tipo I (Lep) (Armenteros et al 2019)
En la aplicacioacuten se puede elegir entre cuatro grupos de organismos para el
anaacutelisis de corte predictivo los cuales corresponden a organismos eucarioacuteticos
organismos Gram positivos organismos Gram negativos y en tipo Archaea Para
fines de nuestro proyecto dado que esta construccioacuten fue intencionada para ser
producida en ceacutelulas de E coli se eligioacute la opcioacuten para organismos Gram
negativos
Para comparar la probabilidad de corte enzimaacutetico de nuestra construccioacuten in silico
de N-AmyELnqQ6xHis se descargoacute los datos bioinformaacuteticos de seis secuencias
aminoaciacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y cuyo corte proteoliacutetico fue
demostrado experimentalmente
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
4121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica del peacuteptido de fusioacuten SmbP fue
amablemente cedido por el Dr Xristo Zaacuterate de la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten La secuencia nucleotiacutedica del SmbP estaacute contenida en un vector de
expresioacuten tipo pET30a(+) y guardado en formato dna
4122 Disentildeo y acoplamiento de peacuteptido de fusioacuten SmbP con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido de fusioacuten con la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo geneacutetico desde la base de datos biotecnoloacutegicos Este
acoplamiento fue manualmente resulto a traveacutes de SnapGene
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pSmbP-
LnqQ fueron elaborado en SnapGene 113 guardados en formato dna y enviado
a Gene Universal Inc (Estados Unidos) a traveacutes del tercero autorizado
Distribuidora Bakterlab SA de CV (Bakterlab Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
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4123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP del
conjunto LnqQ evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea PeptideCutter
(httpswebexpasyorgpeptide_cutter) la cual predice sitios potenciales para ser
cortados por proteasas o por sustancias quiacutemicas en una secuencia de proteiacutena
determinada (Gasteiger et al 2005) Esta aplicacioacuten contiene una lista extensa de
reacciones enzimaacuteticas y quiacutemicas Para fines de nuestro proyecto se eligioacute la
opcioacuten de ldquoEnterokinaserdquo ya que nuestra construccioacuten contiene este dominio
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Para descartar que la existencia de alguacuten codoacuten de paro no observado durante la
fase de post disentildeo optamos por analizar la secuencia nucleotiacutedica de la regioacuten
de intereacutes de pETNL y pSmbP-LnqQ en la aplicacioacuten en liacutenea ORF Finder
(httpswwwncbinlmnihgovorffinder) la cual es una aplicacioacuten que encuentra
marcos de lectura abiertos en una secuencia de nucleoacutetidos Los paraacutemetros
seleccionados correspondieron a ldquoATGrdquo exclusivamente como codoacuten de inicio y
como coacutedigo geneacutetico se utilizoacute la opcioacuten 1 correspondiente a ldquoStandardrdquo Esta
aplicacioacuten realiza una traduccioacuten de la secuencia nucleotiacutedica a partir de la
traduccioacuten de seis marcos de lectura y devuelve un graacutefico que indica la ubicacioacuten
donde se encuentra cada marco de lectura identificado (Wheeler et al 2003)
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
El peso molecular estimado de los productos de los vectores pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron estimado a traveacutes de la aplicacioacuten Compute pIMW de ExPasy
(httpswebexpasyorgcompute_pi) la cual permite estimar el punto isoeleacutectrico
(pI) teoacuterico y el peso molecular (MW) teoacuterico a partir de secuencias reportadas o
secuencias de aminoaacutecidos ingresados por el usuario (Gasteiger et al 2005)
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415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
La solubilidad de los productos de los pETNL y pSmbP-LnqQ fueron analizados
por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk) (Hebditch et al
2017) mientras que la localizacioacuten subcelular de las proteiacutenas fue determinada por
la herramienta BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo et al 2018)
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
Phyre2 (httpwwwsbgbioicacukphyre2htmlpagecgiid=index) es una
aplicacioacuten en liacutenea para el anaacutelisis de modelado para estructuras secundarias y
tridimensionales Esta herramienta permite predecir y analizar la estructura de la
proteiacutena asiacute como funciones y mutaciones haciendo maacutes faacutecil la interfaz al usuario
para interpretar la estructura secundaria y terciaria de los modelos asiacute como la
composicioacuten de dominios y la calidad del modelo (Kelley Mezulis Yates Wass amp
Sternberg 2015)
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
4171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Para transformar las ceacutelulas de E coli con el vector de expresioacuten pET30a(+)
pETNL o pSmbP-LnqQ se utilizoacute la teacutecnica de electroporacioacuten (Potter amp Heller
2003) que consiste en la introduccioacuten de DNA exoacutegeno al interior de las ceacutelulas
por meacutetodos fiacutesico-quiacutemicos A continuacioacuten describimos la teacutecnica
Se preparoacute un cultivo overnight de E coli en un tubo con caldo LB esteacuteril y se
incuboacute por 37degC en agitacioacuten constante por 18 h Al diacutea siguiente 20 microl del cultivo
preinoacuteculo fueron retirados y depositados en un microtubo con 1 ml de caldo LB
esteacuteril este proceso se realizoacute en seis tubos donde tres son etiquetados ldquoMuestrardquo
(M) ldquoAntibioacuteticordquo (A) ldquoViabilidadrdquo (V) y tres maacutes fueron reservados para anaacutelisis
espectrofotomeacutetricos Se incubaron todos los tubos a 37degC durante
aproximadamente 15 h (OD600 entre 04-06) en agitacioacuten constante Todos los
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tubos asignados para anaacutelisis espectrofotomeacutetricos fueron usados para monitoreo
Una vez alcanzado el tiempo establecido los tubos M A y V fueron centrifugados
a 9000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente El sobrenadante de los tubos
fue descartado y las ceacutelulas fueron resuspendidas en 1 ml de agua ultrapura
esteacuteril a temperatura ambiente Los tubos fueron centrifugados a 9000 rpm
durante 2 min a temperatura ambiente Este paso se repitioacute una vez El precipitado
celular en los tubos M A y V fue resuspendido en 35 microl de agua ultrapura esteacuteril y
se agregoacute al menos 2 a 3 microl de plaacutesmido (asymp 500 microg totales) o de agua seguacuten el
caso Finalmente se mezcloacute cuidadosamente con la micropipeta
En el tubo de viabilidad no se agregoacute plaacutesmido y fue sembrado en una placa LB
En el tubo etiquetado como antibioacutetico no se agregoacute plaacutesmido y el precipitado fue
sembrado en una placa de LB suplementado con kanamicina (50 microgml) Al tubo
de control positivo se agregoacute un plaacutesmido resistente a la kanamicina y eacutesta fue
sometida a electroporacioacuten y sembrada en una placa con LB con kanamicina En
la muestra se agregoacute alguno de los siguientes plaacutesmidos pET30a(+) pETNL o
pSmbP-LnqQ y posteriormente fue sometido a electroporacioacuten y sembrado en una
placa de LB con kanamicina
El volumen total de los tubos fue transferido a una celda de electroporacioacuten en el
espacio de 2 mm El equipo de electroporacioacuten (previamente irradiado con luz UV
por 15 min) fue encendido y configurado para electroporar a 2500 V
Posteriormente se agregoacute 1 ml de caldo LB esteacuteril a la celda de electroporacioacuten y
cuidadosamente mezclado (para evitar estresar a la ceacutelula) La mezcla es tomada
con mucho cuidado desde la celda y transferido a un tubo de 15 ml esteacuteril El tubo
fue incubado a 37degC por 1 h en agitacioacuten muy baja Cumplido el tiempo
establecido el tubo fue centrifugado a 9000 rpm durante 2 min Se retiroacute la mayor
parte del sobrenadante (asymp 950 ml) y el restante fue mezclado suavemente con el
precipitado celular hasta suspender la solucioacuten El volumen total resuspendido fue
sembrado en placas de LB agar o LB agar suplementado con kanamicina (50
microgml) dependiendo el caso Las placas fueron incubadas a 37degC en condiciones
de aerobiosis durante 16 h Al terminar las placas fueron revisadas y
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 41
seleccionadas Las ceacutelulas efectivamente transformadas con los plaacutesmidos fueron
resistentes a la accioacuten de la kanamicina mientras que las no transformadas fueron
eliminadas Las ceacutelulas transformadas fueron validadas posteriormente por
teacutecnicas moleculares como extraccioacuten de DNA plasmiacutedico yo identificacioacuten por
producto de PCR punto final
4172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Para la extraccioacuten y purificacioacuten utilizamos el Isolate II Plasmid Mini Kit de
Meridian Biosciencereg (Estados Unidos Cat BIO-52056) Se preparoacute un cultivo
overnight de E coli en un tubo 5 ml de caldo LB esteacuteril y se incuboacute por 37degC en
agitacioacuten constante por no maacutes ni menos de 16 h Al diacutea siguiente previo al
ensayo de extraccioacuten se precalentoacute la solucioacuten de buffer de lavado PW1 a 50degC y
la temperatura se mantuvo a esta temperatura hasta su uso Se verificoacute que el
buffer de lavado PW2 estuviera suplementado con etanol
El cultivo overnight fue centrifugado a 11000 x g por 30 minutos El volumen se
retiroacute y se mantuvo el precipitado celular al cual se agregoacute 250 microl del buffer de
resuspensioacuten P1 y el precipitado se resuspendioacute por completo por voacutertex Es
importante que no quede masa celular adherida en los tubos Posteriormente se
agregaron 250 microl de buffer de lisis P2 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas
6 a 8 veces El tubo fue incubado a temperatura ambiente por 5 min o hasta que el
lisado celular se tornara claro Cumplido el tiempo anterior se adicionaron 300 microl
de buffer de neutralizacioacuten P3 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas 6 a 8
veces Este procedimiento fue para evitar el rompimiento del DNA genoacutemico Los
tubos fueron centrifugados a 11000 x g durante 5 min a temperatura ambiente
Este paso fue repetido hasta que el sobrenadante quedara lo maacutes claro posible
Posteriormente se tomoacute una columna tipo spin y sobre eacutesta se agregoacute un tubo
colector y sobre eacutesta se antildeadioacute el volumen recuperado del paso anterior El tubo
con el volumen fue centrifugado a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Sobre el tubo colector se
agregoacute 500 microl de buffer de lavado PW1 precalentado y se centrifugoacute a 11000 x g
por 5 min a temperatura ambiente El sobrenadante del tubo fue eliminado por
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decantacioacuten Se adicionoacute 600 microl de buffer de lavado PW2 (suplementado con
etanol) y se centrifugoacute a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Centrifugar de nuevo el tubo
colector a 11000 x g por 2 min a temperatura ambiente para remover etanol
residual
Debajo del tubo colector se colocoacute un tubo de 15 ml esteacuteril y se agregoacute 50 microl de
buffer de elucioacuten P directamente sobre la membrana de siacutelice Se incuboacute a
temperatura ambiente y se centrifugoacute a 11000 x g por 2 min a temperatura
ambiente Del tubo con DNA purificado se tomaron 2 microl y se analizaron por nano-
espectrofotometriacutea para el caacutelculo de concentracioacuten y de pureza del DNA
plasmiacutedico
4173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Para comprobar que las ceacutelulas de E coli fueran efectivamente transformadas con
el vector de expresioacuten pET30a(+) pETNL y pSmbP-LnqQ se realizoacute un
experimento de PCR punto final para identificar al plaacutesmido recuperado de las
ceacutelulas de E coli Para ello nos enfocamos en primer lugar a elegir un par de
oligonucleoacutetidos que cumplieran de identificar los vectores de expresioacuten
El par de oligonucleoacutetidos elegidos para el anaacutelisis de las construcciones
corresponden al T7 promoter primer (5rsquo- TAATACGACTCACTATAGGG-3rsquo) y al T7
terminal primer (5rsquo- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3rsquo) los cuales son oligonucleoacutetidos
especiacuteficos para vectores construidos basados en pET30a(+) La secuencia de
ambos oligonucleoacutetidos fue recuperada de una compilacioacuten de AddGene para
ldquoSequencing Primersrdquo (httpswwwaddgeneorgmol-bio-referencesequencing-
primers)
Para determinar la temperatura de fusioacuten oacuteptima del par de oligonucleoacutetidos
utilizamos dos herramientas bioinformaacuteticas en liacutenea La primera aplicacioacuten fue
OligoAnalyzertrade (httpswwwidtdnacomcalcanalyzer) de la compantildeiacutea Integrated
DNA Technologies Inc (Estados Unidos) donde se ajustaron paraacutemetros como la
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concentracioacuten de oligonucleoacutetido las concentraciones de iones monovalentes
(Na+) y divalentes (Mg2+) asiacute como la concentracioacuten de nucleoacutetidos (dNTPs) en la
reaccioacuten para el caacutelculo de formacioacuten de hairpin homodiacutemeros y heterodiacutemeros
La otra aplicacioacuten es Net Primer (httpswwwpremierbiosoftcomnetprimer) de
Premier Biosoft que tambieacuten contiene puntos como la aplicacioacuten anteriormente
mencionada pero contiene opciones como el caacutelculo de rating de eacutexito y
estabilidad en el extremo 3rsquo-terminal
Para realizacioacuten del ensayo de PCR punto final utilizamos el High-Stability PCR
kit (Cat No L00342 Manual No 0285 Versioacuten 08272013) de GenScript Inc
(Estados Unidos) De esta manera ajustamos las condiciones de reaccioacuten de PCR
seguacuten lo determinado por el fabricante para por la DNA polimerasa Green Taq La
reaccioacuten de PCR punto final se ajustoacute a una concentracioacuten de oligonucleoacutetidos de
trabajo para 10 microM concentracioacuten de monovalentes (Na+K+) a 500 mM
concentracioacuten de divalentes (Mg2+) a 15 mM y concentracioacuten de dNTPs a 05 mM
El protocolo general para ensayo de PCR punto final de acuerdo con el fabricante
consistioacute en que por cada 50 microl de volumen de reaccioacuten se agregariacutean 5 microl de 10
X de Reaction Buffer 10 microl de 10 mM de dNTPs 10 microl por el oligonucleoacutetido 5rsquo-
terminal a 20 microM 10 microl por el oligonucleoacutetido 3rsquo-terminal a 20 microM 20 microl de
plaacutesmido (de al menos 100 ngmicrol) 395 microl de agua ultrapura esteacuteril y 05 microl de la
DNA polimerasa Green Taq
4174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Las muestras obtenidas fueron procesadas en un gel de agarosa (1 pv)
adicionada con Eco-Stain ready to use (Cat No DT81413) de BioBasic Inc
(Canadaacute) el cual es una sustancia que tiene un pico de excitacioacuten a λ = 490 nm y
dos picos de emisioacuten λ = 520 nm y λ = 635 nm y esta solucioacuten se agrega al gel en
una relacioacuten de 1 microl por 20 ml de solucioacuten de agarosa Las muestras fueron
corridas durante 1 h a 100 V en caacutemara para electroforesis Al terminar el tiempo
establecido el gel fue retirado e iluminado con luz UV en el transiluminador y se
tomoacute una fotografiacutea como evidencia Todos los geles fueron elaborados con su
respectivos controles positivos negativos y muestras
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418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
4181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Brevemente cultivos con diferentes cepas de E coli transformados con
pET30a(+) pETNL o pSmbP-LnqQ fueron inducidos con IPTG Se realizoacute un
cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado en un matraz con 25 ml de
caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50 microgml) a 37degC en agitacioacuten
constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se registroacute el valor de OD600 del
cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo preinoacuteculo en un matraz
esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina hasta llegar a un valor
inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado a 37degC en agitacioacuten constante
hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de OD600 asymp 04
Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue inoculado con
IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos diferentes
temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue distribuido en
tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten Todos los tubos
usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los tubos fueron
propiamente etiquetados
4182 Extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pETNL
Los cultivos de E coli transformados ya fuera con pET30a(+) pETNL o pSmbP-
LnqQ fueron inducidos por IPTG para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
Brevemente se realizoacute un cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado
en un matraz con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50
microgml) a 37degC en agitacioacuten constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se
registroacute el valor de OD600 del cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo
preinoacuteculo en un matraz esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con
kanamicina hasta llegar a un valor inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado
a 37degC en agitacioacuten constante hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de
OD600 asymp 04 Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue
inoculado con IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 45
diferentes temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue
distribuido en tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten
Todos los tubos usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los
tubos fueron propiamente etiquetados
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten periplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Santos y sus colaboradores (BD Santos et al 2019) que es un
procedimiento en un ensayo de lisozima con choque osmoacutetico Se descongeloacute los
tubos a baja temperatura y posteriormente fueron centrifugados a 8000 times g
durante 15 min a 4degC El sobrenadante de cada tubo fue eliminado y lavado dos
veces con buffer PBS 1X pH 74 (Gibco) friacuteo (8000 times g durante 10 min a 4degC) En
el uacuteltimo lavado los tubos con precipitado celular fueron pesados y sus pesos se
registraron Por uacuteltimo se calculoacute la diferencia entre los tubos con precipitado
celular contra los tubos cuando estaban vaciacuteos A cada uno de los tubos con
precipitado celular se le agregoacute solucioacuten hipertoacutenica friacuteo (sacarosa 20 trizma 20
mM EDTA 2 mM y lisozima 20 mgml pH 80) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten
hipertoacutenica por cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido
de cada tubo fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el
tiempo el cultivo fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC
El sobrenadante fue recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten
periplaacutesmica hipertoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El
precipitado celular es reservado Una vez retirada la fraccioacuten anterior los tubos
con precipitado celular remanentes fueron pesados de nuevo y se agregoacute solucioacuten
hipotoacutenica (agua ultrapura esteacuteril) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten hipotoacutenica por
cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido de cada tubo
fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el tiempo el cultivo
fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC El sobrenadante fue
recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten periplaacutesmica
hipotoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El precipitado celular se
eliminado
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4183 Extraccioacuten de proteiacutenas citoplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pSmbP-LnqQ
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten citoplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Vargas y sus colaboradores (Vargas-Cortez et al 2016) junto con
recomendaciones de Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) que es un
procedimiento basado en perlas de vidrio
Se descongelaron los tubos a baja temperatura y posteriormente centrifugados a
8000 times g durante 15 min a 4degC El precipitado celular de los tubos fueron
resuspendidos en buffer de lisis friacuteo (Tris-HCl 50 mM NaCl 500 mM pH 80) y se
agregaron 150 mg de perlas de vidrio limpios de 01 mm Los precipitados
celulares resuspendidos en perlas fueron mezclados por voacutertex durante 1 min Los
tubos fueron centrifugados a maacutexima velocidad por 15 min a 4degC El sobrenadante
fue recuperado con cuidado de cada tubo y fue etiquetado como ldquoFraccioacuten
citoplaacutesmicardquo
4184 Obtencioacuten de fracciones solubles e insolubles para SDS-PAGE
Para obtener las fracciones solubles e insolubles seguimos el protocolo de Santos
(Byran Santos 2017) Para la fraccioacuten soluble a partir del sedimento celular eacutesta
es resuspendida en 120 microl de agua ultrapura esteacuteril y despueacutes se le agregan 40 microl
de solucioacuten amortiguadora de carga SDS-PAGE 4X suplementado con β-
mercaptoetanol para una concentracioacuten final al 1X La solucioacuten fue hervida durante
10 min y posteriormente centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante
fue separado y guardado como ldquoFraccioacuten solublerdquo Luego al sedimento restante
se le agregaron 120 microl de solucioacuten de urea 8 M y se hierve de nuevo durante otros
10 min para solubilizacioacuten de los cuerpos de inclusioacuten Finalmente la solucioacuten fue
centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante fue separado y guardado
como ldquoFraccioacuten insolublerdquo Ambas fracciones fueron visualizadas posteriormente
en los geles de SDS-PAGE
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4185 Preparacioacuten de gel de SDS-PAGE 16
Los geles de SDS-PAGE fueron preparados bajo las siguientes condiciones se
prepararon dos geles en dos tubos nuevos e independientes conocidos como
lower y upper con suficiente capacidad para almacenar el volumen de cada gel
Primero se preparoacute el lower gel y solo hasta haber terminado ese gel se procedioacute
a preparar el upper gel
Para preparar el lower gel a 16 preparamos una reaccioacuten considerando un
volumen de 10 ml Para ello mezclamos 350 ml de agua destilada 400 ml de
solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) 250 ml de lower buffer (para 25 ml Tris
1515 g SDS 01 g pH 68) 200 microl de APS 10 (pv) y TEMED 20 microl Para el
upper gel a 4 estaacute reaccioacuten fue montada con un volumen de 5 ml Para ello
mezclamos 325 ml de agua destilada 050 ml de solucioacuten de BisAcrilamida 40
(291) 125 ml de upper buffer (para 25 ml Tris 454 g SDS 01 g pH 88) 100 microl
de APS 10 (pv) y 20 microl de TEMED
Tanto la solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) del upper buffer y el lower buffer
fueron retirados del refrigerador y atemperados a temperatura ambiente cuando
menos unos 15 min antes de uso La solucioacuten de APS a una relacioacuten de 01 g por
1 ml (10 pv) debioacute prepararse al momento con agua destilada limpia Toda la
cristaleriacutea usada para preparar el gel de poliacrilamida debioacute ser lavada con agua
destilada limpia y secarse con suficiencia evitando rayar los vidrios
Una vez agregado el TEMED a la mezcla la solucioacuten fue inmediatamente vertido
sobre placas de vidrio Fue necesario esperar entre 20 a 30 minutos para que
completar el proceso de polimerizacioacuten En el lower gel se agregaron 200 microl de
isobutanol para el upper gel en la parte superior se agregoacute un molde para
pocillos Terminado el tiempo de polimerizacioacuten se agregaron las muestras de
proteiacutenas en los pocillos del gel de SDS-PAGE Los geles fueron puestos sobre
una caacutemara de electroforesis vertical y sumergidos en un buffer de corrida a 1X
(para 1000 ml Tris 3 g Glicina 144 g y SDS 1 g) El gel fue corrido a 150 V
durante 1 a 15 h dependiendo de la liacutenea de corrida de la solucioacuten
amortiguadora
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4186 Tincioacuten de gel SDS-PAGE
Previo a tentildeir los geles se prepararon dos soluciones Para la solucioacuten de tincioacuten
se pesaron cuidadosamente y con guantes 50 mg de Coomasie Blue R-250 en un
tubo plaacutestico limpio para un volumen de 50 ml Despueacutes se agregaron 25 ml de
metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta
50 ml con agua destilada limpia Mantener a temperatura ambiente y en
condiciones de obscuridad hasta su uso Mientras que para la solucioacuten de
destincioacuten se midieron 75 ml de metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico
absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta 50 ml con agua destilada limpia
Mantener a temperatura ambiente hasta su uso
Cuando terminado el paso de corrida por electroforesis los geles fueron
cuidadosamente separados de los vidrios El gel fue tentildeido con la solucioacuten de
tincioacuten durante toda la noche en agitacioacuten constante a temperatura ambiente y
posteriormente fue destentildeido con la solucioacuten de destincioacuten durante el resto del diacutea
siguiente bajo las mismas condiciones previas El gel fue puesto sobre un fondo
blanco y se fotografioacute como evidencia
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en
los geles
La presente seccioacuten fue desarrollada posterior a la conclusioacuten de la fase
experimental con el objetivo de explicar la ausencia de bandas tanto de N-
AmyELnqQ como de SmbP-LnqQ en los geles de SDS-PAGE Para abordar el
problema exploramos las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas por el
anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle un anaacutelisis de perfil
aminoaciacutedico y finalmente a traveacutes de diferencias por su origen evolutivo
Las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas como el tamantildeo de proteiacutenas
peso molecular punto isoeleacutectrico nuacutemero total de residuos con carga positiva y
negativa iacutendice alifaacutetico (AI) e iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) fueron calculadas
a traveacutes de ProtParam de ExPasy (httpswebexpasyorgprotparamprotparam-
dochtml) (Gasteiger et al 2005) El iacutendice alifaacutetico (AI) estaacute principalmente
afectado por los cuatro aminoaacutecidos con cadena lateral alifaacutetico alanina valina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 49
leucina e isoleucina El incremento del AI es directamente proporcional a la
termoestabilidad en proteiacutenas globulares (Atsushi 1980) El iacutendice de
hidrofobicidad (GRAVY) es el resultado del promedio que representa la suma total
de los valores de hidropatiacutea de cada uno de los residuos dentro de una cadena
lineal de aminoaacutecidos dividido por el tamantildeo del peacuteptidoproteiacutena Una proteiacutena
con valor GRAVY negativo una proteiacutena hidrofiacutelica mientras que una proteiacutena con
valor GRAVY positivo es hidrofoacutebica (Kyte amp Doolittle 1982)
El anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle fue elaborado a
partir de ProtScale de ExPasy (httpswebexpasyorgprotscale) (Gasteiger et al
2005) Esta herramienta permite elaborar un perfil producido por cualquier escala
aminoaciacutedica a partir de una secuencia aminoaciacutedica Existen 57 escalas de
hidrofobicidad yo hidrofilicidad para fines de nuestro experimento utilizamos la
opcioacuten ldquoHphob Kyte amp Doolittlerdquo
El mapa de calor representa el porcentaje de aminoaacutecidos dada en una secuencia
lineal de aminoaacutecidos con el fin de elaborar un perfil aminoaciacutedico entre los
diferentes peacuteptidos antimicrobianos que fueron efectivamente sobreproducidos por
SmbP La graacutefica fue elaborada a traveacutes de Excel con datos descargados desde la
aplicacioacuten ProtParam de ExPasy
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 50
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS
Las actividades del proyecto fueron realizadas en los Laboratorios de Biologiacutea y de
Sistemas del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea y el
Laboratorio de Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas ubicado en la Divisioacuten de
Estudios de Posgrado ambas infraestructuras pertenecientes a la Facultad de
Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
A continuacioacuten se presenta un listado completo de los materiales y equipos
utilizado
51 Materiales y reactivos
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Microtubos de 15 ml 15 ml y 50 ml Distintas marcas No especificado
Cajas Petri de plaacutestico o vidrio Distintas marcas No especificado
Matraces tipo Erlenmeyer Distintas marcas No especificado
Celdas para espectrofotoacutemetro No especificado No especificado
Celdas de electroporacioacuten No especificado No especificado
Micropipetas (varios voluacutemenes) Distintas marcas No especificado
Medio de cultivo LB Difco 244620
Agar bacterioloacutegico MCD-LAB 9011
Agua grado Biologiacutea Molecular Invitrogen 10977-015
Kanamicina sulfato AG Scientific K-1022
Ampicilina soacutedica Sigma Aldrich A0166
Perlas de vidrio 01 mm Biospec 11079101
IPTG Bioline BIO-37036
LDS Sample Buffer 4X GenScript M00676-10
SDS IBI Scientific IB07062
Persulfato de Amonio (APS) BioBasic AB0072
TEMED Merck 110732
Glicina BioBasic GB0235
Bis-Acrilamida 40 (29109) Merck 100641
Coomasie Briliant Blue BioBasic CB0038
2-mercaptoetanol BioBasic MB0338
Isopropanol 100 DEQ No especificado
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Aacutecido fosfoacuterico 85 Jalmek A1825-13
Hidroacutexido de sodio DEQ No especificado
Aacutecido clorhiacutedrico DEQ No especificado
Alcohol metiacutelico DEQ No especificado
Aacutecido aceacutetico glacial Jalmek A0925-13
Etanol anhidro Jalmek E5325-18
Urea BioBasic UB0148
Buffer de fosfatos salinos 1X (PBS) Gibco 10010-023
Cloruro de sodio Jalmek S2325-05
Tris BioBasic TB0196
Glicerol DEQ No especificado
Guantes de nitrilo Ambiderm No especificado
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S657-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 7 J T Baker S656-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S655-02
QuickClean II Plasmid Miniprep kit GenScript L00420-100
QuickClean II Gel Extraction Kit GenScript L00418-100
QuickClean II PCR Purification Kit GenScript L00419-50
52 Equipos de laboratorio
USO PERSONAL
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Computadora personal Acer Aspire A515-51
LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA Y DE SISTEMAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Incubadora estaacutetica Lab Companion IB-11E
Incubadora de piso con agitacioacuten Lab Companion IS-971
Incubadora de agitacioacuten (microtubos) Eppendorf ThermoMixer C
Horno de secado Shel Lab SGO 6E
Horno de microondas Everstar P90D23AL-XF
Concentrador Thermo Fisher SpeedVac SPD
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Bantildeo de ultrasonido VMR Symphony 97043-996
Contador de colonias Reichert 3327
Agitador orbital Labnet Orbit 1000
Agitador vertical Thermo Scientific Compact Digital Rocket
Termociclador miniPCR Mini8
Termociclador Techne 3Prime
Refrigerador de puertas deslizantes Thermo Scientific MH45PA-GAEE-TS GPR Series
Refrigerador a dos puertas Norlake Scientific LRF 201WW
Congelador de -20 degC MetalFrio Solutions
No especificado
Espectrofotoacutemetro UV-Vis Optizen 2120 UV Plus
Nanoespectrofotoacutemetro BioSpec Shimadzu
Gabinete bioseguridad clase II Labconco Delta Series
Centriacutefuga para microtubos Ohaus Frontier 5515
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
Voacutertex Scientific Industries
Genie 2
Plancha de calentamiento con agitacioacuten magneacutetica
Lab Companion HP-3000L
Microscopio oacuteptico Fisher Scientific Micromaster
Autoclave Lab Companion ST-G Series
Caacutemara profesional Canon EOS M10
Transiluminador Maestro No especificado
Balanza analiacutetica AND GR-200
Balanza semianaliacutetica Ohaus Traveler
Electroporador Eppendorf Eppendorf
Fuente de Poder BioRad PowerPac Basic
Potencioacutemetro Ohaus Starter 5000
LABORATORIO DE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Cromatoacutegrafo GE Life Sciences Aumlktaprime Plus
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
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53 Lugares de experimentacioacuten
Nuestro proyecto fue elaborado entre Febrero de 2018 a Mayo de 2021 y fue
mayoritariamente realizado en las instalaciones del Laboratorio de Biologiacutea
Sinteacutetica y de Sistemas (LBSS) a cargo del Dr Heacutector Javier Ameacutezquita Garciacutea
encontraacutendose en el interior del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y
Nanotecnologiacutea (CIBYN) dependencia de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
(FCQ) de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten El centro estaacute ubicado en la
autopista al Aeropuerto ldquoMariano Escobedordquo Km 10 Parque de Investigacioacuten e
Innovacioacuten Tecnoloacutegica (PIIT) CP 66628 en Apodaca Nuevo Leoacuten Meacutexico
En menor proporcioacuten nuestro trabajo tambieacuten fue realizado en el Laboratorio de
Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas (PEP) a cargo del Dr Xristo Zaacuterate
Kalfoacutepulos Esta unidad estaacute localizada en el interior de la Divisioacuten de Estudios de
Posgrado (DEP) de Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la Universidad
Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) La ubicacioacuten de la divisioacuten estaacute en la calle
Vicente Guerrero sn Col Trevintildeo CP 64570 en Monterrey Nuevo Leoacuten
Meacutexico
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos
Declaracioacuten de manejo y disposicioacuten de residuos
Todos residuos generados durante la realizacioacuten del proyecto de investigacioacuten
fueron gestionados de acuerdo con las caracteriacutesticas de estos siguiendo los
lineamientos establecidos por el Departamento de Medio Ambiente y Seguridad de
la Facultad de Ciencias Quiacutemicas utilizando los recipientes proporcionados por
este departamento en base a la Norma PR-CLB-SRR-000
Los residuos bioloacutegico-quiacutemicos fueron dispuestos en los contenedores
correspondientes en el interior de los laboratorios
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 54
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
En esta seccioacuten nos centramos en el disentildeo in silico de ceacutelulas de E coli
configuradas para detectar moleacuteculas de AIP producidos por el sistema nativo de
QS de ceacutelulas de MRSA De acuerdo con nuestro disentildeo (Figura 2) las ceacutelulas α
corresponden a ceacutelulas de S aureus productoras de moleacuteculas AIP mientras que
las ceacutelulas β corresponden a ceacutelulas de E coli que han sido modificadas con un
par de moacutedulos geneacuteticos biosensor y bacteriocina que le permiten detectar
moleacuteculas de AIP y en respuesta destruyen ceacutelulas de S aureus en el medio A
manera de resumen las ceacutelulas de E coli modificadas producen y excretan LnqQ
en funcioacuten de la concentracioacuten externa de moleacuteculas de AIP
Nuestra determinacioacuten por elegir bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
para nuestro sistema biosensor se explica en la siguiente numeracioacuten en primer
lugar consideramos que debido a su origen proteico son susceptibles a
modificaciones geneacuteticas (Cotter et al 2013)
Figura 2 Sistema QS para deteccioacuten y eliminacioacuten de S aureus
El moacutedulo biosensor conformado por agrC y agrA (azul marino y azul celeste respectivamente) estaacute regulado
por el promotor constitutivo J23110 La deteccioacuten del AIP-II (pentaacutegonos naranja) estaacute regulado por AgrC la
cual activa la fosforilacioacuten (ciacuterculos amarillo) de AgrA y activa la expresioacuten del moacutedulo bacteriocina a traveacutes
de la lnqQ lnqBCEDF y gfp (rojo amarillo y verde respectivamente) regulado por el promotor P2 LnqQ
destruye ceacutelulas de S aureus
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 55
62 Cepas bacterianas
La razoacuten de escoger a E coli como chasis bioloacutegico de produccioacuten es porque ya
ha sido reportado previamente como biosensor de ceacutelulas enteras basados en
deteccioacuten del QS (Sedlmayer Hell Muumlller Auslaumlnder amp Fussenegger 2018) y
ademaacutes porque es el organismo de produccioacuten heteroacuteloga maacutes usado en el campo
de las bacteriocinas (Mesa-Pereira et al 2018) Nuestro modelo estaacute disentildeado
para ser aplicado en E coli BL21 (DE3) ya que ha sido efectivamente reportado
para producir y secretar bacteriocinas de las clases IIa y IId eacuteste uacuteltimo es
importante ya que esta es la clase a la que pertenece la bacteriocina LnqQ (Mesa-
Pereira et al 2017)
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
Para determinar el comportamiento in silico de nuestra ceacutelula de E coli fue
necesario disentildear un vector de expresioacuten con dos moacutedulos geneacuteticos y eacutestos
fueron referidos como moacutedulo biosensor y moacutedulo de bacteriocina
respectivamente Ambos moacutedulos fueron disentildeados de la siguiente manera
promotor-RBS-gene(s) estructural(es)-doble terminador (Figura 3)
Figura 3 Moacutedulos biosensor y de bacteriocina
El moacutedulo biosensor es configurado con agrC y agrA y estaacuten regulados transcripcionalmente por el promotor
J23110 (A) El moacutedulo de bacteriocina estaacute armado con los genes lnqQ y gfp y estaacuten regulados
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 56
transcripcionalmente por el promotor P2 (B) Por uacuteltimo se muestra el disentildeo del sistema detectar y destruir
con los promotores divergentes J23110 y P2 (C)
En primera instancia se debioacute localizar el locus geneacutetico del promotor P2 de
nuestra MRSA fue manualmente localizado puesto que no existiacutea informacioacuten
relacionada al mismo De acuerdo con Shao y otros el locus de un promotor se
encuentra evolutivamente conservado entre especies que estaacuten relacionadas
(Shao Price Deutschbauer Romine amp Arkin 2014) De esta manera utilizamos
la anterior premisa para localizar el promotor P2 en un primer enfoque
localizamos la secuencia nucleotiacutedica del agrB en el archivo genoacutemico de la
MRSA (564 nucleoacutetidos KEGG no SA1842) como referencia ya que se conoce
que este gen es conocido que eacutesta es la primera unidad transcripcional ubicada riacuteo
abajo del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Para el segundo
enfoque usamos la informacioacuten disponible del promotor P2 de S aureus NCTC
8325 (Rajasree Fasim amp Gopal 2016 Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) una
cepa catalogada como estaacutendar para estudios bioinformaacuteticos (S Fuchs et al
2017 Herbert et al 2010) Al combinar lo mejor de ambos enfoques logramos
localizar la composicioacuten nucleotiacutedica del promotor P2 y su tamantildeo a traveacutes de la
identificacioacuten de los dominios
A continuacioacuten explicamos el principio del disentildeo de ambos moacutedulos En primer
lugar el moacutedulo designado como biosensor los genes agrC y agrA son
constitutivamente expresados por accioacuten del promotor J23110 Brevemente se
describe el principio del disentildeo donde inicialmente el AgrC anclado a membrana
de E coli detecta la presencia de moleacuteculas de AIP externas (Marchand amp Collins
2013) De esta manera AgrC sufre de un cambio conformacional y fosforila al
factor de transcripcioacuten AgrA Despueacutes el AgrA fosforilado (AgrA) actuacutea como
factor de transcripcioacuten del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Una
vez que AgrA-P se ha acoplado al promotor P2 el moacutedulo de bacteriocina es
expresado incluyendo los genes tipo estructural (lnqQ) excrecioacuten y
autoinmunidad (lnqBCEDF) del operoacuten lnq asiacute como del gen reportero gfp
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 57
Algunos autores han demostrado que mantener intacto el operoacuten nativo de una
bacteriocina cualesquiera (es decir que contenga los elementos geneacuteticos de su
estructura para su secrecioacuten y para autoinmunidad) en E coli eacutesta ceacutelula
modificada es capaz de excretar bacteriocinas Gram positivos al medio
extracelular (Mesa-Pereira et al 2017)
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
Los moacutedulos geneacuteticos fueron disentildeados para operar en el mismo sentido que el
ensamble por tipo BioBrick al yuxtaponer las propiedades del BioBrick (RFC 10) y
el BglBrick (RFC 21) La intencioacuten del disentildeo es que nuestros moacutedulos geneacuteticos
sean faacutecilmente ensamblados o removidos por teacutecnicas como In-Fusion (Sleight
Bartley Lieviant amp Sauro 2010) o ensamblado por clonacioacuten in vivo (Garciacutea-
Nafriacutea Watson amp Greger 2016) dado que los sitios de restriccioacuten actuacutean como
sitios homoacutelogos para la clonacioacuten
Cada moacutedulo estaacute flanqueado por sitios de restriccioacuten para que puedan ser
intercambiados de ser necesario El moacutedulo de promotores estaacute flanqueado por
los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI manteniendo a EcoRI como unidad neutral
para cuando sean necesario el intercambio de piezas Los elementos del moacutedulo
biosensor estaacuten flanqueados por los sitios BglII y BamHI y los elementos del
moacutedulo de bacteriocinas estaacuten rodeados por los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI
(Figura 4)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 58
Figura 4 Estrategia de construccioacuten in silico
El moacutedulo biosensor (seccioacuten A) estaacute constituido por el BglBrick RFC21 mientras que el moacutedulo bacteriocina
(seccioacuten C) estaacute representado por el BioBrick RFC10 La seccioacuten de promotores (seccioacuten B) fue colocado en
caso de que los promotores fueran cambiados Cada bloque contiene una regioacuten prefija y otra sufija y cada
bloque estaacute flanqueado en ambas direcciones por terminadores dobles de transcripcioacuten (BBa_B0015 ciacuterculos
