UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT

POSGRADO EN CIENCIAS BIOLOGICO AGROPECUARIAS

UNIVIASIOAOAUIONOMAOINAYARB

iii- .~

SISHMA Dr ~IBlIUJECAS

"IDENTIFICACION DEL GEN aoxB EN UNA COLECCION DEPROTEOBACTERIAS RESISTENTES A ARSENICO DEL Rio MOLOLOA"

•QFB ARMANDO QUINTERO CASTANEDA

Tesis presentada como requisito parcial para la obtenci6n del grado deMaestria en Ciencias en el Area de Ciencias Ambientales

Tepic,Nayarit,4dejunio2014

Dr. Diego Garcia ParedesCoordinadordelProgramadeMaestrfaenCienciasBiol6gicoAgropecuariasPresente

Los que suscribimos, integrantes del comite tutorial del QFB Armando QuinteroCastaneda, declaramos que hemos revisado la tesis titulada: "ldentificaci6n del genaoxB en una colecci6n de proteobactertas resistentes a arsenico del rio Mololoa"ydeterminamosquelatesispuedeserpresentadaporelestudiantede MaestrfaenCiencias Biol6gicoAgropecuarias, con opci6nterrninal en CienciasAmbientales.

ELeOMIT'TUTORIAL '~

Dkecto,. d.T~,D~.V....ok. AI.J.o.... Mood.....o ','m••~Co-Director de Tesis: Dra. LetiCIa M6nica Sanchez Herrera ~"'-"')

Asesor de Tesis: Dr, JesUs Bernardmo Velazquez Fernandez ~~~

CBAP/141/14

Xalisco, Nayarit; 10 dejunio de 2014

Ing. Alfredo Gonzalez JaureguiDirector de Administracion EscolarPre sen t e.

Con base al oficio de fecha 04 dejunio de 2014, enviado por los CC.Ora. Veronica Alejandra Mondragon Jaimes, Ora. LeticiaMonica Sanchez Herrera, y Dr. Jesus Bernardino VelaquezFernandez, donde se nos indica que el trabajo de tesis cumple con 10establecidoenformaycontenido,ydebidoaquehacumplidoconlosdemas requisitos que pide el Posgrado en Ciencias BiologicoAgropecuarias de la Universidad Autonoma de Nayarit, se autoriza alC. Armando Quintero Castaneda, continue con los tramitesnecesariosparalapresentaci6ndelexamendegradodemaestrfa.

Sin masporelmomento,recibauncordialsaludo.

C.c.p.-Expediente.

Unidad Academica de Agricultura Carretera Tepic-Compostela Km. 9C.P. 63780, XaliscoNayarit Tel. 311-2-1 1-24-78

EI presente trabajo de investigaci6n forma parte del proyecto "Resistencia a

metalespesadosyantibi6ticosen bacteriasambientalesdel rio Mololoa"quese

desarrollaenel Laboratoriode Resistencia Bacterianadela UnidadAcademicade

Ciencias Quimico Biol6gicas y Farmaceuticas de la UAN, bajo el Iiderazgo de la

Ora. Ver6nica Alejandra Mondrag6n Jaimes y cont6 con el apoyo econ6mico

PROMEP/103.5/07/2519 del mismo proyecto.

Parte de los experimentos se realizaron en ellaboratoriode An<ilisis Especiales

de Ja Unidad de Tecnologia de Alimentos de la UAN y en el Laboratorio de

Biologia Molecular del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierias

(CUCEI) de la Universidad de Guadalajara.

Paginaiv

ADios por permitirme lIegar a buen termino con mi maestria y ayudarme aentenderque caminarpor un senderosinuoso hacemas placenterala lIegadaaldestinofijado.

Ala doctora Veronica Mondragon por despertaren mi persona el interes por lainvestigacion, porpermitirmeformarpartedesu selecto equipo de trabajoyportodosuapoyoycompromisoduranteeldesarrollodemimaestria.

A la doctora Leticia Monica Sanchez por aceptarme como alumno de maeslria, porsuapoyoydedicacionenelproyectodeinvestigacionyporsureiterado interes enlaadopciondelosvaloresimprescindiblesenuninvestigador.

A los M. en C. Monica Elizabeth Martinez y Yolotzin Apatzingan Palomino por laayudayorientacion que me brindaron cuandomas 10 necesitaba.

AI doctor Jesus Bernardino Velazquez porsus enseiianzas en lasasignaturas.

A los compaiieros de generacion, con quienes comparto la felicidad por suslogros.

A la a.F.B. Guadalupe Pacheco y la Biologo Geovanny Melchor por sucomprensionyapoyoenlosmomentosmasdificiles.

Paginav

AI Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologla por el apoyo econ6mico brindado ami persona en la modalidad de becas estudiantiles para alumnos de maestrla (No.debeca335089;CVU448011).

AI Posgrado en Ciencias Biol6gico Agropecuarias y Pesqueras de la UniversidadAut6noma de Nayarit por las facilidades econ6micas y administrativas otorgadaspara mi desempeno como alumno de maestrla en ciencias. De igual manera,agradezco al personal administrativo de la dependencia citada por el apoyobrindadoduranteeldesarrollodemiempresa,queestaporconcluir.

A la direcci6n de la Unidad Academica de Ciencias Quimico Biol6gicas yFarrnaceuticas porperrnitirel uso de las instalacionesdel Laboratorio deResistencia Bacteriana para el desarrollo experimental de la presenteinvestigaci6n.

AI Laboratorio de Resistencia Bacteriana por permitir la realizaci6n de la mayorpartedelosexperimentos.

A la Unidad de Tecnologia de Alimentos por facilitar el uso de instalaciones yequipodel LaboratoriodeAnalisis Especiales.

AI Laboratorio de Biologia Molecular perteneciente al Departamento deFarrnacobiologia del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierias de laUniversidaddeGuadalajaraporpermitirmiaceptaci6nyfacilitarsusinstalacionespara la realizaci6n de una estancia de investigaci6n con la Ora. Maria EstherMacias Rodriguez.

Paginavi

Portu pacienciaycomprension; pocote importo sacrificartu tiempo para que yo

pudieracumplircon elmfo. Portu bondad ysacrificfo me inspirastea sermejor,

porlocualpuedodecirqueestatesislievamuchodeti.Graciasporestarsiempre

amilado,Chaparra.

Amispadresyhermanos

Porelapoyoycomprension que me brindaron durante estos aiios de estudio.Que

Diosrecompensesubondadymelosguardemuchosaiios.

Alamemoriadeunamigo

Quien se nos adelanto en elcaminoyno alcanzo a compartirmigusto poreste

logro. Decorazon lededicoestetriunfo, amigo Don Luis.

ABREVIATURAS Y SiMBOLOS

8itio de inserci6n de casettes de genes en un integr6n

Acr3p Protefnasdetransportetransmembranaldearsenito

Enzimaarsenatoreductasarespiratoria

Gencodificanteparalasubunidadmayordelaarsenitooxidasa

Oper6n de resistencia a arsenico; incluye una enzima arsenato

reductasacitoplasmaticayuncomplejodeexpulsi6ndearsenit0

Transferencia Genetica Horizontal (HGT, por sus siglas en ingles)

Genquecodificalaenzima~-galactosidasa

H20dde Aguadestiladadesionizadaesteril

Oper6n de resistencia a mercuric; incluye una enzima mercurico

reductasayproteinas de expulsi6n

pA Oligonucle6tido forward del par publicado por Hutson et al., 1993

para amplificaci6n de secuencias de rADN 168

pH" Oligonucle6tido reverse del par publicado por Hutson et al., 1993

paraamplificaci6n de secuencias de rADN 168

x2 Jicuadrado

Paginaviii

iNDICE TEMATICO

1. INTRODUCCION ..

1.1 GENERAUDADES DEL ARSENICO 1

1.2 CONTAMINAOON POR ARSENlCO .

1.3 REGULAOON ..

1.4 EXPOSIOON AL ARSENlCO ..

1.5 CLASIFICAOON Y NORMATNA .

1.6 INTERACOON CON MICROORGANISMOS..

1.9ELOPERONaox 13

3. JUSTIFlCACION ..

4.HIPOTESIS ..

5. OBJETIVO GENERAL .......

5.1 OBJETIVOS ESPEdFiCOS ..

6. MATERIALES YMETODOS .

6.1 MATERIAL BIOLOGlCO .....

6.3 ESTRATEGIA DE TRABAJO

6.3.1 PRUEBAS FENOTIPlCAS Y EXTRACOON DE ADN ....

a)pruebas de concentraci6n minima inhibitoria (CMI) 29

b)pruebadecapacidadarsenito-oxidante.... . 30

c) anl1/isisderesultados.... . 30

d)extracci6ndeADNbacteriano ....

6.3.2 REACo6N EN CADENA DE LA POUMERASA (PCR) 31

................................................................................................... 32

a) empleo de los Oligonlle/e6tidos diseiiadosporInskeep eta'., 2007

b)empleodelosOligonlle/e6tidosdiseiiadospor Qllemenellretal., 2008

a)bUsqlledadelgenaoxB en integrones e/aseI ....

b)selecci6ndecepasparaanalisisderADN16S .