rojos) La seccioacuten B estaacute bordeada por los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI (G-X) con la regioacuten EcoRI como
neutral La seccioacuten A EcoRI y BglII (E-G) estaacuten anclados como prefijos mientras que BamHI y XhoI (B-X)
estaacuten puestos como sufijos Los sitios de restriccioacuten BglII y BamHI fueron usados para construir el promotor
constitutivo J23110 en conjunto a su parte estructural (RBS-gen) para el moacutedulo de biosensor Por otro lado
para la seccioacuten C el prefijo estaacute compuesto por los sitios EcoRI-XbaI (E-X) y los sitios SpeI-PstI (S-P) son
colocados como prefijos Los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI fueron usados para construir el promotor
inducible P2 y en conjunto a su parte estructural (RBS-gene) para el moacutedulo de bacteriocina
El plaacutesmido pSB1A3 (AddGene no 116850) (Dupin amp Simmel 2019) sirvioacute como
plantilla para la construccioacuten de los moacutedulos geneacuteticos Las secciones prefijo y
sufijo fueron manualmente remplazados por cualquiera de los moacutedulos disentildeados
El replicoacuten y los genes de resistencia a antibioacutetico del plaacutesmido fueron retenidos
pero el terminador de transcripcioacuten fue remplazado por terminadores dobles
Finalmente un par de plaacutesmidos fueron construidos y cada uno contiene
individualmente del moacutedulo de biosensor o de bacteriocina respectivamente
Finalmente ambos plaacutesmidos fueron manualmente mezclados para crear un
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 59
plaacutesmido que contiene un par de moacutedulos que estaacuten en direcciones divergentes
Este vector de expresioacuten fue nombrado Dual Biosensor-Killer (Figura 5)
Figura 5 Representacioacuten esquemaacutetica del vector Dual Biosensor-Killer
El moacutedulo biosensor contiene los genes agrC y agrA y estaacute rodeado por los sitios de restriccioacuten EcoRI BglII y
XhoI mientras que el moacutedulo de bacteriocina contiene los genes del cluacutester lnqQBCDEF y el gen reportero gfp
y estaacute flanqueado por los sitios de restriccioacuten EcoRI XbaI SpeI y PstI Este plaacutesmido contiene un marcador
de resistencia a ampicilina y se compone de un total de 8904 pb
Parte de la estrategia de nuestro disentildeo consistioacute en que los promotores J23110 y
P2 fueran colocadas en sentidos opuestos para regular de manera independiente
la actividad de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina respectivamente La razoacuten
de aislar ambos moacutedulos es para evitar la expresioacuten por goteo que pudiera existir
por efecto de la fuerza de alguno de los promotores al mantenerse en la misma
direccioacuten transcripcional (Lubkowicz et al 2018) Todos los archivos generados
para la elaboracioacuten del vector de expresioacuten Dual Biosensor-Killer fueron
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 60
elaborados por SnapGene y estaacuten disponibles en los archivos anexos de esta
misma tesis
65 Optimizacioacuten de los codones nativos
De acuerdo con las observaciones (Tabla 1) todas las secuencias fueron
optimizadas para ser expresadas en E coli cepa tipo B Noacutetese que los sitios de
restriccioacuten tiacutepicos y los codones de paro de todas las secuencias utilizadas fueron
removidos El iacutendice CAI antes de la optimizacioacuten en AgrC AgrA LnqQ LnqB
LnqC LnqE LnqD y LnqQ era de 0407 0402 0532 0525 0518 0511 0503
and 0521 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores cambiaron a
0770 0766 0675 0735 0771 0773 0777 y 0747 respectivamente El valor
CAI para la GFP no pudo ser determinado por la aplicacioacuten antes de la
optimizacioacuten pero siacute despueacutes de la optimizacioacuten el cual correspondioacute a 0759 En
relacioacuten con el contenido de GC los valores antes de la optimizacioacuten fueron
282 272 333 225 231 305 y 245 respectivamente Despueacutes de
la optimizacioacuten los datos fueron 433 446 469 400 421 410
431 424 y 424 respectivamente El contenido GC para GFP despueacutes de
la optimizacioacuten fue de 491
Nuestros resultados el promedio del valor CAI y el promedio de contenido GC de
todas las secuencias aminoaciacutedicas antes de ser optimizadas era de 049 plusmn 005 y
2690 plusmn 371 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores
promedio fueron 075 plusmn 003 y 4361 plusmn 287 respectivamente Seguacuten las
especificaciones de la aplicacioacuten si el valor CAI es maacutes cercano a 1 eacuteste indica
que la secuencia de nucleoacutetidos utiliza los codones maacutes utilizados por el
organismo productor heteroacutelogo (Puigbograve et al 2008) Seguacuten los resultados los
valores CAI y el contenido GC de todas las proteiacutenas utilizadas como datos de
entrada fue substancialmente mejorados y estaacute optimizada para ser utilizado en E
coli heteroacuteloga La finalidad de optimizar el contenido nucleotiacutedico de las
secuencias utilizadas para disentildeo a las caracteriacutesticas requeridas del hospedero
es para incrementar el rendimiento de produccioacuten (Puigbograve et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 61
Tabla 1 Uso de codones previo y despueacutes de la optimizacioacuten
Paraacutemetros Previo a la optimizacioacuten Despueacutes de la optimizacioacuten
Gen Tamantildeo (pb) CAI GC CAI GC
agrC 1116 0407 282 0770 433
agrA 717 0402 272 0766 446
lnqQ 162 0532 333 0675 469
lnqB 240 0525 225 0735 400
lnqC 480 0518 231 0771 421
lnqE 1299 0511 259 0773 410
lnqD 678 0503 305 0777 431
lnqF 795 0521 245 0747 424
gfp NA NA NA 0759 491
El iacutendice de adaptacioacuten (CAI) y el contenido de guanidina y citosina (GC) La tabla se divide en dos
secciones previo a la optimizacioacuten y despueacutes de la optimizacioacuten La columna de gen representa el nombre del
dato de entrada y el tamantildeo que indica el total de nucleoacutetidos para cada entrada Los resultados en la tabla
representan la adaptabilidad de las secuencias de entrada usando a E coli como hospedero No fue posible
determinar el uso de codones antes de la optimizacioacuten para el gen gfp debido a que no hay suficiente
informacioacuten al computador el iacutendice CAI con esta tabla de referencia NA = No Aplica
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Es conocido que S aureus posee cuatro grandes variantes de clases de
moleacuteculas de AIP (desde I hasta IV) la cual difiere entre uno a dos residuos en la
seccioacuten madura del AIP (Ji et al 2005 B Wang amp Muir 2016) La diferencia
estructural entre las clases de AIP pueden actuar como inhibidores competitivos
del QS cuando interactuacutean con cepas filogeneacuteticamente relacionadas Este
fenoacutemeno bioloacutegico es conocido como comunicacioacuten cruzada (Everett amp
Rumbaugh 2014)
Para predecir la probabilidad de comunicacioacuten cruzada de nuestro biosensor
descargamos las secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro variantes maacutes
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 62
representativas de AgrD junto la informacioacuten anotada del AgrD de la cepa MRSA
estaacutendar Finalmente realizamos un alineamiento local bajo la herramienta
EMBOSS Water entre cada una de las secuencias aminoaciacutedicas representativas
contra la secuencia aminoaciacutedica de nuestra cepa Los resultados revelan (Tabla
2) que el AgrD de nuestro MRSA tuvo un porcentaje de identidad y de similitud con
el AgrD clase I de 478 y 652 respectivamente Para la clase II los
porcentajes fueron 100 y 100 respectivamente mientras que con la clase III
fueron de 326 y 500 respectivamente Finalmente con la clase IV los
porcentajes fueron de 457 y 609 respectivamente Seguacuten los resultados del
alineamiento podemos inferir que nuestro biosensor es uacutetil para detectar
moleacuteculas de QS producidos por S aureus N315 y por otros S aureus que sean
productores de AIP tipo II Al mismo tiempo nuestro sistema estariacutea limitado a no
detectar S aureus productores de AIP clases I III y IV
Bajo la prediccioacuten anterior nuestro biosensor completo de ceacutelulas estariacutea
capacitado para detectar ceacutelulas de S aureus N315 inclusive cepas de S aureus
USA100 las cuales son productoras naturales de moleacuteculas de AIP clase II
(Grundstad et al 2019) y estaacuten sentildealadas como entre las principales cepas tipo
MRSA que circulan a nivel mundial esta cepa es altamente letal y es una causa
de endocarditis infecciosa en la vaacutelvula nativa del corazoacuten A nivel in vitro se
reporta que es una productora de biopeliacuteculas fuertes (King Kulhankova Stach
Vu amp Salgado-Paboacuten 2016) A pesar de ser una cepa principalmente asociada a
infecciones adquiridas en hospitales (Limbago et al 2009 Tenover et al 2008)
tambieacuten se ha encontrado entre individuos que no han recibido cuidados meacutedicos
previos Noacutetese que esta cepa es resistente a vancomicina (Roberts 2013)
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Tabla 2 Prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Clase AIP Alineamiento de proteiacutenas Tamantildeo ID Similitud Gaps Score Ref
I MNTLFNLFFDFITGILKNIGNIAAYSTCDFIMDEVEVPKELTQLHE- 46 478 652 00 1700 1 2
II MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK 47 1000 100 00 24000 1 2
III MKKLLNKVIELLVDFFNSIGYRAAYINCDFLLDEAEVPKELTQLHE- 46 326 500 00 7200 1 2
IV MNTLYKSFFDFITGVLKNIGNVASYSTCYFIMDEVEIPKELTQLHE- 46 457 609 00 10500 2
MRSA MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK - - - - -
El alineamiento de proteiacutenas se realizoacute entre las cuatro clases mayoritarias de AIP contra el MRSA El alineamiento fue realizado en el programa Clustal Omega
mientras que la identificacioacuten (ID) similitud gaps y score fue determinado de la aplicacioacuten EMBOSS Water
1 (B Wang amp Muir 2016)
2 (Ji et al 2005)
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67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
El anaacutelisis de solubilidad y localizacioacuten subcelular entre todas las secuencias
aminoaciacutedicas utilizadas para construir biosensor de ceacutelulas enteras es necesario
para obtener un alto rendimiento productivo (Ghosh et al 2004) Seguacuten los
resultados obtenidos por la aplicacioacuten Protein-Sol (Tabla 3) para prediccioacuten de
solubilidad eacutestos indican que LnqQ LnqF AgrA y GFP son considerados solubles
mientras que los datos obtenidos para LnqB LnqC y LnqE no pudieron ser
considerados ya que la aplicacioacuten los clasificoacute como proteiacutenas de membrana
Tabla 3 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
Gen Iacutendice Solubilidad
AgrC 0366 Invaacutelido
AgrA 0514 Soluble
LnqQ 0655 Soluble
LnqB 0655 Invaacutelido
LnqC 0644 Invaacutelido
LnqD 0388 Invaacutelido
LnqE 0609 Invaacutelido
LnqF 0607 Soluble
GFP 0592 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice superior de 045 es
porque se consideraron proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
De acuerdo con las predicciones de la aplicacioacuten BUSCA (Tabla 4) la localizacioacuten
subcelular de las proteiacutenas AgrA LnqQ LnqE y GFP es en el citoplasma mientras
que AgrC LnqB LnqC LnqD LnqE y LnqF son producidos en la membrana
plasmaacutetica Los caacutelculos predictivos en las proteiacutenas a sobreproducirse en E coli
concuerda con lo observado en la literatura para los elementos geneacuteticos del
moacutedulo biosensor el AgrC actuariacutea como una proteiacutena transmembranal con
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actividad histidina quinasa mientras que AgrA actuariacutea como factor de
transcripcioacuten que se mueve a traveacutes del citoplasma para anclarse al promotor P2
(Gomes-Fernandes et al 2017) En los elementos del moacutedulo de bacteriocina se
espera que la LnqQ actuacutee como una proteiacutena soluble de bajo peso molecular que
es producido y excretado al medio extracelular (Fujita et al 2007) Para los demaacutes
elementos estructurales de este moacutedulo se sabe que LnqB es una proteiacutena
membranal tipo permeasa mientras que LnqC y LnqD son proteiacutenas con dominios
franqueados en membrana asiacute como LnqE y LnqF son proteiacutenas transportadoras
tipo ABC-2 y ABC respectivamente (Iwatani et al 2012) Por uacuteltimo los valores
de predictivos indican que la GFP seraacute producida como una proteiacutena soluble y
monomeacuterica (Zacharias et al 2002)
Tabla 4 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
Gen Valor Localizacioacuten subcelular
AgrC 075 Membrana plasmaacutetica
AgrA 07 Citoplasma
LnqQ 07 Citoplasma
LnqB 09 Membrana plasmaacutetica
LnqC 083 Membrana plasmaacutetica
LnqD 072 Membrana plasmaacutetica
LnqE 086 Membrana plasmaacutetica
LnqF 07 Citoplasma
GFP 07 Citoplasma
De acuerdo con la aplicacioacuten BUSCA las localizaciones subcelulares disponibles son membrana plasmaacutetica y
citoplasma
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
La determinacioacuten de la alergenicidad es un aspecto deseado durante la
construccioacuten del biosensor de ceacutelulas enteras debido a que nuestro sistema seriacutea
presentado en el futuro como un potencial candidato a agente terapeacuteutico Para
demostrar este punto fue necesario demostrar que la estructura tanto primaria
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como secundaria de la LnqQ presentaba epiacutetopos para ceacutelulas tipo B dado que la
alergenicidad estaacute mediada tanto por ceacutelulas De acuerdo con los resultados de la
secuencia aminoaciacutedica de la LnqQ en su estructura en forma lineal (Tabla 5) se
indica que los potenciales residuos epiacutetopos corresponden a E13 S16-V19 y W21-
D31 Mientras tanto los anaacutelisis realizados por la aplicacioacuten Discotope 20 a la
secuencia aminoaciacutedica en su forma tridimensional indican que no se encontraron
residuos potencialmente epiacutetopos para ceacutelulas B ni se determinaron sitios de
alergenicidad
Tabla 5 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas B en LnqQ
Epiacutetopos EEEEEEEEEEEEEEEE
Secuencia lineal MAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIK
Estructura CCHHHHHHHHHHHHCCHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCC
Superficie EEEBEEBBEBBBEBEEEBBEBBBEEEEEBBEBBEBBBBBEBBBEEBEEEEEEE
La prediccioacuten fue resuelta en la aplicacioacuten BediPrep En la seccioacuten de epiacutetopos si la posicioacuten estaacute arriba de
05 entonces es marcado con una letra ldquoErdquo La aplicacioacuten anexa NetsurfP fue usada para la prediccioacuten
estructural a partir de secuencia lineal y se divide en tres categoriacuteas ldquoHrdquo para heacutelice ldquoErdquo para hoja y ldquoCrdquo para
cadena En la seccioacuten de superficie se divide en dos secciones ldquoBrdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el interior de la proteiacutena (burial) mientras que ldquoErdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el exterior de la proteiacutena (exposed)
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
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610 Prediccioacuten de alergenicidad
De acuerdo con el reporte realizado por la aplicacioacuten AllerCatPro la bacteriocina
LnqQ no posee elementos alergeacutenicos
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
6111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE fue seleccionado porque se ha demostrado que los
primeros 33 residuos de la α-amilasa (AmyE) de B subtilis pueden ser acoplados
a la regioacuten N-terminal a una proteiacutena de intereacutes para su produccioacuten periplaacutesmica
en ceacutelulas de E coli (R M Papi et al 2005)
En primer lugar descargamos la secuencia nucleotiacutedica de la AmyE desde la base
de datos de GenBank Despueacutes utilizamos los dos oligonucleoacutetidos reportados
por Papi y sus colaboradores (R M Papi et al 2005) que estaacuten modificados con
extremos overhangs Cada oligonucleoacutetido estaacute compuesto por un sitio de
restriccioacuten en su extremo 3rsquo-terminal que corresponden a NdeI y BamHI
respectivamente
En la aplicacioacuten SnapGene el archivo geneacutetico del AmyE fue abierto y sobre eacutesta
se incorporaron los dos oligonucleoacutetidos mencionados arriba despueacutes se corrioacute un
ensayo de PCR in silico para extraer el peacuteptido sentildeal N-AmyE de la amilasa El
producto in silico resultante corresponde a un tamantildeo 117 pb que estaacute ordenado
de la siguiente manera 5rsquo-NdeI-(N-AmyE)-BamHI-3rsquo
En la misma aplicacioacuten realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten con
el producto de PCR in silico y el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)dnardquo Desde la
aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten pET-30a(+) y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten NdeI y BamHI
Posteriormente el producto de PCR compuesto con los extremos overhangs fue
cortado tambieacuten con el mismo conjunto de enzimas de restriccioacuten y procedimos a
clonar creando un vector de expresioacuten El vector fue nombrado y guardado como
ldquopET-30a(+)-N-AmyEdnardquo
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6112 Disentildeo y construccioacuten de pETNL
En el extremo del peacuteptido sentildeal N-AmyE se le acoploacute la secuencia nucleotiacutedica de
la LnqQ por teacutecnicas de clonacioacuten molecular in silico Inicialmente el archivo
geneacutetico del gen lnqQ fue descargado (GenBank no AB2352011) y abierto en la
aplicacioacuten de SnapGene
A la secuencia nucleotiacutedica original de la lnqQ en el extremo 5rsquo-terminal
agregamos manualmente una secuencia que contiene el sitio de restriccioacuten BamHI
y riacuteo debajo de eacutesta agregamos un par de nucleoacutetidos (TT) Inmediatamente
despueacutes se colocoacute un codoacuten de inicio (ATG) y se antildeadieron los 52 residuos
restantes para un total de 53 de aminoaacutecidos que representan a LnqQ Justo en el
extremo C-terminal de esta bacteriocina se agregoacute una cola de polihistidina (H89-
H94) y un codoacuten de paro (TAG) En seguida se agregaron otro par de nucleoacutetidos
(TA) y se integroacute un sitio de restriccioacuten SalI Esta seccioacuten correspondioacute a un
fragmento lineal de 193 pb de la secuencia nucleotiacutedica que codifica para
LnqQ6xHis (Tabla 6)
Desde SnapGene realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten entre el
fragmento lineal de 193 pb con el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)N-AmyEdnardquo
Desde la aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten BamHI y SalI
Posteriormente el fragmento lineal fue cortado tambieacuten con el mismo conjunto de
enzimas de restriccioacuten y procedimos a clonar creando un vector de expresioacuten
nombrado y guardado como ldquopETNLdnardquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pETNL estaacute guardando en formato dna bajo el
nombre ldquopETNLdnardquo En este plaacutesmido se observan por los elementos geneacuteticos
propios de un vector pET30(a)+ en conjunto con los genes necesarios para la
construccioacuten N-AmyELnqQ
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Tabla 6 Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ (5rsquorarr3rsquo) Tamantildeo
pETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQL
LAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIKHH
HHHH
94
Los residuos subrayados representan el peacuteptido sentildeal Los residuos en negritas representan a LnqQ
6113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
Los resultados obtenidos del corte proteoliacutetico en el peacuteptido sentildeal N-AmyE fueron
contrastados con los datos de seis secuencias aminoaciacutedicas (Tabla 7) que teniacutean
el reporte de que este mismo peacuteptido sentildeal N-AmyE era cortado de manera
efectiva en cada una de ellas Tres de las secuencias corresponden a las
secuencias aminoaciacutedicas totales de tres α-amilasas reportadas en diferentes
cepas de B subtilis (Emori amp Maruo 1988 Kunst et al 1997 Yang et al 1983)
Dos de eacutestas corresponden a secuencias que se utilizaron para investigar queacute
aminoaacutecidos eran los necesarios para cortar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en ceacutelulas
de B subtilis o de E coli (Nakazawa et al 1986 Sakakibara et al 1993) La
uacuteltima corresponde a una construccioacuten sinteacutetica donde el peacuteptido sentildeal N-AmyE
fue utilizado para transportar liasa de pectina a la regioacuten periplaacutesmica de E coli (R
M Papi et al 2005)
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Tabla 7 Secuencias utilizadas para prediccioacuten de corte enzimaacutetico de N-
AmyELnqQ
Nombre Secuencia aminoaciacutedica
gtYang1983
(CAA234371)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPDDRRLRMEINSQSEKEIQFGKTYTIML
KGTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPAD
TDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtNakazawa1986
(PTUE33)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAQACPPETLVKVKDAEDQL
gtEmori1988
(CAA306431)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIEIRCNTFFQ
gtSakakibara1993
(PTUBE695)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASACAAPFNGTM
gtKunst1997
(NP_3881862)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPETAFKDGDQFTIGKGDPFGKTYTIMLK
GTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPADT
DTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtPapi2005 MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRIRMSYPESKLTGLTGFALAAKVTGGWAGPVVSITNLDQLKANIG
TVTPQVLVINSNISASSLTKVNMGANKTLIGSFQNRTLENIHLRATAQSQNIILQNLIFKHSANIKANDDIQVYLNY
GSKYWIDHCSFVGHSWSTTDGSEDKLLYIGEKADYATISNCFFGSHKYGLIFGHPADDNNAAFNGYPRLTLCHNRFD
NMEVRAPGLMRYGYFHVYNNYINKFHLGFTLAQNANILSESNYFGEGSQNNGMLDDKGSGTFTDTNSVPPITNQKSP
KAQWTATSNYAYTLKTAAQAKDFTQKNAGAQAAALVFGS
gtpETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWV
VSKIKQILGIKHHHHHH
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En las bacterias existen dos mecanismos generales para la secrecioacuten de
proteiacutenas a traveacutes de la membrana citoplasmaacutetica En la viacutea de Secrecioacuten General
denominada como viacutea Sec las proteiacutenas son translocadas a la membrana en su
forma desnaturalizada y posteriormente son plegados en forma nativa en el lado
transversal de la membrana Mientras tanto en la viacutea de Translocacioacuten de
Gemelos Argininas conocida como viacutea Tat las proteiacutenas son translocadas en su
estado plegado nativo (Natale Bruumlser amp Driessen 2008)
De acuerdo con nuestros resultados (Tabla 8) el valor de calculado de prediccioacuten
de corte de peacuteptido sentildeal de las secuencias aminoaciacutedicas completas de tres α-
amilasas representan 09724 (Yang et al 1983) 09458 (Emori amp Maruo 1988) y
09724 (Kunst et al 1997) respectivamente De las secuencias parciales de
peacuteptidos sentildeales N-AmyE los resultados indican 08722 (Nakazawa et al 1986) y
06092 (Sakakibara et al 1993) Para la secuencia que se utilizoacute para exportar la
liasa de pectina al periplasma de E coli el valor calculado correspondioacute a 08262
(R M Papi et al 2005) en todas estas secuencias el mecanismo de secrecioacuten
general de proteiacutenas es el tipo Sec clase I Para nuestra proteiacutena N-AmyELnqQ
el valor calculado estimado fue de 04063 sin que fuera determinado su
mecanismo de corte predictivo Es decir nuestro valor calculado es mucho menor
a lo observado contra secuencias que habiacutean sido probados experimentalmente
Tabla 8 Prediccioacuten de corte enzimaacutetico de peacuteptido sentildeal N-AmyE
Identificacioacuten Prediccioacuten SecSPI TatSPI SecSPII Otro Pos
gtYang1983 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtNakazawa1986 SP(SecSPI) 08722 00359 00229 0069 33 y 34
gtEmori1988 SP(SecSPI) 09458 00122 0009 0033 33 y 34
gtSakakibara1993 SP(SecSPI) 06092 00428 01377 02103 31 y 32
gtKunst1997 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtPapi2005 SP(SecSPI) 08262 00183 00178 01377 31 y 32
gtpETNL Otro 04063 00249 00134 05554 Otro
SecSPI Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal I (Lep) TatSPI Translocoacuten Tat mediado por
Peptidasa de Sentildeal I (Lep) SecSPII Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal II (Lsp) Pos Sitio de
corte enzimaacutetico dentro de la estructura aminoaciacutedica lineal
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612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
6121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo geneacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP estaacute guardado en formato dna
bajo el nombre ldquopET30a-SmbPdnardquo y estaacute flanqueado en el extremo 5rsquo-terminal
por el sitio de restriccioacuten NdeI y en el extremo 3rsquo-terminal por el sitio de restriccioacuten
NcoI El peacuteptido de fusioacuten estaacute dividido en dos secciones en el extremo N-terminal
estaacute compuesta por la regioacuten citoplasmaacutetica de la SmbP (SmbP) compuesta por
94 residuos seguido de dos residuos G95 y T96 riacuteo abajo inicia el extremo C-
terminal que estaacute compuesta por cinco residuos y representa al sitio de corte por
enteroquinasa (DDDDK)
6122 Disentildeo y construccioacuten de pSmbP-LnqQ
El archivo geneacutetico que contiene la bacteriocina LnqQ fue descargado de la base
de datos (GenBank no AB2352011) Inmediatamente en el extremo C-terminal
del peacuteptido de fusioacuten mediante la aplicacioacuten SnapGene antildeadimos manualmente
un residuo de alanina en la posicioacuten 102 y riacuteo debajo de eacutesta antildeadimos los 53
residuos que conforman el LnqQ iniciando con M103 En direccioacuten al extremo C-
terminal inmediatamente despueacutes del codoacuten de teacutermino (TAA) se agregoacute el sitio
de restriccioacuten XhoI Los elementos que componen la construccioacuten del pSmbP-
LnqQ (Tabla 9) estaacuten representados en el siguiente orden 5rsquo-NdeI-SmbP-DDDDK-
LnqQ-XhoI-3rsquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pSmbP-LnqQ estaacute guardado en formato dna bajo
el nombre ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01dnardquo En este plaacutesmido se observan por los
elementos geneacuteticos propios de un vector pET30(a)+
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 73
Tabla 9 Secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica del producto del vector de
expresioacuten (5rsquorarr3rsquo)
Tamantildeo
pSmbP-LnqQ MSGHTAHVDEAVKHAEEAVAHGKEGHTDQLLEHAKESLTHAKAAS
EAGGNTHVGHGIKHLEDAIKHGEEGHVGVATKHAQEAIEHLRASE
HKSHGTDDDDKAMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWL
NAGQAIDWVVSKIKQILGIK
155
Los residuos subrayados representan el peacuteptido de fusioacuten Los residuos resaltados representan el sitio de
corte de enteroquinasa Los residuos en negritas representan a LnqQ
6123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten de PeptideCutter se detectoacute un
uacutenico sitio de corte en la proteiacutena SmbP-LnqQ para la enzima enteroquinasa que
se encuentra ubicado en el residuo K101 lo cual coincide con lo esperado
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Los resultados sobre la identificacioacuten de codones de paro post disentildeo en la
construccioacuten de pETNL y pSmbP-LnqQ indicaron que no existe evidencia de
codones de paro ya que la aplicacioacuten en liacutenea logroacute identificar un marco de lectura
abierto con un tamantildeo de 285 pb que codifican para 94 aminoaacutecidos cuya
secuencia coincide con exactitud con la secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
para el caso de pETNL Mientras tanto un marco de lectura compuesto por un
tamantildeo molecular de 488 pb que se traducen para 155 aminoaacutecidos y cuya
secuencia coincide en su totalidad con la secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
De acuerdo con los resultados calculados por la aplicacioacuten de Compute pIMw tool
de ExPasy el peso molecular teoacuterico estimado del producto N-AmyELnqQ de
pETNL es de 1053468 Da con un punto isoeleacutectrico pi = 1063 mientras que para
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 74
el producto SmbP-LnqQ de pSmbP-LnqQ el peso estimado es de 1669771 Da
con punto isoeleacutectrico pI = 645
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
Seguacuten los resultados los iacutendices de solubilizacioacuten (Tabla 10) de N-AmyELnqQ y
del SmbP-LnqQ es de 0575 y 0865 respectivamente La aplicacioacuten sin embargo
clasifica a los productos del vector pETNL como invaacutelidos mientras que los
productos de pSmbP-LnqQ fueron considerados como solubles La razoacuten porque
la N-AmyELnqQ es considerado como invaacutelido se debe a que fue identificado
como proteiacutena de membrana En el caso de localizacioacuten celular (Tabla 11) los
pronoacutesticos indican que los productos producidos por pETNL y pSmbP-LnqQ se
encontraraacuten en membrana plasmaacutetica y en el citoplasma respectivamente
Tabla 10 Prediccioacuten de solubilidad N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Iacutendice Solubilidad
N-AmyELnqQ 0575 Invaacutelido
SmbP-LnqQ 0865 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice de solubilidad superior
a 045 es porque son considerados proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
Tabla 11 Prediccioacuten de localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Valor Localizacioacuten subcelular
N-AmyELnqQ 085 Membrana plasmaacutetica
SmbP-LnqQ 07 Citoplasma
Esto coincide con lo observado en los antecedentes ya que indican que las
proteiacutenas expresadas en E coli con el peacuteptido sentildeal N-AmyE en su regioacuten N-
terminal a menudo se localizan en el periplasma (Nakazawa et al 1986 R M
Papi et al 2005) Mientras que las proteiacutenas acopladas con el peacuteptido de fusioacuten
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 75
SmbP son reportadas para encontrarse en la regioacuten citoplasmaacutetica debido a que la
seccioacuten aminoaciacutedica que las orienta al periplasma fue removida de la secuencia
original de residuos quedaacutendose por tanto en el citoplasma celular de E coli
(Vargas-Cortez et al 2016)
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
El modelo estructural tanto en su forma secundaria (Figura 6) como tridimensional
(Figura 8) para N-AmyELnqQ asiacute como la presunta estructura secundaria (Figura
7) y tridimensional (Figura 10) para SmbP-LnqQ fueron revelados en este
documento En la estructura secundaria prevista para N-AmyELnqQ se espera
que el 96 de la secuencia esteacute compuesta por estructuras tipo α-heacutelices y se
estima que el 17 de la secuencia aminoaciacutedica total esteacuten embebidas en la
regioacuten transmembranal La evidencia predictiva de la N-AmyELnqQ (Figura 9) a
traveacutes de la aplicacioacuten Phyre2 indicoacute que los primeros 12 residuos del extremo N-
terminal estariacutean orientados en la regioacuten extracelular mientras que los residuos 15
al 30 estariacutean ubicados en regioacuten intermembranal entre el espacio extracelular y la
citoplasmaacutetica El resto de los residuos del extremo C-terminal estariacutean orientados
en la cara citoplasmaacutetica de la ceacutelula de E coli Mientras tanto la estructura
secundaria putativa para SmbP-LnqQ indica que el 85 de secuencia total estaacute
compuesta por α-heacutelices
En las estructuras tridimensionales putativas tanto para N-AmyELnqQ como en la
SmbP-LnqQ prevalece la formacioacuten de cuatro α-heacutelices Estos motivos
estructurales tipo α-heacutelices son comuacutenmente observados en bacteriocinas
similares a LnqQ (Lynch et al 2019) de manera que podemos predecir que la
estructura secundaria y tridimensional de la LnqQ no se ve afectada cuando estaacuten
acopladas tanto por N-AmyE como con SmbP
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 76
Figura 6 Prediccioacuten de la estructura secundaria de N-AmyELnqQ
La estructura secundaria predicha del N-AmyELnqQ en Phyre2
Figura 7 Prediccioacuten de la estructura secundaria de SmbP-LnqQ
La estructura secundaria putativa del SmbP-LnqQ en Phyre2
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 77
Figura 8 Prediccioacuten de estructura tridimensional de N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de N-
AmyELnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones
propuestas por modelo son de (Å) X29824 Y24988 Z25496
Figura 9 Prediccioacuten de heacutelices transmembranales para N-AmyELnqQ
La imagen es resultado de la prediccioacuten propuesta por Phyre2 para heacutelices transmembranales de N-
AmyELnqQ
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Figura 10 Prediccioacuten de estructura tridimensional de SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de SmbP-
LnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones propuestas
por modelo son de (Å) X32655 Y24988 Z25496
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
6171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Las ceacutelulas presuntamente transformadas fueron seleccionadas con kanamicina
De acuerdo con la evidencia presentada (Figura 11) los controles experimentales
cumplieron con su objetivo ya que no se registroacute crecimiento en placas de LB agar
esteacuteriles en el control negativo (Figura 11 a) en cuanto al control de viabilidad
eacuteste demostroacute que la electroporacioacuten no fue un factor significativo que causara la
muerte de ceacutelulas de E coli DH5α como BL21 (DE3) (Figura 11 b c) Por uacuteltimo
los controles con antibioacutetico demostraron que la kanamicina (50 microgml) era lo
suficientemente potente para seleccionar ceacutelulas (Figura 11 d e) Por uacuteltimo
demostramos bajo la teacutecnica de electroporacioacuten que las cepas de ceacutelulas de E
coli tanto BL21 (DE3) como DH5α fueron correctamente transformadas con los
vectores de expresioacuten pETNL (Figura 11 f g) pET30(a)+ (Figura 11 h j) y
pSmbP-LnqQ (Figura 11 i k) Los ensayos fueron realizados por triplicado
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Figura 11 Transformacioacuten de E coli DH5α y BL21 (DE3) con pET30a(+)
pETNL y pSmbP-LnqQ
Roacutetulo Descripcioacuten
a Control negativo
b Control viabilidad DH5α
c Control viabilidad BL21 (DE3)
d Control kanamicina + DH5α
e Control kanamicina + BL21 (DE3)
f DH5α + pETNL
g BL21 (DE3) + pETNL
h DH5α + pET30a(+)
i DH5α + pSmbP-LnqQ
j BL21 (DE3) + pET30a(+)
k BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ
Las placas rotuladas del a-c son placas LB con agar mientras que las placas d-k son placas LB
con agar suplementadas con kanamicina (50 microgml concentracioacuten final)
80
6172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Los ensayos para la extraccioacuten y purificacioacuten de los plaacutesmidos pET30(a)+ pETNL
y pSmbP-LnqQ de ceacutelulas de E coli que fueron observados en un gel de agarosa
1 (pv) Seguacuten la evidencia (Figura 12) nuestros controles demuestran que
tanto el plaacutesmido pETNL como el vector pSmbP-LnqQ se encontraban presentes
Los iacutendices de concentracioacuten y calidad de cada uno de los vectores fueron para
pET30(a)+ de 911 ngmicrol con A260A280 en 195 para el vector pETNL de 532 ngmicrol
con A260A280 en 194 y para el vector pSmbP-LnqQ de 2861 ngmicrol con A260A280 en
188 Seguacuten la literatura los iacutendices para considerar a un DNA plasmiacutedico como
puro deben tener valores espectrofotomeacutetricos de A260A280 entre 18-20 donde un
valor menor a 18 se considera como contaminacioacuten con proteiacutenas y un valor de
superior a 20 se considera contaminacioacuten por RNA (Koetsier Cantor amp Biolabs
sf) Podemos inferir que los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron recuperados en buena cantidad con un buen iacutendice de pureza
Figura 12 Gel de agarosa con plaacutesmidos
pETNL y pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer
TBE 1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Plaacutesmido pETNL
3 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
4 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli
BL21 (DE3) transformados con los vectores
de expresioacuten pETNL o pSmbP-LnqQ
El marcador de peso molecular corresponde
a 100-5000bp DNA Marker Plus Ready to
Use (Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
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6173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Seguacuten los resultados obtenidos por OligoAnalyzer Tool tras ajustar las
condiciones de los oligonucleoacutetidos a las especificaciones del fabricante del kit de
la polimerasa el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 promoter primer es de
20 pb con un contenido GC a 40 y un valor Tm = 591degC con un hairpin de -036
kcalmol a una Tm de 316degC y un valor homodiacutemero de -416 kcalmol Mientras
tanto el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 terminal primer es de 19 pb con
un contenido GC a 526 y un valor Tm = 61degC con un hairpin de 002 kcalmol a
una Tm de 248degC y un valor homodiacutemero de -474 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten NetPrimer el oligonucleoacutetido T7
promoter primer tiene un rating de eacutexito en 860 y presenta un valor de estabilidad
en su extremo 3rsquo-terminal de -87 kcalmol y no se identificoacute al hairpin el valor
homodiacutemero se registroacute en -759 kcalmol En el caso del oligonucleoacutetido T7
terminal primer este presenta un rating de eacutexito en 870 con un valor de
estabilidad en su extremo 3rsquo-terminal de -1142 kcalmol y tampoco se identificaron
hairpins el valor homodiacutemero se registroacute en -574 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los criterios habituales para seleccioacuten de oligonucleoacutetidos ambos
se mantuvieron en los estaacutendares ya que presentaron un tamantildeo entre 18 a 25 pb
con un hairpin cuyo valor de Tm fue menor a la Tm reportado para el
oligonucleoacutetido y los valores tanto de los homodiacutemeros y heterodiacutemeros nunca
fueron maacutes negativo o iguales a -9 kcalmol
En cuanto al caacutelculo de la Ta para ambos oligonucleoacutetidos utilizamos la regla
general de sustraer 5degC al Tm calculado para en ambos oligonucleoacutetidos Para el
caacutelculo de la Ta oacuteptimo para un par de oligonucleoacutetidos para un blanco en
particular se utilizoacute la siguiente foacutermula matemaacutetica TaOpt = 03 times (Tm de oligo) +
07 times (Tm producto) minus 149 donde el valor de Tm del oligonucleoacutetido es la
temperatura de fusioacuten del oligonucleoacutetido menos estable y la Tm es el valor del
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temperatura de fusioacuten del producto de PCR (Rychlik Spencer amp Rhoads 1990)
De esta manera promediamos el valor de la Tm de ambos oligonucleoacutetidos y el
resultado fue 60degC A este valor le sustrajimos 5degC para un Ta ajustado en 55degC
en los ensayos de PCR punto final para la identificacioacuten de los plaacutesmidos
Por uacuteltimo calculamos el total de ciclos y el tiempo de extensioacuten para los ensayos
de PCR punto final De acuerdo con las especificaciones del fabricante se debe
agregar 1 minuto por cada kb por sintetizar en los ensayos De esta manera
calculamos en primera instancia el tamantildeo molecular de los productos de los
ensayos de PCR de los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
para determinar el tiempo de extensioacuten Para lograr este objetivo realizamos una
reaccioacuten in silico de PCR punto final entre los dos oligonucleoacutetidos T7 con cada
uno de los vectores de expresioacuten utilizados
Los archivos geneacuteticos de los tres vectores de expresioacuten fueron abiertos desde la
aplicacioacuten de SnapGene y ejecutamos una PCR punto final in silico
Posteriormente corrimos una simulacioacuten de gel de agarosa al 1 De acuerdo con
los resultados de nuestra simulacioacuten (Figura 13) las bandas esperadas de los
productos lineales de PCR de los vectores de pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
se encontrariacutean entre 367 pb 488 pb y 651 pb respectivamente Con esto
confirmamos que ninguno de los productos de PCR esperados tendriacutea un tamantildeo
superior al 1 kb y procedimos a configurar la reaccioacuten para el ensayo de PCR
punto final
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Figura 13 Simulacioacuten de PCR para
vectores de expresioacuten
Gel de agarosa 10 generado desde
SnapGene
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Producto PCR de pET-30a(+)
2 Producto PCR de pETNL
3 Producto PCR de pSmbP-LnqQ
Las bandas corresponden a productos lineales
de PCR
El marcador de peso molecular in silico
corresponde a PCR DNA Ladder de GenScript
(Cat En desuso Estados Unidos) y fue tomado
desde la aplicacioacuten de SnapGene versioacuten 113
Asiacute pues configuramos las condiciones de corrida en el termociclador las cuales
fueron registradas de la siguiente manera una desnaturalizacioacuten inicial a 94degC por
180 s despueacutes 30 ciclos de desnaturalizacioacuten alineamiento y extensioacuten con
temperaturas en 94degC 55degC y 72degC respectivamente y sus respectivos tiempos de
reaccioacuten a 30 s 45 s y 30 s Finalmente se agregoacute una etapa de extensioacuten final
con una temperatura a 72degC por 420 s
6174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Despueacutes de realizar la teacutecnica de PCR punto final y una posterior corrida en un gel
de agarosa al 1 con buffer TBE 1X observamos una banda con tamantildeo de 367
pb para el producto de PCR obtenida del vector pET30(a)+ al tiempo que
recolectamos una banda de 488 pb para el producto de PCR del vector pETNL
(Figura 14) y finalmente encontramos una banda de 651 pb para el producto de
PCR del vector pSmbP-LnqQ (Figura 15) Dado que los valores predichos en la
simulacioacuten coinciden con los observado experimentalmente confirmamos que
nuestras cepas de E coli estaban efectivamente transformadas con su respectivo
vector de expresioacuten
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Figura 14 PCR de pETNL
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 PCR de pET30(a) virgen
3 PCR de pETNL
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
Figura 15 PCR de pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Control positivo pET30(a) vaciacuteo
3 Control positivo pETNL
4 Control negativo PCR pUC57-DPQ
5 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
6 Control negativo PCR pUC57-DPQ
7 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
Para los anaacutelisis de expresioacuten de proteiacutenas utilizamos algunos vectores de
expresioacuten que han sido exitosos en la produccioacuten de proteiacutenas Los vectores
pET30a-SmbP_LL-37 y pET30a-SmbP_MP1106 fueron amablemente compartidos
por David Antonio Peacuterez miembro del grupo de investigacioacuten PEP con sede en la
Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la UANL
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(Monterrey Nuevo Leoacuten) Similarmente el vector pET30NP-Hoc fue compartido
por Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros miembro del grupo de investigacioacuten
NBR con sede en el CIBYN (Apodaca Nuevo Leoacuten)
Dado que la informacioacuten de los tres plaacutesmidos se encuentra o se encontraba en
estado de revisioacuten al momento de redactar este documento por sus respectivos
comiteacutes de revisioacuten solo podemos limitarnos a mencionar los pesos moleculares
de los productos de cada vector de expresioacuten Para los dos vectores de David
Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) el peso molecular estimado de
ambos productos es 15 kDa mientras que el vector de Francisco Balderas el peso
molecular de su producto es de 95 kDa (F Balderas comunicacioacuten personal
2021)
6181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Para la induccioacuten por IPTG seguimos los protocolos preestablecidos para la
induccioacuten de proteiacutenas heteroacutelogas en ceacutelulas de E coli En nuestro ensayo la
concentracioacuten de IPTG elegida para la induccioacuten de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
correspondioacute a 01 mM Nosotros utilizamos esta concentracioacuten debido a que los
reportes indican que esta concentracioacuten es lo suficiente para saturar la reaccioacuten
bioloacutegica evitando la toxicidad celular por este compuesto (Malakar amp Venkatesh
2012) Los valores tiacutepicos de IPTG maacutes utilizados para la induccioacuten usualmente se
encuentran entre 05 mM y 10 mM (Mesa-Pereira et al 2018)
En nuestros cultivos el IPTG fue antildeadido en la fase exponencial tardiacutea (OD600 =
04-06) dado que el costo energeacutetico es maacutes alto durante la fase exponencial
temprana que en la tardiacutea (Malakar amp Venkatesh 2012) Ademaacutes se presume que
en esta fase el total de proteiacutenas producidas pueden alcanzar rendimientos
productivos superiores a 350 (Larentis et al 2014) Para nuestros ensayos
utilizamos dos temperaturas para inducir 37degC y 25degC y la razoacuten de utilizar una
temperatura maacutes baja es porque es un meacutetodo habitual para incrementar la
solubilidad de proteiacutenas recombinantes en E coli (Schein 1989)
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6182 SDS-PAGE de proteiacutenas periplaacutesmicas de E coli modificadas
con pETNL
Nuestros estudios preliminares bioinformaacuteticos indicaban que la proteiacutena N-
AmyELnqQ seriacutea insoluble (Tabla 10) y que tanto por sus antecedentes
(Nakazawa et al 1986 R M Papi et al 2005 Sjoumlstroumlm et al 1987) por sus
caracteriacutesticas moleculares estariacutea presuntamente ubicada en la regioacuten
periplaacutesmica de E coli (Tabla 11) Sin embargo nuestros resultados por ensayos
de SDS-PAGE indicaron que la induccioacuten por IPTG en ceacutelulas de E coli BL21
(DE3) transformados con el vector pETNL para la produccioacuten de N-AmyELnqQ
tanto en la fraccioacuten soluble como insoluble de proteiacutenas a una temperatura de
induccioacuten 25degC (Figura 16) como a 37degC (Figura 17) en la fraccioacuten periplaacutesmica
no fue posible en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) esta manifestacioacuten fue reportado
en muacuteltiples ocasiones De acuerdo con nuestros resultados no logramos
determinar la presencia de bandas de proteiacutenas en la regioacuten esperada que seguacuten
los anaacutelisis predictivos la proteiacutena N-AmyELnqQ debiacutea tener un peso molecular
cercano a 105 kDa
Es de mencionar que el valor de prediccioacuten de corte de peacuteptido sentildeal de la
proteiacutena N-AmyELnqQ fue muy inferior a los valores de prediccioacuten observados en
secuencias que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y que habiacutean sido previamente
validados experimentalmente (Tabla 8) Otro aspecto para considerar es que los
residuos reconocidos para el corte enzimaacutetico difieren entre los diferentes tipos de
bacterias (Nakazawa et al 1986) Esto quedoacute demostrado cuando observamos
que los residuos utilizados para el corte de este peacuteptido sentildeal podiacutean diferir
inclusive en el mismo tipo de bacteria Por ejemplo en la secuencia total de
aminoaacutecidos de la α-amilasa reportada por Yang y otros (Yang et al 1983) Emori
y otros (Emori amp Maruo 1988) y Kunst y otros (Kunst et al 1997) los residuos
observados corresponden al 33 y 34 mientras que para las secuencias de
aminoaacutecidos a los que se les fue acoplado el peacuteptido sentildeal en su regioacuten N-terminal
como las reportadas por Sakakibara y otros (Sakakibara et al 1993) y Papi y
otros (R M Papi et al 2005) los residuos de corte se ubicaron en la posicioacuten 31 y
32
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Figura 16 Gel de E coli BL21 (DE3) con pETNL inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
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Figura 17 Gel de E coli BL21 (DE3) pETNL inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
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6183 SDS-PAGE de proteiacutenas citoplaacutesmicas de E coli modificadas
con pSmbP-LnqQ
Los estudios preliminares predictivos para la produccioacuten heteroacuteloga de SmbP-
LnqQ en E coli indicaban que la presencia del peacuteptido de fusioacuten SmbP
aumentariacutea la solubilidad de la proteiacutena recombinante solubilidad (Tabla 10) y que
ademaacutes seriacutea localizado en el citoplasma celular (Tabla 11) con un peso
molecular aproximado de 167 kDa Nuestros resultados por ensayos de SDS-
PAGE indicaron que no hubo produccioacuten citoplasmaacutetica de una banda esperada
de 15 kDa tras inducir con IPTG a ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) transformados
con el vector pSmbP-LnqQ para la produccioacuten del peacuteptido SmbP-LnqQ tanto a
25degC como 37degC (Figura 18) Estos ensayos fueron realizados por triplicado
Esto nos orilloacute a plantearnos dos posibilidades con relacioacuten a la proteiacutena SmbP-
LnqQ la primera era que pudiera presentar problemas por plegamiento durante su
produccioacuten en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) y que la segunda fuera problemas
internos relacionados al IPTG Para demostrar la primera hipoacutetesis transformamos
ceacutelulas de E coli Origami con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ y utilizamos el
vector pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo este vector seguacuten su autor
produce una proteiacutena de un tamantildeo de 15 kDa en ceacutelulas de E coli Origami
debido a que es una proteiacutena problemaacutetica (datos no publicados) Nuestra
evidencia (Figura 19) sentildeala que el IPTG no es causa probable de la nula
produccioacuten debido a que se observoacute una banda muy definida en la regioacuten de los
15 kDa para las bacterias transformadas con el vector terminacioacuten MP1106 que
habiacutean sido inducidas por IPTG tanto a 25degC como 37degC Tampoco se observoacute
que la cepa Origami contuviera un factor bioloacutegico no considerado en la cepa
BL21 (DE3) que pudiera agilizar la produccioacuten de la proteiacutena SmbP-LnqQ ya que
no encontramos ninguna banda de un tamantildeo de 15 kDa en las ceacutelulas Origami
transformados
Ante los resultados previos consideramos posibilidad de que el problema se
encontrara especiacuteficamente en la cepa de E coli (DE3) presente en nuestro
laboratorio Para demostrar este punto procedimos a transformarla la cepa con el
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 90
vector de expresioacuten pET30NP-Hoc para fines de control positivo para nuestro
experimento Seguacuten su autor este vector de expresioacuten produce una proteiacutena lineal
de 95 kDa al inducirse por IPTG a 1 mM (datos no publicados) Nuestros
resultados en el gel SDS-PAGE muestran una banda de proteiacutenas extraiacutedas de E
coli transformados pET30NP-Hoc en la seccioacuten de 95 kDa y es producido tanto a
37degC (Figura 20) como a 25degC (Figura 21) Sin embargo no pudimos observar
ninguna banda sobre expresada de 10 kDa para las BL21 (DE3) transformadas
con pETNL ni una banda tampoco de 15 kDa para las bacterias transformadas con
pSmbP-LnqQ De esta manera descartamos la idea que existiera un problema
bioloacutegico procedente en la cepa de E coli BL21 (DE3) mantenida en nuestro
laboratorio
Se conoce que la bacteriocina LnqQ ya ha sido sujeta a modificaciones geneacuteticas
para incrementar su produccioacuten al ser clonada y expresada con eacutexito con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) registraacutendose
rendimientos hasta de 130 mg por litro de cultivo bacteriano (Ma et al 2012) Ante
la ausencia de una banda de proteiacutenas en la regioacuten de 15 kDa en nuestro vector
de expresioacuten con peacuteptido de fusioacuten SmbP-LnqQ se ha comentado que no existen
razones para suponer que todas las etiquetas de fusioacuten son aptas para todo tipo
de necesidades ya que es casi imposible determinar cuaacutel es el peacuteptido de fusioacuten
oacuteptimo para la produccioacuten Sin embargo una de las ventajas de utilizar peacuteptidos
de fusioacuten reconocidos es que son reconocidos sus ventajas y desventajas ya que
en algunos casos algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la solubilidad
de las proteiacutenas tales como TRX MBP NusA etc pero otros peacuteptidos sentildeales no
incrementan la solubilidad de la proteiacutena de intereacutes como GST BAP etc Incluso
algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la carga metaboacutelica en la ceacutelula
como GST MBP y NusA (Waugh 2005)
A pesar del buen registro experimental disponible sobre construcciones que
contienen el peacuteptido de fusioacuten SmbP (Vargas-Cortez et al 2016) suponemos en
nuestro caso en particular que dada las limitaciones de su corto historial
experimental auacuten no existe informacioacuten que determine las ventajas y desventajas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 91
pertinente al peacuteptido de fusioacuten SmbP para observar si son viables para la
produccioacuten solubilidad yo purificacioacuten de maacutes tipos de bacteriocinas
Figura 18 Gel de E coli BL21 (DE3) pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3)+ pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3) transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
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Figura 19 Gel de E coli Origami pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli Origami transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
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Figura 20 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 37degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 37degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 37degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 37degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 37degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 37degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 37degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 37degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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Figura 21 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 25degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 25degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 25degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 25degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 25degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 25degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 25degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 25degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de
proteiacutenas
Seguacuten el anaacutelisis fisicoquiacutemico de las secuencias aminoaciacutedicas que fueron
utilizadas en las construcciones para N-AmyE (Tabla 12) todas son de gran
tamantildeo y de alto peso molecular este peacuteptido se ha reportado para la
sobreexpresioacuten de AmyE en E coli (Nakazawa et al 1986) Asiacute como para la
sobreexpresioacuten de una regioacuten de 39 kDa que codifica para una regioacuten N-terminal
de una liasa de pectina (Pnl) en E coli (R Papi amp Kyriakidis 2003) a la fecha no
hemos visto alguacuten reporte de que este peacuteptido sentildeal haya sido utilizado para
producir proteiacutenas de bajo peso molecular
Por otro lado las secuencias que fueron exitosamente producidos con peacuteptido de
fusioacuten SmbP (Tabla 14) tambieacuten han mostrado ser uacutetil para producir proteiacutenas de
alto peso molecular o peacuteptidos de bajo peso molecular con actividad
antimicrobiana como VpDef (Montfort-Gardeazabal Claudio Casillas-Vega amp
Zarate 2020) Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al 2021) y muy recientemente LL-
37 (Perez-Perez et al 2021) el peacuteptido de fusioacuten tambieacuten ha demostrado ser
exitoso para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas de alto peso molecular como GFP y
RFP (Vargas-Cortez et al 2016) De esta manera consideramos que tanto el
tamantildeo como el peso molecular no son factores que intervengan durante el
proceso sobreproduccioacuten mediado tanto N-AmyE como con SmbP El punto
isoeleacutectrico tampoco parece ser un factor importante ya que el valor de AmyE es
aacutecido (561) mientras que Pnl es baacutesico (877) Situacioacuten similar sucede entre los
peacuteptidos microbianos puesto que VpDef es ligeramente aacutecido (686) en cambio el
resto de los peacuteptidos (Bin1b 949 LL-37 1061) son baacutesicos similar a LnqQ
Sin embargo observamos que tanto el iacutendice alifaacutetico (AI) como los valores del
iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) siacute son diferentes entre los distintos tipos de
peacuteptidos antimicrobianos Individualmente el valor AI de LnqQ es de 12115
(Tabla 12) y es superior al resto de los demaacutes peacuteptidos antimicrobianos con una
media de 5363 plusmn 3321) El valor AI para N-AmyELnqQ es de 11947 (Tabla 13) y
para SmbP-LnqQ es de 8323 (Tabla 15) respectivamente
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Tabla 12 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con N-AmyE
ID AmyE Pnl LnqQ
L 627 316 53
MW 6929711 3448665 589810
pI 561 877 1010
R(-) 69 21 2
R(+) 55 25 8
AI 6694 7636 12115
GRAVY -0648 -0291 +0300
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 13 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con N-AmyE
ID N-AmyEAmyE N-AmyEPnl N-AmyELnqQ
L 660 360 94
MW 7279942 3947961 1053468
pI 588 922 1063
R(-) 69 22 2
R(+) 58 30 12
AI 6982 8061 11947
GRAVY -0553 -0205 +0426
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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Tabla 14 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID VpDef Bin1b LL-37
L 49 45 37
MW 543498 520906 449332
pI 686 949 1061
R(-) 6 3 5
R(+) 6 9 11
AI 2388 4756 8946
GRAVY -0996 -0571 -0724
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 15 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID SmbP-VpDef SmbP-Bin1b SmbP-LL-37 SmbP-LnqQ
L 152 148 140 155
MW 1630268 1607675 1536102 1669471
pI 594 648 645 645
R(-) 26 23 25 22
R(+) 16 19 21 18
AI 5086 5878 1828 8323
GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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En cuanto al iacutendice de hidrofobicidad LnqQ mostroacute un valor GRAVY positivo
(+0300) mientras que el resto de los peacuteptidos antimicrobianos donde el valor
GRAVY promedio era de -073 plusmn 019 No es de sorprender que las bacteriocinas
del subgrupo de la familia de las aureocinas similares a A53 como LnqQ
aureocina A53 lacticina Z epidermicina NI01 lactolisterina BU y BHT-B tengan
valores GRAVY positivos (Perez Zendo amp Sonomoto 2018) Sin embargo cuando
LnqQ estaacute acoplado a N-AmyE el valor GRAVY se vuelve auacuten maacutes positivo con
+0426 (Tabla 13) y cuando estaacute fusionado con SmbP el valor GRAVY cambia a -
0514 (Tabla 15)
La literatura menciona que un peacuteptido o proteiacutena presenta un valor GRAVY
positivo debe considerarse como hidrofoacutebica mientras que un valor GRAVY
negativo significa que la proteiacutena es hidrofiacutelica (Kyte amp Doolittle 1982) De manera
que proteiacutenas con valores GRAVY negativos indican que la proteiacutena presenta una
estructura globular (hidrofiacutelicos) mientras que proteiacutenas con valores GRAVY
positivos indican la posibilidad que la proteiacutena guarde alguna relacioacuten con la
membrana (hidrofoacutebicos) (Enany 2014)
El valor GRAVY es considerado como el factor que maacutes influye en la movilidad de
las proteiacutenas en los geles de SDS-PAGE una proteiacutena con un valor GRAVY
negativo tiende a migrar maacutes lento que las proteiacutenas con valores positivos en los
geles para proteiacutenas (Shirai et al 2008) Las unioacuten de las moleacuteculas de SDS con
las proteiacutenas se produce a traveacutes de los aminoaacutecidos hidrofoacutebicos (Robinson amp
Tanford 2002) algunas estructuras hidrofoacutebicas son capaces de unir moleacuteculas
SDS hasta en un rango desde 34 a 10 g de SDS por 1 g de proteiacutena lo que
influiriacutea en una migracioacuten electroforeacutetica anoacutemala en los geles de SDS-PAGE
(Rath Glibowicka Nadeau Chen amp Deber 2009) LnqQ es una proteiacutena globular
(Acedo et al 2016) que utiliza la membrana especiacuteficamente para atacar
(Yoneyama Imura Ohno et al 2009) con lo que suponemos que el iacutendice de
hidrofobicidad pudiera estar afectando en el comportamiento electroforeacutetico de las
proteiacutenas Sin embargo tambieacuten la literatura sugiere que el comportamiento
anoacutemalo en las proteiacutenas de membrana en los geles de SDS-PAGE pudiera no
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 99
necesariamente relacionado a la carga neta de la proteiacutena ni a su iacutendice de
hidrofobicidad (Rath amp Deber 2013)
Al evaluar individualmente a LnqQ a traveacutes la escala Kyte-Doolittle observamos
que el peacuteptido posee dos secciones hidrofoacutebicas que se encuentran
aproximadamente entre los extremos del peacuteptido (entre residuos 5 al 15 y del 31 al
49) representando el 60 del total de la secuencia de LnqQ es hidrofoacutebica
(Figura 22) Si LnqQ estaacute acoplada con N-AmyE se observan las dos regiones
hidrofoacutebicas (entre residuos 9-50 y 66-85) que representa que el 6860 del total
de la secuencia sea hidrofoacutebica (Figura 23) Mientras tanto SmbP retiene sus dos
regiones hidrofoacutebicas que se ubican hacia la regioacuten C-terminal entre los residuos
103-117 y 133-151 componiendo el 2313 de total de la secuencia (Figura 24)
Dado que existe un reporte de produccioacuten exitosa entre la LnqQ acoplada con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO (Ma et al 2012) decidimos evaluar su valor AI GRAVY
y su escala Kyte-Doolittle Seguacuten los resultados de ProtParam para SUMO-LnqQ
los valores AI y GRAVY son de 8337 y -0516 respectivamente los cuales son
similares a lo reportado para SmbP-LnqQ Por otro lado seguacuten la escala Kyte-
Doolittle cinco regiones hidrofoacutebicas fueron descritas a lo largo de toda la
construccioacuten y estaacuten aproximadamente repartidas en toda la estructura lineal
entre los residuos 16-18 53-70 87-91 119-134 y 150-168 lo que representa el
28 del total de la secuencia (Figura 25) El valor GRAVY positivo y el alto
porcentaje de residuos hidrofoacutebicos para N-AmyELnqQ nos permite suponer que
estaacute proteiacutena se encontrariacutea anclada en la membrana celular lo que dificultariacutea su
solubilizacioacuten en los geles de proteiacutenas
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Figura 22 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la LnqQ
Figura 23 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de N-AmyELnqQ
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 10 20 30 40 50 60
Valo
r
Posicioacuten
LnqQ
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
N-AmyELnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 101
Figura 24 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SmbP-LnqQ
Figura 25 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SUMO-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SUMO-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Va
lor
Posicioacuten
SmbP-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Va
lor
Posicioacuten
SUMO-LnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 102
Ante la ausencia de una respuesta objetiva que explique la ausencia de bandas de
SmbP-LnqQ en los ensayos analizamos el perfil de aminoaacutecidos y detectamos
que la presencia de cisteiacutenas entre los peacuteptidos antimicrobianos tampoco fue un
factor determinante durante la sobreproduccioacuten con la SmbP ya que tanto VpDef
como Bin1b (que se caracterizan por ser abundantes en cisteiacutenas) como LL-37
(que no tiene cisteiacutenas) fueron exitosamente producidos El mapa de calor (Figura
26) sentildealoacute un alto porcentaje de Trp en LnqQ en comparacioacuten con los demaacutes
peacuteptidos antimicrobianos De acuerdo con la escala Kyte-Doolittle Trp es
considerado un residuo hidrofiacutelico (Kyte amp Doolittle 1982) cuando en realidad es
hidrofoacutebico por sus caracteriacutesticas uacutenicas (Mishra Choi Moon amp Baek 2018)
Este residuo funge como estabilizador de las proteiacutenas en la membranas anclaje
y orientacioacuten hacia el lado hidrofiacutelico de la bicapa lipiacutedica (Khemaissa Sagan amp
Walrant 2021) por eso son de alta importancia en proteiacutenas de membrana porque
apoyan en la estabilidad proteiacutena en la interfaz lipiacutedica por su forma riacutegida y plana
(Yau Wimley Gawrisch amp White 1998) Se presume que Trp permite que
peacuteptidos antimicrobianos similares a la aureocina A53 se mantengan unidos a la
membrana (Netz Bastos amp Sahl 2002) Sin embargo al analizar el porcentaje de
Trp entre N-AmyELnqQ SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ descubrimos que los
valores son muy similares 11 26 y 23 Por lo que Trp no seriacutea un factor
clave para que LnqQ sea producido en E coli
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
VpDef
Bin1b
LL37
LnqQ
Figura 26 Perfil aminoaciacutedico de los peacuteptidos antes de acoplarse con SmbPc
El mapa de calor representa la distribucioacuten de los residuos entre los peacuteptidos La intensidad del color negro
representa el porcentaje de residuos entre los peacuteptidos antes de ser acoplados con SmbP
Dada la similitud fisicoquiacutemica entre SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ abordamos el
problema desde el punto de vista analiacutetico otros autores demostraron que
proteiacutenas de peso molecular alto como N-AmyEPnl (R Papi amp Kyriakidis 2003) o
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 103
de peso molecular pequentildeo como SmbP-Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al
2021) SmbP-VpDef (Montfort-Gardeazabal et al 2020) SmbP-LL-37 (Perez-
Perez et al 2021) eran faacutecilmente observables mediante la teacutecnica de SDS-
PAGE hechos que utilizamos para la visualizacioacuten preliminar tanto N-AmyELnqQ
como de SmbP-LnqQ en los ensayos electroforeacuteticos Sin embargo en el reporte
de sobreproduccioacuten por SUMO-LnqQ los ensayos electroforeacuteticos preliminares
fueron realizados bajo la teacutecnica SDS-PAGE con Tricina (Ma et al 2012) Esta
variante es utilizada para resolver proteiacutenas con pesos moleculares pequentildeos que
oscilan entre 1 a 30 kDa (Haider Reid amp Sharp 2012) pero tambieacuten es uacutetil para
analizar proteiacutenas hidrofoacutebicas (Schaumlgger 2006) lo cual seriacutea un candidato ad
hoc a las caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas observadas de la LnqQ
Por uacuteltimo y no menos importante es tambieacuten de mencionar todas las
secuencias aminoaciacutedicas donde los peacuteptidos antimicrobianos tuvieron eacutexito con la
SmbP tienen su origen evolutivo en sistemas eucarioacuteticos las defensinas VpDef
(Zhang et al 2015) y Bin1b (Guo et al 2009) provienen del invertebrado
Venerupis philippinarum y del epidiacutedimo de la rata Rattus norvegicus
respectivamente mientras que la catelicidina LL-37 proviene del sistema inmune
de chimpanceacutes y humanos (Agerberth et al 1995) nuestra LnqQ posee un origen
procariota a traveacutes de Lactococcus lactis QU5 (Fujita et al 2007) Las defensinas
estaacuten compuestas por estructuras tipo beta plegadas mediadas por cisteiacutenas
conservadas mientras que los dominios antimicrobianos de las catelicidinas son
estructuralmente lineales carentes de puentes disulfuro y estaacuten compuestas por
varias heacutelices (Dorin McHugh Cox amp Davidson 2014) LnqQ es una estructura
lineal compuesta por dos heacutelices anfipaacuteticas (Perez et al 2014) por lo que el
factor estructural tampoco seriacutea un factor clave salvo por el hecho de que
provienen de oriacutegenes evolutivos distintos
A manera de conclusioacuten de acuerdo con la evidencia recolectada tanto a nivel
bioinformaacutetico como experimental encontramos que el marco de lectura de los
vectores para la produccioacuten de N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ estaban
correctamente orientados y dispuestos en sus marcos de lecturas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 104
correspondientes los geles de poliacrilamida siacute fueron efectivos para detectar
proteiacutenas con un peso similar (lisozima 144 kDa) a los peacuteptidos de nuestras
construcciones (N-AmyELnqQ= 1053 kDa y SmbP-LnqQ= 1669 kDa)
Confirmamos que el IPTG siacute es capaz de inducir la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
de control tanto en cepas de E coli BL21 (DE3) como de Origami tanto a 25degC
como a 37degC De manera que tanto N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ suponemos
que siacute son producidas pero por caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas propias de la LnqQ
es posible que 1) dado su alta hidrofobicidad es posible que N-AmyELnqQ se
mantenga acoplada en la membrana celular lo que dificultariacutea su solubilizacioacuten en
los geles de SDS-PAGE 2) desde el punto de vista analiacutetico es posible que SDS-
PAGE no sea la teacutecnica oacuteptima para la visualizacioacuten de las proteiacutenas hidrofoacutebicas
3) no existe informacioacuten conclusiva que respalde soacutelidamente porqueacute SmbP-LnqQ
no logroacute ser sobreproducida utilizando E coli como organismo heteroacutelogo
productor
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 105
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES
El biosensor disentildeado de ceacutelulas de E coli basado en la deteccioacuten de moleacuteculas
de QS es capaz de producir LnqQ en base a la concentracioacuten externa de AIP
excretada por MRSA La capacidad del biosensor estaacute mediada por un vector de
expresioacuten disentildeado que lleva por nombre Dual Biosensor-Killer Este plaacutesmido
ademaacutes puede ser utilizado para la construccioacuten de otros biosensores que
compartan el objetivo de detectar y destruir otros patoacutegenos productores de
sentildeales tipo QS Seguacuten nuestros anaacutelisis bioinformaacuteticos in silico nuestro
biosensor estaacute capacitado para detectar y destruir cepas de S aureus que sean
productoras de moleacuteculas de sentildealizacioacuten tipo AIP clase II De acuerdo con
nuestros pronoacutesticos nuestra cepa modificada seriacutea capaz de producir secretar y
ser capaz de ser resistente a la produccioacuten de LnqQ debido a que la maquinaria
geneacutetica se mantuvo intacto Nuestros resultados revelan indican que la LnqQ
seraacute lo suficientemente soluble cuando sea sobreexpresado Por uacuteltimo
determinamos que no existen epiacutetopos para ceacutelulas tipo B ni riesgo de
alergenicidad De esta manera la LnqQ producida por este sistema bioloacutegico es
aparentemente seguro para ser utilizado como un potencial candidato a agente
terapeacuteutico Los resultados in silico motivan al desarrollo y disentildeo de nuevos
agentes antimicrobianos a traveacutes de biosensores de ceacutelulas enteras para eliminar
patoacutegenos tanto sensibles como resistentes a los antibioacuteticos A pesar de los
favorables resultados reportados en publicaciones anteriores y la evidencia
predictiva sobre el peacuteptido sentildeal N-AmyE y con el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la
produccioacuten de proteiacutenas recombinantes como la bacteriocina LnqQ dichas
observaciones no pueden ser aplicadas para la produccioacuten expresioacuten y
purificacioacuten desde ceacutelulas de E coli BL21 (DE3)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 106
ANEXOS
Divulgacioacuten de la investigacioacuten
Publicaciones
Beniacutetez-Chao DF Balderas-Cisneros FDJ Leoacuten-Buitimea A and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Design and in silico analysis of a whole-cell biosensor able to
kill methicillin-resistant Staphylococcus aureus Biotechnol Appl Biochem
httpsdoiorg101002bab2210
Beniacutetez-Chao DF Leoacuten-Buitimea A Lerma-Escalera JA and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Bacteriocins An Overview of Antimicrobial Toxicity and
Biosafety Assessment by in vivo Models Front Microbiol
httpsdoiorg103389fmicb2021630695
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 107
Archivos de disentildeo
Todos los archivos gestionados para los disentildeos estaacuten guardados en su formato
correspondiente adentro de la carpeta de ldquoDoctoral ndash Anexosrdquo la cual fue anexada
propiamente en el disco compacto
Se elaboroacute una carpeta nombrada ldquoBioBricks and Modulesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 61 hasta 610 y estaacute subdivida
en cuatro subcarpetas nombradas como ldquoBioBricks (secuencias originales)rdquo
ldquoModulesrdquo ldquoPlasmidsrdquo ldquoTemplatesrdquo y el ldquoDual Biosensor Killerdnardquo Estos archivos
fueron elaborados a traveacutes de la aplicacioacuten de SnapGene 113 y estaacuten guardados
en formato dna Tambieacuten entregamos dos documentos en formato PDF que
contienen la secuencia nucleotiacutedica optimizada de todos genes usados para el
moacutedulo de biosensor y para el moacutedulo de bacteriocina
Se creoacute una carpeta nombrada ldquoSignal and fusion peptidesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 611 hasta 618 y en esta se
encontraraacute la subcarpeta ldquoMapa Geneacutetico de vectores de expresioacuten de expresioacuten
pETNL y pSmbP-LnqQrdquo Ademaacutes se entregaron tres archivos PDF donde dos de
eacutestos archivos contienen datos predictivos de la estructura secundaria y terciaria
de los productos de pETNL ldquoPhyre2 pETNLpdfrdquo y de pSmbP-LnqQ ldquoPhyre2
pSmbP-LnqQrdquo a traveacutes de la aplicacioacuten en liacutenea Phyre2 y el otro archivo PDF
ldquoSimulacioacuten agarosa 1pdfrdquo que contiene una simulacioacuten en gel de agarosa 1
(pv) de los productos lineales de los vectores de expresioacuten pET30a(+) pETNL y
pSmbP-LnqQ En la carpeta de este capiacutetulo tambieacuten se entregaron cinco archivos
en formato dna que contienen la informacioacuten nucleotiacutedica de la construccioacuten de
los vectores de expresioacuten cuyos nombres son ldquopET30(a)-NAmyE-LnqQ
pETNLpdfrdquo ldquopET-30a(+)pdfrdquo ldquopET-30a(+)-N-AmyEpdfrdquo ldquopET30a-SmbPpdfrdquo y
ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01pdfrdquo Todos los archivos estaacuten marcados con sus
respectivas caracteriacutesticas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 108
Resumen autobiograacutefico
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
Candidato para el grado de
Doctor en Ciencias con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Tesis Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing de
Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Edad 31 antildeos
Campo de estudio Desarrollo de agentes terapeacuteuticos y biologiacutea sinteacutetica
Biografiacutea Nacido en Monterrey Nuevo Leoacuten el diacutea 24 de julio de 1990 hijo de
Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas
Educacioacuten Egresado de Licenciado en Biotecnologiacutea Genoacutemica (UANL) en el
2013 y Maestro en Ciencias con Acentuacioacuten en Microbiologiacutea (UANL) en 2015
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 109
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UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 138
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada vii
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologiacutea (CONACYT) por el apoyo
brindado con la Beca Nacional de Posgrado con nuacutemero de becario 289476
(CVU no 516171) para la continuacioacuten de estudios
A la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) y a la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten (UANL) por el apoyo otorgado con la aprobacioacuten de becas y por el
uso directo e indirecto de sus instalaciones materiales y equipos
Al Dr Joseacute Rubeacuten Morones Ramiacuterez mi asesor a quien agradezco por la
oportunidad de colaborar en el equipo de investigacioacuten Nanobiotechnology
Research Group (NBR) Externo mi agradecimiento por las asesoriacuteas y el uso
de instalaciones equipos y materiales en el Centro de Investigacioacuten en
Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea (CIBYN) asiacute como el financiamiento para la
obtencioacuten de materiales de experimentacioacuten y ejecucioacuten de servicios y el
mejoramiento de mi vida profesional
Al MC Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros y al Dr Angel Leoacuten Buitimea
miembros del NBR y quienes fueron clave en la elaboracioacuten de este proyecto
asiacute como en los artiacuteculos cientiacuteficos redactados durante el proceso doctoral
Al Dr Xristo Zaacuterate Kalfoacutepulos miembro del comiteacute tutorial por su apoyo
teacutecnico y asesoriacutea por el equipo de investigacioacuten del Laboratorio de Expresioacuten y
Produccioacuten de Proteiacutenas (PEP) El agradecimiento se extiende a David Peacuterez
Bryan Santos y Jessica Goacutemez por sus importantes contribuciones
A los demaacutes miembros NBR asiacute como del comiteacute tutorial por sus comentarios
revisiones y asesoriacuteas en la elaboracioacuten de este proyecto
A mis padres Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas y a mi
hermano Angel Alejandro Beniacutetez Chao por su apoyo emocional e
incondicional en el transcurso de este proyecto
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada viii
DEDICATORIA
Para Dios iexclGracias por el don de pensar
Para mi mamaacute Lupita y mi papaacute Alejandro
Para mis hermanos Angel Alejandro y Jesuacutes Alejandro (+)
Para mis mejores amigos Esthela Maldonado Ricardo ldquoMankisrdquo Garciacutea Ricardo ldquoCiegordquo
Garciacutea Edgar ldquoBomboacutenrdquo Villareal Gerardo ldquoPepisrdquo Villarreal Mayela ldquoMonkeyrdquo Maldonado
Aniluacute Maldonado Eduardo Mendoza Alejandra Villarreal Isaac ldquoBebordquo Gonzaacutelez Cristy Llanes
Salma Alemaacuten iexclGracias por ser tan importantes para miacute
Para mis colegas del NBR muy en especial para Paco Balderas Angel Leoacuten Javier Garza
Paco ldquoNegrordquo Rodriacuteguez Dago Torres Luis Cepeda Albert Lerma Jordy Lerma Ceacutesar Garza
Alex de la Garza Isabel Caamal Gricelda Mendiola Fatemehalsadat Tabatabaeifar Hossein
Alishaharatobotni Nahid Rafiei y otros maacutes Se extiende la dedicatoria a mis colegas en PEP en
especial para David Peacuterez Jessica Goacutemez Brayan Santos Evelyn Martiacutenez
Para los que fueron mis estudiantes de verano o de servicio social con mencioacuten especial para
Montse Villegas Rauacutel Garciacutea Cinthia Castillo Sarai Fierros Jessica Ojeda y otros maacutes
Para mis colegas de generacioacuten de doctorado en especial para Paco Balderas David Peacuterez y
Gaby Quintanilla
Para el equipo administrativo del CIBYN con menciones especiales para Karla Islas y Mayra
Sandoval asiacute como de todo el equipo de intendencia muy en especial para la Sra Antonia
ldquoTontildeitardquo Sandoval y la Sra Martha Flores asiacute como para el guardia Nehemiacuteas y el chofer
Ernesto
Para el equipo administrativo de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
con mencioacuten especial para Karina Navarro y para la Sra Edmunda de intendencia
Para mis queridos perros muy en especial para Lucky Toby (+) y Pelusa (+)
Para mis ex alumnos de preparatoria del Centro Escolar Gante iexclLo logreacute
Para todos los que han trabajado como meseros y repartidores para continuar con sus estudios
yo sostener una familia iexclUstedes tienen mis maacutes sinceros respetos
Para todos los que han roto rompen y romperaacuten los liacutemites de lo conocido
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada ix
Si nos negamos categoacutericamente a reconocer que somos susceptibles de
cometer un error una equivocacioacuten profunda ndash nos acompantildearaacute siempre Pero
si somos capaces de evaluarnos con un poco de coraje por muy lamentables
que sean las reflexiones que podamos engendrarnos nuestras posibilidades
mejoran enormemente
Carl Sagan
El mundo y sus demonios La ciencia como una luz en la obscuridad (1995)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada x
TABLA DE CONTENIDO
PORTADA I
FIRMAS DE APROBACIOacuteN DE TESIS II
FIRMAS DE REVISIOacuteN DE TESIS III
CONTRAPORTADA IV
RESUMEN IV
PRESENTACIOacuteN VI
AGRADECIMIENTOS VII
DEDICATORIA VIII
TABLA DE CONTENIDO X
LISTA DE FIGURAS XIV
LISTA DE TABLAS XV
LISTA DE ABREVIATURAS XVI
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN 1
11 ERA DE LOS ANTIBIOacuteTICOS 1
12 INFECCIONES RESISTENTES A LOS ANTIBIOacuteTICOS AMENAZA MUNDIAL 2
13 PROBLEMA SANITARIO CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTES 4
14 TRATAMIENTOS ACTUALES PARA EL COMBATE A INFECCIONES RESISTENTES 5
15 TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS A LOS ANTIBIOacuteTICOS 6
CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES 8
21 CONTROL BIOLOacuteGICO POBLACIONAL POR MICROORGANISMOS 8
22 BIOLOGIacuteA SINTEacuteTICA Y SU PAPEL EN PRODUCCIOacuteN DE BACTERIOCINAS 8
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica 8
222 Definicioacuten de los biosensores 9
23 QUORUM SENSING COMUNICACIOacuteN ENTRE CEacuteLULAS 10
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus 11
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD 12
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA 12
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada 12
24 BIOSENSORES DE CEacuteLULAS ENTERAS BASADOS EN DETECCIOacuteN DE QS 13
25 LAS BACTERIOCINAS 15
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas 15
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos 17
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xi
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes 19
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos 19
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas 20
256 La bacteriocina Lacticina Q 21
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados 22
26 PRODUCCIOacuteN HETEROacuteLOGA DE BACTERIOCINAS 23
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE 24
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP 25
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS 26
31 Justificacioacuten 26
32 Hipoacutetesis 28
33 Objetivo General 28
34 Objetivos Especiacuteficos 28
35 Metas 29
36 Aportacioacuten cientiacutefica 29
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA 30
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 30
42 Cepas bacterianas 30
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina 31
44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 33
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas 33
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 34
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 34
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 34
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 35
410 Prediccioacuten de alergenicidad 35
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 35
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 37
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 38
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 38
415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 39
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 39
418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 44
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en los geles 48
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xii
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS 50
51 Materiales y reactivos 50
52 Equipos de laboratorio 51
53 Lugares de experimentacioacuten 53
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos 53
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES 54
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras 54
62 Cepas bacterianas 55
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina 55
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos 57
65 Optimizacioacuten de los codones nativos 60
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada 61
67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas 64
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas 64
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B 65
610 Prediccioacuten de alergenicidad 67
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL 67
612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ 72
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos 73
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 73
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 74
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ 75
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ 78
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE 84
619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de proteiacutenas 95
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES 105
ANEXOS 106
Divulgacioacuten de la investigacioacuten 106
Archivos de disentildeo 107
Resumen autobiograacutefico 108
REFERENCIAS 109
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiii
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 CONCEPTO DEL BIOSENSOR BASADO EN CEacuteLULAS ENTERAS 30
FIGURA 2 SISTEMA QS PARA DETECCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE S AUREUS 54
FIGURA 3 MOacuteDULOS BIOSENSOR Y DE BACTERIOCINA 55
FIGURA 4 ESTRATEGIA DE CONSTRUCCIOacuteN IN SILICO 58
FIGURA 5 REPRESENTACIOacuteN ESQUEMAacuteTICA DEL VECTOR DUAL BIOSENSOR-KILLER 59