c)analisisdeseCllenciasderADN 36

7. RESULTADOS YDISCUSION.

7.1 CONCENTRA06N MINIMA INHIBITORlA (CMI)

7.2 ACfIVIDAD ARSENITO-OXIDANTE .

7.3 IDENTIFICACI6N DEL GEN aoxB .

7.3.1 BUSQUEDA DEL GEN CON LOS OLIGONUCLE6TIDOS DESCRITOS PORINSKEEP etal., 2007.... . 41

7.3.2 BUSQUEDA DEL GEN CON UTILIZA06N DE LOSOLIGONUCLE6TIDOS DESCRITOS POR QuEMENEUR et al., 2008 42

7.4 BUSQUEDA DEL GEN aoxB INMERSO EN INTEGRONES CLASE 1 46

7.5 ANALISIS DE SECUENCIAS DE rADN 165 .

8. CONCLUSlONES .

9. PRODUCTOS DE LA INVESTIGACION ..

11. BIBLlOGRAFM..........

tNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Prineipa/es compuestos organieos e inorganieos que forma el arsenieo.2

Cuadro 2. Normas y regulaeiones para el arsfmieo inorg{mieo . . . .. . 5

Cuadro 3. Identifieaeion y sitios de aislamiento de las espeeies baeterianasutilizadasenesteestudio... . 28

Oligonueleotidos empleados en esta investigaeion, tamaiio delesperado (euando eorresponde) y

Cuadro 5. Resultados de las pruebas de CMI de arsenito y aetividad arsenito-oxidante... . 38

Tamaiios resultados de la seeueneiaeion de lospor PCR del

Paginaxi

fNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Cicio biogeoquimico del arsenico 4

Figura 2. Estructura y cicio catalfticooxidasa ...

Figura 3. Estructura cristalina de la Arsenito

arsenito...... 11

Figura 4. Contextogenetico de 21 islasdearsenico 15

Figura 5. Filogenia de secuencias aoxB y rADN 16S.....

Figura 6. Comparacion de las regiones amplificadas por los oligonucleotidos deInskeep et al., 2007 y Quemeneur et al.,200B... . 20

Figura 7 Alineamiento de secuencias nucleotidicas de siete genes aoxBpublicados y tentativos que muestra las regiones usadas para el diseiio deoligonucleotidos.... . 21

Figura B. Ubicacion geog,,!Jfica del rio Mololoa ..

Figura 9. Sitios muestreados en la bUsqueda de bacteriasresistentes..

Figura 10. Esquema de la estrategia experimental utilizada en este estudio

Figura 11. Plantilla empleada en la tecnica de CMI ...

Figura 12. Planteamiento de las pruebas de PCR con oligonucleotidos dirigidos alas secuencias conseNadas Int/1 y qacED del Integron Clase I en combinacionconlosoligonucleotidosparaelgenaoxB... . ... 35

Figura 13. Pruebas de CMI de arsenito realizadas a las 15 cepas de estudio ......39

Figura 14. Resultados de pruebas de actividad arsenito-oxidante en medio~ ~

Figura 15. Electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados por PCRcon los oligonucleotidos de Inskeep et al.,2007. .. .......42

Paginaxii

Figura 16. Corrimien/o e/ec/rofore/ico en ge/es de agarosa a11% en TAE de lasbandas amplificadas con losoligonucle6/idos de Quemeneure/al., 2008 43

Figura 17. Resul/ado del BLA5Tpfll entre la secuencia de aminoacidos obtenida dela secuencia de 640 pb Y las secuencias reportadas en la base de datos Non-redundan/pro/einsequences, del NCBlfIl 43

Figura 18. Elec/roforesis de los produc/os de PCR para la amplificaci6n de rADN165...... . . .. 49

Paginaxiii

RESUMEN

Elarsenicoenallasconcenlracionesrepresenlaunriesgoparalasaludhumanay

el ambienle. EI rro Mololoa, que alraviesa la ciudad de Tepic, Nayaril, presenla

concenlraciones eJevadas de arsemico. Ademas es afeclado por descargas

induslriales, agropecuarias, domeslicas, de servicios y Iixiviados del liradero

municipal a cielo abierto "Ellxtele", 10 que causa un serio problema de salud

publica. En estudios previos lIevados a cabo en este sitio, se han aislado e

identificadounaseriedemicroorganismosconcapacidadderesislenciaaarsenico

y metales pesados como mercurio, cromo, cadmio y a antibi6ticos como

kanamicina, cipro!1oxacino, gentamicina y beta-Iactamicos. Eslos hallazgos

sugieren laexistencia de una constante presi6n de selecci6n en la zona.Ello

implicaques61olasbacleriasencuyogenomaseencuenlrengenesderesistencia

aagentesseJectivoslograransobrevivir.

Enestetrabajo, seencontr6 que8 de las 15cepasestudiadastienenlacapacidad

deconvertirarsenitoenarsenatoporreacci6ndeoxidaci6n,loqueexplicael

fenotipoarsenilo resislenle, con valores de concentraci6n minimainhibiloria (CMI)

de arsenilo de sodio (NaAs02) enlre 2 y 15 mM, correspondienle a las cepas C4:

E. cloacae, C5: Enterobacter sp., C10: Enterobacter sp., C12: K. pneumoniae,

C16: E. aerogenes, C20: K. pneumoniae, C81: K. pneumoniae y C95: K.

pneumoniae. La idenlificaci6n del gen aoxB como responsable del fenolipo

arsenito-resislenleconutilizaci6ndelosoligonucle6lidosreportadosparaeslegen

no fueposible. Probablemenle,seaconsecuenciadelaocurrenciadeunproceso

exaplativo donde los microorganismos empleen un mecanisme enzlmalico dislinto

delsistemaaoxparalaoxidaci6ndearsenilo.

Paginaxiv

SUMMARY

The presence of high concentrations of arsenic in a certain site represents a

constant risk to populations living there. In Mololoa River, which flows across the

city of Tepic, Nayarit, concentrations of arsenic above the average content of

continental crust haves been found. Along with this, pollution by sewage and

landfill leachate "Ellxtete"constitutesa serious public health problem. In previous

studies, arsenic-resistant microorganisms have been isolated from samples of

sewage and leachate. Those organisms are also resistant to heavy metals such as

mercury, chromium, cadmium and antibiotics such as kanamycin, ciprofloxacin,

gentamicin and beta-Iactams.

In this work, it was found that 8 of 14 studied strains have the ability to convert

arsenite to arsenate by oxidation. This explains the phenotype resistant arsenite,

with values of minimum concentration inhibitory (CMI) are between 2 and 15 mM

(NaAsOz) sodium arsenite, corresponding to the strains C4: E. cloacae, C5:

Enferobacfersp., C10: Enferobacfersp., C12: K. pneumoniae, C16: E. aerogenes,

C20: K. pneumoniae, C81: K. pneumoniae y C95: K. pneumoniae. It was not

possible to identify the aoxB genotype. This could be probably caused by

occurrence of an exaptative process arisingfromdifferentenzymaticmechanisms

other than "aox".

Paginaxv

Pilginaxvi

1. INTRODUCCION

1.1 GENERALIDADES DEL ARSENICO

EI arsenico (As) es un metaloide ubicuo en el ambiente (Brown y Ross, 2002) que

pertenece al grupo Vde la tabla peri6dica de los elementos yes, por 10 tanto,

clasificado como un metal pesado. Se encuentra en la naturaleza en cuatro

estadosdeoxidaci6n(+5,+3,0,y-3),conarsenatopentavalente[+5,AsMl.Y

arsenito trivalente [+3, As (111)] como las formas mas comunes. EI arsenico

elementalmuyraramenteseencuentraen lanaturaleza, perosepuedeencontrar

en forma de masas microcristalinas en Siberia, Alemania, Francia, Italia, Rumania,

ylos EE.UU. La mayor parte seencuentraen conjunci6n con azufreen minerales

tales como arsenopirita (FeAsS), rejalgar (AsS), oropimente (As2S3) y enargita

(CuJAsS.) (Mateos etal., 2006).

Dado que se encuentra en cuatro estados de oxidaci6n, este elemento puede

formar una serie de compuestos quimicos, de los cuales se resumen los

principalesenelcuadr01.

Los compuestos arsenicales tienen una larga historia como agentesmedicinalesy

venenosos. Se sabe que las sociedades humanas ya conocian el arsenico en el

ana 3000 a. de C. y que posiblemente fue descubierto por su presencia como

subproducto en las actividades mineras. Su usc medicinal fue descrito desde el

an0400 a. de C. porHip6crates, quien recomend61a aplicaci6n de una pasta de

rejalgar (AsS) para tratar ulceras cutaneas. Historias de muertes por

envenenamientoconarsenicohanabundadoenloscirculosdelapolitica. Durante

el Renacimiento en !talia, los Borgias usaron arsenico para asesinar oponentes

politicos (Sambu yWi!son, 2008).

Paginal

Cuadro 1. Prlncipales compuestos organlcos e Inorganlcos que forma elarsenico.

Nombre(Sin6nimo) IArsenlcolnorganlco, As (III)

F6rmulaqufmica

6xidodearsenico(1I1),tri6xidode arsenico

acidoortoarsenioso,acidoarsenioso

(Orto)arsen~os, salesdelacido. ortoarsenioso

clorurodearsenico(III),triciorurodearsenico

su~urode arsenico (III), trisu~urode arsenico

HzAsO,', HAsO,", AsO,"

AsCI>

Arsenicoinorganico, As (V)

6xidodearsenicoM,pent6xidodearsenico

acidoortoarsenico,acidoarsenico

(Orto)arseniatos,salesdelacidoarsenico

A,senicoorganico

acidop-aminobenceno-ars6nico

acido4-nitrofenilars6nico,

acidop-nitrofenilarsonico

arsenobetalna

dialquilcloroarslna

alquildicloroarsina

Tomadode. Carbonell etal., 1995.