FIGURA 6 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE N-AMYELNQQ 76
FIGURA 7 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE SMBP-LNQQ 76
FIGURA 8 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE N-AMYELNQQ 77
FIGURA 9 PREDICCIOacuteN DE HEacuteLICES TRANSMEMBRANALES PARA N-AMYELNQQ 77
FIGURA 10 PREDICCIOacuteN DE ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE SMBP-LNQQ 78
FIGURA 11 TRANSFORMACIOacuteN DE E COLI DH5Α Y BL21 (DE3) CON PET30A(+) PETNL Y PSMBP-LNQQ 79
FIGURA 12 GEL DE AGAROSA CON PLAacuteSMIDOS PETNL Y PSMBP-LNQQ 80
FIGURA 13 SIMULACIOacuteN DE PCR PARA VECTORES DE EXPRESIOacuteN 83
FIGURA 14 PCR DE PETNL 84
FIGURA 15 PCR DE PSMBP-LNQQ 84
FIGURA 16 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON PETNL INDUCIDO A 25degC 87
FIGURA 17 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PETNL INDUCIDO A 37degC 88
FIGURA 18 GEL DE E COLI BL21 (DE3) PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 91
FIGURA 19 GEL DE E COLI ORIGAMI PSMBP-LNQQ INDUCIDO A 25degC Y 37degC 92
FIGURA 20 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 37degC 93
FIGURA 21 GEL DE E COLI BL21 (DE3) CON CONTROLES INDUCIDO A 25degC 94
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xv
LISTA DE TABLAS
TABLA 1 USO DE CODONES PREVIO Y DESPUEacuteS DE LA OPTIMIZACIOacuteN 61
TABLA 2 PREDICCIOacuteN DE COMUNICACIOacuteN CRUZADA 63
TABLA 3 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD DE PROTEIacuteNAS 64
TABLA 4 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN SUBCELULAR DE PROTEIacuteNAS 65
TABLA 5 PREDICCIOacuteN DE EPIacuteTOPOS DE CEacuteLULAS B EN LNQQ 66
TABLA 6 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE N-AMYELNQQ 69
TABLA 7 SECUENCIAS UTILIZADAS PARA PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE N-AMYELNQQ 70
TABLA 8 PREDICCIOacuteN DE CORTE ENZIMAacuteTICO DE PEacutePTIDO SENtildeAL N-AMYE 71
TABLA 9 SECUENCIA AMINOACIacuteDICA DE SMBP-LNQQ 73
TABLA 10 PREDICCIOacuteN DE SOLUBILIDAD N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
TABLA 11 PREDICCIOacuteN DE LOCALIZACIOacuteN CELULAR N-AMYELNQQ Y SMBP-LNQQ 74
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvi
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Significado
E coli Escherichia coli
S aureus Staphylococcus aureus
MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina
L lactis Lactococcus lactis
ESKAPE Acroacutenimo de seis especies bacterianas Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp
OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud
QS Quorum Sensing (Percepcioacuten de Quoacuterum)
LnqQ Lacticina Q
agrBDCA Operoacuten agr de S aureus
agrB Gen que codifica AgrB
agrD Gen que codifica AgrD
HSL Moleacutecula homo serilactonado
AIP Moleacutecula autoinductora
agrC Gen que codifica AgrC
agrA Gen que codifica AgrA
AgrB Transportadora proteasa necesaria para la maduracioacuten de AgrD
AgrD Peacuteptido precursor a la moleacutecula autoinductora
AgrC Receptor transmembranal con actividad histidina quinasa
AgrA Proteiacutena reguladora de unioacuten al DNA de respuesta
AgrA-P AgrA fosforilado
pH Potencial de hidroacutegeno
pI Punto isoeleacutectrico
AMP Peacuteptidos antimicrobianos
kDA Kilo Dalton
MIC Concentracioacuten miacutenima inhibitoria
microM Micromolar
microgml Microgramo por mililitro
lnqRQBCDEF Cluacutester geneacutetico
AmyE Alfa-amilasa
N-AmyE Peacuteptido sentildeal de la AmyE
SmbP Proteiacutena pequentildea de unioacuten a metales
SmbP Regioacuten citoplaacutesmitica de la SmbP (peacuteptido de fusioacuten)
Ala33 Las letras indican el aminoaacutecido y los nuacutemeros la posicioacuten en la cadena
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranoacutesido
SBP Massachussets Institute of Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts
KEGG Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes
FPB FP Base
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xvii
PDB Protein Data Bank
nm Nanoacutemetros
DBK Plaacutesmido Dual Biosensor Killer
CAI Caacutelculo de Iacutendice de Adaptacioacuten
CUD Codon Usage Database
BUSCA Bologna Unified Subcellular Component Annotador
PCR Reaccioacuten en cadena de la polimerasa
pET30(+)a Plaacutesmido tipo pET30(+)a sin modificaciones
pETNL Plaacutesmido que contiene N-AmyELnqQ6xHis
pSmPc-LnqQ Plaacutesmido que contiene SmbP-LnqQ
LB Medio de cultivo LB
OD600 Densidad oacuteptica
microl Microlitros
microg Microgramos
degC Grados Celsius
h Hora
ml Mililitro
g Gramo
g Fuerza centriacutefuga relativa
rpm Revoluciones por minuto
min Minuto
dNTPs Trifosfatos de desoxinucleoacutetidos
V Volts
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
pv Peso volumen
NaCl Cloruro de sodio
Tris-HCl Solucioacuten de Tris ajustada con aacutecido clorhiacutedrico (HCl)
M Molar
SDS Dodecil Sulfato Soacutedico
APS Persulfato de amonio
TEMED Tetramethylethylenediamine
X Veces de concentracioacuten de trabajo
mm Miliacutemetros
lnqQ Gen de lacticina Q
P2 Promotor 2 inducible del operoacuten agr de S aureus
gfp Gen de GFP
GFP Proteiacutena verde fluorescente
J23110 Promotor J23110 constitutivo para E coli
AIP-I AIP clase I
AIP-II AIP clase 2
AIP-III AIP clase 3
AIP-IV AIP clase 4
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada xviii
Ala Alanina (A)
Arg Arginina (R)
Asn Asparagina (N)
Asp Asparato (D)
Cys Cisteiacutena (C)
Gln Glutamina (Q)
Glu Glutamato (E)
Gly Glicina (G)
His Histidina (H)
Ile Isoleucina (I)
Leu Leucina (L)
Lys Lisina (K)
Met Metionina (M)
Phe Fenilalanina (F)
Pro Prolina (P)
Ser Serina (S)
Thr Treonina (T)
Trp Triptoacutefano (W)
Tyr Tirosina (Y)
Val Valina (V)
Pnl Liasa de pectina
AmyE Amilasa E
N-AmyEPnl Liasa de pectina asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
N-AmyEAmyE Amilasa E asociada con el peacuteptido sentildeal N-AmyE
VpDef Defensina de Venerupis philippinarum
Bin1b Defensina de Rattus norvegicus
LL-37 Catelicidina de humanoschimpanceacutes
SmbP-VpDef VpDef asociado con SmbP
SmbP-Bin1b Bin1b asociado con SmbP
SmbP-LL-37 LL-37 asociado con SmbP
SUMO-LnqQ LnqQ asociado con SUMO
AI Iacutendice alifaacutetico
GRAVY Iacutendice de hidrofobicidad
CAPIacuteTULO 1 INTRODUCCIOacuteN
A lo largo de nuestra historia los humanos hemos desarrollado soluciones a los
problemas del mundo que nos rodea No es extrantildeo que el combate a las
enfermedades sean uno de los temas maacutes recurrentes Existen referencias
histoacutericas entre las diferentes civilizaciones de la antiguumledad como los chinos
(Nicola amp Abagyan 2009) aztecas (Davidson amp De Montellano 1983) y los nubia-
sudaneses (Bassett Keith Armelagos Martin amp Villanueva 1980) del uso
empiacuterico de sustancias para tratar infecciones y enfermedades Hace unos
doscientos antildeos atraacutes se pensoacute que los subproductos de la revolucioacuten industrial
seriacutean tratamiento efectivo contra infecciones y aunque los resultados fueron
alentadores al principios los resultados observados ante otro tipo de infecciones
no tuvieron el mismo eacutexito (Gaynes 2017)
11 Era de los antibioacuteticos
En 1928 Alexander Fleming encontroacute una solucioacuten efectiva para contrarrestar las
infecciones al describir al hongo Penicillium notatum que teniacutea efectos antagoacutenicos
sobre diferentes cepas estafilocoacutecicas (Fleming 1929) inaugurando asiacute la
conocida era dorada en descubrimiento de los antibioacuteticos (Podolsky 2018) Las
virtudes observadas en los antibioacuteticos fueron raacutepidamente puestas en juicio
cuando el mismo Fleming vaticinoacute en su discurso de entrega al premio Nobel que
el abuso y uso excesivo de los antibioacuteticos podriacutea generar brotes de patoacutegenos
resistentes a los antibioacuteticos (Fleming 1945) Cada vez que un nuevo antibioacutetico
era liberado a los sistemas de salud puacuteblicos pronto se reportaba un brote de
resistencia relacionado a antibioacutetico (Clatworthy Pierson amp Hung 2007) Con el
boom de nuevas clases de antibioacuteticos desde los 1940s hasta principios de 1970s
la alerta por resistencia a los antibioacuteticos quedoacute praacutecticamente inadvertida De
hecho entre los 1960s y 1970s existe evidencia que la comunidad cientiacutefica
internacional fue apaacutetica y minimizoacute el hecho de que el abuso de los antibioacuteticos
fuera una causa de resistencia a los faacutermacos en las bacterias patoacutegenas
(Podolsky 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 2
El tema de la resistencia a los antibioacuteticos no tuvo impacto suficiente hasta que
con el paso de las deacutecadas surgieron de brotes de patoacutegenos resistentes de
importancia cliacutenica como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA
por sus siglas en ingleacutes) tanto en Reino Unido (Gardner Oxon Stamp Bowgen amp
Moore 1962) como en Estados Unidos (Barrett McGehee amp Finland 1968) y
ademaacutes las nuevas clases de antibioacuteticos empezaron a escasear desde los 1980s
hasta casi los 2000s Adicionalmente los inversionistas se motivaron a encontrar
nuevas clases antibioacuteticos al observar maacutes ganancias en descubrir compuestos
anticanceriacutegenos (Ventola 2015) los reglamentos sanitarios se volvieron maacutes
estrictos para la liberacioacuten de antibioacuteticos para prevenir la presentacioacuten de
infecciones multirresistentes emergentes (Davies 2006) Todos estos factores
incluyendo otros que tal vez no fueron mencionados allanaron el establecimiento
de poliacuteticas en salud puacuteblica para buscar o sintetizar alguacuten faacutermaco o sustancia
que contrarreste el avance de microorganismos patoacutegenos resistentes de
relevancia cliacutenica (World Health Organization 2017)
12 Infecciones resistentes a los antibioacuteticos amenaza mundial
Cifras de la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) mostraron el peligroso
ascenso de infecciones por bacterias resistentes en las uacuteltimas deacutecadas donde se
calcula un promedio de 700000 muertes anuales para el 2019 (World Health
Organization 2019b) y la advertencia de que si los gobiernos y organizaciones
responsables de la salud puacuteblica a nivel mundial no elaboran poliacuteticas efectivas
para el 2050 tendremos un promedio de 10 millones de muertes al antildeo por
consecuencias de este tipo de infecciones (Dadgostar 2019)
En Meacutexico carecemos de un sistema de recoleccioacuten de datos confiables en este
tipo de infecciones (Amabile-Cuevas 2010) pero en un estudio realizado durante
seis meses del 2019 se recuperaron 23000 cepas resistentes a faacutermacos en 47
centros de salud puacuteblicos de todo el paiacutes siendo algunas de las maacutes comunes E
coli Klebsiella sp Enterobacter sp Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter sp
Enterococcus faecium resistente a vancomicina y Staphylococccus aureus
resistente a meticilina (MRSA) (Vazquez-Rodriguez et al 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 3
En todas las regiones del mundo las infecciones resistentes han tenido un
peligroso ascenso En Estados Unidos las muertas anuales por infecciones
resistentes pasaron de 23000 muertes en 2013 (Frieden 2013) a 35000 durante
el 2019 (CDC 2019) Por otro lado en Europa las muertes atribuibles a
infecciones resistentes aumentaron de 25000 en 2007 (European Centre for
Disease Prevention and Control 2009) a 33110 en 2015 (Cassini et al 2019) En
42 paiacuteses del continente africano se registraron 54000 casos atribuibles a
tuberculosis multirresistente (MDR multi-resistant) y en ocho paiacuteses se registraron
3200 muertes relacionadas a la variante extremadamente resistente (XDR
extreme resistant) en un periacuteodo del 2004 al 2011 (Ndihokubwayo et al 2013) En
el continente asiaacutetico en China por ejemplo el rango de bacterias aislados que
eran resistentes a los antibioacuteticos pasoacute de 22774 casos a 190610 de 2005 a
2017 respectivamente (Qu Huang amp Lv 2019) en la India un estudio reporta
que el 70 de aislados cliacutenicos tipo Gram negativos son resistentes a los
faacutermacos y entre ellos se podiacutean encontrar cepas de Escherichia coli Klebsiella
pneumoniae Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa (Taneja amp
Sharma 2019)
Las infecciones resistentes son material incluso de intereacutes para el sector
econoacutemico El Banco Mundial ha elaborado dos escenarios para predecir el
impacto econoacutemico de las infecciones resistentes para el 2050 en un escenario
de bajo impacto el Producto Interno Bruto (PIB) mundial podriacutea disminuir hasta un
11 Sin embargo en un escenario de alto impacto el dantildeo al PIB global podriacutea
representar hasta una disminucioacuten de 38 Los costos al sistema de salud
puacuteblico en el mundo podriacutean oscilar entre los $300 mil millones a $1 cuatrilloacuten
presentando incluso un serio riesgo para el sector ganadero ya que en el
escenario de bajo impacto esto representariacutea una disminucioacuten de 26 esperado
a un 75 en un escenario de alto impacto (The World Bank 2016)
Las infecciones resistentes representa un punto de intereacutes incluso para la
Organizacioacuten de la Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO
Food and Agriculture Organization) ya que actualmente se presume que en 42
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 4
paiacuteses donde existen datos confiables de consumo de antibioacuteticos en el sector
ganadero y de agricultura se estima que en el 2010 el consumo era de 63000
toneladas de antibioacuteticoantildeo mientras que para el 2030 se estima un consumo
105600 toneladas de antibioacuteticoantildeo representando un incremento de 67 Los
iacutendices de metabolizacioacuten de antibioacuteticos tanto en ganado como en produccioacuten
pesquera presentan una baja metabolizacioacuten ya que entre un 70-80 y un 75-
90 respectivamente son excretados a las fuentes acuiacuteferas La produccioacuten de
cultivos consume entre un 02 a 04 del total de antibioacuteticos en relacioacuten con la
produccioacuten ganadera (FAO sf)
La relevancia sanitaria mundial de S aureus es porque se trata de un miembro del
grupo ESKAPE un grupo de patoacutegenos localizados en infraestructuras
hospitalarias asilos o en equipos e instrumentos meacutedicos como ventiladores y
cateacuteteres y que son habitualmente resistentes a los antibioacuteticos (Rice 2008) Esta
bacteria es la primera causa nosocomial tanto en Latinoameacuterica (26)
Norteameacuterica (260) y la segunda causa nosocomial de Europa (195)
(Biedenbach Moet amp Jones 2004) Se presume que un 30 de la poblacioacuten total
de humanos estaacute colonizado con al menos una subespecie de S aureus
(Wertheim et al 2005) y esto podriacutea ser porque el haacutebitat de esta bacteria en los
humanos es la parte anterior de las fosas nasales (Mulcahy amp McLoughlin 2016)
13 Problema sanitario con Staphylococcus aureus resistentes
S aureus es una bacteria Gram positiva y es considerada una de las principales
causas de enfermedades en piel (Foster 1996) Ademaacutes es capaz de desarrollar
biopeliacuteculas en dispositivos implantados en seres humanos y cateacuteteres causando
infecciones croacutenicas y persistentes (Dunne 2002) La osteomielitis y periodontitis
tambieacuten son producto de la biopeliacutecula este patoacutegeno estaacute involucrado en heridas
croacutenicas en pacientes diabeacuteticos con uacutelceras y estaacute relacionado a infecciones al
endocardio oculares y en casos de rinosinusitis croacutenica (Archer et al 2011) Se
considera que es un patoacutegeno de alto riesgo para pacientes con Fibrosis Quiacutestica
ya que es el maacutes reportado entre personas con 11 a 15 antildeos con esta condicioacuten
(Razvi et al 2009)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 5
Ahora bien se estima que entre un 13 al 74 del total de infecciones resistentes
en el mundo son causados por una variante resistente de S aureus resistente a la
meticilina la cepa MRSA (Koumlck et al 2010) la cual estaacute es sentildealada desde el
2017 por la OMS como un patoacutegeno de alta prioridad al que debe encontrarse una
solucioacuten pronta y efectiva (World Health Organization 2017) Por ejemplo en
Estados Unidos el total de pacientes por infecciones nosocomiales tipo MRSA
ascendioacute de 24 en 1975 a un 29 en 1991 (Panlilio et al 1992) y hasta casi
57 para el antildeo 2000 (NNIS 2004) En la actualidad el MRSA es considerado
endeacutemico en ese paiacutes ya que se estima que el 2 de la poblacioacuten es acarreador
de este estafilococo (Kavanagh 2019)
En Meacutexico los primeros casos de MRSA asociado a comunidad (CA-MRSA) cepa
USA300 fueron reportados a inicios del 2008 (Mariacutea E Velazquez-Meza et al
2011) y durante el 2010 un estudio anuncioacute que la cepa de MRSA maacutes
frecuentemente aislada en nuestro paiacutes era la New YorkJapan (Rodriacuteguez-
Noriega et al 2010) Tambieacuten se conoce que cepas de MRSA en hospitales
puacuteblicos en nuestro paiacutes fluctuoacute entre un 7 al 30 en pacientes entre las
deacutecadas de 1980s a 2000s (M E Velazquez-Meza et al 2004) mientras que el
Instituto Nacional de Cancerologiacutea determinoacute que 17 de las cepas aisladas de
3000 hemocultivos recuperados entre el 2005 al 2015 de pacientes con caacutencer
correspondiacutean a MRSA (Velaacutezquez-Acosta Cornejo-Juaacuterez amp Volkow-Fernaacutendez
2018)
14 Tratamientos actuales para el combate a infecciones
resistentes
En la actualidad las clases maacutes comunes de antibioacuteticos para combatir
infecciones resistentes a los antibioacuteticos son las penicilinas cefalosporinas
quinolonas macroacutelidos tetraciclinas glucopeacuteptidos y monobactaacutemicos (Taylor
Stapleton amp Paul Luzio 2002) En las uacuteltimas dos deacutecadas se han aprobado una
gran variedad de antibioacuteticos para el tratamiento de infecciones causados por
bacterias tanto Gram positivos como Gram negativos Los antibioacuteticos maacutes
recientemente reportados para el tratamiento de bacterias multirresistentes Gram
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 6
positivas incluyen β-lactaacutemicos (ceftarolina y ceftobiprol) glicopeacuteptidos
(dalbavancin oritavancin y telavancin) oxazolidinonas (tedizolid fosfato)
quinolonas (besifloxacina delafloxacin y ozenoxacina) y tetraciclinas
(omadaciclina) (Koulenti et al 2019) Seguacuten la OMS hasta el 2019 se sabe de 50
agentes antimicrobianos que se encuentran en desarrollo cliacutenico donde 32 son
antibioacuteticos activos contra patoacutegenos de prioridad de la OMS diez son agentes
bioloacutegicos 2 son clasificados como agentes novedosos y dos pertenecen al grupo
de bacterias Gram negativas multirresistentes (World Health Organization 2019a)
15 Tratamientos alternativos a los antibioacuteticos
Los patoacutegenos resisten a los antibioacuteticos bajo tres grandes mecanismos de
resistencia intriacutenseca adaptativa yo adquirida (Arzanlou Chai amp Venter 2017
Blair Webber Baylay Ogbolu amp Piddock 2015 Sandoval-Motta amp Aldana 2016)
Es por ello que urge desarrollar una solucioacuten pronta y efectiva para contrarrestar
las infecciones causadas por patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos los cuales
son uno de los puntos que la OMS ha declarado como prioritarios (OrsquoNeill 2016)
En la guerra contra la resistencia a los antibioacuteticos nuestro grupo de investigacioacuten
ha participado en la creacioacuten de compuestos que puedan combatirlos como
tratamientos mixtos de antibioacuteticos (Montelongo-Peralta Leoacuten-Buitimea Palma-
Nicolaacutes Gonzalez-Christen amp Morones-Ramiacuterez 2019) nanopartiacuteculas de plata
asociados con metales de transicioacuten (Javier A Garza-Cervantes et al 2017)
nanomateriales asociados con nanopartiacuteculas de plata sintetizados con poliacutemeros
sensibles al ambiente (Ruben Morones amp Frey 2007) o producidos de manera
sustentable (Escaacutercega-Gonzaacutelez et al 2018) o a partir de un exopolisacaacuterido
producido por una levadura que actuacutea como agente reductor y que estaacuten
capeados por agentes con actividad antimicrobiana y antibiopeliacutecula (Javier
Alberto Garza-Cervantes et al 2019)
Otros grupos de investigacioacuten tambieacuten han desarrollado otro tipo de armas contra
la resistencia a los antibioacuteticos como el uso de teacutecnicas de decorado en
bacterioacutefagos (phage display) para producir vacunas en la caacutepside de
bacterioacutefagos inhabilitados (Bao et al 2019) o uso de agentes de control bioloacutegico
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contra patoacutegenos de alimentos (Gutieacuterrez Fernaacutendez Rodriacuteguez amp Garciacutea 2019)
o para el tratamiento de aguas residuales (Jassim Limoges amp El-Cheikh 2016)
Los esfuerzos actuales se han focalizado en encontrar yo desarrollar nuevas
clases de antibioacuteticos y agentes antimicrobianos contra bacterias resistentes (Fair
amp Tor 2014) y de prioridad ante la OMS (World Health Organization 2017) Las
corrientes alternativas a los antibioacuteticos maacutes reconocidas en la actualidad estaacuten
clasificadas en dos grandes enfoques el enfoque de prevencioacuten a las
enfermedades donde se desarrollan y se utilizan vacunas probioacuteticos o
prebioacuteticos mientras que en el enfoque por tratamiento a las enfermedades se
utilizan la terapia de fagos la aplicacioacuten directa de endolisinas yo exolisinas el
uso de microorganismos depredadores vivos o el uso directo de bacteriocinas
(Allen Trachsel Looft amp Casey 2014) Tambieacuten la Biologiacutea Sinteacutetica se ha
involucrado en resolver la problemaacutetica de infecciones resistentes a los faacutermacos
al participar en el disentildeo de biosensores basados en ceacutelulas completas que sean
capaces de destruir patoacutegenos mediante la previa de deteccioacuten de moleacuteculas
excretadas por microrganismos de intereacutes (Beniacutetez‐Chao Balderas‐Cisneros
Leoacuten‐Buitimea amp Morones‐Ramiacuterez 2021)
La biosiacutentesis purificacioacuten y aplicacioacuten de bacteriocinas contra patoacutegenos Gram
negativos y Gram positivos ha sido punto central para diversos grupos de
investigacioacuten (Cabral Penumutchu Norris Morones-Ramirez amp Belenky 2018
McAuliffe et al 1998 Rea Ross Cotter amp Hill 2011 Sandiford amp Upton 2012
Wong et al 2015) asiacute como la siacutentesis de nanocompuestos como liposomas
quitosano y nanopartiacuteculas hechos a base de compuestos de plantas (Sidhu amp
Nehra 2017) o de nanofibras (Fahim Khairalla amp El-Gendy 2016) que esteacuten
acomplejados con bacteriocinas Maacutes adelante se describiraacuten detalles sobre las
bacteriocinas y su relacioacuten en el combate a las infecciones resistentes a los
antibioacuteticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 8
CAPIacuteTULO 2 ANTECEDENTES
21 Control bioloacutegico poblacional por microorganismos
En la Naturaleza todos los seres vivos estaacuten interactuando y compitiendo por
nichos ecoloacutegicos para sobrevivir crecer y reproducirse para una adaptacioacuten
efectiva en el ambiente donde se desarrollan Este fenoacutemeno es universal ya que
pueden encontrarse en estilos de vida unicelulares y multicelulares (Grice et al
2009) Para competir por los nutrientes los microorganismos contienen
compuestos que matan o limitan el crecimiento de otra poblacioacuten Estos
compuestos pueden ser antibioacuteticos peacuteptidos antimicrobianos moleacuteculas de bajo
peso molecular entre otros maacutes (Gonzalez et al 2011 2010)
Cuando microorganismos vivos por sus caracteriacutesticas bioloacutegicas son usados para
suprimir la densidad poblacional de un tipo especiacutefico de organismo hacieacutendolo
menos abundante o dantildeino se le conoce como control bioloacutegico Es importante
mencionar que esta definicioacuten solo incluye a especiacutemenes vivos como
depredadores paraacutesitos nemaacutetodos hongos bacterias protozoarios inclusive
virus Sin embargo genes sin un recipiente bioloacutegico o metabolitos producidos por
un organismo de control sin que eacuteste se encuentre presente durante el control
poblacional son excluidos de esta definicioacuten (Eilenberg Hajek amp Lomer 2001)
Por ejemplo cultivos de Candida albicans (Peters et al 2010) Pseudomonas
aeruginosa (Filkins et al 2015) Bacillus subtilis (Gonzalez et al 2011)
Enterococcus faecium (Viccedilosa et al 2018) Acanthamoeba polyphaga (de Souza
Soares Benitez amp Rott 2017) disminuyeron la expresioacuten de patogenicidad en S
aureus Incluso cultivos de E coli han mostrado actividad fungicida contra cultivos
de C albicans (Cabral et al 2018)
22 Biologiacutea Sinteacutetica y su papel en produccioacuten de bacteriocinas
221 Introduccioacuten a la Biologiacutea Sinteacutetica
La Biologiacutea Sinteacutetica consiste en disentildear libreriacuteas de elementos geneacuteticos como
promotores secuencias codificadoras terminadores factores de transcripcioacuten
entre otras maacutes asiacute tambieacuten se enfoca en el ensamblaje de circuitos geneacuteticos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 9
hasta en el disentildeo y creacioacuten de organismos completos Este campo utiliza datos
cuantitativos para crear modelos bioloacutegicos y matemaacuteticos que permitan predecir
el comportamiento de un sistema bioloacutegico (Cameron Bashor amp Collins 2014
Garciacutea-Granados Lerma-Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2019)
En la publicacioacuten de Brophy y Voigt se revisan los principios baacutesicos para el
disentildeo de circuitos geneacuteticos para que los sistemas bioloacutegicos sean emulados
para cumplir con tareas o puedan fabricar materiales es importante considerar la
correcta eleccioacuten de reguladores asiacute como puntos de control que cuantifiquen el
impacto en el rendimiento (Brophy amp Voigt 2014)
222 Definicioacuten de los biosensores
Un sensor quiacutemico es un dispositivo que transforma en una informacioacuten quiacutemica
en una sentildeal analiacutetica de utilidad y puede detectar desde la concentracioacuten de una
muestra especiacutefica hasta el anaacutelisis total de sus compuestos Este tipo de
sensores contiene dos unidades funcionales baacutesicas un receptor y un transductor
El receptor transforma la informacioacuten quiacutemica de la muestra en una forma de
energiacutea que puede ser medido por un transductor El transductor transforma la
energiacutea en una sentildeal analiacutetica uacutetil (Hulanicki Glab amp Ingman 1991) De esta
manera comprendemos que un biosensor es ldquoun dispositivo que a traveacutes de
reacciones especiacuteficas de enzimas aisladas sistemas inmunes tejidos organelos
o ceacutelulas enteras sirve para detectar compuestosrdquo (IUPAC 1992)
Asiacute en los biosensores basados en ceacutelulas completas un analito de intereacutes
ingresa al interior celular y es reconocido por un factor transcripcional el cual
controla la transcripcioacuten de un gen mediante el reconocimiento de un promotor
especiacutefico Estos biosensores pueden reconocer diferentes analitos como
hidrocarburos metales pesados antibioacuteticos (Garnier-Rocha 2019) Incluso
algunos modelos biosensores se han aprovechado del fenoacutemeno de quorum
sensing para crear sistemas de comunicacioacuten sinteacuteticos con la capacidad de
controlar poblaciones (Balagaddeacute et al 2008)
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23 Quorum Sensing Comunicacioacuten entre ceacutelulas
El concepto QS refiere a que es un mecanismo de comunicacioacuten entre
microorganismos que dependen de sentildeales quiacutemicas (moleacuteculas sentildealizadoras)
que son excretadas al medio extracelular y que dependen la densidad celular
(Fuqua Winans amp Greenberg 1994) Las bacterias similares a organismos de
diferentes dominios se sostienen de mecanismos de comunicacioacuten y se valen de
diferentes moleacuteculas Esta interaccioacuten puede ser intriacutenseca (es decir intracelular o
adentro de la misma ceacutelula) o extriacutenseca (es decir extracelular o afuera de la
ceacutelula) y crea un fenotipo de respuesta en una poblacioacuten especiacutefica del mismo
(Fuqua et al 1994)
Mientras los cultivos productores de QS esteacuten creciendo eacutestos pueden producir
excretar acumular y detectar moleacuteculas de sentildealizacioacuten quiacutemicas externas
conocidas como autoinductores los cuales son producidos a niveles basales pero
que se acumulan en el exterior celular Cuando la densidad celular de bacterias y
la concentracioacuten de moleacuteculas autoinductoras alcanzan un umbral de
concentracioacuten especiacutefico el cultivo experimenta un cambio en su fenotipo (Garg
Manchanda amp Kumar 2014 Rutherford amp Bassler 2012) Esta respuesta variacutea
seguacuten el tipo de sentildeal emitido ya que su forma y composicioacuten quiacutemica es diferente
seguacuten la especie que la produzca (Fuqua et al 1994) siendo las respuestas maacutes
comunes la formulacioacuten de esporulados factores de virulencia asociados a
invasioacuten bioluminiscencia virulencia yo la creacioacuten biopeliacuteculas (Miller amp Bassler
2002)
El fenoacutemeno de QS sucede tanto en bacterias productoras Gram negativas y las
Gram positivas pero las moleacuteculas auto inductoras son de diferente composicioacuten
quiacutemica En las bacterias Gram negativas las moleacuteculas de sentildealizacioacuten son
conocidas como homoserina lactonada aciladas (HSL) mientras que en bacterias
Gram positivas el mecanismo es a traveacutes de peacuteptidos excretados (Miller amp
Bassler 2002)
En el modelo general de QS en Gram positivos en primera instancia el gen que
contiene el precursor de la moleacutecula sentildealizadora (tambieacuten conocido como
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autoinductor inmaduro) es transcrito y traducido y eacutesta es posteriormente
parcialmente hidrolizada para crear un autoinductor maduro Eacuteste uacuteltimo es
enviado al exterior celular por un transportador tipo ABC Cuando la concentracioacuten
del autoinductor maduro alcanza un umbral miacutenimo de activacioacuten una proteiacutena
tipo quinasa sensor de histidina localizada en el exterior celular detecta la
presencia de eacutesta mediante un sistema a dos componentes El sensor quinasa se
auto fosforila en un residuo conservado de histidina (H) Despueacutes este grupo
fosforilo es transferido a una proteiacutena reguladora de respuesta adyacente la cual
es fosforilada en un residuo conservado de aspartato (D) La proteiacutena reguladora
de respuesta fosforilado activa la transcripcioacuten de los genes de intereacutes (Miller amp
Bassler 2002)
231 Quorum Sensing de Staphylococcus aureus
En S aureus estaacute gobernado por el operoacuten agr que es de un tamantildeo nucleotiacutedico
de 35 kb y se compone de dos unidades transcriptoacutemicas divergentes conocidos
como RNAII y RNAIII los cuales estaacuten gobernados por los promotores P2 y P3
respectivamente (Le amp Otto 2015) El promotor P2 estaacute involucrado en actividades
del QS mientras que el promotor P3 se encarga de la expresioacuten de factores de
virulencia (Miller amp Bassler 2002) como produccioacuten de hemolisinas proteasas
lipasas e indirectamente participan en la liberacioacuten de biopeliacuteculas (Quave amp
Horswill 2014) A nivel geneacutetico la induccioacuten del operoacuten agr depende
parcialmente por la unioacuten de los productos geacutenicos del operoacuten sar en los dos
promotores disponibles del operoacuten agr (Manna Bayer amp Cheung 1998)
El promotor P2 es el de importancia para el sistema QS debido a que el transcrito
resultante agrBDCA produce cuatro proteiacutenas AgrB AgrD AgrC y AgrA los
cuales son los componentes principales del sistema de QS de S aureus A
manera de resumen podemos en global que AgrC y AgrA participan como
elementos biosensores mientras que AgrB y AgrD son los elementos necesarios
para la biosiacutentesis de AIP El AgrD es un peacuteptido precursor a la moleacutecula
autoinductora (AIP por sus siglas en ingleacutes) y el AgrB funciona transportadora
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como proteasa y estaacute involucrada en la maduracioacuten del AIP (Gomes-Fernandes
et al 2017 Horswill Stoodley Stewart amp Parsek 2007)
232 Sistema de biosiacutentesis de AIP AgrB y AgrD
El gen que produce AgrD se expresa y se traduce en una versioacuten propeacuteptido de la
moleacutecula AIP que sufre de una modificacioacuten postraduccionalmente para que sea
bioloacutegicamente activo La moleacutecula AIP inmadura se compone de tres secciones
conocidas como regioacuten del peacuteptido liacuteder regioacuten madura del AIP y secuencia de
reconocimiento que corresponden a las regiones N- central y C-terminales
respectivamente (B Wang amp Muir 2016)
El AgrD es inicialmente procesado en la regioacuten N-terminal (se compone de 32
residuos) y sirve de guiacutea Eacuteste es translocado a la cara externa de la membrana
celular Mientras la regioacuten peptidasa de la proteiacutena transmembranal AgrB
reconoce la regioacuten N-terminal del AIP inmaduro
233 Sistema biosensor AgrC y AgrA
AgrC y AgrA funcionan en conjunto con un sistema claacutesico de dos componentes
Donde la proteiacutena transmembranal tipo receptor con actividad histidina quinasa
AgrC se encarga de que detectar las moleacuteculas AIP liberadas al exterior por S
aureus una vez acoplado el AIP con el receptor eacuteste uacuteltimo causa una
autofosforilacioacuten del dominio citoplasmaacutetico del AgrC seguido de la transferencia
del grupo fosfato de la proteiacutena reguladora de respuesta de unioacuten al DNA AgrA
Una vez que AgrA es fosforilado (AgrA-P) eacuteste se une a la regioacuten intergeacutenica de
los promotores P2 y P3 del operoacuten agr (Gomes-Fernandes et al 2017)
234 Hipervariabilidad del AgrD y su relacioacuten con la comunicacioacuten cruzada
Bioquiacutemicamente el AgrD inmaduro tiene un tamantildeo entre 46 a 47 residuos seguacuten
su clase Despueacutes de procesamiento AgrD maduro tiene un tamantildeo final entre 7 a
8 aminoaacutecidos (que variacutea seguacuten la clase) y contiene un anillo tiolactonado
producto de la condensacioacuten entre un grupo tiol de una cisteiacutena interna ubicada
cuatro aminoaacutecidos antes del uacuteltimo aminoaacutecido y el grupo carboxilo del uacuteltimo
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aminoaacutecido (que puede ser metionina o fenilalanina dependiendo la clase) (B
Wang Zhao Novick amp Muir 2015)
En AgrC el dominio que contiene los elementos para deteccioacuten del receptor de la
moleacutecula AIP produce diferentes formas de propeacuteptidos De esta manera se
deduce que cada moleacutecula de AIP producida depende de su propia proteiacutena
detectora AgrC Por tanto la presencia en el medio de moleacuteculas de AIP que no
estaacuten filogeneacuteticamente relacionadas resultan en la inhibicioacuten de QS Es decir
miembros productores del mismo tipo de AIP pueden inducir el comportamiento
tiacutepico por QS pero si los productores no pertenecen al mismo grupo se puede
inhibir su respuesta Este fenoacutemeno es conocido como comunicacioacuten cruzada
(Rutherford amp Bassler 2012) La regioacuten hipervariable del operoacuten agr estaacute ubicado
en el transcrito gobernado por el promotor P2 entre los genes agrC agrD y agrB
Consensualmente se ha determinado cuatro grandes clases de AIP y permite
clasificar a los tipos de S aureus en base a esta regioacuten (Shopsin et al 2003)
24 Biosensores de ceacutelulas enteras basados en deteccioacuten de QS
A continuacioacuten presentamos una compilacioacuten de publicaciones de diferentes
ceacutelulas que fueron modificadas para actuar como biosensores capaces de detectar
moleacuteculas producidas por organismos productores de sentildeales quiacutemicas tipo QS
algunos de los ejemplos mencionados cuentan con la capacidad de producir yo
liberar sustancias antimicrobianas capaces de destruir al productor de esas
sentildeales
Balagaddeacute y otros disentildearon un sistema de comunicacioacuten sinteacutetico conocido como
depredador y presa en la que dos ceacutelulas modificadas de E coli son capaces de
comunicarse -y matar a una de ellas- a traveacutes del sistema de QS En este modelo
las ceacutelulas asignadas como depredadoras producen y liberar moleacuteculas tipo QS
que se difunden en el medio y al llegar a la ceacutelula presa por sus mecanismos
internos activan la produccioacuten una toxina especiacutefica para la ceacutelula asignada como
presa provocaacutendoles la muerte celular Por otro lado las ceacutelulas presas para
evitar su muerte temprana deben producir constantemente una proteiacutena antitoxina
que anule la actividad de la toxina (Balagaddeacute et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 14
Saeidi y sus colaboradores crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basados en la
deteccioacuten del QS al modificar ceacutelulas de E coli para que detectaran moleacuteculas
3OC12 HSL producidas por P aeruginosa En este sistema las moleacuteculas QS son
difundidas a traveacutes del medio y son reconocidas por un factor de transcripcioacuten en
E coli que activa una unidad transcripcional para producir piocianina un
antibioacutetico especiacutefico con actividad contra P aeruginosa y porina E7 un agente
liacutetico especiacutefico contra E coli a medida que aumenta la concentracioacuten de la
moleacutecula QS incrementa la concentracioacuten del antibioacutetico y de la porina Cuando
se acumula suficiente cantidad de porinas en el interior celular las ceacutelulas de E
coli son lisadas y se libera piocianina para finalmente atacar a las ceacutelulas de P
aeruginosa (Saeidi et al 2011) Dos antildeos maacutes tarde Gupta y sus colaboradores
modificaron este biosensor agregando un moacutedulo de excrecioacuten que libera una
sustancia antimicrobiana al exterior a traveacutes de un peacuteptido sentildeal y atacar
especiacuteficamente a P aeruginosa evitando la muerte de la ceacutelula productora de
antibioacutetico (S Gupta Bram amp Weiss 2013)
Marchand y sus colegas crearon un sistema de comunicacioacuten interespeciacutefico para
la interaccioacuten entre dos bacterias con oriacutegenes evolutivos diferentes Bacillus
megaterium (Gram positiva) y E coli (Gram negativa) utilizando el mecanismo del
operoacuten agr de S aureus En este reporte ceacutelulas de E coli fungieron como
productoras de moleacuteculas de QS al expresar las proteiacutenas AgrD y AgrB que en
condiciones nativas producen moleacuteculas de AIP en S aureus Mientras que
ceacutelulas de B megaterium fungieron como biosensores al producir las proteiacutenas
AgrC y AgrA que en condiciones nativas sirven como un sistema a dos
componentes que detectan la presencia externa de la moleacutecula de AIP y activan a
un factor de transcripcioacuten (Marchand amp Collins 2013)
Zeng y sus colaboradores crearon un modelo biomatemaacutetico a partir de una E coli
que funcionara como un biosensor de moleacuteculas de AIP producidas por S aureus
que seriacutea contrarrestado por accioacuten de la lisostafina una bacteriocina de actividad
contra S aureus La simulacioacuten del modelo indicoacute que una ceacutelula de E coli podriacutea
tardar hasta 25 horas en detectar las primeras moleacuteculas de AIP producidas de S
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 15
aureus al tiempo que generariacutea la suficiente concentracioacuten de bacteriocinas para
matar a ceacutelulas de S aureus (Zeng et al 2013)
Borrero y sus colegas crearon un biosensor de ceacutelulas enteras basado en la
deteccioacuten de moleacuteculas de QS para poder contrarrestar moleacuteculas de QS
producidos por un patoacutegeno de intereacutes cliacutenico resistente a los antibioacuteticos En este
caso ceacutelulas modificadas de Lactobacillus lactis fueron capaces de detectar las
moleacuteculas producidas por Enterococcus faecalis El lactobacilo modificado mostroacute
alta efectividad de tres bacteriocinas producidas para controlar el crecimiento de
este patoacutegeno incluyendo sus variedades multirresistentes (Borrero Chen Dunny
amp Kaznessis 2015)
Holowko y sus colegas desarrollaron ceacutelulas de E coli capaces de sentir
moleacuteculas de QS producidas por Vibrio cholerae (Holowko Wang Jayaraman amp
Poh 2016) Mientras que Lubkowicz y sus colaboradores modificaron ceacutelulas de
Lactobacillus reuteri con la capacidad para detectar moleacuteculas de AIP clase I
producidas por S aureus en rangos de concentracioacuten desde la escala nanomolar
hasta micromolar (Lubkowicz et al 2018)
25 Las Bacteriocinas
En contexto a la anterior seccioacuten una fraccioacuten del total de biosensores de ceacutelulas
enteras disentildeados son capaces de producir y excretar sustancias antimicrobianas
que afecten el crecimiento de ceacutelulas productoras de moleacuteculas QS Para fines de
este trabajo nos referimos a las bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
que pertenece a un grupo de peacuteptidos con actividad antimicrobiana con origen
evolutivo en bacterias los cuales seraacuten descritos a continuacioacuten
251 Introduccioacuten a las bacteriocinas
Las bacteriocinas son un grupo de peacuteptidos de bajo peso molecular que son
producidos exclusivamente y excretados por bacterias y que tienen la capacidad
de inhibir el crecimiento de otra bacteria Las bacteriocinas pueden ser producidas
in situ por bacterias probioacuteticas Al ser de origen proteico las bacteriocinas son
sujetos a modificaciones por Ingenieriacutea Geneacutetica (Cotter Ross amp Hill 2013) Las
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bacteriocinas usualmente actuacutean por permeabilizacioacuten por membrana causada por
su naturaleza catioacutenica al interactuar con la membrana Usualmente las
bacteriocinas son de caraacutecter hidrofoacutebico y anfipaacutetico Su estructura quiacutemica son
generalmente peacuteptidos acoplados con glicoproteiacutenas y lipoproteiacutenas Su punto
isoeleacutectrico estaacute habituado a 81 a 101 usualmente son termoestables y tiene un
rango de pH amplio entre 30 a 90 (Heredia-Castro Heacuternaacutendez-Mendoza
Gonzaacutelez-Coacuterdova amp Vallejo-Cordoba 2017) En la Naturaleza cuando las
bacterias comparten el mismo nicho ecoloacutegicos eacutestas deben luchar y defenderse
de otros y las bacteriocinas son uno de los mecanismos bioloacutegicos reconocidos
(Duffy Schouten amp Raaijmakers 2003)
La disponibilidad de datos en bacteriocinas en la Naturaleza es muy amplio ya que
se presume que un 99 del total de bacterias son productoras de al menos un tipo
de bacteriocina y muchos de ellos permanecen auacuten sin ser descubiertos
(Klaenhammer 1988) Hasta la fecha de acuerdo con datos de bases de datos
sobre bacteriocinas de calidad mundial (actualizado hasta la uacuteltima versioacuten 25 de