HzAsO.

HAsO,

HzAsO,', HAsO,", AsO,"

CHzAsO(OH)2

(CH,)zAsO

CHzAsH,

(CH,)zAsH

(CH,)zAs

H,N-C,H,'AsO(OH)2

(CH,)zAs'CH,COOH-­

(CH,)zAs'CH,CH,OH

RzAsCI

Pagina2

Durantela Edad Media, laspropiedadest6xicasdelarsenicofueronmuyutilizadas

yelarsenicoblanco(tri6xidodearsenico)fueelvenenodeelecci6n,porsualla

toxicidad. Durante la Primera Guerra Mundial, se desarrollaron y utilizaron como

armas qulmicas los gases arsenicales, entre ellos el gas Lewisita (c1orovinil­

dicloroarsina), que es un potente agentevesicante, irritante localytoxico

sistemico.Aprincipiosdeestesiglo, losarsenicalesorganicosseemplearonpara

combatirenfermedadescomolatripanosomiasisylaslfilisy,algunos compuestos

de arsenico inorganico, para el tratamiento de enfermedades cutaneascronicas,

anemia, leucemia y enfermedades pulmonares (Sambu y Wilson, 2008).

Actualmente, alrededor del 90% de todos los compuestos de arsemico producidos

porel humane se utilizan como conservantes de la madera, donde el arsenato

cromado de cobre es el mas utilizado. E110% restante se usa en insecticidas,

fertilizantes, herbicidas, fungicidas, producci6n de vidrio, semiconductores y

produccion de aleaciones de metales; tambien se utiliza como ingrediente en

medicamentos para el tratamiento de algunas enfermedades (por ejemplo,

enfermedad del sueno y leucemia cronica mieloide) (Mateos etal. ,2006).

1.2 CONTAMINACION paR ARSENICO

Lasfuentes naturales del arsenico presente en elartlbiente incluyenelvulcanismo,

la actividad hidrotermica y la erosion de las rocas sedimentarias e igneas que

contienen minerales de arsenico en su composicion (Figura 1). Las actividades

antropogenicas, tales como la fundicion de minerales, quema de combustibles

fosiles yel usc de agroquimicos tambien representan unafuente importante de

arsenicoenelambiente (Oremland y Stolz, 2003).

Este metaloide se encuentra ampliamente distribuido de forma desigual en la

atmosferaterrestre, hidrosfera, suelos, sedimentos,yorganismosvivos(Culieny

Pagina3

Reimer, 1989). Su contenidoen lacortezaterrestreoscilaentre 1.5y2mg/kgyes

el numero 20 en la lista de los elementos mas abundantes (N. A. S., 1977). Se

encuentranaltasconcentracionesdearsenicoenlasareasdondese presenta una

actividadgeotermicanotable,aslcomoensuelosprocedentesde roca madre de

origenvolcanico (Carbonell etal., 1995).

Figura 1. Cicio biogeoquimico del arsenico. Se muestra la implicaci6n de los

microorganismos en laformaci6n de las especies qufmicasdel arsenico. Traducidode

Jones,2007.

Suciclobiogeoquimicoesaltamentedependientedelatransformaci6nbacteriana,

la que consiste en metilar, reducir y/o oxidar el metaloide. Dichas

biotransformacionestienen un rolfundamentalen lamovilidadyladistribuci6nde

arsenicoenelambiente (Silvery Phung, 2005).

Pagina4

1.3 REGULACI6N

La regulaci6n del arsenicoesta a cargo de diversas dependencias (Cuadro 2). EI

valor limite actual de arsenico en agua potable establecido poria OMS esde 10

flg As/L (WHO, 2004). Esla concentraci6n tambien fue adoptada en Mexico como

Ilmile maximo penmisible en agua de loma domiciliaria, segun 10 eslipula la NOM­

127-SSAl-1994, que eslablece los Iimiles maximos permisibles en agua para uso

yconsumohumano.

La dosis de referencia LOAEL (nivel masbajo de efeclos adversos observables)

calculada para elarsenico a partir del valor de 0.17 mg/L dearsenicoen elagua

conunaestimaci6ndelaingesli6ndearsenicoatravesdelosalimentos de 0.002

mg/dra, unconsumode4.5lilrosdeaguaaldiayun pesocorporalpromediode

55 kg en las personas expueslas, es de 0.014 mg/kg-dia (ATSDR, 2009).

Cuadro2. Normasyregulaciones paraelarsenicoinorganico.

Organismo I

Aire-Iugarde trabajo 10 "g/m3

NIOSH Aire-Iugardetrabajo 2 ug/m3

OSHA Aire - lugar de trabajo 10 "g/m3

Aire-ambiente No Aplica

EPA Agua-aguade bebida 10 partes porbill6n

FDA Alimentos 0.5-2partesporbiIl6n

ACGIH: Conferencia Americana de Higienistas Industriales Gubernamentales

EPA AgenciadeProtecci6nAmbientaide EE. UU

FDAAdministraci6ndeAlimentosyFarmacosdeEE.UU

NIOSH:lnstitutoNacionalparalaSeguridadylaSaludOcupacionai

OSHA:Administraci6ndeSeguridadySaludOcupacionaldeEE.UU

Tomado de. ATSDR, 2009.

PaginaS

1.4 EXPOSICI6N AL ARStNICO

EI arsEmico, al igual que otros metales pesados, no puede ser destruido en el

ambiente,porlocualpuedepropagarseycausarefectosperjudicialesenlosseres

humanos,animalesyotrosorganismos(Mateosetal.,2006).

Lasprincipales rutasde exposicion al arsenicoson la ingesta de alimentosyde

agua de bebida, asf como la inhalacion de particulas. EI nivel de absorcion esta

influido poria ruta de exposicion y la especie quimica de arsenico. Las plantas

puedenabsorberarsenicodelsueloodelamateriadepositadasobre sus hojas.

Generalmente, la absorcion de las formas organicas de arsenicoesmuysuperior

alaabsorciondelasinorganicas, aunquenormalmente las concentracionesenlas

plantas son bajas (Moreno-Grau, 2003). EI arsenato y arsenito, al entraral agua

deconsumo humanodesdefuentes naturales, han causado envenenamientos en

paises de America y Asia (Nordstrom, 2002; Ravenscroft et al., 2009). Ademas, en

otros paises se ha reportado contaminacion por arsenico debida a actividades

antropogenicas como la mineria (Smedley y Kinniburgh, 2002)

EI principal aportedeAs a la dieta son losalimentosdeorigen marino, pues los

crustaceosypecesmarinoscomestiblestienenlasconcentracionesmasaltas(0.1

a 90 ~g/g). Sin embargo, el As presente en este tipo de alimentos es organico, el

cualesmenostoxico.La ingestion en elaguade bebida(principaImentearsenico

inorganico) es una importantefuente deexposicion, que puede lIegara ser un

problema grave de saIud pliblica. Esteproblemahasidodescritoenvariospaises,

donde las concentraciones rebasan varias veces el limite maximo permitido

establecido por la OMS para agua de consumo humano. EI ingreso al organismo a

traves del aireysuelo es mucho menor, perc puede lIegara serimportante en

poblacionesaledariasalasfuentesdeemision(PimparkeryBhave,2010).

Pagina6

EI arsenico resulla 16xico para la mayorla de formas de vida (Cullen y Reimer,

1989). Debido a su simililud eslruclural con el fosfalo, el arsenalo ejerce su

loxicidadpordesacoplamienlodelafosforilaci6n oxidaliva, con 10 que inlerrumpe

la slnlesis de ATP. Por su parte, el arsenilo forma fuertes enlaces con grupos

funcionalescomo losgruposliol de los residuosdecislelnae imidazolderesiduos

dehislidinadeprolelnascelulares, molivoporelcualejerceunafuerte inhibicion

enzimalica (Oremland ySlolz, 2003).

Eliodalugaraprocesosdeloxicidadagudaycronica;laingesliondedosis

grandes provoca problemas gaslrointestinales, lraslornos en funciones de

sislemas cardiovascular, nervioso y finalmenle, muerte. Tambien depresion de

medulaosea,hemolisis, hepalomegalia, melanosis,polineuropalfayencefalopalfa

(Boll,2013).

La exposicion cronica se ha relacionado con una variedad de slnlomas de

afeclacionesdermicas como dermalilis exfolialiva, queralosis, vilfligo y cancer de

piel, as! como con neuropalfa periferica, encefalopalfa, bronquilis, fibrosis

pulmonar, hepaloesplenomegalia, hipertension portal, enfermedad vascular

perifericaf'enfermedad del pie negro", aterosclerosis, cancer y diabeles mellilus

(Boll,2013).

Segun informes de la OMS, la exposici6n prolongada al arsenico en el agua

polable esla causalmenle relacionada con un mayor riesgo de cancer en piel,

pulmones, vejiga y rinones, asi como con cambios de la piel (hiperqueralosis y

cambios en la pigmenlacion). A partir de concenlraciones 2: 50 ~g As/L de agua

polablese han observado relacionesde exposici6n-respueslapara U'riavariedad

depalologias, con un riesgo mayordecancerdepulm6nyvejigaydelesionesen

lapiel(Boll,2013).