junio de 2021) indican que el University of Nebraska Medical Centerrsquos
Antimicrobial Peptide Database (ADP por sus siglas en ingleacutes)
(httpswangapd3commainphp) se mantienen registrados un total de 3257
peacuteptidos antimicrobianos de los seis reinos bioloacutegicos existentes de los cuales
181 son peacuteptidos con actividad anti-MRSA (G Wang Li amp Wang 2016) Aunque
Bactibase (httpbactibasehammamilaborgmainphp) es una base de datos de
bacteriocinas que no se ha actualizado desde 2017 sus datos siguen siendo muy
valiosos ya que nos ofrece una realidad en la ciencia de las bacteriocinas puesto
que la mayoriacutea de las bacteriocinas descubiertas han sido aisladas de bacterias
Gram positivas donde 206 pertenecen a este grupo y 19 a las cepas Gram
negativas El geacutenero maacutes reportado para las bacteriocinas de origen en Gram
positivas son los Lactobacillus seguido de Enterococcus Streptococcus
Lactococcus y el geacutenero Bacillus mientras que el geacutenero maacutes reportado para las
bacteriocinas de origen en Gram negativas es Escherichia El tamantildeo promedio de
las bacteriocinas es de 43 residuos (Hammami Zouhir Le Lay Ben Hamida amp
Fliss 2010)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 17
Un buen nuacutemero de bacteriocinas han sido previamente reportadas como agentes
terapeacuteuticos puesto que se han utilizado en dosis hasta cien veces superiores al
valor de concentracioacuten miacutenima inhibitoria reportado sin presentar efectos
citotoacutexicos en liacuteneas celulares eucarioacuteticas (Hols Ledesma-Garciacutea Gabant amp
Mignolet 2019) ni en tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Por
ejemplo la nisina la bacteriocina maacutes famosa en la industria y en el mundo ha
sido declarado por la Administracioacuten de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA por sus siglas en ingleacutes) como sustancia Generalmente Reconocida
como Segura (GRAS por sus siglas en ingleacutes) para su uso como conservador de
alimentos (Cotter Hill amp Ross 2005) Se sabe que la mayoriacutea de las bacteriocinas
han tenido un largo historial de seguridad (Silva Silva amp Ribeiro 2018) Sin
embargo a pesar de la gran disponibilidad de datos de ensayos en bacteriocinas
recientemente se ha manifestado la urgencia de incrementar y explorar su uso en
modelos in vivo para evaluar su eficacia como agentes antimicrobianos y evaluar
los posibles efectos secundarios los cuales son necesarios para asegurar su eacutexito
como candidatos potenciales a agentes terapeacuteuticos en su lucha contra
infecciones resistentes a los antibioacuteticos (Beniacutetez-Chao Leoacuten-Buitimea Lerma-
Escalera amp Morones-Ramiacuterez 2021)
252 Diferencia entre peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos
Los peacuteptidos antimicrobianos bacteriocinas y antibioacuteticos son sustancias de origen
bioloacutegico que cumplen con el mismo papel de defensa lo cierto es que existen
claras diferencias entre ellas que dependen de su origen composicioacuten quiacutemica
entre maacutes factores A continuacioacuten se ofrece una breve explicacioacuten entre los
diferentes tipos de sustancias antimicrobianas
Los Peacuteptidos Antimicrobianos (AMP antimicrobial peptides) tambieacuten conocidos
como peacuteptidos de autodefensa (HDP host defense peptide) son peacuteptidos
producidos por un hospedero y son parte del sistema inmune al conferirles
capacidades defensivas Son de un rango de tamantildeo entre 10 a 60 residuos en
promedio 3326 residuos que estaacuten compuestas mayoritariamente por α-heacutelices
con cargas positivas (catioacutenicas) o anfipaacuteticas (cargas hidrofoacutebicas e hidrofiacutelicas)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 18
tambieacuten existen referentes con carga anioacutenica Los AMP estaacuten clasificados seguacuten
su origen ya que estaacuten ubicuamente presentes en todos los reinos bioloacutegicos
como mamiacuteferos plantas microorganismos acuaacuteticos insectos yo anfibios
seguacuten su actividad ya que pueden ser antibacterianos antifuacutengicos
antiinflamatorios antivirales antiparasitarios yo anticanceriacutegenos seguacuten su
estructura como tipo lineal con estructurales secundarias con α-heacutelices y β-tiras
plegadas y por seguacuten por el tipo dominante de aminoaacutecidos como glicina arginina
prolina histidina y triptoacutefano (Huan Kong Mou amp Yi 2020 Lei et al 2019)
Si el AMP es de origen evolutivo bacteriano se les conoce como bacteriocinas Los
oriacutegenes pueden ser por bacterias Gram positivas como negativas incluyendo
miembros del dominio de las Archaea (Chikindas Weeks Drider Chistyakov amp
Dicks 2018) Sin embargo cuando el AMP es de origen eucarioacutetico existen tres
clasificaciones defensinas (Shafee Lay Hulett amp Anderson 2016) histatinas o
catelicidinas (De Smet amp Contreras 2005) Existen intermediarios evolutivos como
las bacteriocinas tipo defensina que son un grupo de bacteriocinas que comparte
los puentes de disulfuro en las mismas posiciones que podriacutean observarse en las
defensinas (Baindara et al 2016 Sugrue OrsquoConnor Hill Stanton amp Paul Ross
2020)
Tanto las bacteriocinas como los antibioacuteticos comparten funcionalidad bioloacutegica al
ser ambas sustancias que nulifican o matan a otras poblaciones pero existen
diferencias muy marcadas entre ellas puesto que las bacteriocinas son
sintetizadas como metabolitos primarios mientras que los antibioacuteticos son
secundarios El espectro de accioacuten de las bacteriocinas es mucho maacutes reducido
que los antibioacuteticos eacutestos uacuteltimos son muy amplios El grado de actividad es
mucho maacutes intenso entre bacteriocinas ya que su rango de accioacuten se encuentra
en el orden de los nano a micro molar mientras que los antibioacuteticos son rango de
accioacuten estaacute ranqueado entre los micro y milimolar Debido a su origen proteico las
bacteriocinas son altamente propensas a ser degradados por enzimas Sin
embargo las bacteriocinas son maacutes termodinaacutemicamente estables y con una
actividad maacutes amplia de pH que los antibioacuteticos Las bacteriocinas atacan
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 19
generalmente la membrana extracelular generando poros mientras que los
antibioacuteticos pueden atacar la membrana tambieacuten yo atacar blancos intracelulares
Se conoce que las bacteriocinas presentan baja o nula toxicidad en comparacioacuten
con los antibioacuteticos (Perez Zendo amp Sonomoto 2014)
253 Bacteriocinas utilizadas contra S aureus resistentes
En la actualidad diversos estudios enfocados en bacteriocinas se han enfocado
en su actividad contra cepas de S aureus resistentes a los antibioacuteticos Por
ejemplo la lisostafina fue utilizado el control de S aureus ATCC 29740 (Oldham amp
Daley 1991) mientras que la pentocina JL-1 ha sido efectivo para el control de S
aureus multirresistente (Jiang Zou Cheng Fang amp Huang 2017) La bacteriocina
entianina mostroacute actividad contra MRSA (ATCC 43300) (S W Fuchs et al 2011)
La epidermicina NI01 mostroacute actividad contra MRSA (Sandiford amp Upton 2012)
Asiacute tambieacuten como las enterocinas DD28 y DD93 con actividad anti estafilocoacutecica
contra ceacutelulas MRSA (Al Atya et al 2016)
254 Bacteriocinas contra patoacutegenos resistentes a los antibioacuteticos
Las bacteriocinas son un grupo muy bien definido de peacuteptidos antimicrobianos que
tienen su origen evolutivo en bacterias y en algunas arqueobacterias Por sus
caracteriacutesticas proteicas las bacteriocinas son elementos geneacuteticos que pueden
ser faacutecilmente modificados por teacutecnicas de Ingenieriacutea geneacutetica (Cotter et al
2013) Las caracteriacutesticas generales de las bacteriocinas son que su espectro de
accioacuten es actuar tanto en las bacterias Gram positivas como negativas Su modo
de actividad por actividad bactericida o bacteriostaacutetico Su mecanismo de accioacuten
es por permeabilizacioacuten de membrana creando lisis celular Su estructura
bioquiacutemica es muy variada que pueden ser peacuteptidos glicoproteiacutenas y
lipoproteiacutenas Son de peso molecular variable sin embargo las bacteriocinas de
origen en Gram positivas son de tamantildeo pequentildeo Debido a su naturaleza
proteica las bacteriocinas son susceptibles al corte proteoliacutetico y altamente
estables a altas temperaturas (Heredia-Castro et al 2017)
Entre algunas de las bacteriocinas que se han utilizado para el control de
patoacutegenos resistentes estaacute la bacteriocina AS-48 la cual ha sido ampliamente
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 20
utilizado contra cepas de referencia y cliacutenicos para Mycobacterium tuberculosis
(Aguilar-Peacuterez et al 2018) Otro ejemplo es la pentocina JL-1 ha demostrado
tener actividad contra diferentes cepas bacterianas (Jiang et al 2017) Entianina
ha mostrado actividad contra Enterococcus faecalis resistente a vancomicina
(ATCC 51299) (S W Fuchs et al 2011) Las klebcinas poseen actividad contra
especies resistentes y multirresistentes de cepas del geacutenero Klebsiella
(Denkovskienė et al 2019) La lista de bacteriocinas reportadas como efectivas
contra patoacutegenos resistentes de relevancia cliacutenica es muy larga y que puede ser
observada en la literatura correspondiente (Cui et al 2012 Gabrielsen Brede
Nes amp Diep 2014 Newstead Varjonen Nuttall amp Paterson 2020 Perez et al
2014)
255 Breve clasificacioacuten de las bacteriocinas
Las bacteriocinas pueden ser producidos tanto por microorganismos Gram
positivos como negativos inclusive por miembros del dominio Archaea (Chikindas
et al 2018)
Hasta el diacutea de hoy no hemos encontrado un oacutergano internacional que regule la
clasificacioacuten de las bacteriocinas maacutes que lo propuesto en grupos de investigacioacuten
ligados a la ciencia de las bacteriocinas Las bacteriocinas con origen evolutivo en
organismos Gram positivos estaacuten actualmente clasificados en cuatro grandes
clases la clase I corresponde a bacteriocinas modificadas postraduccionalmente
de muy bajo peso molecular (lt5 kDa) la clase II se refiere a bacteriocinas
termoestables no modificadas de bajo peso molecular (lt10 kDa) la clase III
contiene bacteriocinas termosensibles de alto peso molecular (gt10 kDa) y por
uacuteltimo la clase IV se compone de proteiacutenas acomplejadas con carbohidratos o
liacutepidos (Newstead et al 2020 Perez et al 2014)
Dada la diversidad de bacteriocinas para fines de este trabajo solo nos
enfocaremos en las bacteriocinas tipo II de las Gram positivas ya que se clasifican
en cuatro grandes subclases La clase IIa representa la familia de las
bacteriocinas con actividad antilisteria por su actividad especiacutefica contra cepas de
Listeria monocytogenes y ademaacutes porque se mantiene un dominio conservado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 21
YGNGV conocido como la caja de pediocina y que ubica en extremo N-terminal
Uno de los ejemplos maacutes reconocidos es la enterocina NKR-5-3C La clase IIb
representa a las bacteriocinas compuestas por dos peacuteptidos que en siacute son dos
peacuteptidos diferentes que actuacutean sineacutergicamente para atacar a un blanco como
lactococcin Q que se compone de los peacuteptidos lactococcina Qα y lactococcin Qβ
La clase IIc se relaciona con las bacteriocinas circularizadas que estaacuten unidas de
extremo a extremo como lactociclina Q y leucociclina Q La clase IId se compone
de bacteriocinas sin peacuteptido liacuteder y que se sintetizan sin una secuencia liacuteder en su
extremo N-terminal Algunos ejemplos son la weissllicina Y weissllicina M
leucocina Q leucocina N lacticina Z y lacticina Q (Perez et al 2014)
256 La bacteriocina Lacticina Q
La lacticina Q (LnqQ) es una bacteriocina que fue por vez descubierta por Fujita y
sus colaboradores en el 2007 Esta bacteriocina fue aislada por primera vez por
Lactococcus lactis QU5 una cepa Gram positiva que fue aislada de una muestra
de maiacutez fresco recolectado en campos agriacutecolas de la comunidad de Aso en
Kumamoto Japoacuten La composicioacuten bioquiacutemica de LnqQ es que se trata de peacuteptido
lineal compuesto por 53 residuos y con un peso molecular de 592050 Da (Fujita
et al 2007) La estructura tridimensional descubierta por Acedo y otros revela
que es una proteiacutena globular que se compone de cuatro α-heacutelices cuya superficie
es altamente catioacutenica y su nuacutecleo hidrofoacutebico Esta secuencia presenta una
carga neta +6 y su pI = 108 (Acedo et al 2016)
Esta bacteriocina ha mostrado ser un peacuteptido antimicrobiano con alta efectividad
contra bacterias Gram positivas siendo antagonista de uno los principales
patoacutegenos reportados en cliacutenicas como S aureus Por ejemplo se han registrado
diversos rangos de concentracioacuten miacutenima inhibitoria (MIC) de la LnqQ como 8 microM
contra S aureus ATCC 6538 y 32 microM contra S aureus ATCC 29213 (Acedo et al
2016) Tambieacuten se ha reportado 18 microM (Fujita et al 2007) o 10 microgml (Ma Yu
Han Wang amp Zhang 2012) contra S aureus ATCC 12600
Se conoce que la LnqQ genera alta permeabilidad en la membrana sin necesidad
de anclarse sobre moleacuteculas especiacuteficas como el Liacutepido II (Yoneyama Imura
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 22
Ichimasa et al 2009) Posteriormente se determinoacute que el mecanismo de accioacuten
es a traveacutes de un modelo conocido como Poro Toroidal Enorme (HTP huge
toroidal pore) donde las estructuras α-heacutelices cargadas positivamente y presentes
en la LnqQ se unen covalentemente hacia la membrana celular que estaacute cargada
negativamente y entonces genera un poro en forma de toroide enorme de 46 a
66 nm de diaacutemetro generando una estructura conocida como lipid flip-flop lo que
permite el goteo de moleacuteculas intercelular de manera que la ceacutelula muere La
translocacioacuten del peacuteptido desde el exterior a la cara interna de la ceacutelula ocurre
sincroacutenicamente con la formacioacuten del poro toroidal (Yoneyama Imura Ohno
et al 2009) En un estudio a nivel in vitro se determinoacute que cuando LnqQ es
agregado a niveles MIC sobre cultivos bacterianos sensibles aumenta la
acumulacioacuten de radicales libres tipo hidroxilos y por consecuencia la ceacutelula muere
(Li et al 2013)
257 Composicioacuten geneacutetica de la LnqQ y genes asociados
Las bacteriocinas son sustancias toacutexicas que pueden atacar a su microorganismo
productor si eacuteste no cuenta con caracteriacutesticas que le permitan resistir (Ishibashi
et al 2014 Iwatani et al 2012 Ladjouzi Lucau-Danila Benachour amp Drider
2020 Mesa-Pereira et al 2017 Nascimento et al 2012) De manera que todos
los operones de las bacteriocinas se componen habitualmente de los siguientes
elementos geneacuteticos promotor gen estructural (bacteriocina) genes de
inmunidad genes de transporte una proteiacutena accesoria y un terminador de la
transcripcioacuten (Mesa-Pereira et al 2017)
La LnqQ no es ninguna excepcioacuten a la regla ya que similar a otras bacteriocinas
la produccioacuten secrecioacuten y autoinmunidad estaacute regulado por el cluacutester geneacutetico
lnqRQBCDEF que se encuentra en Lactococcus lactis QU5 y que descubierto por
Iwatani y otros en el 2012 (Iwatani et al 2012) Al diacutea de hoy auacuten no estaacute del todo
bien determinado la funcionalidad de los elementos que conforman el operoacuten pero
se sabe que el cluacutester lnqQBCDEF es esencial para la completa produccioacuten de
LnqQ mientras que los productos LnqEF son esenciales y los productos LnqBCD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 23
estaacuten parcialmente involucrados en la inmunidad y secrecioacuten de la bacteriocina
(Iwatani Horikiri Zendo Nakayama amp Sonomoto 2013)
26 Produccioacuten heteroacuteloga de bacteriocinas
Entre las virtudes observadas en las bacteriocinas estaacuten en que gozan de una
excelente reputacioacuten en seguridad bioloacutegica (Silva et al 2018) y de una gran
diversidad de bancos de datos sobre bacteriocinas (Hammami et al 2010 G
Wang et al 2016) Estos datos pueden apoyar para el disentildeo y construccioacuten de
bacteriocinas de novo (Fields et al 2020) Sin embargo a la fecha una cantidad
raquiacutetica de bacteriocinas han sido capaces de ser producidos en masa siendo la
nisina y la pediocina PA-1 las uacutenicas bacteriocinas en destacar industrialmente
Una de las hipoacutetesis que maacutes planteada supone que las bacteriocinas no han
destacado en el mercado porque eacutestas deben de producirse en altas cantidades y
con suficiente actividad bioloacutegica y en los organismos nativos este proceso se
considera que es un desgaste energeacutetico significativo ya que el rendimiento
productivo es usualmente bajo (Mesa-Pereira Rea Cotter Hill amp Ross 2018)
Desde la fundacioacuten de la Ingenieriacutea Geneacutetica las proteiacutenas han sido objeto de
muacuteltiples modificaciones para aumentar su produccioacuten y purificacioacuten utilizando
diversos sistemas bioloacutegicos productores desde sistemas procariotas como E coli
hasta sistemas eucariotas como ceacutelulas de levaduras o inclusive en liacuteneas
celulares eucariotas A pesar del avance actual que existen ya en estas teacutecnicas
la produccioacuten de proteiacutenas puede presentar incluso problemas de rutina en
laboratorios dedicados a este campo como la formacioacuten de cuerpos de inclusioacuten
toxicidad o baja produccioacuten de proteiacutenas (Bell Engleka Malik amp Strickler 2013)
En este trabajo nos hemos enfocado en la exploracioacuten de un peacuteptido sentildeal N-
AmyE y un peacuteptido de fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de la bacteriocina
LnqQ tanto en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica de ceacutelulas de E coli Nuestro
objetivo es que la aplicacioacuten de las etiquetas en la produccioacuten de la bacteriocina
permita la produccioacuten y purificacioacuten de LnqQ en ceacutelulas de E coli mientras
mantiene su funcionalidad bioloacutegica bactericida contra cultivos de S aureus En
este capiacutetulo presentaremos antecedentes relacionados al peacuteptido sentildeal N-AmyE
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 24
y al peacuteptido de fusioacuten SmbP asiacute como los disentildeos bioinformaacuteticos utilizados para
la construccioacuten de las etiquetas con la bacteriocina se incluyen ensayos in silico
predictivos para estimar la estructura tridimensional de la bacteriocina con su
etiqueta asiacute como ensayos para estimar el corte
261 Peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE es un dominio proteico localizado en la regioacuten N-terminal
de la α-amilasa (AmyE) (Yang Galiii amp Henner 1983) Bioquiacutemicamente la AmyE
es una enzima (1 4-α-D-glucano-glucanohidrolasa EC 3211) cuya funcioacuten es
catalizar la hidroacutelisis de enlaces glicosiacutedicos (α-14) del almidoacuten para producir
glucosa y dextrinas (R Gupta Gigras Mohapatra Goswami amp Chauhan 2003)
La secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica de algunas AmyE fueron reportadas
desde hace varias deacutecadas Por ejemplo en 1983 Yang y sus colaboradores
reportaron la secuencia nucleotiacutedica del AmyE de la cepa Bacillus subtilis 1A289
(Yang et al 1983) Antildeos maacutes tarde en 1988 Emori y sus colegas tambieacuten
reportaron la secuencia nucleotiacutedica completa de la variante producida por la cepa
de B subtilis 2633 (Emori amp Maruo 1988)
La existencia del peacuteptido sentildeal N-AmyE de la α-amilasa fue propuesta por Yang y
sus colaboradores cuando develaron la secuencia nucleotiacutedica completa del
mismo argumentando que el presunto peacuteptido sentildeal debiacutea tener un tamantildeo de 32
aminoaacutecidos Tambieacuten observaron que AmyE podriacutea expresarse en ceacutelulas de
otras especies como E coli manteniendo su actividad bioloacutegica (Yang et al 1983)
La utilidad biotecnoloacutegica del peacuteptido sentildeal N-AmyE es porque se ha reportado
que es funcionalmente activo tanto en Bacillus subtilis como en E coli ya que al
fusionarse eacutesta con la regioacuten N-terminal de una proteiacutena de intereacutes biotecnoloacutegico
estaacute puede ser liberado al medio extracelular Por ejemplo al fusionar el peacuteptido
sentildeal N-AmyE con una β-lactamasa eacutesta es capaz de excretarse al medio
extracelular tanto en ceacutelulas de B subtilis como de E coli Sin embargo el sitio de
reconocimiento para el corte del peacuteptido sentildeal difiere entre ambos tipos de ceacutelulas
(Nakazawa Takano Sohma amp Yamane 1986) Un anaacutelisis multivariado de datos
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 25
determinoacute que las secuencias nucleotiacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en su seccioacuten N-terminal tienden a ser excretados en el periplasma y en la
seccioacuten extracelular de E coli (Sjoumlstroumlm Wold Wieslander amp Rilfors 1987)
El mecanismo de corte hidroliacutetico por el que el peacuteptido sentildeal N-AmyE se separa de
la amilasa AmyE es debido a su estructura secundaria y a la presencia de un
dominio rico en alaninas (aminoaacutecido apolar) en el extremo C-terminal de del
peacuteptido N-AmyE Sin embargo el patroacuten de corte enzimaacutetico difiere seguacuten el tipo
organismo donde sea expresado ya que el sitio de corte oacuteptimo de este peacuteptido
se encuentra entre Ala33 y X34 cuando se expresa en B subtilis pero en E coli la
AmyE tiende a cortarse entre Ala31 y un aminoaacutecido cual sea (X) (Sakakibara
Tsutsumi Nakamura amp Yamane 1993)
En el 2005 el peacuteptido sentildeal N-AmyE reportado por Yang y otros fue acoplado en
la regioacuten N-terminal de una liasa de pectina para permitir su expresioacuten en ceacutelulas
de E coli (DE3) en la regioacuten periplaacutesmica Los resultados de ese estudio indicaron
que se logroacute la excrecioacuten efectiva de la liasa de pectina al medio extracelular
espacio periplaacutesmico citoplasma y a nivel membranal de E coli despueacutes de haber
sido inducido por con IPTG (R M Papi Chaitidou Trikka amp Kyriakidis 2005)
262 Peacuteptido de fusioacuten SmbP
La mayoriacutea de peacuteptidos de fusioacuten utilizados para la expresioacuten de proteiacutenas
recombinantes son el Dominio de Unioacuten a Celulosa (CBDcenA) Glutatioacuten-S-
Transferasa (GST) Proteiacutena de Unioacuten a Maltosa (MBP) tiorredoxina (TRX) y las
Proteiacutenas Modificadoras tipo Ubiquitina de Tamantildeo Pequentildeo (SUMO) (Mesa-
Pereira et al 2018) o la regioacuten citoplasmaacutetica del proteiacutena pequentildea de unioacuten a
metales SmbP (Vargas-Cortez Morones-Ramirez Balderas-Renteria amp Zarate
2016) a continuacioacuten ofrecemos maacutes informacioacuten relacionada al uacuteltimo peacuteptido de
fusioacuten
En el 2004 Barney y sus colaboradores describieron a la Proteiacutena Pequentildea de
Unioacuten a Metales en el periplasma de Nitrosomonas europaea Esta proteiacutena posee
un peso molecular de 99 kDa y presenta una inusual cantidad de residuos de
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histidina (17) seguido de alanina (16) glutamato (14) glicina (11) y lisina
(9) los cuales componen el 67 de la composicioacuten total de residuos Esta
proteiacutena carece naturalmente de metionina y de cisteiacutenas Estructuralmente se
trata de una unidad monomeacuterica compuesta por 93 residuos cuya principal
caracteriacutestica es una regioacuten compuesta de 10 repeticiones secuenciales cada una
con motivo de siete aminoaacutecidos donde el cuarto residuo es una histidina
conservada estos motivos permiten la estabilizacioacuten de un nuacutecleo hidrofoacutebico
Como su nombre lo establece esta proteiacutena posee alta afinidad a metales
divalentes como Cu2+ Ni2+ Zn2+ y de otras valencias como Fe3+ (Barney LoBrutto
amp Francisco 2004) Esta proteiacutena ha sido utilizada para la expresioacuten periplaacutesmica
y posterior purificacioacuten de Hormona de Crecimiento Humano (hGH)
bioloacutegicamente activa (Perez-Perez et al 2020)
En 2015 el dominio periplaacutesmico de la SmbP que corresponde a la seccioacuten maacutes
proacutexima al extremo N-terminal en la estructura lineal del mismo fue removido por
Vargas y sus colaboradores manteniendo uacutenicamente el dominio citoplasmaacutetico
de la SmbP citoplasmaacutetica (SmbP) Eacutesta uacuteltima es uacutetil como etiqueta de afinidad
para teacutecnicas de cromatografiacutea de afinidad con iones metaacutelicos inmovilizados
(IMAC por sus siglas en ingleacutes) Esta proteiacutena fue reportada como efectiva para la
expresioacuten citoplaacutesmica de proteiacutenas en E coli como RFP GFP SHY2 NDPK2 y
LovR (Vargas-Cortez et al 2016)
Recientemente la SmbP fue utilizada por primera vez para la produccioacuten del
peacuteptido antimicrobiano Bin1b utilizando E coli como hospedero para la
sobreproduccioacuten El peacuteptido fue sobre producido y purificado mostrando actividad
antimicrobiana contra E coli y S aureus (Montfort-Gardeazabal Balderas-
Renteria Casillas-Vega amp Zarate 2021)
CAPIacuteTULO 3 JUSTIFICACIOacuteN HIPOacuteTESIS Y OBJETIVOS
31 Justificacioacuten
La idea de disentildear y utilizar un biosensor de ceacutelula para controlar cultivos de
MRSA es porque las moleacuteculas sentildealizadoras del QS se han reportado como
estiacutemulos quiacutemicos para ser reconocidos como ceacutelulas enteras vivas modificadas
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para su reconocimiento Ademaacutes de que ya se han reportado diversos biosensores
completos de ceacutelulas que pueden producir y excretar bacteriocinas capaces de
matar a microorganismos multirresistentes productores de sentildeales QS
La decisioacuten de inclinarnos hacia las bacteriocinas como patoacutegenos es porque
atacan un espectro limitado de bacterias dentro de una comunidad microbioloacutegica
y no ocurre de manera simultaacutenea en un espectro amplio como ocurre
habitualmente con los antibioacuteticos lo que promueve una mayor probabilidad de
seleccioacuten de mutantes que puedan conferir resistencia Ademaacutes las bacteriocinas
estaacuten constantemente evolucionando y permiten a sus productores combatir
contra patoacutegenos de resistencia emergentes (Riley et al 2012)
Las bacteriocinas han mostrado ademaacutes ser potenciales agentes terapeacuteuticos ya
que no afectan tejidos del hospedero (Kurlenda amp Grinholc 2012) Incluso las
bacteriocinas se han administrado en concentraciones tan altas como 100 veces
superiores al MIC originalmente reportado con nulos efectos citotoacutexicos en liacuteneas
celulares eucarioacuteticas (Hols et al 2019) Ademaacutes la mayoriacutea de los productores
nativos en bacteriocinas poseen un excelente historial en seguridad (Silva et al
2018)
La propuesta de etiquetar bacteriocinas con un peacuteptido sentildeal es porque durante el
proceso de recuperacioacuten previo a la purificacioacuten es comuacuten encontrar una baja
cantidad de proteiacutenas y ademaacutes proteasas que disminuyen el rendimiento
productivo Con el peacuteptido sentildeal la purificacioacuten de las proteiacutenas se simplifica
porque son faacutecilmente recuperadas de la fraccioacuten periplaacutesmica seguido un choque
osmoacutetico sin la necesidad de lisar toda la ceacutelula (Ramanan et al 2010) mientras
que la decisioacuten de antildeadir peacuteptidos de fusioacuten en los disentildeos geneacuteticos es porque se
trata de etiquetas que se colocan en la regioacuten N-terminal o C-terminal de una
proteiacutena con intereacutes biotecnoloacutegico Estos peacuteptidos representan un meacutetodo
recurrente en la sobreexpresioacuten de bacteriocinas porque ayudan en la purificacioacuten
aumentan la expresioacuten proteica mejoran la solubilidad permiten que la proteiacutena
sea producida en un estado similar al nativo incrementan el rendimiento de
produccioacuten y disminuyen su degradacioacuten (Mesa-Pereira et al 2018)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 28
32 Hipoacutetesis
El disentildeo de un biosensor construido a base de ceacutelulas enteras E coli modificadas
pronostica indica que funcionaraacute como alarma bioloacutegica al detectar moleacuteculas de
QS de S aureus En consecuencia liberaraacute un compuesto antimicrobiano con
actividad especiacutefica contra el organismo blanco El peacuteptido antimicrobiano seraacute
validado experimentalmente a traveacutes del peacuteptido sentildeal N-AmyE y el peacuteptido de
fusioacuten SmbP para la expresioacuten heteroacuteloga de LnqQ en E coli que seraacute producido
en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica respectivamente
33 Objetivo General
Presentar el disentildeo in silico de un mecanismo biosensor basado en el sistema de
quorum sensing de S aureus para producir Lacticina Q y producir
experimentalmente este peacuteptido antimicrobiano tanto en la regioacuten periplaacutesmica
como citoplaacutesmica de E coli
34 Objetivos Especiacuteficos
1 Disentildear el moacutedulo geneacutetico biosensor para detectar la presencia externa de
moleacuteculas autoinductoras (AIP) producidos por MRSA
2 Disentildear el moacutedulo geneacutetico de bacteriocinas para liberar lacticina Q (LnqQ)
en funcioacuten a la concentracioacuten externa de moleacuteculas AIP producidos por
MRSA
3 Disentildear un vector de expresioacuten que contenga ambos moacutedulos geneacuteticos
tanto biosensor como de bacteriocinas
4 Predecir la especificidad teoacuterica del biosensor completo de ceacutelulas enteras
entre diferentes sentildeales de QS
5 Predecir la solubilidad y localizacioacuten subcelular de cada una de las
proteiacutenas utilizadas para el disentildeo del moacutedulo biosensor y el moacutedulo de
bacteriocina
6 Predecir la existencia de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B y nivel de alergenicidad
en la LnqQ producida en E coli
7 Disentildear el vector de expresioacuten pETNL que contenga el peacuteptido sentildeal N-
AmyE en conjunto con el LnqQ acoplado con una etiqueta de polihistidina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 29
8 Disentildear el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ que contenga el peacuteptido de
fusioacuten SmbP en conjunto con el LnqQ
9 Construir los vectores de expresioacuten pETNL y pSmbP-LnqQ y transformar
ceacutelulas de E coli
10 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten periplaacutesmica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pETNL
11 Inducir y detectar la produccioacuten de LnqQ en la regioacuten citoplasmaacutetica de
ceacutelulas de E coli transformado con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ
35 Metas
En un periacuteodo a tres antildeos nos propusimos alcanzar las siguientes metas
bull Disentildear in silico un sistema biosensor en E coli capaz de sentir moleacuteculas
de Quorum Sensing producidas por S aureus y producir una sustancia
antimicrobiana en funcioacuten a la concentracioacuten externa de las moleacuteculas QS
bull Predecir la capacidad del peacuteptido sentildeal N-AmyE y del peacuteptido de fusioacuten
SmbP para producir bacteriocinas en la regioacuten periplaacutesmica y citoplaacutesmica
de E coli respectivamente
bull Presentar los resultados obtenidos en al menos un artiacuteculo de investigacioacuten
con arbitraje internacional
bull Cumplir con eacutexito el examen predoctoral
bull Obtener el grado de Doctor en Ciencias con Orientacioacuten en Microbiologiacutea
36 Aportacioacuten cientiacutefica
Nuestra aportacioacuten consiste en presentar el disentildeo y el trabajo teoacuterico necesario
para la construccioacuten de un biosensor de ceacutelulas enteras basado en quorum
sensing capaz de producir bacteriocinas en funcioacuten a la concentracioacuten disponible
de moleacuteculas tipo QS evitando asiacute la sobreproduccioacuten yo goteo de bacteriocinas
que pueden contribuir a la resistencia en patoacutegenos Asiacute tambieacuten experimentamos
en peacuteptido sentildeal N-AmyE y al peacuteptido de fusioacuten SmbP para validarlos como una
herramienta bioloacutegica para la produccioacuten y purificacioacuten de bacteriocinas en ceacutelulas
modificadas de E coli
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 30
CAPIacuteTULO 4 METODOLOGIacuteA
41 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
La idea de disentildear un biosensor basado en ceacutelulas enteras surge al yuxtaponer
dos enfoques usados para tratar enfermedades resistentes a los antibioacuteticos que
es mediante el uso de organismos bioloacutegicamente activos con bacteriocinas (Allen
et al 2014)
En este sentido tenemos dos ceacutelulas independientes que son reconocidas como α
y β respectivamente (Figura 1) las ceacutelulas α que corresponden a un productor
de sentildeales tipo QS liberan moleacuteculas de sentildealizacioacuten al medio externo mientras
que las ceacutelulas β que corresponden al biosensor son emulados para detectar
moleacuteculas de QS de las ceacutelulas α En respuesta a esta deteccioacuten los mecanismos
internos de las ceacutelulas β producen y excretan una toxina especiacutefica contra las
ceacutelulas α y asiacute controlar su crecimiento poblacional
Figura 1 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
Ceacutelulas β fungen como sistema de deteccioacuten y destruccioacuten al reconocer moleacuteculas de reconocimiento tipo QS
producidos por ceacutelulas α y causar su muerte
42 Cepas bacterianas
Nosotros designamos a E coli (BL21) DE3 como chasis bioloacutegico porque ha sido
ampliamente reconocido para la sobreproduccioacuten de bacteriocinas recombinantes
(Mesa-Pereira et al 2018) Para el disentildeo del moacutedulo biosensor optamos por
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utilizar los datos anotados del genoma de la cepa S aureus N315 una cepa
reconocida como MRSA y que ha sido reportado como unas de las principales
causas de infecciones resistentes a meticilina asociado a comunidad (CA-MRSA)
y a hospitales (HA-MRSA) (Kuroda et al 2001) Para el disentildeo del moacutedulo de
bacteriocina utilizamos los datos bioinformaacuteticos del cluacutester de genes lnqQBCDEF
de L lactis QU5 que permiten la produccioacuten y excrecioacuten la LnqQ asiacute como para su
autoinmunidad (Fujita et al 2007 Iwatani et al 2012) Abajo se presentan los
disentildeos de ambos moacutedulos asiacute como la estrategia general para su ensamblado en
un vector de expresioacuten
La cepa de E coli BL21 (DE3) fue seleccionada para ensayos de expresioacuten
proteica con el peacuteptido sentildeal N-AmyE o con el peacuteptido de fusioacuten SmbP La cepa E
coli DH5 fue utilizada para ensayos de clonacioacuten La cepa E coli Origami fue
escogida para produccioacuten de proteiacutenas problemaacuteticas
Un cultivo de E coli BL21 (DE3) fue amablemente donado por el Instituto
Tecnoloacutegico de Monterrey (Monterrey Nuevo Leoacuten) La cepa de E coli DH5α fue
recuperada de un stock de cultivos de nuestro laboratorio en el CIBYN (Apodaca
Nuevo Leoacuten) La cepa E coli Origami fue compartida por el Dr Xristo Zaacuterate de la
UANL (Monterrey Nuevo Leoacuten) Todas las cepas fueron mantenidas y crecidas en
caldo LB o suplementado con agar (2) a 37degC en condiciones aeroacutebicas
43 Disentildeo de moacutedulos geneacuteticos biosensor y de bacteriocina
Tanto los moacutedulos biosensor como el de bacteriocina fueron disentildeados de la
siguiente manera contienen un promotor un sitio de unioacuten al ribosoma gen
estructural y un terminador doble de transcripcioacuten Los disentildeos fueron elaborados
bajo la herramienta bioinformaacutetica SnapGene 113 en el formato correspondiente
Todos los datos bioinformaacuteticos utilizados para ambos disentildeos fueron recuperados
de alguna de las siguientes bases de datos Massachussets Institute of
Technologyrsquos Registry of Standard Biological Parts (SBP) (httppartsigemorg)
(Galdzicki Rodriguez Chandran Sauro amp Gennari 2011) Kyoto Encyclopedia
Genes and Genomes (KEGG) (httpswwwgenomejpkegg) (Kanehisa amp Goto
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 32
2000) FP Base (FPB) (httpswwwfpbaseorg) (Lambert 2019) y GenBank
(httpswwwncbinlmnihgovgenbank) (Clark Karsch-Mizrachi Lipman Ostell amp
Sayers 2016) y Protein Data Bank (PDB) (httpswwwrcsborg) (Berman et al
2000)
Para el disentildeo del moacutedulo biosensor usamos los datos del promotor constitutivo
de E coli J23110 (SBP no BBa_J23110) como regulador transcripcional de los
genes del operoacuten agrC y agrA Nosotros utilizamos la secuencia nucleotiacutedica y
aminoaciacutedica del agrC (KEGG no SA1843) que se compone de 1116 nucleoacutetidos
y 371 residuos respectivamente y tambieacuten de la informacioacuten disponible para la
agrA (KEGG no SA1844) que se compone de 717 nucleoacutetidos y 238 residuos Los
sitios de unioacuten a ribosoma (SBP no BBa_B0034) fueron colocados entre cada gen
estructural y al final de la unidad transcriptoacutemica se colocoacute un doble terminador de
transcripcioacuten (SBP no BBa_B0015) tanto el moacutedulo biosensor como en moacutedulo
de bacteriocina
Para el disentildeo del moacutedulo de bacteriocina utilizamos los datos del promotor
inducible P2 del MRSA para regular la expresioacuten del cluacutester geneacutetico lnqQBCDEF
y el gen reportero gfp Debido a que la secuencia del promotor P2 no se
encontraba disponible de manera que primero tuvimos que localizar la regioacuten en
el archivo genoacutemico de la MRSA (GenBank no BA0000183) los resultados de
este punto seraacuten explicados maacutes a fondo en la seccioacuten correspondiente
Para la seccioacuten estructural del moacutedulo de bacteriocina buscamos el archivo
bioinformaacutetico que contuviera los genes estructurales secrecioacuten y de auto
inmunidad del cluacutester lnqQBCDEF (GenBank no AB7123931) El archivo original
fue manipulado para seccionar los elementos geneacuteticos que pertenecen al cluacutester
esta informacioacuten seraacute explicada con maacutes detalle
Por uacuteltimo usamos la secuencia nucleotiacutedica y aminoaciacutedica del gen monomeacuterico
gfp (FPBase no QKFJN) como reportero de Aequorea victoria (Zacharias Violin
Newton amp Tsien 2002) Esta proteiacutena es monomeacuterica posee un peso molecular
en 270 kDa El valor maacuteximo de excitacioacuten es λ = 488 nm mientras que el valor
maacuteximo de emisioacuten es λ = 507 nm El coeficiente de extincioacuten es 56000 M-1cm-1
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44 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
El plaacutesmido de AddGene (httpswwwaddgeneorg) (AddGene no 116850) fue
utilizado para la construccioacuten in silico de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
dentro de un plaacutesmido al cual nos referiremos a partir de ahora como plaacutesmido
Dual Biosensor Killer (DBK) Este plaacutesmido fue disentildeado en la aplicacioacuten
SnapGene versioacuten 113
45 Optimizacioacuten de los codones nativos en las secuencias seleccionadas
Para la optimizacioacuten de los codones de todas las secuencias nucleotiacutedicas se
utilizoacute la herramienta bioinformaacutetica GenSmart Codon Optimization Tool
(httpswwwgenscriptcomtoolsgensmart-codon-optimization) versioacuten Beta 10
Las secuencias nucleotiacutedicas yo aminoaciacutedicas recolectadas para el disentildeo de los
moacutedulos geneacuteticos funcionaron como datos de entrada La aplicacioacuten fue
configurada para ldquoEscherichia colirdquo como organismo para expresioacuten de proteiacutenas
Es importante mencionar que solicitamos la exclusioacuten de sitios de restriccioacuten
habitualmente localizados en la regioacuten muacuteltiple de clonacioacuten del vector de
expresioacuten pET30a(+) como BamHI (GGATCC) BglII (AGATCT) ClaI (ATCGAT)
EcoRI (GAATTC) HindIII (AAGCTT) KpnI (GGTACC) NcoI (CCATGG) NdeI
(CATATG) NheI (GCTAGC) NotI (GCGGCCGC) PstI (CTGCAG) SacI (GAGCTC) SacII
(CCGCGG) SalI (GTCGAC) SmaI (CCCGGG) SpeI (ACTAGT) SphI (GCATGC) XbaI
(TCTAGA) XhoI (CTCGAG) XmaI (CCCGGG)
Una vez optimizadas usamos CAI Tool (httpgenomesurvesCAIcal) para el
Caacutelculo del Iacutendice de Adaptacioacuten (CAI por sus siglas en ingleacutes) para determinar el
iacutendice de adaptacioacuten de las secuencias nucleotiacutedicas antes y despueacutes de la
optimizacioacuten Esta herramienta utiliza la secuencia nucleotiacutedica y el uso de
codones tanto del organismo nativo como el organismo productor heteroacutelogo (u
organismo recipiente) como entradas para la optimizacioacuten De acuerdo a los
autores el iacutendice tiene un rango de respuesta que oscila entre 0 hasta 1 donde el
valor correspondiente 1 indica si la secuencia de entrada usa los codones maacutes
frecuentemente utilizados por el organismo recipiente (Puigbograve Bravo amp Garcia-
Vallve 2008) Para esta aplicacioacuten los iacutendices de uso de codones de cada
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organismo los datos de entrada deben ser descargados y posteriormente deben
ingresarse manualmente Todos los iacutendices fueron descargados de la base de
datos Codon Usage Database (httpswwwkazusaorjpcodon) y se descargaron
para los organismos E coli B (CUD no 413997) S aureus N315 (CUD
no158879) L lactis subsp cremoris (CUD no 1359) and A victoria (CUD no
6100)
46 Especificidad del biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Se realizoacute un alineamiento local entre pares probando de manera independiente
cada una las cuatro clases maacutes comunes de AgrD contra la secuencia
aminoaciacutedica del AgrD del MRSA seleccionada para determinar la especificidad
del biosensor y en consecuencia la existencia de un comportamiento de
comunicacioacuten cruzada El alineamiento se realizoacute en la aplicacioacuten EMBOSS Water
(httpswwwebiacukToolspsaemboss_water) (Madeira et al 2019) Las
secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro clases maacutes representativas de AgrD
fueron descargadas de los datos publicados por Wang y otros (B Wang amp Muir
2016) mientras que la secuencia de AgrD de la cepa MRSA que seleccionamos
fue recuperada de una base de datos (KEGG no SAS066)
47 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
La solubilidad de las proteiacutenas seleccionadas para su expresioacuten en E coli fue
predicha por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk)
(Hebditch Carballo-Amador Charonis Curtis amp Warwicker 2017) La precisioacuten
general de la herramienta fue estimada en 706 De acuerdo con los autores
cualquier valor de solubilidad superior a 045 se considera que es soluble De esta
manera cualquier proteiacutena con valor inferior a 045 se infiere que no son solubles
Es importante mencionar que esta herramienta no es uacutetil para determinar el iacutendice