Pagina7

1.5 CLASIFlCACI6N Y NORMATIVA

En el 2002, el arsenico fue c1asificado por la Agencia Inlernacional para la

Invesligaci6n del Cancer (IARC, por sus siglas en ingles) dEmlro del grupo 1 de

carcinogenicidad. Esla misma descripci6n Ie alribuy6 el programa nacional de

toxicologia de Estados Unidos (NTP, por sus siglas en ingles), y la Agencia de

Protecci6n al Ambiente (EPA, por sus siglas en ingles) 10 c1asific6 en el grupo A,

que corresponde a la clasificaci6n de carcin6geno humane conocido. Ademas,

bajolaautorizaci6ndela Ley del Aire Limpio, la EPAclasificaalarsenicocomoun

contaminanteaereopeligroso, y 10 define como una sustancia quepuedeprovocar

una mortalidad creciente 0 enfermedades serias en seres humanos que hayan

estadoexpuestosa niveles significativos de estecontaminante. En 1986, la EPA

promulg6 las Normas Nacionales para la Emisi6n de Contaminanles Peligrosos en

el Aire, las cuales aplican en 3 cate90rias de fuentes eslacionarias: fabricas de

arsenico, fundidorasprimarias de cobre, yfabricas de manufaclura de vidrio. Sin

embargo, no exisle un eslandar de aire ambiental para el arsenico (ATSDR, 2009)

Elnivel perrnisibledearsenicoen el aguade bebida eslablecidoporla EPAes 10

ppb (nivel maximo conlaminante), valor que igualmente la Organizaci6n Mundial

de la Salud recomienda como crilerio provisional para el agua de bebida. La

Administraci6n de Drogas y Alimentos (FDA) ha eslablecido los niveles de

lolerancia de arsenico presenle en los sUbproduclos de animales que fueron

tratados con medicamentosveterinarios. Estos niveles oscilanenlre las 0.5 ppm

en huevosyen lostejidos comestibles crudosde pollosypavosylas2 ppm en

ciertossubproductoscrudosdecerdos, Losmariscos(especialmenlelgsmoluscos

Y los crustaceos) tienden a concentrarel arsenico disuelloen el aguade mar. Sin

embargo, este esta presente en la forma organica, la cual no produce efectos

adversosenlosconsumidoreshumanos, ademas de que se excrela rapidamente

del cuerpo (ATSDR, 2009).

Pagina8

1.6 INTERACCI6N CON MICROORGANISMOS

Las bacterias desempeiian un rolfundamentalen laespeciaci6nymovilizaci6ndel

arsenico en el ambiente (Oremland y Stolz, 2005). Esta funci6n resulta favorecida

porsuversatilidadparacrecerendistintoshabitats,puedenocuparnichos

ecol6gicos mes6filosoterm6filos (Inskeep etal., 2007; Quemeneuretal., 2008;

Quemeneur et al., 2010; Rhine et al., 2005), as! como subterraneos subarticos

(donde la temperatura fluctua entre4y 10·C) (Osborne etal., 2010)

Los microorganismosse involucran en elciclodel arsEmico mediante reacciones

de reducci6n, oxidaci6n y metilaci6n (Bhattacha~ee y Rosen, 2007;

Mukhopadhyay et al., 2002; Oremland y Stolz, 2003). Para ello se valen de la

expresi6n de genes especificos que les confieren capacidad de resistir

concentracioneselevadasdelmetaloide,locualsuponeunaventajacon respecto

aaqueliasquecarecendelosmismos(Ehrlich,1997).

Los mecanismos de resistencia hasla hoy descritos estan codificados

geneticamente en micrcorganismos de distintos generos. La reducci6n del

arsenatosehadescritocomoun mecanismo de resistencia bacterianaalarsenico

mediado por la presencia del oper6n arsCBAR, que implica la entrada del As(V) a

la celula poria via del fosfato. Unavezenelcitoplasmaes reducidoaAs(III)porla

arsenito reductasa codificada porel gen arsC, y luego es bombeado fuera de la

celula por proteinas codificadas por los genes arsAB, que se ubican en la

membrana citoplasmatica. Finalmente, el gen arsR cumple una funci6n reguladora

aunque se ha descrito que puede estar ausente en algunas bacteria~reductoras

(XuyRosen,1997).

Otro mecanismo involucra los miembros de la familia de transportadores tipo

Acr3p, que realizan una funci6n similar a arsB, perc no presentan una similitud

significativa en su secuencia por 10 que ha side reportado en especies

Pagina9

filogeneticamente mas distantes que ArsB. Acr3p puede agruparse en dos

subfamilias en base a sus disimilitudes filogeneticas: Acr3pl y Acr3pll. Ambas

subfamilias han sido descritas en bacteriasdesuelo, perc nose haestablecido

unacorrelaci6nentreelgenotipoyla resistencia a arsenito (Caietal.,2009a).