de solubilidad en proteiacutenas membranales
48 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
La herramienta bioinformaacutetica BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo
Martelli Fariselli Profiti amp Casadio 2018) predice la localizacioacuten subcelular de
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una proteiacutena en E coli Esta aplicacioacuten nos permite distinguir entre proteiacutenas
globulares de proteiacutenas membranales Para fines de nuestro proyecto nosotros
configuramos a la aplicacioacuten para identificar ldquoProkarya ndash Gram negativerdquo debido a
que eacuteste es el origen taxonoacutemico de nuestro organismo productor heteroacutelogo
49 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
410 Prediccioacuten de alergenicidad
La alergenicidad de la LnqQ fue evaluada en la herramienta bioinformaacutetica
AllerCatPro versioacuten 17 (httpsallercatprobiia-staredusg) la cual permite
predecir si el componente es capaz de crear una respuesta aleacutergica tipo I mediada
a la inmunoglobulina tipo E (IgE) basada en el anaacutelisis estructural lineal y
tridimensional de la proteiacutena (Maurer-Stroh et al 2019)
411 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
4111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica de la amilasa AmyE fue
descargado del cataacutelogo de GenBank (GenBank no V001011) El peacuteptido sentildeal
de este archivo fue manualmente extraiacutedo con la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 113 siguiendo las recomendaciones de la publicacioacuten de Papi y sus
colaboradores (R M Papi et al 2005)
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4112 Disentildeo y acoplamiento del peacuteptido sentildeal N-AmyE con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo nucleotiacutedico de la LnqQ (GenBank no AB2352011) El
acoplamiento fue manualmente resuelto utilizando la aplicacioacuten bioinformaacutetica
SnapGene 110 agregando sitios de restriccioacuten y algunos nucleoacutetidos tomando
en cuenta las recomendaciones de AddGene de dejar un espacio para asistir en la
clonacioacuten molecular por PCR (httpswwwaddgeneorgprotocolspcr-cloning)
Dos vectores de expresioacuten basados en pET-30a(+) fueron disentildeados in silico
donde uno de los vectores contiene exclusivamente el peacuteptido sentildeal N-AmyE y en
el siguiente estaacute el N-AmyE acoplado con la LnqQ
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pETNL fue
elaborado en SnapGene 113 y guardado en formato dna y enviado a BioBasic
Inc (Canadaacute) a traveacutes del tercero autorizado Productos y Equipos
Biotecnoloacutegicos SA de CV (Probiotek Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
4113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido sentildeal N-AmyE del
conjunto LnqQ con etiqueta de polihistidina fue evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea
SignalP 50 (httpwwwcbsdtudkservicesSignalP) el cual es un servidor que
determina la presencia de peacuteptidos sentildeales y la localizacioacuten de sus sitios de corte
proteoliacutetico en proteiacutenas de origen en Archaea bacterias Gram positivas y
negativas y organismos eucarioacuteticos (Armenteros et al 2019)
Esta herramienta puede distinguir entre tres tipos de peacuteptidos sentildeales tiacutepicos El
primer mecanismo es a traveacutes la viacutea Sec tipo I (SPI) que es conocido como el
mecanismo estaacutendar de excrecioacuten donde los peacuteptidos sentildeales son transportados
por el translocoacuten Sec y son escindidos por accioacuten de la Peptidasa de Sentildeal tipo I
(Lep) El segundo mecanismo corresponde a la viacutea Sec tipo II (SPII) donde los
peacuteptidos sentildeales lipoproteiacutecos son transportados por el translocoacuten Sec y cortados
mediante la Peptidasa de Sentildeal tipo II (Lsp) El uacuteltimo mecanismo corresponde a
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 37
la viacutea Tat donde los peacuteptidos sentildeales son transportados por el translocoacuten Tat tipo
y son escindidos por la Peptidasa de Sentildeal tipo I (Lep) (Armenteros et al 2019)
En la aplicacioacuten se puede elegir entre cuatro grupos de organismos para el
anaacutelisis de corte predictivo los cuales corresponden a organismos eucarioacuteticos
organismos Gram positivos organismos Gram negativos y en tipo Archaea Para
fines de nuestro proyecto dado que esta construccioacuten fue intencionada para ser
producida en ceacutelulas de E coli se eligioacute la opcioacuten para organismos Gram
negativos
Para comparar la probabilidad de corte enzimaacutetico de nuestra construccioacuten in silico
de N-AmyELnqQ6xHis se descargoacute los datos bioinformaacuteticos de seis secuencias
aminoaciacutedicas que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y cuyo corte proteoliacutetico fue
demostrado experimentalmente
412 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
4121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo que contiene la secuencia nucleotiacutedica del peacuteptido de fusioacuten SmbP fue
amablemente cedido por el Dr Xristo Zaacuterate de la Universidad Autoacutenoma de
Nuevo Leoacuten La secuencia nucleotiacutedica del SmbP estaacute contenida en un vector de
expresioacuten tipo pET30a(+) y guardado en formato dna
4122 Disentildeo y acoplamiento de peacuteptido de fusioacuten SmbP con LnqQ
Para acoplar el peacuteptido de fusioacuten con la seccioacuten N-terminal de la LnqQ se
descargoacute el archivo geneacutetico desde la base de datos biotecnoloacutegicos Este
acoplamiento fue manualmente resulto a traveacutes de SnapGene
El documento que contiene los datos geneacuteticos del vector de expresioacuten pSmbP-
LnqQ fueron elaborado en SnapGene 113 guardados en formato dna y enviado
a Gene Universal Inc (Estados Unidos) a traveacutes del tercero autorizado
Distribuidora Bakterlab SA de CV (Bakterlab Nuevo Leoacuten) para su siacutentesis
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4123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
El iacutendice de prediccioacuten del corte proteoliacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP del
conjunto LnqQ evaluado con la aplicacioacuten en liacutenea PeptideCutter
(httpswebexpasyorgpeptide_cutter) la cual predice sitios potenciales para ser
cortados por proteasas o por sustancias quiacutemicas en una secuencia de proteiacutena
determinada (Gasteiger et al 2005) Esta aplicacioacuten contiene una lista extensa de
reacciones enzimaacuteticas y quiacutemicas Para fines de nuestro proyecto se eligioacute la
opcioacuten de ldquoEnterokinaserdquo ya que nuestra construccioacuten contiene este dominio
413 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Para descartar que la existencia de alguacuten codoacuten de paro no observado durante la
fase de post disentildeo optamos por analizar la secuencia nucleotiacutedica de la regioacuten
de intereacutes de pETNL y pSmbP-LnqQ en la aplicacioacuten en liacutenea ORF Finder
(httpswwwncbinlmnihgovorffinder) la cual es una aplicacioacuten que encuentra
marcos de lectura abiertos en una secuencia de nucleoacutetidos Los paraacutemetros
seleccionados correspondieron a ldquoATGrdquo exclusivamente como codoacuten de inicio y
como coacutedigo geneacutetico se utilizoacute la opcioacuten 1 correspondiente a ldquoStandardrdquo Esta
aplicacioacuten realiza una traduccioacuten de la secuencia nucleotiacutedica a partir de la
traduccioacuten de seis marcos de lectura y devuelve un graacutefico que indica la ubicacioacuten
donde se encuentra cada marco de lectura identificado (Wheeler et al 2003)
414 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
El peso molecular estimado de los productos de los vectores pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron estimado a traveacutes de la aplicacioacuten Compute pIMW de ExPasy
(httpswebexpasyorgcompute_pi) la cual permite estimar el punto isoeleacutectrico
(pI) teoacuterico y el peso molecular (MW) teoacuterico a partir de secuencias reportadas o
secuencias de aminoaacutecidos ingresados por el usuario (Gasteiger et al 2005)
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415 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
La solubilidad de los productos de los pETNL y pSmbP-LnqQ fueron analizados
por la aplicacioacuten Protein-Sol (httpsprotein-solmanchesteracuk) (Hebditch et al
2017) mientras que la localizacioacuten subcelular de las proteiacutenas fue determinada por
la herramienta BUSCA (httpbuscabiocompuniboit) (Savojardo et al 2018)
416 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
Phyre2 (httpwwwsbgbioicacukphyre2htmlpagecgiid=index) es una
aplicacioacuten en liacutenea para el anaacutelisis de modelado para estructuras secundarias y
tridimensionales Esta herramienta permite predecir y analizar la estructura de la
proteiacutena asiacute como funciones y mutaciones haciendo maacutes faacutecil la interfaz al usuario
para interpretar la estructura secundaria y terciaria de los modelos asiacute como la
composicioacuten de dominios y la calidad del modelo (Kelley Mezulis Yates Wass amp
Sternberg 2015)
417 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
4171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Para transformar las ceacutelulas de E coli con el vector de expresioacuten pET30a(+)
pETNL o pSmbP-LnqQ se utilizoacute la teacutecnica de electroporacioacuten (Potter amp Heller
2003) que consiste en la introduccioacuten de DNA exoacutegeno al interior de las ceacutelulas
por meacutetodos fiacutesico-quiacutemicos A continuacioacuten describimos la teacutecnica
Se preparoacute un cultivo overnight de E coli en un tubo con caldo LB esteacuteril y se
incuboacute por 37degC en agitacioacuten constante por 18 h Al diacutea siguiente 20 microl del cultivo
preinoacuteculo fueron retirados y depositados en un microtubo con 1 ml de caldo LB
esteacuteril este proceso se realizoacute en seis tubos donde tres son etiquetados ldquoMuestrardquo
(M) ldquoAntibioacuteticordquo (A) ldquoViabilidadrdquo (V) y tres maacutes fueron reservados para anaacutelisis
espectrofotomeacutetricos Se incubaron todos los tubos a 37degC durante
aproximadamente 15 h (OD600 entre 04-06) en agitacioacuten constante Todos los
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tubos asignados para anaacutelisis espectrofotomeacutetricos fueron usados para monitoreo
Una vez alcanzado el tiempo establecido los tubos M A y V fueron centrifugados
a 9000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente El sobrenadante de los tubos
fue descartado y las ceacutelulas fueron resuspendidas en 1 ml de agua ultrapura
esteacuteril a temperatura ambiente Los tubos fueron centrifugados a 9000 rpm
durante 2 min a temperatura ambiente Este paso se repitioacute una vez El precipitado
celular en los tubos M A y V fue resuspendido en 35 microl de agua ultrapura esteacuteril y
se agregoacute al menos 2 a 3 microl de plaacutesmido (asymp 500 microg totales) o de agua seguacuten el
caso Finalmente se mezcloacute cuidadosamente con la micropipeta
En el tubo de viabilidad no se agregoacute plaacutesmido y fue sembrado en una placa LB
En el tubo etiquetado como antibioacutetico no se agregoacute plaacutesmido y el precipitado fue
sembrado en una placa de LB suplementado con kanamicina (50 microgml) Al tubo
de control positivo se agregoacute un plaacutesmido resistente a la kanamicina y eacutesta fue
sometida a electroporacioacuten y sembrada en una placa con LB con kanamicina En
la muestra se agregoacute alguno de los siguientes plaacutesmidos pET30a(+) pETNL o
pSmbP-LnqQ y posteriormente fue sometido a electroporacioacuten y sembrado en una
placa de LB con kanamicina
El volumen total de los tubos fue transferido a una celda de electroporacioacuten en el
espacio de 2 mm El equipo de electroporacioacuten (previamente irradiado con luz UV
por 15 min) fue encendido y configurado para electroporar a 2500 V
Posteriormente se agregoacute 1 ml de caldo LB esteacuteril a la celda de electroporacioacuten y
cuidadosamente mezclado (para evitar estresar a la ceacutelula) La mezcla es tomada
con mucho cuidado desde la celda y transferido a un tubo de 15 ml esteacuteril El tubo
fue incubado a 37degC por 1 h en agitacioacuten muy baja Cumplido el tiempo
establecido el tubo fue centrifugado a 9000 rpm durante 2 min Se retiroacute la mayor
parte del sobrenadante (asymp 950 ml) y el restante fue mezclado suavemente con el
precipitado celular hasta suspender la solucioacuten El volumen total resuspendido fue
sembrado en placas de LB agar o LB agar suplementado con kanamicina (50
microgml) dependiendo el caso Las placas fueron incubadas a 37degC en condiciones
de aerobiosis durante 16 h Al terminar las placas fueron revisadas y
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seleccionadas Las ceacutelulas efectivamente transformadas con los plaacutesmidos fueron
resistentes a la accioacuten de la kanamicina mientras que las no transformadas fueron
eliminadas Las ceacutelulas transformadas fueron validadas posteriormente por
teacutecnicas moleculares como extraccioacuten de DNA plasmiacutedico yo identificacioacuten por
producto de PCR punto final
4172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Para la extraccioacuten y purificacioacuten utilizamos el Isolate II Plasmid Mini Kit de
Meridian Biosciencereg (Estados Unidos Cat BIO-52056) Se preparoacute un cultivo
overnight de E coli en un tubo 5 ml de caldo LB esteacuteril y se incuboacute por 37degC en
agitacioacuten constante por no maacutes ni menos de 16 h Al diacutea siguiente previo al
ensayo de extraccioacuten se precalentoacute la solucioacuten de buffer de lavado PW1 a 50degC y
la temperatura se mantuvo a esta temperatura hasta su uso Se verificoacute que el
buffer de lavado PW2 estuviera suplementado con etanol
El cultivo overnight fue centrifugado a 11000 x g por 30 minutos El volumen se
retiroacute y se mantuvo el precipitado celular al cual se agregoacute 250 microl del buffer de
resuspensioacuten P1 y el precipitado se resuspendioacute por completo por voacutertex Es
importante que no quede masa celular adherida en los tubos Posteriormente se
agregaron 250 microl de buffer de lisis P2 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas
6 a 8 veces El tubo fue incubado a temperatura ambiente por 5 min o hasta que el
lisado celular se tornara claro Cumplido el tiempo anterior se adicionaron 300 microl
de buffer de neutralizacioacuten P3 y se mezcloacute suavemente por inversioacuten unas 6 a 8
veces Este procedimiento fue para evitar el rompimiento del DNA genoacutemico Los
tubos fueron centrifugados a 11000 x g durante 5 min a temperatura ambiente
Este paso fue repetido hasta que el sobrenadante quedara lo maacutes claro posible
Posteriormente se tomoacute una columna tipo spin y sobre eacutesta se agregoacute un tubo
colector y sobre eacutesta se antildeadioacute el volumen recuperado del paso anterior El tubo
con el volumen fue centrifugado a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Sobre el tubo colector se
agregoacute 500 microl de buffer de lavado PW1 precalentado y se centrifugoacute a 11000 x g
por 5 min a temperatura ambiente El sobrenadante del tubo fue eliminado por
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decantacioacuten Se adicionoacute 600 microl de buffer de lavado PW2 (suplementado con
etanol) y se centrifugoacute a 11000 x g por 5 min a temperatura ambiente El
sobrenadante del tubo fue eliminado por decantacioacuten Centrifugar de nuevo el tubo
colector a 11000 x g por 2 min a temperatura ambiente para remover etanol
residual
Debajo del tubo colector se colocoacute un tubo de 15 ml esteacuteril y se agregoacute 50 microl de
buffer de elucioacuten P directamente sobre la membrana de siacutelice Se incuboacute a
temperatura ambiente y se centrifugoacute a 11000 x g por 2 min a temperatura
ambiente Del tubo con DNA purificado se tomaron 2 microl y se analizaron por nano-
espectrofotometriacutea para el caacutelculo de concentracioacuten y de pureza del DNA
plasmiacutedico
4173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Para comprobar que las ceacutelulas de E coli fueran efectivamente transformadas con
el vector de expresioacuten pET30a(+) pETNL y pSmbP-LnqQ se realizoacute un
experimento de PCR punto final para identificar al plaacutesmido recuperado de las
ceacutelulas de E coli Para ello nos enfocamos en primer lugar a elegir un par de
oligonucleoacutetidos que cumplieran de identificar los vectores de expresioacuten
El par de oligonucleoacutetidos elegidos para el anaacutelisis de las construcciones
corresponden al T7 promoter primer (5rsquo- TAATACGACTCACTATAGGG-3rsquo) y al T7
terminal primer (5rsquo- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3rsquo) los cuales son oligonucleoacutetidos
especiacuteficos para vectores construidos basados en pET30a(+) La secuencia de
ambos oligonucleoacutetidos fue recuperada de una compilacioacuten de AddGene para
ldquoSequencing Primersrdquo (httpswwwaddgeneorgmol-bio-referencesequencing-
primers)
Para determinar la temperatura de fusioacuten oacuteptima del par de oligonucleoacutetidos
utilizamos dos herramientas bioinformaacuteticas en liacutenea La primera aplicacioacuten fue
OligoAnalyzertrade (httpswwwidtdnacomcalcanalyzer) de la compantildeiacutea Integrated
DNA Technologies Inc (Estados Unidos) donde se ajustaron paraacutemetros como la
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concentracioacuten de oligonucleoacutetido las concentraciones de iones monovalentes
(Na+) y divalentes (Mg2+) asiacute como la concentracioacuten de nucleoacutetidos (dNTPs) en la
reaccioacuten para el caacutelculo de formacioacuten de hairpin homodiacutemeros y heterodiacutemeros
La otra aplicacioacuten es Net Primer (httpswwwpremierbiosoftcomnetprimer) de
Premier Biosoft que tambieacuten contiene puntos como la aplicacioacuten anteriormente
mencionada pero contiene opciones como el caacutelculo de rating de eacutexito y
estabilidad en el extremo 3rsquo-terminal
Para realizacioacuten del ensayo de PCR punto final utilizamos el High-Stability PCR
kit (Cat No L00342 Manual No 0285 Versioacuten 08272013) de GenScript Inc
(Estados Unidos) De esta manera ajustamos las condiciones de reaccioacuten de PCR
seguacuten lo determinado por el fabricante para por la DNA polimerasa Green Taq La
reaccioacuten de PCR punto final se ajustoacute a una concentracioacuten de oligonucleoacutetidos de
trabajo para 10 microM concentracioacuten de monovalentes (Na+K+) a 500 mM
concentracioacuten de divalentes (Mg2+) a 15 mM y concentracioacuten de dNTPs a 05 mM
El protocolo general para ensayo de PCR punto final de acuerdo con el fabricante
consistioacute en que por cada 50 microl de volumen de reaccioacuten se agregariacutean 5 microl de 10
X de Reaction Buffer 10 microl de 10 mM de dNTPs 10 microl por el oligonucleoacutetido 5rsquo-
terminal a 20 microM 10 microl por el oligonucleoacutetido 3rsquo-terminal a 20 microM 20 microl de
plaacutesmido (de al menos 100 ngmicrol) 395 microl de agua ultrapura esteacuteril y 05 microl de la
DNA polimerasa Green Taq
4174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Las muestras obtenidas fueron procesadas en un gel de agarosa (1 pv)
adicionada con Eco-Stain ready to use (Cat No DT81413) de BioBasic Inc
(Canadaacute) el cual es una sustancia que tiene un pico de excitacioacuten a λ = 490 nm y
dos picos de emisioacuten λ = 520 nm y λ = 635 nm y esta solucioacuten se agrega al gel en
una relacioacuten de 1 microl por 20 ml de solucioacuten de agarosa Las muestras fueron
corridas durante 1 h a 100 V en caacutemara para electroforesis Al terminar el tiempo
establecido el gel fue retirado e iluminado con luz UV en el transiluminador y se
tomoacute una fotografiacutea como evidencia Todos los geles fueron elaborados con su
respectivos controles positivos negativos y muestras
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418 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
4181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Brevemente cultivos con diferentes cepas de E coli transformados con
pET30a(+) pETNL o pSmbP-LnqQ fueron inducidos con IPTG Se realizoacute un
cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado en un matraz con 25 ml de
caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50 microgml) a 37degC en agitacioacuten
constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se registroacute el valor de OD600 del
cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo preinoacuteculo en un matraz
esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina hasta llegar a un valor
inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado a 37degC en agitacioacuten constante
hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de OD600 asymp 04
Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue inoculado con
IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos diferentes
temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue distribuido en
tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten Todos los tubos
usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los tubos fueron
propiamente etiquetados
4182 Extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pETNL
Los cultivos de E coli transformados ya fuera con pET30a(+) pETNL o pSmbP-
LnqQ fueron inducidos por IPTG para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
Brevemente se realizoacute un cultivo preinoacuteculo de E coli BL21 (DE3) transformado
en un matraz con 25 ml de caldo LB suplementado con kanamicina (conc final 50
microgml) a 37degC en agitacioacuten constante durante toda la noche Al diacutea siguiente se
registroacute el valor de OD600 del cultivo preinoacuteculo Se inoculoacute un volumen de cultivo
preinoacuteculo en un matraz esteacuteril con 25 ml de caldo LB suplementado con
kanamicina hasta llegar a un valor inicial de OD600 asymp 01 Este matraz fue incubado
a 37degC en agitacioacuten constante hasta alcanzar un valor espectrofotomeacutetrico de
OD600 asymp 04 Una vez que cultivo cumplioacute con punto anterior este cultivo fue
inoculado con IPTG (concentracioacuten final 01 mM) y se incuboacute durante 16 h en dos
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diferentes temperaturas a 25degC y a 37degC Cumplido el tiempo el cultivo fue
distribuido en tubos de 50 ml esteacuteriles y enviados directamente a congelacioacuten
Todos los tubos usados fueron pesados previo a su llenado con los cultivos Los
tubos fueron propiamente etiquetados
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten periplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Santos y sus colaboradores (BD Santos et al 2019) que es un
procedimiento en un ensayo de lisozima con choque osmoacutetico Se descongeloacute los
tubos a baja temperatura y posteriormente fueron centrifugados a 8000 times g
durante 15 min a 4degC El sobrenadante de cada tubo fue eliminado y lavado dos
veces con buffer PBS 1X pH 74 (Gibco) friacuteo (8000 times g durante 10 min a 4degC) En
el uacuteltimo lavado los tubos con precipitado celular fueron pesados y sus pesos se
registraron Por uacuteltimo se calculoacute la diferencia entre los tubos con precipitado
celular contra los tubos cuando estaban vaciacuteos A cada uno de los tubos con
precipitado celular se le agregoacute solucioacuten hipertoacutenica friacuteo (sacarosa 20 trizma 20
mM EDTA 2 mM y lisozima 20 mgml pH 80) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten
hipertoacutenica por cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido
de cada tubo fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el
tiempo el cultivo fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC
El sobrenadante fue recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten
periplaacutesmica hipertoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El
precipitado celular es reservado Una vez retirada la fraccioacuten anterior los tubos
con precipitado celular remanentes fueron pesados de nuevo y se agregoacute solucioacuten
hipotoacutenica (agua ultrapura esteacuteril) a una relacioacuten de 10 microl solucioacuten hipotoacutenica por
cada mg de peso huacutemedo de ceacutelulas Posteriormente el contenido de cada tubo
fue mezclado y fueron incubados por 40 min a 4degC Finalizado el tiempo el cultivo
fue centrifugado a 8000 times g durante 10 min a 4degC El sobrenadante fue
recuperado en nuevos tubos y etiquetados como ldquoFraccioacuten periplaacutesmica
hipotoacutenicardquo y se conservaron a -20degC hasta nuevo uso El precipitado celular se
eliminado
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4183 Extraccioacuten de proteiacutenas citoplaacutesmicas en ceacutelulas de E coli
transformados con pSmbP-LnqQ
Para la extraccioacuten de proteiacutenas en la seccioacuten citoplaacutesmica de ceacutelulas se utilizoacute el
protocolo de Vargas y sus colaboradores (Vargas-Cortez et al 2016) junto con
recomendaciones de Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) que es un
procedimiento basado en perlas de vidrio
Se descongelaron los tubos a baja temperatura y posteriormente centrifugados a
8000 times g durante 15 min a 4degC El precipitado celular de los tubos fueron
resuspendidos en buffer de lisis friacuteo (Tris-HCl 50 mM NaCl 500 mM pH 80) y se
agregaron 150 mg de perlas de vidrio limpios de 01 mm Los precipitados
celulares resuspendidos en perlas fueron mezclados por voacutertex durante 1 min Los
tubos fueron centrifugados a maacutexima velocidad por 15 min a 4degC El sobrenadante
fue recuperado con cuidado de cada tubo y fue etiquetado como ldquoFraccioacuten
citoplaacutesmicardquo
4184 Obtencioacuten de fracciones solubles e insolubles para SDS-PAGE
Para obtener las fracciones solubles e insolubles seguimos el protocolo de Santos
(Byran Santos 2017) Para la fraccioacuten soluble a partir del sedimento celular eacutesta
es resuspendida en 120 microl de agua ultrapura esteacuteril y despueacutes se le agregan 40 microl
de solucioacuten amortiguadora de carga SDS-PAGE 4X suplementado con β-
mercaptoetanol para una concentracioacuten final al 1X La solucioacuten fue hervida durante
10 min y posteriormente centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante
fue separado y guardado como ldquoFraccioacuten solublerdquo Luego al sedimento restante
se le agregaron 120 microl de solucioacuten de urea 8 M y se hierve de nuevo durante otros
10 min para solubilizacioacuten de los cuerpos de inclusioacuten Finalmente la solucioacuten fue
centrifugada a 13000 rpm por 10 min El sobrenadante fue separado y guardado
como ldquoFraccioacuten insolublerdquo Ambas fracciones fueron visualizadas posteriormente
en los geles de SDS-PAGE
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4185 Preparacioacuten de gel de SDS-PAGE 16
Los geles de SDS-PAGE fueron preparados bajo las siguientes condiciones se
prepararon dos geles en dos tubos nuevos e independientes conocidos como
lower y upper con suficiente capacidad para almacenar el volumen de cada gel
Primero se preparoacute el lower gel y solo hasta haber terminado ese gel se procedioacute
a preparar el upper gel
Para preparar el lower gel a 16 preparamos una reaccioacuten considerando un
volumen de 10 ml Para ello mezclamos 350 ml de agua destilada 400 ml de
solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) 250 ml de lower buffer (para 25 ml Tris
1515 g SDS 01 g pH 68) 200 microl de APS 10 (pv) y TEMED 20 microl Para el
upper gel a 4 estaacute reaccioacuten fue montada con un volumen de 5 ml Para ello
mezclamos 325 ml de agua destilada 050 ml de solucioacuten de BisAcrilamida 40
(291) 125 ml de upper buffer (para 25 ml Tris 454 g SDS 01 g pH 88) 100 microl
de APS 10 (pv) y 20 microl de TEMED
Tanto la solucioacuten de BisAcrilamida 40 (291) del upper buffer y el lower buffer
fueron retirados del refrigerador y atemperados a temperatura ambiente cuando
menos unos 15 min antes de uso La solucioacuten de APS a una relacioacuten de 01 g por
1 ml (10 pv) debioacute prepararse al momento con agua destilada limpia Toda la
cristaleriacutea usada para preparar el gel de poliacrilamida debioacute ser lavada con agua
destilada limpia y secarse con suficiencia evitando rayar los vidrios
Una vez agregado el TEMED a la mezcla la solucioacuten fue inmediatamente vertido
sobre placas de vidrio Fue necesario esperar entre 20 a 30 minutos para que
completar el proceso de polimerizacioacuten En el lower gel se agregaron 200 microl de
isobutanol para el upper gel en la parte superior se agregoacute un molde para
pocillos Terminado el tiempo de polimerizacioacuten se agregaron las muestras de
proteiacutenas en los pocillos del gel de SDS-PAGE Los geles fueron puestos sobre
una caacutemara de electroforesis vertical y sumergidos en un buffer de corrida a 1X
(para 1000 ml Tris 3 g Glicina 144 g y SDS 1 g) El gel fue corrido a 150 V
durante 1 a 15 h dependiendo de la liacutenea de corrida de la solucioacuten
amortiguadora
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 48
4186 Tincioacuten de gel SDS-PAGE
Previo a tentildeir los geles se prepararon dos soluciones Para la solucioacuten de tincioacuten
se pesaron cuidadosamente y con guantes 50 mg de Coomasie Blue R-250 en un
tubo plaacutestico limpio para un volumen de 50 ml Despueacutes se agregaron 25 ml de
metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta
50 ml con agua destilada limpia Mantener a temperatura ambiente y en
condiciones de obscuridad hasta su uso Mientras que para la solucioacuten de
destincioacuten se midieron 75 ml de metanol absoluto y 5 ml de aacutecido aceacutetico
absoluto Esta solucioacuten fue aforada hasta 50 ml con agua destilada limpia
Mantener a temperatura ambiente hasta su uso
Cuando terminado el paso de corrida por electroforesis los geles fueron
cuidadosamente separados de los vidrios El gel fue tentildeido con la solucioacuten de
tincioacuten durante toda la noche en agitacioacuten constante a temperatura ambiente y
posteriormente fue destentildeido con la solucioacuten de destincioacuten durante el resto del diacutea
siguiente bajo las mismas condiciones previas El gel fue puesto sobre un fondo
blanco y se fotografioacute como evidencia
419 Presuntas causas de la ausencia de bandas de proteiacutenas de intereacutes en
los geles
La presente seccioacuten fue desarrollada posterior a la conclusioacuten de la fase
experimental con el objetivo de explicar la ausencia de bandas tanto de N-
AmyELnqQ como de SmbP-LnqQ en los geles de SDS-PAGE Para abordar el
problema exploramos las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas por el
anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle un anaacutelisis de perfil
aminoaciacutedico y finalmente a traveacutes de diferencias por su origen evolutivo
Las propiedades fisicoquiacutemicas de las proteiacutenas como el tamantildeo de proteiacutenas
peso molecular punto isoeleacutectrico nuacutemero total de residuos con carga positiva y
negativa iacutendice alifaacutetico (AI) e iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) fueron calculadas
a traveacutes de ProtParam de ExPasy (httpswebexpasyorgprotparamprotparam-
dochtml) (Gasteiger et al 2005) El iacutendice alifaacutetico (AI) estaacute principalmente
afectado por los cuatro aminoaacutecidos con cadena lateral alifaacutetico alanina valina
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 49
leucina e isoleucina El incremento del AI es directamente proporcional a la
termoestabilidad en proteiacutenas globulares (Atsushi 1980) El iacutendice de
hidrofobicidad (GRAVY) es el resultado del promedio que representa la suma total
de los valores de hidropatiacutea de cada uno de los residuos dentro de una cadena
lineal de aminoaacutecidos dividido por el tamantildeo del peacuteptidoproteiacutena Una proteiacutena
con valor GRAVY negativo una proteiacutena hidrofiacutelica mientras que una proteiacutena con
valor GRAVY positivo es hidrofoacutebica (Kyte amp Doolittle 1982)
El anaacutelisis de hidrofobicidad a traveacutes de la escala Kyte-Doolittle fue elaborado a
partir de ProtScale de ExPasy (httpswebexpasyorgprotscale) (Gasteiger et al
2005) Esta herramienta permite elaborar un perfil producido por cualquier escala
aminoaciacutedica a partir de una secuencia aminoaciacutedica Existen 57 escalas de
hidrofobicidad yo hidrofilicidad para fines de nuestro experimento utilizamos la
opcioacuten ldquoHphob Kyte amp Doolittlerdquo
El mapa de calor representa el porcentaje de aminoaacutecidos dada en una secuencia
lineal de aminoaacutecidos con el fin de elaborar un perfil aminoaciacutedico entre los
diferentes peacuteptidos antimicrobianos que fueron efectivamente sobreproducidos por
SmbP La graacutefica fue elaborada a traveacutes de Excel con datos descargados desde la
aplicacioacuten ProtParam de ExPasy
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 50
CAPIacuteTULO 5 MATERIALES Y EQUIPOS
Las actividades del proyecto fueron realizadas en los Laboratorios de Biologiacutea y de
Sistemas del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y Nanotecnologiacutea y el
Laboratorio de Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas ubicado en la Divisioacuten de
Estudios de Posgrado ambas infraestructuras pertenecientes a la Facultad de
Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten
A continuacioacuten se presenta un listado completo de los materiales y equipos
utilizado
51 Materiales y reactivos
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Microtubos de 15 ml 15 ml y 50 ml Distintas marcas No especificado
Cajas Petri de plaacutestico o vidrio Distintas marcas No especificado
Matraces tipo Erlenmeyer Distintas marcas No especificado
Celdas para espectrofotoacutemetro No especificado No especificado
Celdas de electroporacioacuten No especificado No especificado
Micropipetas (varios voluacutemenes) Distintas marcas No especificado
Medio de cultivo LB Difco 244620
Agar bacterioloacutegico MCD-LAB 9011
Agua grado Biologiacutea Molecular Invitrogen 10977-015
Kanamicina sulfato AG Scientific K-1022
Ampicilina soacutedica Sigma Aldrich A0166
Perlas de vidrio 01 mm Biospec 11079101
IPTG Bioline BIO-37036
LDS Sample Buffer 4X GenScript M00676-10
SDS IBI Scientific IB07062
Persulfato de Amonio (APS) BioBasic AB0072
TEMED Merck 110732
Glicina BioBasic GB0235
Bis-Acrilamida 40 (29109) Merck 100641
Coomasie Briliant Blue BioBasic CB0038
2-mercaptoetanol BioBasic MB0338
Isopropanol 100 DEQ No especificado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 51
Aacutecido fosfoacuterico 85 Jalmek A1825-13
Hidroacutexido de sodio DEQ No especificado
Aacutecido clorhiacutedrico DEQ No especificado
Alcohol metiacutelico DEQ No especificado
Aacutecido aceacutetico glacial Jalmek A0925-13
Etanol anhidro Jalmek E5325-18
Urea BioBasic UB0148
Buffer de fosfatos salinos 1X (PBS) Gibco 10010-023
Cloruro de sodio Jalmek S2325-05
Tris BioBasic TB0196
Glicerol DEQ No especificado
Guantes de nitrilo Ambiderm No especificado
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S657-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 7 J T Baker S656-02
Solucioacuten estaacutendar amortiguadora pH 4 J T Baker S655-02
QuickClean II Plasmid Miniprep kit GenScript L00420-100
QuickClean II Gel Extraction Kit GenScript L00418-100
QuickClean II PCR Purification Kit GenScript L00419-50
52 Equipos de laboratorio
USO PERSONAL
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Computadora personal Acer Aspire A515-51
LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA Y DE SISTEMAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Incubadora estaacutetica Lab Companion IB-11E
Incubadora de piso con agitacioacuten Lab Companion IS-971
Incubadora de agitacioacuten (microtubos) Eppendorf ThermoMixer C
Horno de secado Shel Lab SGO 6E
Horno de microondas Everstar P90D23AL-XF
Concentrador Thermo Fisher SpeedVac SPD
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 52
Bantildeo de ultrasonido VMR Symphony 97043-996
Contador de colonias Reichert 3327
Agitador orbital Labnet Orbit 1000
Agitador vertical Thermo Scientific Compact Digital Rocket
Termociclador miniPCR Mini8
Termociclador Techne 3Prime
Refrigerador de puertas deslizantes Thermo Scientific MH45PA-GAEE-TS GPR Series
Refrigerador a dos puertas Norlake Scientific LRF 201WW
Congelador de -20 degC MetalFrio Solutions
No especificado
Espectrofotoacutemetro UV-Vis Optizen 2120 UV Plus
Nanoespectrofotoacutemetro BioSpec Shimadzu
Gabinete bioseguridad clase II Labconco Delta Series
Centriacutefuga para microtubos Ohaus Frontier 5515
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
Voacutertex Scientific Industries
Genie 2
Plancha de calentamiento con agitacioacuten magneacutetica
Lab Companion HP-3000L
Microscopio oacuteptico Fisher Scientific Micromaster
Autoclave Lab Companion ST-G Series
Caacutemara profesional Canon EOS M10
Transiluminador Maestro No especificado
Balanza analiacutetica AND GR-200
Balanza semianaliacutetica Ohaus Traveler
Electroporador Eppendorf Eppendorf
Fuente de Poder BioRad PowerPac Basic
Potencioacutemetro Ohaus Starter 5000
LABORATORIO DE EXPRESIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
Nombre Compantildeiacutea Cataacutelogo
Cromatoacutegrafo GE Life Sciences Aumlktaprime Plus
Centriacutefuga de piso Thermo Scientific Sorvall Legend XFR
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 53
53 Lugares de experimentacioacuten
Nuestro proyecto fue elaborado entre Febrero de 2018 a Mayo de 2021 y fue
mayoritariamente realizado en las instalaciones del Laboratorio de Biologiacutea
Sinteacutetica y de Sistemas (LBSS) a cargo del Dr Heacutector Javier Ameacutezquita Garciacutea
encontraacutendose en el interior del Centro de Investigacioacuten en Biotecnologiacutea y
Nanotecnologiacutea (CIBYN) dependencia de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas
(FCQ) de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten El centro estaacute ubicado en la
autopista al Aeropuerto ldquoMariano Escobedordquo Km 10 Parque de Investigacioacuten e
Innovacioacuten Tecnoloacutegica (PIIT) CP 66628 en Apodaca Nuevo Leoacuten Meacutexico
En menor proporcioacuten nuestro trabajo tambieacuten fue realizado en el Laboratorio de
Expresioacuten y Purificacioacuten de Proteiacutenas (PEP) a cargo del Dr Xristo Zaacuterate
Kalfoacutepulos Esta unidad estaacute localizada en el interior de la Divisioacuten de Estudios de
Posgrado (DEP) de Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la Universidad
Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) La ubicacioacuten de la divisioacuten estaacute en la calle
Vicente Guerrero sn Col Trevintildeo CP 64570 en Monterrey Nuevo Leoacuten
Meacutexico
54 Seguridad en el laboratorio y disposicioacuten de residuos
Declaracioacuten de manejo y disposicioacuten de residuos
Todos residuos generados durante la realizacioacuten del proyecto de investigacioacuten
fueron gestionados de acuerdo con las caracteriacutesticas de estos siguiendo los
lineamientos establecidos por el Departamento de Medio Ambiente y Seguridad de
la Facultad de Ciencias Quiacutemicas utilizando los recipientes proporcionados por
este departamento en base a la Norma PR-CLB-SRR-000
Los residuos bioloacutegico-quiacutemicos fueron dispuestos en los contenedores
correspondientes en el interior de los laboratorios
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 54
CAPIacuteTULO 6 RESULTADOS Y DISCUSIONES
61 Concepto del biosensor basado en ceacutelulas enteras
En esta seccioacuten nos centramos en el disentildeo in silico de ceacutelulas de E coli
configuradas para detectar moleacuteculas de AIP producidos por el sistema nativo de
QS de ceacutelulas de MRSA De acuerdo con nuestro disentildeo (Figura 2) las ceacutelulas α
corresponden a ceacutelulas de S aureus productoras de moleacuteculas AIP mientras que
las ceacutelulas β corresponden a ceacutelulas de E coli que han sido modificadas con un
par de moacutedulos geneacuteticos biosensor y bacteriocina que le permiten detectar
moleacuteculas de AIP y en respuesta destruyen ceacutelulas de S aureus en el medio A
manera de resumen las ceacutelulas de E coli modificadas producen y excretan LnqQ
en funcioacuten de la concentracioacuten externa de moleacuteculas de AIP
Nuestra determinacioacuten por elegir bacteriocinas como sustancias antimicrobianas
para nuestro sistema biosensor se explica en la siguiente numeracioacuten en primer
lugar consideramos que debido a su origen proteico son susceptibles a
modificaciones geneacuteticas (Cotter et al 2013)
Figura 2 Sistema QS para deteccioacuten y eliminacioacuten de S aureus
El moacutedulo biosensor conformado por agrC y agrA (azul marino y azul celeste respectivamente) estaacute regulado
por el promotor constitutivo J23110 La deteccioacuten del AIP-II (pentaacutegonos naranja) estaacute regulado por AgrC la
cual activa la fosforilacioacuten (ciacuterculos amarillo) de AgrA y activa la expresioacuten del moacutedulo bacteriocina a traveacutes
de la lnqQ lnqBCEDF y gfp (rojo amarillo y verde respectivamente) regulado por el promotor P2 LnqQ
destruye ceacutelulas de S aureus
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 55
62 Cepas bacterianas
La razoacuten de escoger a E coli como chasis bioloacutegico de produccioacuten es porque ya
ha sido reportado previamente como biosensor de ceacutelulas enteras basados en
deteccioacuten del QS (Sedlmayer Hell Muumlller Auslaumlnder amp Fussenegger 2018) y
ademaacutes porque es el organismo de produccioacuten heteroacuteloga maacutes usado en el campo
de las bacteriocinas (Mesa-Pereira et al 2018) Nuestro modelo estaacute disentildeado
para ser aplicado en E coli BL21 (DE3) ya que ha sido efectivamente reportado
para producir y secretar bacteriocinas de las clases IIa y IId eacuteste uacuteltimo es
importante ya que esta es la clase a la que pertenece la bacteriocina LnqQ (Mesa-
Pereira et al 2017)
63 Disentildeo de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina
Para determinar el comportamiento in silico de nuestra ceacutelula de E coli fue
necesario disentildear un vector de expresioacuten con dos moacutedulos geneacuteticos y eacutestos
fueron referidos como moacutedulo biosensor y moacutedulo de bacteriocina
respectivamente Ambos moacutedulos fueron disentildeados de la siguiente manera
promotor-RBS-gene(s) estructural(es)-doble terminador (Figura 3)
Figura 3 Moacutedulos biosensor y de bacteriocina
El moacutedulo biosensor es configurado con agrC y agrA y estaacuten regulados transcripcionalmente por el promotor
J23110 (A) El moacutedulo de bacteriocina estaacute armado con los genes lnqQ y gfp y estaacuten regulados
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 56
transcripcionalmente por el promotor P2 (B) Por uacuteltimo se muestra el disentildeo del sistema detectar y destruir
con los promotores divergentes J23110 y P2 (C)
En primera instancia se debioacute localizar el locus geneacutetico del promotor P2 de
nuestra MRSA fue manualmente localizado puesto que no existiacutea informacioacuten
relacionada al mismo De acuerdo con Shao y otros el locus de un promotor se
encuentra evolutivamente conservado entre especies que estaacuten relacionadas
(Shao Price Deutschbauer Romine amp Arkin 2014) De esta manera utilizamos
la anterior premisa para localizar el promotor P2 en un primer enfoque
localizamos la secuencia nucleotiacutedica del agrB en el archivo genoacutemico de la
MRSA (564 nucleoacutetidos KEGG no SA1842) como referencia ya que se conoce
que este gen es conocido que eacutesta es la primera unidad transcripcional ubicada riacuteo
abajo del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Para el segundo
enfoque usamos la informacioacuten disponible del promotor P2 de S aureus NCTC
8325 (Rajasree Fasim amp Gopal 2016 Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) una
cepa catalogada como estaacutendar para estudios bioinformaacuteticos (S Fuchs et al
2017 Herbert et al 2010) Al combinar lo mejor de ambos enfoques logramos
localizar la composicioacuten nucleotiacutedica del promotor P2 y su tamantildeo a traveacutes de la
identificacioacuten de los dominios
A continuacioacuten explicamos el principio del disentildeo de ambos moacutedulos En primer
lugar el moacutedulo designado como biosensor los genes agrC y agrA son
constitutivamente expresados por accioacuten del promotor J23110 Brevemente se
describe el principio del disentildeo donde inicialmente el AgrC anclado a membrana
de E coli detecta la presencia de moleacuteculas de AIP externas (Marchand amp Collins
2013) De esta manera AgrC sufre de un cambio conformacional y fosforila al
factor de transcripcioacuten AgrA Despueacutes el AgrA fosforilado (AgrA) actuacutea como
factor de transcripcioacuten del promotor P2 (Reynolds amp Wigneshweraraj 2011) Una
vez que AgrA-P se ha acoplado al promotor P2 el moacutedulo de bacteriocina es
expresado incluyendo los genes tipo estructural (lnqQ) excrecioacuten y
autoinmunidad (lnqBCEDF) del operoacuten lnq asiacute como del gen reportero gfp
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 57
Algunos autores han demostrado que mantener intacto el operoacuten nativo de una
bacteriocina cualesquiera (es decir que contenga los elementos geneacuteticos de su
estructura para su secrecioacuten y para autoinmunidad) en E coli eacutesta ceacutelula
modificada es capaz de excretar bacteriocinas Gram positivos al medio
extracelular (Mesa-Pereira et al 2017)
64 Estrategia general para el ensamblaje de moacutedulos
Los moacutedulos geneacuteticos fueron disentildeados para operar en el mismo sentido que el
ensamble por tipo BioBrick al yuxtaponer las propiedades del BioBrick (RFC 10) y
el BglBrick (RFC 21) La intencioacuten del disentildeo es que nuestros moacutedulos geneacuteticos
sean faacutecilmente ensamblados o removidos por teacutecnicas como In-Fusion (Sleight
Bartley Lieviant amp Sauro 2010) o ensamblado por clonacioacuten in vivo (Garciacutea-
Nafriacutea Watson amp Greger 2016) dado que los sitios de restriccioacuten actuacutean como
sitios homoacutelogos para la clonacioacuten
Cada moacutedulo estaacute flanqueado por sitios de restriccioacuten para que puedan ser
intercambiados de ser necesario El moacutedulo de promotores estaacute flanqueado por
los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI manteniendo a EcoRI como unidad neutral
para cuando sean necesario el intercambio de piezas Los elementos del moacutedulo
biosensor estaacuten flanqueados por los sitios BglII y BamHI y los elementos del
moacutedulo de bacteriocinas estaacuten rodeados por los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI
(Figura 4)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 58
Figura 4 Estrategia de construccioacuten in silico
El moacutedulo biosensor (seccioacuten A) estaacute constituido por el BglBrick RFC21 mientras que el moacutedulo bacteriocina
(seccioacuten C) estaacute representado por el BioBrick RFC10 La seccioacuten de promotores (seccioacuten B) fue colocado en
caso de que los promotores fueran cambiados Cada bloque contiene una regioacuten prefija y otra sufija y cada
bloque estaacute flanqueado en ambas direcciones por terminadores dobles de transcripcioacuten (BBa_B0015 ciacuterculos
rojos) La seccioacuten B estaacute bordeada por los sitios de restriccioacuten BglII y XbaI (G-X) con la regioacuten EcoRI como
neutral La seccioacuten A EcoRI y BglII (E-G) estaacuten anclados como prefijos mientras que BamHI y XhoI (B-X)
estaacuten puestos como sufijos Los sitios de restriccioacuten BglII y BamHI fueron usados para construir el promotor
constitutivo J23110 en conjunto a su parte estructural (RBS-gen) para el moacutedulo de biosensor Por otro lado
para la seccioacuten C el prefijo estaacute compuesto por los sitios EcoRI-XbaI (E-X) y los sitios SpeI-PstI (S-P) son
colocados como prefijos Los sitios de restriccioacuten XbaI y SpeI fueron usados para construir el promotor
inducible P2 y en conjunto a su parte estructural (RBS-gene) para el moacutedulo de bacteriocina
El plaacutesmido pSB1A3 (AddGene no 116850) (Dupin amp Simmel 2019) sirvioacute como
plantilla para la construccioacuten de los moacutedulos geneacuteticos Las secciones prefijo y
sufijo fueron manualmente remplazados por cualquiera de los moacutedulos disentildeados
El replicoacuten y los genes de resistencia a antibioacutetico del plaacutesmido fueron retenidos
pero el terminador de transcripcioacuten fue remplazado por terminadores dobles
Finalmente un par de plaacutesmidos fueron construidos y cada uno contiene
individualmente del moacutedulo de biosensor o de bacteriocina respectivamente
Finalmente ambos plaacutesmidos fueron manualmente mezclados para crear un
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 59
plaacutesmido que contiene un par de moacutedulos que estaacuten en direcciones divergentes
Este vector de expresioacuten fue nombrado Dual Biosensor-Killer (Figura 5)
Figura 5 Representacioacuten esquemaacutetica del vector Dual Biosensor-Killer
El moacutedulo biosensor contiene los genes agrC y agrA y estaacute rodeado por los sitios de restriccioacuten EcoRI BglII y
XhoI mientras que el moacutedulo de bacteriocina contiene los genes del cluacutester lnqQBCDEF y el gen reportero gfp
y estaacute flanqueado por los sitios de restriccioacuten EcoRI XbaI SpeI y PstI Este plaacutesmido contiene un marcador
de resistencia a ampicilina y se compone de un total de 8904 pb
Parte de la estrategia de nuestro disentildeo consistioacute en que los promotores J23110 y
P2 fueran colocadas en sentidos opuestos para regular de manera independiente
la actividad de los moacutedulos biosensor y de bacteriocina respectivamente La razoacuten
de aislar ambos moacutedulos es para evitar la expresioacuten por goteo que pudiera existir
por efecto de la fuerza de alguno de los promotores al mantenerse en la misma
direccioacuten transcripcional (Lubkowicz et al 2018) Todos los archivos generados
para la elaboracioacuten del vector de expresioacuten Dual Biosensor-Killer fueron
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 60
elaborados por SnapGene y estaacuten disponibles en los archivos anexos de esta
misma tesis
65 Optimizacioacuten de los codones nativos
De acuerdo con las observaciones (Tabla 1) todas las secuencias fueron
optimizadas para ser expresadas en E coli cepa tipo B Noacutetese que los sitios de
restriccioacuten tiacutepicos y los codones de paro de todas las secuencias utilizadas fueron
removidos El iacutendice CAI antes de la optimizacioacuten en AgrC AgrA LnqQ LnqB
LnqC LnqE LnqD y LnqQ era de 0407 0402 0532 0525 0518 0511 0503
and 0521 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores cambiaron a
0770 0766 0675 0735 0771 0773 0777 y 0747 respectivamente El valor
CAI para la GFP no pudo ser determinado por la aplicacioacuten antes de la
optimizacioacuten pero siacute despueacutes de la optimizacioacuten el cual correspondioacute a 0759 En
relacioacuten con el contenido de GC los valores antes de la optimizacioacuten fueron
282 272 333 225 231 305 y 245 respectivamente Despueacutes de
la optimizacioacuten los datos fueron 433 446 469 400 421 410
431 424 y 424 respectivamente El contenido GC para GFP despueacutes de
la optimizacioacuten fue de 491
Nuestros resultados el promedio del valor CAI y el promedio de contenido GC de
todas las secuencias aminoaciacutedicas antes de ser optimizadas era de 049 plusmn 005 y
2690 plusmn 371 respectivamente Despueacutes de la optimizacioacuten los valores
promedio fueron 075 plusmn 003 y 4361 plusmn 287 respectivamente Seguacuten las
especificaciones de la aplicacioacuten si el valor CAI es maacutes cercano a 1 eacuteste indica
que la secuencia de nucleoacutetidos utiliza los codones maacutes utilizados por el
organismo productor heteroacutelogo (Puigbograve et al 2008) Seguacuten los resultados los
valores CAI y el contenido GC de todas las proteiacutenas utilizadas como datos de
entrada fue substancialmente mejorados y estaacute optimizada para ser utilizado en E
coli heteroacuteloga La finalidad de optimizar el contenido nucleotiacutedico de las
secuencias utilizadas para disentildeo a las caracteriacutesticas requeridas del hospedero
es para incrementar el rendimiento de produccioacuten (Puigbograve et al 2008)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 61
Tabla 1 Uso de codones previo y despueacutes de la optimizacioacuten
Paraacutemetros Previo a la optimizacioacuten Despueacutes de la optimizacioacuten
Gen Tamantildeo (pb) CAI GC CAI GC
agrC 1116 0407 282 0770 433
agrA 717 0402 272 0766 446
lnqQ 162 0532 333 0675 469
lnqB 240 0525 225 0735 400
lnqC 480 0518 231 0771 421
lnqE 1299 0511 259 0773 410
lnqD 678 0503 305 0777 431
lnqF 795 0521 245 0747 424
gfp NA NA NA 0759 491
El iacutendice de adaptacioacuten (CAI) y el contenido de guanidina y citosina (GC) La tabla se divide en dos
secciones previo a la optimizacioacuten y despueacutes de la optimizacioacuten La columna de gen representa el nombre del
dato de entrada y el tamantildeo que indica el total de nucleoacutetidos para cada entrada Los resultados en la tabla
representan la adaptabilidad de las secuencias de entrada usando a E coli como hospedero No fue posible
determinar el uso de codones antes de la optimizacioacuten para el gen gfp debido a que no hay suficiente
informacioacuten al computador el iacutendice CAI con esta tabla de referencia NA = No Aplica
66 Especificidad de biosensor por prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Es conocido que S aureus posee cuatro grandes variantes de clases de
moleacuteculas de AIP (desde I hasta IV) la cual difiere entre uno a dos residuos en la
seccioacuten madura del AIP (Ji et al 2005 B Wang amp Muir 2016) La diferencia
estructural entre las clases de AIP pueden actuar como inhibidores competitivos
del QS cuando interactuacutean con cepas filogeneacuteticamente relacionadas Este
fenoacutemeno bioloacutegico es conocido como comunicacioacuten cruzada (Everett amp
Rumbaugh 2014)
Para predecir la probabilidad de comunicacioacuten cruzada de nuestro biosensor
descargamos las secuencias aminoaciacutedicas de las cuatro variantes maacutes
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 62
representativas de AgrD junto la informacioacuten anotada del AgrD de la cepa MRSA
estaacutendar Finalmente realizamos un alineamiento local bajo la herramienta
EMBOSS Water entre cada una de las secuencias aminoaciacutedicas representativas
contra la secuencia aminoaciacutedica de nuestra cepa Los resultados revelan (Tabla
2) que el AgrD de nuestro MRSA tuvo un porcentaje de identidad y de similitud con
el AgrD clase I de 478 y 652 respectivamente Para la clase II los
porcentajes fueron 100 y 100 respectivamente mientras que con la clase III
fueron de 326 y 500 respectivamente Finalmente con la clase IV los
porcentajes fueron de 457 y 609 respectivamente Seguacuten los resultados del
alineamiento podemos inferir que nuestro biosensor es uacutetil para detectar
moleacuteculas de QS producidos por S aureus N315 y por otros S aureus que sean
productores de AIP tipo II Al mismo tiempo nuestro sistema estariacutea limitado a no
detectar S aureus productores de AIP clases I III y IV
Bajo la prediccioacuten anterior nuestro biosensor completo de ceacutelulas estariacutea
capacitado para detectar ceacutelulas de S aureus N315 inclusive cepas de S aureus
USA100 las cuales son productoras naturales de moleacuteculas de AIP clase II
(Grundstad et al 2019) y estaacuten sentildealadas como entre las principales cepas tipo
MRSA que circulan a nivel mundial esta cepa es altamente letal y es una causa
de endocarditis infecciosa en la vaacutelvula nativa del corazoacuten A nivel in vitro se
reporta que es una productora de biopeliacuteculas fuertes (King Kulhankova Stach
Vu amp Salgado-Paboacuten 2016) A pesar de ser una cepa principalmente asociada a
infecciones adquiridas en hospitales (Limbago et al 2009 Tenover et al 2008)
tambieacuten se ha encontrado entre individuos que no han recibido cuidados meacutedicos
previos Noacutetese que esta cepa es resistente a vancomicina (Roberts 2013)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 63
Tabla 2 Prediccioacuten de comunicacioacuten cruzada
Clase AIP Alineamiento de proteiacutenas Tamantildeo ID Similitud Gaps Score Ref
I MNTLFNLFFDFITGILKNIGNIAAYSTCDFIMDEVEVPKELTQLHE- 46 478 652 00 1700 1 2
II MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK 47 1000 100 00 24000 1 2
III MKKLLNKVIELLVDFFNSIGYRAAYINCDFLLDEAEVPKELTQLHE- 46 326 500 00 7200 1 2
IV MNTLYKSFFDFITGVLKNIGNVASYSTCYFIMDEVEIPKELTQLHE- 46 457 609 00 10500 2
MRSA MNTLVNMFFDFIIKLAKAIGIVGGVNACSSLFDEPKVPAELTNLYDK - - - - -
El alineamiento de proteiacutenas se realizoacute entre las cuatro clases mayoritarias de AIP contra el MRSA El alineamiento fue realizado en el programa Clustal Omega
mientras que la identificacioacuten (ID) similitud gaps y score fue determinado de la aplicacioacuten EMBOSS Water
1 (B Wang amp Muir 2016)
2 (Ji et al 2005)
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67 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
El anaacutelisis de solubilidad y localizacioacuten subcelular entre todas las secuencias
aminoaciacutedicas utilizadas para construir biosensor de ceacutelulas enteras es necesario
para obtener un alto rendimiento productivo (Ghosh et al 2004) Seguacuten los
resultados obtenidos por la aplicacioacuten Protein-Sol (Tabla 3) para prediccioacuten de
solubilidad eacutestos indican que LnqQ LnqF AgrA y GFP son considerados solubles
mientras que los datos obtenidos para LnqB LnqC y LnqE no pudieron ser
considerados ya que la aplicacioacuten los clasificoacute como proteiacutenas de membrana
Tabla 3 Prediccioacuten de solubilidad de proteiacutenas
Gen Iacutendice Solubilidad
AgrC 0366 Invaacutelido
AgrA 0514 Soluble
LnqQ 0655 Soluble
LnqB 0655 Invaacutelido
LnqC 0644 Invaacutelido
LnqD 0388 Invaacutelido
LnqE 0609 Invaacutelido
LnqF 0607 Soluble
GFP 0592 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice superior de 045 es
porque se consideraron proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
68 Localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
De acuerdo con las predicciones de la aplicacioacuten BUSCA (Tabla 4) la localizacioacuten
subcelular de las proteiacutenas AgrA LnqQ LnqE y GFP es en el citoplasma mientras
que AgrC LnqB LnqC LnqD LnqE y LnqF son producidos en la membrana
plasmaacutetica Los caacutelculos predictivos en las proteiacutenas a sobreproducirse en E coli
concuerda con lo observado en la literatura para los elementos geneacuteticos del
moacutedulo biosensor el AgrC actuariacutea como una proteiacutena transmembranal con
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 65
actividad histidina quinasa mientras que AgrA actuariacutea como factor de
transcripcioacuten que se mueve a traveacutes del citoplasma para anclarse al promotor P2
(Gomes-Fernandes et al 2017) En los elementos del moacutedulo de bacteriocina se
espera que la LnqQ actuacutee como una proteiacutena soluble de bajo peso molecular que
es producido y excretado al medio extracelular (Fujita et al 2007) Para los demaacutes
elementos estructurales de este moacutedulo se sabe que LnqB es una proteiacutena
membranal tipo permeasa mientras que LnqC y LnqD son proteiacutenas con dominios
franqueados en membrana asiacute como LnqE y LnqF son proteiacutenas transportadoras
tipo ABC-2 y ABC respectivamente (Iwatani et al 2012) Por uacuteltimo los valores
de predictivos indican que la GFP seraacute producida como una proteiacutena soluble y
monomeacuterica (Zacharias et al 2002)
Tabla 4 Prediccioacuten de localizacioacuten subcelular de proteiacutenas
Gen Valor Localizacioacuten subcelular
AgrC 075 Membrana plasmaacutetica
AgrA 07 Citoplasma
LnqQ 07 Citoplasma
LnqB 09 Membrana plasmaacutetica
LnqC 083 Membrana plasmaacutetica
LnqD 072 Membrana plasmaacutetica
LnqE 086 Membrana plasmaacutetica
LnqF 07 Citoplasma
GFP 07 Citoplasma
De acuerdo con la aplicacioacuten BUSCA las localizaciones subcelulares disponibles son membrana plasmaacutetica y
citoplasma
69 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas tipo B
La determinacioacuten de la alergenicidad es un aspecto deseado durante la
construccioacuten del biosensor de ceacutelulas enteras debido a que nuestro sistema seriacutea
presentado en el futuro como un potencial candidato a agente terapeacuteutico Para
demostrar este punto fue necesario demostrar que la estructura tanto primaria
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como secundaria de la LnqQ presentaba epiacutetopos para ceacutelulas tipo B dado que la
alergenicidad estaacute mediada tanto por ceacutelulas De acuerdo con los resultados de la
secuencia aminoaciacutedica de la LnqQ en su estructura en forma lineal (Tabla 5) se
indica que los potenciales residuos epiacutetopos corresponden a E13 S16-V19 y W21-
D31 Mientras tanto los anaacutelisis realizados por la aplicacioacuten Discotope 20 a la
secuencia aminoaciacutedica en su forma tridimensional indican que no se encontraron
residuos potencialmente epiacutetopos para ceacutelulas B ni se determinaron sitios de
alergenicidad
Tabla 5 Prediccioacuten de epiacutetopos de ceacutelulas B en LnqQ
Epiacutetopos EEEEEEEEEEEEEEEE
Secuencia lineal MAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIK
Estructura CCHHHHHHHHHHHHCCHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCC
Superficie EEEBEEBBEBBBEBEEEBBEBBBEEEEEBBEBBEBBBBBEBBBEEBEEEEEEE
La prediccioacuten fue resuelta en la aplicacioacuten BediPrep En la seccioacuten de epiacutetopos si la posicioacuten estaacute arriba de
05 entonces es marcado con una letra ldquoErdquo La aplicacioacuten anexa NetsurfP fue usada para la prediccioacuten
estructural a partir de secuencia lineal y se divide en tres categoriacuteas ldquoHrdquo para heacutelice ldquoErdquo para hoja y ldquoCrdquo para
cadena En la seccioacuten de superficie se divide en dos secciones ldquoBrdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el interior de la proteiacutena (burial) mientras que ldquoErdquo para indicar que el aminoaacutecido estaacute
orientado hacia el exterior de la proteiacutena (exposed)
Las aplicaciones BediPrep 20 y Discotope 20 fueron utilizados para calcular la
localizacioacuten de epiacutetopos para ceacutelulas tipo B Se utilizoacute a la LnqQ (PDB no 2N8P
GenBank no AB2352011) como dato de entrada para ambas aplicaciones
BediPrep 20 (httpwwwcbsdtudkservicesBepiPred) fue utilizado para
identificar epiacutetopos de ceacutelulas tipo B en la forma lineal del peacuteptido Esta
herramienta fue entrenada para usar el algoritmo Random Forest para predecir si
un residuo aminoaciacutedico puede ser parte de un epiacutetopo (Jespersen Peters
Nielsen amp Marcatili 2017) Mientras tanto la herramienta Discotope 20
(httpwwwcbsdtudkservicesDiscoTope) fue utilizado para la prediccioacuten de
epiacutetopos discontinuos de ceacutelulas tipo B en proteiacutenas reportadas con estructuras
tridimensionales (Kringelum Lundegaard Lund amp Nielsen 2012)
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610 Prediccioacuten de alergenicidad
De acuerdo con el reporte realizado por la aplicacioacuten AllerCatPro la bacteriocina
LnqQ no posee elementos alergeacutenicos
611 Disentildeo y anaacutelisis in silico de pETNL
6111 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido sentildeal N-AmyE
El peacuteptido sentildeal N-AmyE fue seleccionado porque se ha demostrado que los
primeros 33 residuos de la α-amilasa (AmyE) de B subtilis pueden ser acoplados
a la regioacuten N-terminal a una proteiacutena de intereacutes para su produccioacuten periplaacutesmica
en ceacutelulas de E coli (R M Papi et al 2005)
En primer lugar descargamos la secuencia nucleotiacutedica de la AmyE desde la base
de datos de GenBank Despueacutes utilizamos los dos oligonucleoacutetidos reportados
por Papi y sus colaboradores (R M Papi et al 2005) que estaacuten modificados con
extremos overhangs Cada oligonucleoacutetido estaacute compuesto por un sitio de
restriccioacuten en su extremo 3rsquo-terminal que corresponden a NdeI y BamHI
respectivamente
En la aplicacioacuten SnapGene el archivo geneacutetico del AmyE fue abierto y sobre eacutesta
se incorporaron los dos oligonucleoacutetidos mencionados arriba despueacutes se corrioacute un
ensayo de PCR in silico para extraer el peacuteptido sentildeal N-AmyE de la amilasa El
producto in silico resultante corresponde a un tamantildeo 117 pb que estaacute ordenado
de la siguiente manera 5rsquo-NdeI-(N-AmyE)-BamHI-3rsquo
En la misma aplicacioacuten realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten con
el producto de PCR in silico y el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)dnardquo Desde la
aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten pET-30a(+) y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten NdeI y BamHI
Posteriormente el producto de PCR compuesto con los extremos overhangs fue
cortado tambieacuten con el mismo conjunto de enzimas de restriccioacuten y procedimos a
clonar creando un vector de expresioacuten El vector fue nombrado y guardado como
ldquopET-30a(+)-N-AmyEdnardquo
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6112 Disentildeo y construccioacuten de pETNL
En el extremo del peacuteptido sentildeal N-AmyE se le acoploacute la secuencia nucleotiacutedica de
la LnqQ por teacutecnicas de clonacioacuten molecular in silico Inicialmente el archivo
geneacutetico del gen lnqQ fue descargado (GenBank no AB2352011) y abierto en la
aplicacioacuten de SnapGene
A la secuencia nucleotiacutedica original de la lnqQ en el extremo 5rsquo-terminal
agregamos manualmente una secuencia que contiene el sitio de restriccioacuten BamHI
y riacuteo debajo de eacutesta agregamos un par de nucleoacutetidos (TT) Inmediatamente
despueacutes se colocoacute un codoacuten de inicio (ATG) y se antildeadieron los 52 residuos
restantes para un total de 53 de aminoaacutecidos que representan a LnqQ Justo en el
extremo C-terminal de esta bacteriocina se agregoacute una cola de polihistidina (H89-
H94) y un codoacuten de paro (TAG) En seguida se agregaron otro par de nucleoacutetidos
(TA) y se integroacute un sitio de restriccioacuten SalI Esta seccioacuten correspondioacute a un
fragmento lineal de 193 pb de la secuencia nucleotiacutedica que codifica para
LnqQ6xHis (Tabla 6)
Desde SnapGene realizamos un ensayo in silico de restriccioacuten y ligacioacuten entre el
fragmento lineal de 193 pb con el vector de expresioacuten ldquopET-30a(+)N-AmyEdnardquo
Desde la aplicacioacuten se abrioacute el archivo que contiene el vector de expresioacuten y se
cortoacute in silico por medio de las enzimas de restriccioacuten BamHI y SalI
Posteriormente el fragmento lineal fue cortado tambieacuten con el mismo conjunto de
enzimas de restriccioacuten y procedimos a clonar creando un vector de expresioacuten
nombrado y guardado como ldquopETNLdnardquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pETNL estaacute guardando en formato dna bajo el
nombre ldquopETNLdnardquo En este plaacutesmido se observan por los elementos geneacuteticos
propios de un vector pET30(a)+ en conjunto con los genes necesarios para la
construccioacuten N-AmyELnqQ
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Tabla 6 Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ (5rsquorarr3rsquo) Tamantildeo
pETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQL
LAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWVVSKIKQILGIKHH
HHHH
94
Los residuos subrayados representan el peacuteptido sentildeal Los residuos en negritas representan a LnqQ
6113 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido sentildeal N-
AymELnqQ6xHis
Los resultados obtenidos del corte proteoliacutetico en el peacuteptido sentildeal N-AmyE fueron
contrastados con los datos de seis secuencias aminoaciacutedicas (Tabla 7) que teniacutean
el reporte de que este mismo peacuteptido sentildeal N-AmyE era cortado de manera
efectiva en cada una de ellas Tres de las secuencias corresponden a las
secuencias aminoaciacutedicas totales de tres α-amilasas reportadas en diferentes
cepas de B subtilis (Emori amp Maruo 1988 Kunst et al 1997 Yang et al 1983)
Dos de eacutestas corresponden a secuencias que se utilizaron para investigar queacute
aminoaacutecidos eran los necesarios para cortar el peacuteptido sentildeal N-AmyE en ceacutelulas
de B subtilis o de E coli (Nakazawa et al 1986 Sakakibara et al 1993) La
uacuteltima corresponde a una construccioacuten sinteacutetica donde el peacuteptido sentildeal N-AmyE
fue utilizado para transportar liasa de pectina a la regioacuten periplaacutesmica de E coli (R
M Papi et al 2005)
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Tabla 7 Secuencias utilizadas para prediccioacuten de corte enzimaacutetico de N-
AmyELnqQ
Nombre Secuencia aminoaciacutedica
gtYang1983
(CAA234371)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPDDRRLRMEINSQSEKEIQFGKTYTIML
KGTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPAD
TDTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtNakazawa1986
(PTUE33)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAQACPPETLVKVKDAEDQL
gtEmori1988
(CAA306431)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLERALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQHEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIEIRCNTFFQ
gtSakakibara1993
(PTUBE695)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFYLVLAGPAAASACAAPFNGTM
gtKunst1997
(NP_3881862)
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNELTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTA
IQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNE
VKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYG
SQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVES
HDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNV
MAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAV
LYPDDIAKAPHVFLENYKTGVTHSFNDQLTITLRADANTTKAVYQINNGPETAFKDGDQFTIGKGDPFGKTYTIMLK
GTNSDGVTRTEKYSFVKRDPASAKTIGYQNPNHWSQVNAYIYKHDGSRVIELTGSWPGKPMTKNADGIYTLTLPADT
DTTNAKVIFNNGSAQVPGQNQPGFDYVLNGLYNDSGLSGSLPH
gtPapi2005 MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRIRMSYPESKLTGLTGFALAAKVTGGWAGPVVSITNLDQLKANIG
TVTPQVLVINSNISASSLTKVNMGANKTLIGSFQNRTLENIHLRATAQSQNIILQNLIFKHSANIKANDDIQVYLNY
GSKYWIDHCSFVGHSWSTTDGSEDKLLYIGEKADYATISNCFFGSHKYGLIFGHPADDNNAAFNGYPRLTLCHNRFD
NMEVRAPGLMRYGYFHVYNNYINKFHLGFTLAQNANILSESNYFGEGSQNNGMLDDKGSGTFTDTNSVPPITNQKSP
KAQWTATSNYAYTLKTAAQAKDFTQKNAGAQAAALVFGS
gtpETNL MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASRILMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWLNAGQAIDWV
VSKIKQILGIKHHHHHH
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En las bacterias existen dos mecanismos generales para la secrecioacuten de
proteiacutenas a traveacutes de la membrana citoplasmaacutetica En la viacutea de Secrecioacuten General
denominada como viacutea Sec las proteiacutenas son translocadas a la membrana en su
forma desnaturalizada y posteriormente son plegados en forma nativa en el lado
transversal de la membrana Mientras tanto en la viacutea de Translocacioacuten de
Gemelos Argininas conocida como viacutea Tat las proteiacutenas son translocadas en su
estado plegado nativo (Natale Bruumlser amp Driessen 2008)
De acuerdo con nuestros resultados (Tabla 8) el valor de calculado de prediccioacuten
de corte de peacuteptido sentildeal de las secuencias aminoaciacutedicas completas de tres α-
amilasas representan 09724 (Yang et al 1983) 09458 (Emori amp Maruo 1988) y
09724 (Kunst et al 1997) respectivamente De las secuencias parciales de
peacuteptidos sentildeales N-AmyE los resultados indican 08722 (Nakazawa et al 1986) y
06092 (Sakakibara et al 1993) Para la secuencia que se utilizoacute para exportar la
liasa de pectina al periplasma de E coli el valor calculado correspondioacute a 08262
(R M Papi et al 2005) en todas estas secuencias el mecanismo de secrecioacuten
general de proteiacutenas es el tipo Sec clase I Para nuestra proteiacutena N-AmyELnqQ
el valor calculado estimado fue de 04063 sin que fuera determinado su
mecanismo de corte predictivo Es decir nuestro valor calculado es mucho menor
a lo observado contra secuencias que habiacutean sido probados experimentalmente
Tabla 8 Prediccioacuten de corte enzimaacutetico de peacuteptido sentildeal N-AmyE
Identificacioacuten Prediccioacuten SecSPI TatSPI SecSPII Otro Pos
gtYang1983 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtNakazawa1986 SP(SecSPI) 08722 00359 00229 0069 33 y 34
gtEmori1988 SP(SecSPI) 09458 00122 0009 0033 33 y 34
gtSakakibara1993 SP(SecSPI) 06092 00428 01377 02103 31 y 32
gtKunst1997 SP(SecSPI) 09724 00104 00079 00092 33 y 34
gtPapi2005 SP(SecSPI) 08262 00183 00178 01377 31 y 32
gtpETNL Otro 04063 00249 00134 05554 Otro
SecSPI Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal I (Lep) TatSPI Translocoacuten Tat mediado por
Peptidasa de Sentildeal I (Lep) SecSPII Translocoacuten Sec mediado por Peptidasa de Sentildeal II (Lsp) Pos Sitio de
corte enzimaacutetico dentro de la estructura aminoaciacutedica lineal
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612 Disentildeo y anaacutelisis in silico del pSmbP-LnqQ
6121 Recuperacioacuten bioinformaacutetica del peacuteptido de fusioacuten SmbP
El archivo geneacutetico del peacuteptido de fusioacuten SmbP estaacute guardado en formato dna
bajo el nombre ldquopET30a-SmbPdnardquo y estaacute flanqueado en el extremo 5rsquo-terminal
por el sitio de restriccioacuten NdeI y en el extremo 3rsquo-terminal por el sitio de restriccioacuten
NcoI El peacuteptido de fusioacuten estaacute dividido en dos secciones en el extremo N-terminal
estaacute compuesta por la regioacuten citoplasmaacutetica de la SmbP (SmbP) compuesta por
94 residuos seguido de dos residuos G95 y T96 riacuteo abajo inicia el extremo C-
terminal que estaacute compuesta por cinco residuos y representa al sitio de corte por
enteroquinasa (DDDDK)
6122 Disentildeo y construccioacuten de pSmbP-LnqQ
El archivo geneacutetico que contiene la bacteriocina LnqQ fue descargado de la base
de datos (GenBank no AB2352011) Inmediatamente en el extremo C-terminal
del peacuteptido de fusioacuten mediante la aplicacioacuten SnapGene antildeadimos manualmente
un residuo de alanina en la posicioacuten 102 y riacuteo debajo de eacutesta antildeadimos los 53
residuos que conforman el LnqQ iniciando con M103 En direccioacuten al extremo C-
terminal inmediatamente despueacutes del codoacuten de teacutermino (TAA) se agregoacute el sitio
de restriccioacuten XhoI Los elementos que componen la construccioacuten del pSmbP-
LnqQ (Tabla 9) estaacuten representados en el siguiente orden 5rsquo-NdeI-SmbP-DDDDK-
LnqQ-XhoI-3rsquo
El archivo geneacutetico del plaacutesmido pSmbP-LnqQ estaacute guardado en formato dna bajo
el nombre ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01dnardquo En este plaacutesmido se observan por los
elementos geneacuteticos propios de un vector pET30(a)+
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Tabla 9 Secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
Plaacutesmido Secuencia aminoaciacutedica del producto del vector de
expresioacuten (5rsquorarr3rsquo)
Tamantildeo
pSmbP-LnqQ MSGHTAHVDEAVKHAEEAVAHGKEGHTDQLLEHAKESLTHAKAAS
EAGGNTHVGHGIKHLEDAIKHGEEGHVGVATKHAQEAIEHLRASE
HKSHGTDDDDKAMAGFLKVVQLLAKYGSKAVQWAWANKGKILDWL
NAGQAIDWVVSKIKQILGIK
155
Los residuos subrayados representan el peacuteptido de fusioacuten Los residuos resaltados representan el sitio de
corte de enteroquinasa Los residuos en negritas representan a LnqQ
6123 Prediccioacuten de corte proteoliacutetico de peacuteptido de fusioacuten SmbP-
LnqQ
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten de PeptideCutter se detectoacute un
uacutenico sitio de corte en la proteiacutena SmbP-LnqQ para la enzima enteroquinasa que
se encuentra ubicado en el residuo K101 lo cual coincide con lo esperado
613 Identificacioacuten de codones de paro en los disentildeos
Los resultados sobre la identificacioacuten de codones de paro post disentildeo en la
construccioacuten de pETNL y pSmbP-LnqQ indicaron que no existe evidencia de
codones de paro ya que la aplicacioacuten en liacutenea logroacute identificar un marco de lectura
abierto con un tamantildeo de 285 pb que codifican para 94 aminoaacutecidos cuya
secuencia coincide con exactitud con la secuencia aminoaciacutedica de N-AmyELnqQ
para el caso de pETNL Mientras tanto un marco de lectura compuesto por un
tamantildeo molecular de 488 pb que se traducen para 155 aminoaacutecidos y cuya
secuencia coincide en su totalidad con la secuencia aminoaciacutedica de SmbP-LnqQ
614 Prediccioacuten de peso molecular de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
De acuerdo con los resultados calculados por la aplicacioacuten de Compute pIMw tool
de ExPasy el peso molecular teoacuterico estimado del producto N-AmyELnqQ de
pETNL es de 1053468 Da con un punto isoeleacutectrico pi = 1063 mientras que para
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el producto SmbP-LnqQ de pSmbP-LnqQ el peso estimado es de 1669771 Da
con punto isoeleacutectrico pI = 645
615 Prediccioacuten de solubilidad y localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-
LnqQ
Seguacuten los resultados los iacutendices de solubilizacioacuten (Tabla 10) de N-AmyELnqQ y
del SmbP-LnqQ es de 0575 y 0865 respectivamente La aplicacioacuten sin embargo
clasifica a los productos del vector pETNL como invaacutelidos mientras que los
productos de pSmbP-LnqQ fueron considerados como solubles La razoacuten porque
la N-AmyELnqQ es considerado como invaacutelido se debe a que fue identificado
como proteiacutena de membrana En el caso de localizacioacuten celular (Tabla 11) los
pronoacutesticos indican que los productos producidos por pETNL y pSmbP-LnqQ se
encontraraacuten en membrana plasmaacutetica y en el citoplasma respectivamente
Tabla 10 Prediccioacuten de solubilidad N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Iacutendice Solubilidad
N-AmyELnqQ 0575 Invaacutelido
SmbP-LnqQ 0865 Soluble
De acuerdo con la aplicacioacuten Protein-Sol reporta que cualquier valor de solubilidad con superior a 045 es
considerado soluble Los datos que fueron considerados como invaacutelidos con un iacutendice de solubilidad superior
a 045 es porque son considerados proteiacutenas de membrana y son invaacutelidos para esta herramienta
Tabla 11 Prediccioacuten de localizacioacuten celular N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
Producto Valor Localizacioacuten subcelular
N-AmyELnqQ 085 Membrana plasmaacutetica
SmbP-LnqQ 07 Citoplasma
Esto coincide con lo observado en los antecedentes ya que indican que las
proteiacutenas expresadas en E coli con el peacuteptido sentildeal N-AmyE en su regioacuten N-
terminal a menudo se localizan en el periplasma (Nakazawa et al 1986 R M
Papi et al 2005) Mientras que las proteiacutenas acopladas con el peacuteptido de fusioacuten
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SmbP son reportadas para encontrarse en la regioacuten citoplasmaacutetica debido a que la
seccioacuten aminoaciacutedica que las orienta al periplasma fue removida de la secuencia
original de residuos quedaacutendose por tanto en el citoplasma celular de E coli
(Vargas-Cortez et al 2016)
616 Prediccioacuten de estructura secundaria y tridimensional de N-AmyELnqQ
y SmbP-LnqQ
El modelo estructural tanto en su forma secundaria (Figura 6) como tridimensional
(Figura 8) para N-AmyELnqQ asiacute como la presunta estructura secundaria (Figura
7) y tridimensional (Figura 10) para SmbP-LnqQ fueron revelados en este
documento En la estructura secundaria prevista para N-AmyELnqQ se espera
que el 96 de la secuencia esteacute compuesta por estructuras tipo α-heacutelices y se
estima que el 17 de la secuencia aminoaciacutedica total esteacuten embebidas en la
regioacuten transmembranal La evidencia predictiva de la N-AmyELnqQ (Figura 9) a
traveacutes de la aplicacioacuten Phyre2 indicoacute que los primeros 12 residuos del extremo N-
terminal estariacutean orientados en la regioacuten extracelular mientras que los residuos 15
al 30 estariacutean ubicados en regioacuten intermembranal entre el espacio extracelular y la
citoplasmaacutetica El resto de los residuos del extremo C-terminal estariacutean orientados
en la cara citoplasmaacutetica de la ceacutelula de E coli Mientras tanto la estructura
secundaria putativa para SmbP-LnqQ indica que el 85 de secuencia total estaacute
compuesta por α-heacutelices
En las estructuras tridimensionales putativas tanto para N-AmyELnqQ como en la
SmbP-LnqQ prevalece la formacioacuten de cuatro α-heacutelices Estos motivos
estructurales tipo α-heacutelices son comuacutenmente observados en bacteriocinas
similares a LnqQ (Lynch et al 2019) de manera que podemos predecir que la
estructura secundaria y tridimensional de la LnqQ no se ve afectada cuando estaacuten
acopladas tanto por N-AmyE como con SmbP
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Figura 6 Prediccioacuten de la estructura secundaria de N-AmyELnqQ
La estructura secundaria predicha del N-AmyELnqQ en Phyre2
Figura 7 Prediccioacuten de la estructura secundaria de SmbP-LnqQ
La estructura secundaria putativa del SmbP-LnqQ en Phyre2
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Figura 8 Prediccioacuten de estructura tridimensional de N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de N-
AmyELnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones
propuestas por modelo son de (Å) X29824 Y24988 Z25496
Figura 9 Prediccioacuten de heacutelices transmembranales para N-AmyELnqQ
La imagen es resultado de la prediccioacuten propuesta por Phyre2 para heacutelices transmembranales de N-
AmyELnqQ
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Figura 10 Prediccioacuten de estructura tridimensional de SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada en el programa Phyre2 y representa la estructura tridimensional putativa de SmbP-
LnqQ La imagen estaacute coloreada con los colores del arcoiacuteris de N- al C-terminal Las dimensiones propuestas
por modelo son de (Å) X32655 Y24988 Z25496
617 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ
6171 Transformacioacuten de ceacutelulas de E coli con DNA exoacutegeno
Las ceacutelulas presuntamente transformadas fueron seleccionadas con kanamicina
De acuerdo con la evidencia presentada (Figura 11) los controles experimentales
cumplieron con su objetivo ya que no se registroacute crecimiento en placas de LB agar
esteacuteriles en el control negativo (Figura 11 a) en cuanto al control de viabilidad
eacuteste demostroacute que la electroporacioacuten no fue un factor significativo que causara la
muerte de ceacutelulas de E coli DH5α como BL21 (DE3) (Figura 11 b c) Por uacuteltimo
los controles con antibioacutetico demostraron que la kanamicina (50 microgml) era lo
suficientemente potente para seleccionar ceacutelulas (Figura 11 d e) Por uacuteltimo
demostramos bajo la teacutecnica de electroporacioacuten que las cepas de ceacutelulas de E
coli tanto BL21 (DE3) como DH5α fueron correctamente transformadas con los
vectores de expresioacuten pETNL (Figura 11 f g) pET30(a)+ (Figura 11 h j) y
pSmbP-LnqQ (Figura 11 i k) Los ensayos fueron realizados por triplicado
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 79
Figura 11 Transformacioacuten de E coli DH5α y BL21 (DE3) con pET30a(+)
pETNL y pSmbP-LnqQ
Roacutetulo Descripcioacuten
a Control negativo
b Control viabilidad DH5α
c Control viabilidad BL21 (DE3)
d Control kanamicina + DH5α
e Control kanamicina + BL21 (DE3)
f DH5α + pETNL
g BL21 (DE3) + pETNL
h DH5α + pET30a(+)
i DH5α + pSmbP-LnqQ
j BL21 (DE3) + pET30a(+)
k BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ
Las placas rotuladas del a-c son placas LB con agar mientras que las placas d-k son placas LB
con agar suplementadas con kanamicina (50 microgml concentracioacuten final)
80
6172 Extraccioacuten y purificacioacuten de DNA exoacutegeno de ceacutelulas de E coli
Los ensayos para la extraccioacuten y purificacioacuten de los plaacutesmidos pET30(a)+ pETNL
y pSmbP-LnqQ de ceacutelulas de E coli que fueron observados en un gel de agarosa
1 (pv) Seguacuten la evidencia (Figura 12) nuestros controles demuestran que
tanto el plaacutesmido pETNL como el vector pSmbP-LnqQ se encontraban presentes
Los iacutendices de concentracioacuten y calidad de cada uno de los vectores fueron para
pET30(a)+ de 911 ngmicrol con A260A280 en 195 para el vector pETNL de 532 ngmicrol
con A260A280 en 194 y para el vector pSmbP-LnqQ de 2861 ngmicrol con A260A280 en
188 Seguacuten la literatura los iacutendices para considerar a un DNA plasmiacutedico como
puro deben tener valores espectrofotomeacutetricos de A260A280 entre 18-20 donde un
valor menor a 18 se considera como contaminacioacuten con proteiacutenas y un valor de
superior a 20 se considera contaminacioacuten por RNA (Koetsier Cantor amp Biolabs
sf) Podemos inferir que los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-
LnqQ fueron recuperados en buena cantidad con un buen iacutendice de pureza
Figura 12 Gel de agarosa con plaacutesmidos
pETNL y pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer
TBE 1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Plaacutesmido pETNL
3 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
4 Plaacutesmido pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli
BL21 (DE3) transformados con los vectores
de expresioacuten pETNL o pSmbP-LnqQ
El marcador de peso molecular corresponde
a 100-5000bp DNA Marker Plus Ready to
Use (Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 81
6173 Oligonucleoacutetidos para identificacioacuten de plaacutesmidos por PCR
punto final
Seguacuten los resultados obtenidos por OligoAnalyzer Tool tras ajustar las
condiciones de los oligonucleoacutetidos a las especificaciones del fabricante del kit de
la polimerasa el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 promoter primer es de
20 pb con un contenido GC a 40 y un valor Tm = 591degC con un hairpin de -036
kcalmol a una Tm de 316degC y un valor homodiacutemero de -416 kcalmol Mientras
tanto el tamantildeo molecular del oligonucleoacutetido T7 terminal primer es de 19 pb con
un contenido GC a 526 y un valor Tm = 61degC con un hairpin de 002 kcalmol a
una Tm de 248degC y un valor homodiacutemero de -474 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los resultados de la aplicacioacuten NetPrimer el oligonucleoacutetido T7
promoter primer tiene un rating de eacutexito en 860 y presenta un valor de estabilidad
en su extremo 3rsquo-terminal de -87 kcalmol y no se identificoacute al hairpin el valor
homodiacutemero se registroacute en -759 kcalmol En el caso del oligonucleoacutetido T7
terminal primer este presenta un rating de eacutexito en 870 con un valor de
estabilidad en su extremo 3rsquo-terminal de -1142 kcalmol y tampoco se identificaron
hairpins el valor homodiacutemero se registroacute en -574 kcalmol El valor heterodiacutemero
entre ambos oligonucleoacutetidos es de -438 kcalmol
De acuerdo con los criterios habituales para seleccioacuten de oligonucleoacutetidos ambos
se mantuvieron en los estaacutendares ya que presentaron un tamantildeo entre 18 a 25 pb
con un hairpin cuyo valor de Tm fue menor a la Tm reportado para el
oligonucleoacutetido y los valores tanto de los homodiacutemeros y heterodiacutemeros nunca
fueron maacutes negativo o iguales a -9 kcalmol
En cuanto al caacutelculo de la Ta para ambos oligonucleoacutetidos utilizamos la regla
general de sustraer 5degC al Tm calculado para en ambos oligonucleoacutetidos Para el
caacutelculo de la Ta oacuteptimo para un par de oligonucleoacutetidos para un blanco en
particular se utilizoacute la siguiente foacutermula matemaacutetica TaOpt = 03 times (Tm de oligo) +
07 times (Tm producto) minus 149 donde el valor de Tm del oligonucleoacutetido es la
temperatura de fusioacuten del oligonucleoacutetido menos estable y la Tm es el valor del
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 82
temperatura de fusioacuten del producto de PCR (Rychlik Spencer amp Rhoads 1990)
De esta manera promediamos el valor de la Tm de ambos oligonucleoacutetidos y el
resultado fue 60degC A este valor le sustrajimos 5degC para un Ta ajustado en 55degC
en los ensayos de PCR punto final para la identificacioacuten de los plaacutesmidos
Por uacuteltimo calculamos el total de ciclos y el tiempo de extensioacuten para los ensayos
de PCR punto final De acuerdo con las especificaciones del fabricante se debe
agregar 1 minuto por cada kb por sintetizar en los ensayos De esta manera
calculamos en primera instancia el tamantildeo molecular de los productos de los
ensayos de PCR de los vectores de expresioacuten pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
para determinar el tiempo de extensioacuten Para lograr este objetivo realizamos una
reaccioacuten in silico de PCR punto final entre los dos oligonucleoacutetidos T7 con cada
uno de los vectores de expresioacuten utilizados
Los archivos geneacuteticos de los tres vectores de expresioacuten fueron abiertos desde la
aplicacioacuten de SnapGene y ejecutamos una PCR punto final in silico
Posteriormente corrimos una simulacioacuten de gel de agarosa al 1 De acuerdo con
los resultados de nuestra simulacioacuten (Figura 13) las bandas esperadas de los
productos lineales de PCR de los vectores de pET30(a)+ pETNL y pSmbP-LnqQ
se encontrariacutean entre 367 pb 488 pb y 651 pb respectivamente Con esto
confirmamos que ninguno de los productos de PCR esperados tendriacutea un tamantildeo
superior al 1 kb y procedimos a configurar la reaccioacuten para el ensayo de PCR
punto final
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 83
Figura 13 Simulacioacuten de PCR para
vectores de expresioacuten
Gel de agarosa 10 generado desde
SnapGene
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Producto PCR de pET-30a(+)
2 Producto PCR de pETNL
3 Producto PCR de pSmbP-LnqQ
Las bandas corresponden a productos lineales
de PCR
El marcador de peso molecular in silico
corresponde a PCR DNA Ladder de GenScript
(Cat En desuso Estados Unidos) y fue tomado
desde la aplicacioacuten de SnapGene versioacuten 113
Asiacute pues configuramos las condiciones de corrida en el termociclador las cuales
fueron registradas de la siguiente manera una desnaturalizacioacuten inicial a 94degC por
180 s despueacutes 30 ciclos de desnaturalizacioacuten alineamiento y extensioacuten con
temperaturas en 94degC 55degC y 72degC respectivamente y sus respectivos tiempos de
reaccioacuten a 30 s 45 s y 30 s Finalmente se agregoacute una etapa de extensioacuten final
con una temperatura a 72degC por 420 s
6174 Corrida de DNA en gel de agarosa
Despueacutes de realizar la teacutecnica de PCR punto final y una posterior corrida en un gel
de agarosa al 1 con buffer TBE 1X observamos una banda con tamantildeo de 367
pb para el producto de PCR obtenida del vector pET30(a)+ al tiempo que
recolectamos una banda de 488 pb para el producto de PCR del vector pETNL
(Figura 14) y finalmente encontramos una banda de 651 pb para el producto de
PCR del vector pSmbP-LnqQ (Figura 15) Dado que los valores predichos en la
simulacioacuten coinciden con los observado experimentalmente confirmamos que
nuestras cepas de E coli estaban efectivamente transformadas con su respectivo
vector de expresioacuten
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 84
Figura 14 PCR de pETNL
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 PCR de pET30(a) virgen
3 PCR de pETNL
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
Figura 15 PCR de pSmbP-LnqQ
Gel de agarosa 1 (pv) adicionado con Eco-
Stain corrido durante 1 h a 120 V en buffer TBE
1 X
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (pb)
1 Control negativo
2 Control positivo pET30(a) vaciacuteo
3 Control positivo pETNL
4 Control negativo PCR pUC57-DPQ
5 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
6 Control negativo PCR pUC57-DPQ
7 Muestra PCR pSmbP-LnqQ
Los plaacutesmidos fueron extraiacutedos de E coli BL21
(DE3) transformados con los vectores de
expresioacuten pETNL o pET30(a)
El marcador de peso molecular corresponde a
100-5000bp DNA Marker Plus Ready to Use
(Cat No SGM03 BioBasic Canadaacute)
618 Determinacioacuten de expresioacuten proteica por SDS-PAGE
Para los anaacutelisis de expresioacuten de proteiacutenas utilizamos algunos vectores de
expresioacuten que han sido exitosos en la produccioacuten de proteiacutenas Los vectores
pET30a-SmbP_LL-37 y pET30a-SmbP_MP1106 fueron amablemente compartidos
por David Antonio Peacuterez miembro del grupo de investigacioacuten PEP con sede en la
Unidad de Posgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas (FCQ) de la UANL
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 85
(Monterrey Nuevo Leoacuten) Similarmente el vector pET30NP-Hoc fue compartido
por Francisco de Jesuacutes Balderas Cisneros miembro del grupo de investigacioacuten
NBR con sede en el CIBYN (Apodaca Nuevo Leoacuten)
Dado que la informacioacuten de los tres plaacutesmidos se encuentra o se encontraba en
estado de revisioacuten al momento de redactar este documento por sus respectivos
comiteacutes de revisioacuten solo podemos limitarnos a mencionar los pesos moleculares
de los productos de cada vector de expresioacuten Para los dos vectores de David
Peacuterez (D Peacuterez comunicacioacuten personal 2021) el peso molecular estimado de
ambos productos es 15 kDa mientras que el vector de Francisco Balderas el peso
molecular de su producto es de 95 kDa (F Balderas comunicacioacuten personal
2021)
6181 Induccioacuten de IPTG en ceacutelulas de E coli modificadas
Para la induccioacuten por IPTG seguimos los protocolos preestablecidos para la
induccioacuten de proteiacutenas heteroacutelogas en ceacutelulas de E coli En nuestro ensayo la
concentracioacuten de IPTG elegida para la induccioacuten de N-AmyELnqQ y SmbP-LnqQ
correspondioacute a 01 mM Nosotros utilizamos esta concentracioacuten debido a que los
reportes indican que esta concentracioacuten es lo suficiente para saturar la reaccioacuten
bioloacutegica evitando la toxicidad celular por este compuesto (Malakar amp Venkatesh
2012) Los valores tiacutepicos de IPTG maacutes utilizados para la induccioacuten usualmente se
encuentran entre 05 mM y 10 mM (Mesa-Pereira et al 2018)
En nuestros cultivos el IPTG fue antildeadido en la fase exponencial tardiacutea (OD600 =
04-06) dado que el costo energeacutetico es maacutes alto durante la fase exponencial
temprana que en la tardiacutea (Malakar amp Venkatesh 2012) Ademaacutes se presume que
en esta fase el total de proteiacutenas producidas pueden alcanzar rendimientos
productivos superiores a 350 (Larentis et al 2014) Para nuestros ensayos
utilizamos dos temperaturas para inducir 37degC y 25degC y la razoacuten de utilizar una
temperatura maacutes baja es porque es un meacutetodo habitual para incrementar la
solubilidad de proteiacutenas recombinantes en E coli (Schein 1989)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 86
6182 SDS-PAGE de proteiacutenas periplaacutesmicas de E coli modificadas
con pETNL
Nuestros estudios preliminares bioinformaacuteticos indicaban que la proteiacutena N-
AmyELnqQ seriacutea insoluble (Tabla 10) y que tanto por sus antecedentes
(Nakazawa et al 1986 R M Papi et al 2005 Sjoumlstroumlm et al 1987) por sus
caracteriacutesticas moleculares estariacutea presuntamente ubicada en la regioacuten
periplaacutesmica de E coli (Tabla 11) Sin embargo nuestros resultados por ensayos
de SDS-PAGE indicaron que la induccioacuten por IPTG en ceacutelulas de E coli BL21
(DE3) transformados con el vector pETNL para la produccioacuten de N-AmyELnqQ
tanto en la fraccioacuten soluble como insoluble de proteiacutenas a una temperatura de
induccioacuten 25degC (Figura 16) como a 37degC (Figura 17) en la fraccioacuten periplaacutesmica
no fue posible en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) esta manifestacioacuten fue reportado
en muacuteltiples ocasiones De acuerdo con nuestros resultados no logramos
determinar la presencia de bandas de proteiacutenas en la regioacuten esperada que seguacuten
los anaacutelisis predictivos la proteiacutena N-AmyELnqQ debiacutea tener un peso molecular
cercano a 105 kDa
Es de mencionar que el valor de prediccioacuten de corte de peacuteptido sentildeal de la
proteiacutena N-AmyELnqQ fue muy inferior a los valores de prediccioacuten observados en
secuencias que contienen el peacuteptido sentildeal N-AmyE y que habiacutean sido previamente
validados experimentalmente (Tabla 8) Otro aspecto para considerar es que los
residuos reconocidos para el corte enzimaacutetico difieren entre los diferentes tipos de
bacterias (Nakazawa et al 1986) Esto quedoacute demostrado cuando observamos
que los residuos utilizados para el corte de este peacuteptido sentildeal podiacutean diferir
inclusive en el mismo tipo de bacteria Por ejemplo en la secuencia total de
aminoaacutecidos de la α-amilasa reportada por Yang y otros (Yang et al 1983) Emori
y otros (Emori amp Maruo 1988) y Kunst y otros (Kunst et al 1997) los residuos
observados corresponden al 33 y 34 mientras que para las secuencias de
aminoaacutecidos a los que se les fue acoplado el peacuteptido sentildeal en su regioacuten N-terminal
como las reportadas por Sakakibara y otros (Sakakibara et al 1993) y Papi y
otros (R M Papi et al 2005) los residuos de corte se ubicaron en la posicioacuten 31 y
32
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 87
Figura 16 Gel de E coli BL21 (DE3) con pETNL inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 25degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 25degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 88
Figura 17 Gel de E coli BL21 (DE3) pETNL inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido ni IPTG Fraccioacuten insoluble
6 E coli BL21 (DE3) sin plaacutesmido + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
7 E coli BL21 (DE3) + pETNL sin IPTG a 37degC Fraccioacuten insoluble
8 E coli BL21 (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM a 37degC Fraccioacuten insoluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles e insolubles que fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pETNL El marcador de peso molecular corresponde a
HyperPAGE Prestained Protein Marker (10 kDa to 190 kDa) (Cat No BIO-33066 Meridian Life Science Inc
Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 89
6183 SDS-PAGE de proteiacutenas citoplaacutesmicas de E coli modificadas
con pSmbP-LnqQ
Los estudios preliminares predictivos para la produccioacuten heteroacuteloga de SmbP-
LnqQ en E coli indicaban que la presencia del peacuteptido de fusioacuten SmbP
aumentariacutea la solubilidad de la proteiacutena recombinante solubilidad (Tabla 10) y que
ademaacutes seriacutea localizado en el citoplasma celular (Tabla 11) con un peso
molecular aproximado de 167 kDa Nuestros resultados por ensayos de SDS-
PAGE indicaron que no hubo produccioacuten citoplasmaacutetica de una banda esperada
de 15 kDa tras inducir con IPTG a ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) transformados
con el vector pSmbP-LnqQ para la produccioacuten del peacuteptido SmbP-LnqQ tanto a
25degC como 37degC (Figura 18) Estos ensayos fueron realizados por triplicado
Esto nos orilloacute a plantearnos dos posibilidades con relacioacuten a la proteiacutena SmbP-
LnqQ la primera era que pudiera presentar problemas por plegamiento durante su
produccioacuten en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) y que la segunda fuera problemas
internos relacionados al IPTG Para demostrar la primera hipoacutetesis transformamos
ceacutelulas de E coli Origami con el vector de expresioacuten pSmbP-LnqQ y utilizamos el
vector pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo este vector seguacuten su autor
produce una proteiacutena de un tamantildeo de 15 kDa en ceacutelulas de E coli Origami
debido a que es una proteiacutena problemaacutetica (datos no publicados) Nuestra
evidencia (Figura 19) sentildeala que el IPTG no es causa probable de la nula
produccioacuten debido a que se observoacute una banda muy definida en la regioacuten de los
15 kDa para las bacterias transformadas con el vector terminacioacuten MP1106 que
habiacutean sido inducidas por IPTG tanto a 25degC como 37degC Tampoco se observoacute
que la cepa Origami contuviera un factor bioloacutegico no considerado en la cepa
BL21 (DE3) que pudiera agilizar la produccioacuten de la proteiacutena SmbP-LnqQ ya que
no encontramos ninguna banda de un tamantildeo de 15 kDa en las ceacutelulas Origami
transformados
Ante los resultados previos consideramos posibilidad de que el problema se
encontrara especiacuteficamente en la cepa de E coli (DE3) presente en nuestro
laboratorio Para demostrar este punto procedimos a transformarla la cepa con el
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 90
vector de expresioacuten pET30NP-Hoc para fines de control positivo para nuestro
experimento Seguacuten su autor este vector de expresioacuten produce una proteiacutena lineal
de 95 kDa al inducirse por IPTG a 1 mM (datos no publicados) Nuestros
resultados en el gel SDS-PAGE muestran una banda de proteiacutenas extraiacutedas de E
coli transformados pET30NP-Hoc en la seccioacuten de 95 kDa y es producido tanto a
37degC (Figura 20) como a 25degC (Figura 21) Sin embargo no pudimos observar
ninguna banda sobre expresada de 10 kDa para las BL21 (DE3) transformadas
con pETNL ni una banda tampoco de 15 kDa para las bacterias transformadas con
pSmbP-LnqQ De esta manera descartamos la idea que existiera un problema
bioloacutegico procedente en la cepa de E coli BL21 (DE3) mantenida en nuestro
laboratorio
Se conoce que la bacteriocina LnqQ ya ha sido sujeta a modificaciones geneacuteticas
para incrementar su produccioacuten al ser clonada y expresada con eacutexito con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO en ceacutelulas de E coli BL21 (DE3) registraacutendose
rendimientos hasta de 130 mg por litro de cultivo bacteriano (Ma et al 2012) Ante
la ausencia de una banda de proteiacutenas en la regioacuten de 15 kDa en nuestro vector
de expresioacuten con peacuteptido de fusioacuten SmbP-LnqQ se ha comentado que no existen
razones para suponer que todas las etiquetas de fusioacuten son aptas para todo tipo
de necesidades ya que es casi imposible determinar cuaacutel es el peacuteptido de fusioacuten
oacuteptimo para la produccioacuten Sin embargo una de las ventajas de utilizar peacuteptidos
de fusioacuten reconocidos es que son reconocidos sus ventajas y desventajas ya que
en algunos casos algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la solubilidad
de las proteiacutenas tales como TRX MBP NusA etc pero otros peacuteptidos sentildeales no
incrementan la solubilidad de la proteiacutena de intereacutes como GST BAP etc Incluso
algunos peacuteptidos de fusioacuten pueden incrementar la carga metaboacutelica en la ceacutelula
como GST MBP y NusA (Waugh 2005)
A pesar del buen registro experimental disponible sobre construcciones que
contienen el peacuteptido de fusioacuten SmbP (Vargas-Cortez et al 2016) suponemos en
nuestro caso en particular que dada las limitaciones de su corto historial
experimental auacuten no existe informacioacuten que determine las ventajas y desventajas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 91
pertinente al peacuteptido de fusioacuten SmbP para observar si son viables para la
produccioacuten solubilidad yo purificacioacuten de maacutes tipos de bacteriocinas
Figura 18 Gel de E coli BL21 (DE3) pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli BL21 (DE3)+ pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli BL21 (DE3) + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
9 Lisozima (144 kDa)
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli BL21 (DE3) transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 92
Figura 19 Gel de E coli Origami pSmbP-LnqQ inducido a 25degC y 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
2 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
3 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
4 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 25degC Fraccioacuten soluble
5 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 sin IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
6 E coli Origami + pET30a-SmbP_MP1106 + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
7 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 01 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
8 E coli Origami + pSmbP-LnqQ + 1 mM IPTG a 37degC Fraccioacuten soluble
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las proteiacutenas fueron extraiacutedas de E coli Origami transformados con el vector de expresioacuten
pET30a-SmbP_MP1106 como control positivo y el vector pSmbP-LnqQ como experimental El marcador de
peso molecular corresponde a Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No
M00624 GenScript Estados Unidos)
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Figura 20 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 37degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 37degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 37degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 37degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 37degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 37degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 37degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 37degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 37degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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Figura 21 Gel de E coli BL21 (DE3) con controles inducido a 25degC
Roacutetulo Descripcioacuten
M Marcador de peso molecular (kDa)
1 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc 25degC
2 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 25degC
3 E coli BL21 (DE3) + pET30NP-Hoc + IPTG 1 mM 25degC
4 E coli BL21 (DE3) + pET30a-SmbP_LL-37 + IPTG 1 mM 25degC
5 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 01 mM 25degC
6 E coli (DE3) + pETNL + IPTG 1 mM 25degC
7 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 01 mM 25degC
8 E coli (DE3) + pSmbP-LnqQ + IPTG 1 mM 25degC
Gel de poliacrilamida 165 (pv) adicionado tentildeido con Coomasie Blue R-250 durante 2 h a 120 V en buffer
de corrida 1 X Las bandas son las fracciones solubles de las proteiacutenas extraiacutedas de E coli BL21 (DE3)
transformados con los vectores de expresioacuten pET30NP-Hoc y pET30a-SmbP_LL-37 como controles positivos
y los vectores pETNL y pSmbP-LnqQ como experimentales El marcador de peso molecular corresponde a
Broad Multi Color Pre-Stained Protein Standard (5 kDa to 270 kDa) (Cat No M00624 GenScript Estados
Unidos)
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619 Presuntas causas de la ausencia de bandas de intereacutes en los geles de
proteiacutenas
Seguacuten el anaacutelisis fisicoquiacutemico de las secuencias aminoaciacutedicas que fueron
utilizadas en las construcciones para N-AmyE (Tabla 12) todas son de gran
tamantildeo y de alto peso molecular este peacuteptido se ha reportado para la
sobreexpresioacuten de AmyE en E coli (Nakazawa et al 1986) Asiacute como para la
sobreexpresioacuten de una regioacuten de 39 kDa que codifica para una regioacuten N-terminal
de una liasa de pectina (Pnl) en E coli (R Papi amp Kyriakidis 2003) a la fecha no
hemos visto alguacuten reporte de que este peacuteptido sentildeal haya sido utilizado para
producir proteiacutenas de bajo peso molecular
Por otro lado las secuencias que fueron exitosamente producidos con peacuteptido de
fusioacuten SmbP (Tabla 14) tambieacuten han mostrado ser uacutetil para producir proteiacutenas de
alto peso molecular o peacuteptidos de bajo peso molecular con actividad
antimicrobiana como VpDef (Montfort-Gardeazabal Claudio Casillas-Vega amp
Zarate 2020) Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al 2021) y muy recientemente LL-
37 (Perez-Perez et al 2021) el peacuteptido de fusioacuten tambieacuten ha demostrado ser
exitoso para la sobreproduccioacuten de proteiacutenas de alto peso molecular como GFP y
RFP (Vargas-Cortez et al 2016) De esta manera consideramos que tanto el
tamantildeo como el peso molecular no son factores que intervengan durante el
proceso sobreproduccioacuten mediado tanto N-AmyE como con SmbP El punto
isoeleacutectrico tampoco parece ser un factor importante ya que el valor de AmyE es
aacutecido (561) mientras que Pnl es baacutesico (877) Situacioacuten similar sucede entre los
peacuteptidos microbianos puesto que VpDef es ligeramente aacutecido (686) en cambio el
resto de los peacuteptidos (Bin1b 949 LL-37 1061) son baacutesicos similar a LnqQ
Sin embargo observamos que tanto el iacutendice alifaacutetico (AI) como los valores del
iacutendice de hidrofobicidad (GRAVY) siacute son diferentes entre los distintos tipos de
peacuteptidos antimicrobianos Individualmente el valor AI de LnqQ es de 12115
(Tabla 12) y es superior al resto de los demaacutes peacuteptidos antimicrobianos con una
media de 5363 plusmn 3321) El valor AI para N-AmyELnqQ es de 11947 (Tabla 13) y
para SmbP-LnqQ es de 8323 (Tabla 15) respectivamente
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Tabla 12 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con N-AmyE
ID AmyE Pnl LnqQ
L 627 316 53
MW 6929711 3448665 589810
pI 561 877 1010
R(-) 69 21 2
R(+) 55 25 8
AI 6694 7636 12115
GRAVY -0648 -0291 +0300
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 13 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con N-AmyE
ID N-AmyEAmyE N-AmyEPnl N-AmyELnqQ
L 660 360 94
MW 7279942 3947961 1053468
pI 588 922 1063
R(-) 69 22 2
R(+) 58 30 12
AI 6982 8061 11947
GRAVY -0553 -0205 +0426
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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Tabla 14 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas antes de
ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID VpDef Bin1b LL-37
L 49 45 37
MW 543498 520906 449332
pI 686 949 1061
R(-) 6 3 5
R(+) 6 9 11
AI 2388 4756 8946
GRAVY -0996 -0571 -0724
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
Tabla 15 Propiedades fisicoquiacutemicas entre las diferentes proteiacutenas despueacutes
de ser acoplados con SmbP-LnqQ
ID SmbP-VpDef SmbP-Bin1b SmbP-LL-37 SmbP-LnqQ
L 152 148 140 155
MW 1630268 1607675 1536102 1669471
pI 594 648 645 645
R(-) 26 23 25 22
R(+) 16 19 21 18
AI 5086 5878 1828 8323
GRAVY -0938 -0807 -0861 -0514
ID identidad del peacuteptido yo proteiacutena L tamantildeo MW peso molecular en Da pI punto isoeleacutectrico R(-) total
de residuos cargados negativamente (Asp + Glu) R(+) total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys)
AI iacutendice alifaacutetico GRAVY iacutendice de hidrofobicidad
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En cuanto al iacutendice de hidrofobicidad LnqQ mostroacute un valor GRAVY positivo
(+0300) mientras que el resto de los peacuteptidos antimicrobianos donde el valor
GRAVY promedio era de -073 plusmn 019 No es de sorprender que las bacteriocinas
del subgrupo de la familia de las aureocinas similares a A53 como LnqQ
aureocina A53 lacticina Z epidermicina NI01 lactolisterina BU y BHT-B tengan
valores GRAVY positivos (Perez Zendo amp Sonomoto 2018) Sin embargo cuando
LnqQ estaacute acoplado a N-AmyE el valor GRAVY se vuelve auacuten maacutes positivo con
+0426 (Tabla 13) y cuando estaacute fusionado con SmbP el valor GRAVY cambia a -
0514 (Tabla 15)
La literatura menciona que un peacuteptido o proteiacutena presenta un valor GRAVY
positivo debe considerarse como hidrofoacutebica mientras que un valor GRAVY
negativo significa que la proteiacutena es hidrofiacutelica (Kyte amp Doolittle 1982) De manera
que proteiacutenas con valores GRAVY negativos indican que la proteiacutena presenta una
estructura globular (hidrofiacutelicos) mientras que proteiacutenas con valores GRAVY
positivos indican la posibilidad que la proteiacutena guarde alguna relacioacuten con la
membrana (hidrofoacutebicos) (Enany 2014)
El valor GRAVY es considerado como el factor que maacutes influye en la movilidad de
las proteiacutenas en los geles de SDS-PAGE una proteiacutena con un valor GRAVY
negativo tiende a migrar maacutes lento que las proteiacutenas con valores positivos en los
geles para proteiacutenas (Shirai et al 2008) Las unioacuten de las moleacuteculas de SDS con
las proteiacutenas se produce a traveacutes de los aminoaacutecidos hidrofoacutebicos (Robinson amp
Tanford 2002) algunas estructuras hidrofoacutebicas son capaces de unir moleacuteculas
SDS hasta en un rango desde 34 a 10 g de SDS por 1 g de proteiacutena lo que
influiriacutea en una migracioacuten electroforeacutetica anoacutemala en los geles de SDS-PAGE
(Rath Glibowicka Nadeau Chen amp Deber 2009) LnqQ es una proteiacutena globular
(Acedo et al 2016) que utiliza la membrana especiacuteficamente para atacar
(Yoneyama Imura Ohno et al 2009) con lo que suponemos que el iacutendice de
hidrofobicidad pudiera estar afectando en el comportamiento electroforeacutetico de las
proteiacutenas Sin embargo tambieacuten la literatura sugiere que el comportamiento
anoacutemalo en las proteiacutenas de membrana en los geles de SDS-PAGE pudiera no
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 99
necesariamente relacionado a la carga neta de la proteiacutena ni a su iacutendice de
hidrofobicidad (Rath amp Deber 2013)
Al evaluar individualmente a LnqQ a traveacutes la escala Kyte-Doolittle observamos
que el peacuteptido posee dos secciones hidrofoacutebicas que se encuentran
aproximadamente entre los extremos del peacuteptido (entre residuos 5 al 15 y del 31 al
49) representando el 60 del total de la secuencia de LnqQ es hidrofoacutebica
(Figura 22) Si LnqQ estaacute acoplada con N-AmyE se observan las dos regiones
hidrofoacutebicas (entre residuos 9-50 y 66-85) que representa que el 6860 del total
de la secuencia sea hidrofoacutebica (Figura 23) Mientras tanto SmbP retiene sus dos
regiones hidrofoacutebicas que se ubican hacia la regioacuten C-terminal entre los residuos
103-117 y 133-151 componiendo el 2313 de total de la secuencia (Figura 24)
Dado que existe un reporte de produccioacuten exitosa entre la LnqQ acoplada con el
peacuteptido de fusioacuten SUMO (Ma et al 2012) decidimos evaluar su valor AI GRAVY
y su escala Kyte-Doolittle Seguacuten los resultados de ProtParam para SUMO-LnqQ
los valores AI y GRAVY son de 8337 y -0516 respectivamente los cuales son
similares a lo reportado para SmbP-LnqQ Por otro lado seguacuten la escala Kyte-
Doolittle cinco regiones hidrofoacutebicas fueron descritas a lo largo de toda la
construccioacuten y estaacuten aproximadamente repartidas en toda la estructura lineal
entre los residuos 16-18 53-70 87-91 119-134 y 150-168 lo que representa el
28 del total de la secuencia (Figura 25) El valor GRAVY positivo y el alto
porcentaje de residuos hidrofoacutebicos para N-AmyELnqQ nos permite suponer que
estaacute proteiacutena se encontrariacutea anclada en la membrana celular lo que dificultariacutea su
solubilizacioacuten en los geles de proteiacutenas
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Figura 22 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la LnqQ
Figura 23 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para N-AmyELnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de N-AmyELnqQ
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 10 20 30 40 50 60
Valo
r
Posicioacuten
LnqQ
-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
N-AmyELnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 101
Figura 24 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SmbP-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SmbP-LnqQ
Figura 25 Perfil de hidrofobicidad Kyte-Doolittle para SUMO-LnqQ
La imagen fue elaborada a partir de los resultados obtenidos en ProtScale de ExPasy y representa el perfil
hidrofobicidad de la SUMO-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Va
lor
Posicioacuten
SmbP-LnqQ
-3
-25
-2
-15
-1
-05
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Va
lor
Posicioacuten
SUMO-LnqQ
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 102
Ante la ausencia de una respuesta objetiva que explique la ausencia de bandas de
SmbP-LnqQ en los ensayos analizamos el perfil de aminoaacutecidos y detectamos
que la presencia de cisteiacutenas entre los peacuteptidos antimicrobianos tampoco fue un
factor determinante durante la sobreproduccioacuten con la SmbP ya que tanto VpDef
como Bin1b (que se caracterizan por ser abundantes en cisteiacutenas) como LL-37
(que no tiene cisteiacutenas) fueron exitosamente producidos El mapa de calor (Figura
26) sentildealoacute un alto porcentaje de Trp en LnqQ en comparacioacuten con los demaacutes
peacuteptidos antimicrobianos De acuerdo con la escala Kyte-Doolittle Trp es
considerado un residuo hidrofiacutelico (Kyte amp Doolittle 1982) cuando en realidad es
hidrofoacutebico por sus caracteriacutesticas uacutenicas (Mishra Choi Moon amp Baek 2018)
Este residuo funge como estabilizador de las proteiacutenas en la membranas anclaje
y orientacioacuten hacia el lado hidrofiacutelico de la bicapa lipiacutedica (Khemaissa Sagan amp
Walrant 2021) por eso son de alta importancia en proteiacutenas de membrana porque
apoyan en la estabilidad proteiacutena en la interfaz lipiacutedica por su forma riacutegida y plana
(Yau Wimley Gawrisch amp White 1998) Se presume que Trp permite que
peacuteptidos antimicrobianos similares a la aureocina A53 se mantengan unidos a la
membrana (Netz Bastos amp Sahl 2002) Sin embargo al analizar el porcentaje de
Trp entre N-AmyELnqQ SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ descubrimos que los
valores son muy similares 11 26 y 23 Por lo que Trp no seriacutea un factor
clave para que LnqQ sea producido en E coli
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
VpDef
Bin1b
LL37
LnqQ
Figura 26 Perfil aminoaciacutedico de los peacuteptidos antes de acoplarse con SmbPc
El mapa de calor representa la distribucioacuten de los residuos entre los peacuteptidos La intensidad del color negro
representa el porcentaje de residuos entre los peacuteptidos antes de ser acoplados con SmbP
Dada la similitud fisicoquiacutemica entre SmbP-LnqQ y SUMO-LnqQ abordamos el
problema desde el punto de vista analiacutetico otros autores demostraron que
proteiacutenas de peso molecular alto como N-AmyEPnl (R Papi amp Kyriakidis 2003) o
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 103
de peso molecular pequentildeo como SmbP-Bin1b (Montfort-Gardeazabal et al
2021) SmbP-VpDef (Montfort-Gardeazabal et al 2020) SmbP-LL-37 (Perez-
Perez et al 2021) eran faacutecilmente observables mediante la teacutecnica de SDS-
PAGE hechos que utilizamos para la visualizacioacuten preliminar tanto N-AmyELnqQ
como de SmbP-LnqQ en los ensayos electroforeacuteticos Sin embargo en el reporte
de sobreproduccioacuten por SUMO-LnqQ los ensayos electroforeacuteticos preliminares
fueron realizados bajo la teacutecnica SDS-PAGE con Tricina (Ma et al 2012) Esta
variante es utilizada para resolver proteiacutenas con pesos moleculares pequentildeos que
oscilan entre 1 a 30 kDa (Haider Reid amp Sharp 2012) pero tambieacuten es uacutetil para
analizar proteiacutenas hidrofoacutebicas (Schaumlgger 2006) lo cual seriacutea un candidato ad
hoc a las caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas observadas de la LnqQ
Por uacuteltimo y no menos importante es tambieacuten de mencionar todas las
secuencias aminoaciacutedicas donde los peacuteptidos antimicrobianos tuvieron eacutexito con la
SmbP tienen su origen evolutivo en sistemas eucarioacuteticos las defensinas VpDef
(Zhang et al 2015) y Bin1b (Guo et al 2009) provienen del invertebrado
Venerupis philippinarum y del epidiacutedimo de la rata Rattus norvegicus
respectivamente mientras que la catelicidina LL-37 proviene del sistema inmune
de chimpanceacutes y humanos (Agerberth et al 1995) nuestra LnqQ posee un origen
procariota a traveacutes de Lactococcus lactis QU5 (Fujita et al 2007) Las defensinas
estaacuten compuestas por estructuras tipo beta plegadas mediadas por cisteiacutenas
conservadas mientras que los dominios antimicrobianos de las catelicidinas son
estructuralmente lineales carentes de puentes disulfuro y estaacuten compuestas por
varias heacutelices (Dorin McHugh Cox amp Davidson 2014) LnqQ es una estructura
lineal compuesta por dos heacutelices anfipaacuteticas (Perez et al 2014) por lo que el
factor estructural tampoco seriacutea un factor clave salvo por el hecho de que
provienen de oriacutegenes evolutivos distintos
A manera de conclusioacuten de acuerdo con la evidencia recolectada tanto a nivel
bioinformaacutetico como experimental encontramos que el marco de lectura de los
vectores para la produccioacuten de N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ estaban
correctamente orientados y dispuestos en sus marcos de lecturas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 104
correspondientes los geles de poliacrilamida siacute fueron efectivos para detectar
proteiacutenas con un peso similar (lisozima 144 kDa) a los peacuteptidos de nuestras
construcciones (N-AmyELnqQ= 1053 kDa y SmbP-LnqQ= 1669 kDa)
Confirmamos que el IPTG siacute es capaz de inducir la sobreproduccioacuten de proteiacutenas
de control tanto en cepas de E coli BL21 (DE3) como de Origami tanto a 25degC
como a 37degC De manera que tanto N-AmyELnqQ como SmbP-LnqQ suponemos
que siacute son producidas pero por caracteriacutesticas fisicoquiacutemicas propias de la LnqQ
es posible que 1) dado su alta hidrofobicidad es posible que N-AmyELnqQ se
mantenga acoplada en la membrana celular lo que dificultariacutea su solubilizacioacuten en
los geles de SDS-PAGE 2) desde el punto de vista analiacutetico es posible que SDS-
PAGE no sea la teacutecnica oacuteptima para la visualizacioacuten de las proteiacutenas hidrofoacutebicas
3) no existe informacioacuten conclusiva que respalde soacutelidamente porqueacute SmbP-LnqQ
no logroacute ser sobreproducida utilizando E coli como organismo heteroacutelogo
productor
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 105
CAPIacuteTULO 7 CONCLUSIONES
El biosensor disentildeado de ceacutelulas de E coli basado en la deteccioacuten de moleacuteculas
de QS es capaz de producir LnqQ en base a la concentracioacuten externa de AIP
excretada por MRSA La capacidad del biosensor estaacute mediada por un vector de
expresioacuten disentildeado que lleva por nombre Dual Biosensor-Killer Este plaacutesmido
ademaacutes puede ser utilizado para la construccioacuten de otros biosensores que
compartan el objetivo de detectar y destruir otros patoacutegenos productores de
sentildeales tipo QS Seguacuten nuestros anaacutelisis bioinformaacuteticos in silico nuestro
biosensor estaacute capacitado para detectar y destruir cepas de S aureus que sean
productoras de moleacuteculas de sentildealizacioacuten tipo AIP clase II De acuerdo con
nuestros pronoacutesticos nuestra cepa modificada seriacutea capaz de producir secretar y
ser capaz de ser resistente a la produccioacuten de LnqQ debido a que la maquinaria
geneacutetica se mantuvo intacto Nuestros resultados revelan indican que la LnqQ
seraacute lo suficientemente soluble cuando sea sobreexpresado Por uacuteltimo
determinamos que no existen epiacutetopos para ceacutelulas tipo B ni riesgo de
alergenicidad De esta manera la LnqQ producida por este sistema bioloacutegico es
aparentemente seguro para ser utilizado como un potencial candidato a agente
terapeacuteutico Los resultados in silico motivan al desarrollo y disentildeo de nuevos
agentes antimicrobianos a traveacutes de biosensores de ceacutelulas enteras para eliminar
patoacutegenos tanto sensibles como resistentes a los antibioacuteticos A pesar de los
favorables resultados reportados en publicaciones anteriores y la evidencia
predictiva sobre el peacuteptido sentildeal N-AmyE y con el peacuteptido de fusioacuten SmbP para la
produccioacuten de proteiacutenas recombinantes como la bacteriocina LnqQ dichas
observaciones no pueden ser aplicadas para la produccioacuten expresioacuten y
purificacioacuten desde ceacutelulas de E coli BL21 (DE3)
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 106
ANEXOS
Divulgacioacuten de la investigacioacuten
Publicaciones
Beniacutetez-Chao DF Balderas-Cisneros FDJ Leoacuten-Buitimea A and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Design and in silico analysis of a whole-cell biosensor able to
kill methicillin-resistant Staphylococcus aureus Biotechnol Appl Biochem
httpsdoiorg101002bab2210
Beniacutetez-Chao DF Leoacuten-Buitimea A Lerma-Escalera JA and Morones-
Ramiacuterez JR 2021 Bacteriocins An Overview of Antimicrobial Toxicity and
Biosafety Assessment by in vivo Models Front Microbiol
httpsdoiorg103389fmicb2021630695
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 107
Archivos de disentildeo
Todos los archivos gestionados para los disentildeos estaacuten guardados en su formato
correspondiente adentro de la carpeta de ldquoDoctoral ndash Anexosrdquo la cual fue anexada
propiamente en el disco compacto
Se elaboroacute una carpeta nombrada ldquoBioBricks and Modulesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 61 hasta 610 y estaacute subdivida
en cuatro subcarpetas nombradas como ldquoBioBricks (secuencias originales)rdquo
ldquoModulesrdquo ldquoPlasmidsrdquo ldquoTemplatesrdquo y el ldquoDual Biosensor Killerdnardquo Estos archivos
fueron elaborados a traveacutes de la aplicacioacuten de SnapGene 113 y estaacuten guardados
en formato dna Tambieacuten entregamos dos documentos en formato PDF que
contienen la secuencia nucleotiacutedica optimizada de todos genes usados para el
moacutedulo de biosensor y para el moacutedulo de bacteriocina
Se creoacute una carpeta nombrada ldquoSignal and fusion peptidesrdquo que contiene
informacioacuten de los resultados para las secciones 611 hasta 618 y en esta se
encontraraacute la subcarpeta ldquoMapa Geneacutetico de vectores de expresioacuten de expresioacuten
pETNL y pSmbP-LnqQrdquo Ademaacutes se entregaron tres archivos PDF donde dos de
eacutestos archivos contienen datos predictivos de la estructura secundaria y terciaria
de los productos de pETNL ldquoPhyre2 pETNLpdfrdquo y de pSmbP-LnqQ ldquoPhyre2
pSmbP-LnqQrdquo a traveacutes de la aplicacioacuten en liacutenea Phyre2 y el otro archivo PDF
ldquoSimulacioacuten agarosa 1pdfrdquo que contiene una simulacioacuten en gel de agarosa 1
(pv) de los productos lineales de los vectores de expresioacuten pET30a(+) pETNL y
pSmbP-LnqQ En la carpeta de este capiacutetulo tambieacuten se entregaron cinco archivos
en formato dna que contienen la informacioacuten nucleotiacutedica de la construccioacuten de
los vectores de expresioacuten cuyos nombres son ldquopET30(a)-NAmyE-LnqQ
pETNLpdfrdquo ldquopET-30a(+)pdfrdquo ldquopET-30a(+)-N-AmyEpdfrdquo ldquopET30a-SmbPpdfrdquo y
ldquopSmbP-LnqQ GFJBC01pdfrdquo Todos los archivos estaacuten marcados con sus
respectivas caracteriacutesticas
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 108
Resumen autobiograacutefico
MC Diego Francisco Beniacutetez Chao
Candidato para el grado de
Doctor en Ciencias con orientacioacuten en Microbiologiacutea Aplicada
Tesis Control poblacional y oscilatorio utilizando el Quorum Sensing de
Staphylococcus aureus mediante un circuito geneacutetico de Escherichia coli
Edad 31 antildeos
Campo de estudio Desarrollo de agentes terapeacuteuticos y biologiacutea sinteacutetica
Biografiacutea Nacido en Monterrey Nuevo Leoacuten el diacutea 24 de julio de 1990 hijo de
Mariacutea Guadalupe Chao Soto y Alejandro Beniacutetez Villegas
Educacioacuten Egresado de Licenciado en Biotecnologiacutea Genoacutemica (UANL) en el
2013 y Maestro en Ciencias con Acentuacioacuten en Microbiologiacutea (UANL) en 2015
UANL-FCQ Doctorado en Microbiologiacutea Aplicada 109
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