Por otra parte, se ha descrito la oxidaci6n de arsenito principalmente como un

mecanismo de detoxificaci6n, ya quetransforma elAs (III) ubicado en elexterior

de la membrana celular, a una especie quimica menos t6xica, As (V). Sin

embargo, en losultimosanossehandescritobacteriasquimiolitotr6ficascapaces

deoxidararsenitomediante un mecanismoquepermite laobtenci6n deenergia.

Ensayos in vitro indican que en el proceso se transfieren electrones obtenidos

desdelaoxidaci6ndelarsenitoalacadenatransportadoradeelectrones,donde

se utiliza el oxigeno como aceptorfinal y di6xido de carbono como fuente de

carbono(Salmassi etal., 2005).

Laarsenitooxidasaesunaproteinaperiplasmicaqueseencuentraacopladaala

superficie externa de la membrana interna, esta asociada funcionalmente a la

cadena respiratoria (Ellis etal., 2001) y ha sido descrita en una seria de aislados

pertenecientestantoa Bacteria como Archaea (Cai etal.,2009b).

La oxidaci6n del arsenito a arsenato ocurre a nivel del periplasma bacteriano,

dondeescatalizadaporuna enzimadenominadaarsenito oxidasa, Ia cualexhibe

actividadarsenitooxidanteen presencia de oxigeno, azurinaocitocromo ccomo

aceptores de electrones (Anderson etal., 1992; Ahmann, 1994; Mukhgpadhyay et

al., 2002; Ellisetal., 2001).

Esta enzima es heterodimerica con una subunidad mayor de 88 kDa (-825

aminoacidos) (AoxB) que contiene una Mo-pterina y un grupo 3Fe-4S, y una

subunidad menor de 14 kDa (-135 aminoacidos) (AoxA) que contiene el dominio

PaginalO

Rieske 2Fe-2S (Figura 2). AoxA posee un peptide TAT (Twin-Arginine Transporter)

en el extreme amino terminal como senal para que la proteina heterodimerica

plegada sea transportada del citoplasma al espacio periplasmico (Muller etal.,

2003). ElcofactorMo-pterinacontienedospterinasorientadasuna hacia arriba y

otraabajo, de manerasimilara 10quesehaencontradoenotroscofactoresMo­

pterina de la familia de enzimas dimetilslJlf6xido (DMSO) reductasas (Ellis et al.,

2001; Mukhopadhyayetal., 2002).

Figura 2. Estructurayciclocataliticopropuesto para laenzima arsenitooxidasa.Los

pasosson (i) uni6n del arsenito, H,AsO,a laenzima, (ii)transferenciadedoselectrones

al cofactormolibdeno (Mo),(iii) salidadearsenato(H,AsO'),(iv)transferenciadelosdos

electrones del Mo{lV) algrupo 3Fe-4S, (v)transferencia de los doselectrones del grupo

3Fe-4S de 1a subunidad mayor al Rieske 2Fe-2S de la subunidad pequena, y (vi)

transferencia de los electrones del Rieskedela arsenitooxidasa al oxlgeno en la cadena

respiratoria.Traducidode:Mukhopadhyayetal.,2002.

ElciciocataJiticopropuestodelaarsenitooxidasainvolucraelingresodelarsenito

alinteriordelaprotelnaatravesdeunorificioc6nicoenlasuperficiedl!laenzima

(posiblemente coordinado por los residuos His-195, Glu-203, Arg-419 y His-423).

Despues, el arsenito entra en contacto directo por ataque nucleofilico con el

molibdeno (VI) del cofactor Mo-pterina oxidado, 10 queorigina iatransferencia de

doselectrones. Elarsenatoes Iiberadoatravesdelmismoorificiodeentradayel

Paginall

molibdeno es reducido a Mo (IV). Despues, los electrones se transfieren primero al

grupo [3Fe-4S] situadoa unos 1.5 nm dedistancia del MO,dentrodelasubunidad

grande Mo-pterina de la proteina, y despues a un grupo [2Fe-2S] situado en la

subunidad pequena. A partir de ese sitio, los electrones se transfierenalacadena

respiratoria de la membrana interna, posiblemente primero a una azurina 0 un

citocromo y eventualmente al oxigeno, el aceptor terminal de electrones

(Mukhopadhyayetal., 2002; Anderson etal., 1992, Ellis etal., 2001 y Hoke etal.,

2004 citados en: Silvery Phung, 2005).

EIanalisisde lasubunidadmayordelaenzimaarsenitooxidasaporcristalografia

yde lasecuenciaaminoacidica han determinadoque secomponede una seriede

hojas beta y helices alfa que en conjuntodan lugara laexistenciadecuatro

dominios (Figura 3) (Ellis et al., 2001; Quem{meur et al., 2008). Los alineamientos

multiples entre secuencias obtenidas de diferentes especies bacterianas han

mostrado la existencia del motivo C-X2-C-X3-C-X70-S que corresponde al inicio de

dosdeloscuatrodominiosconservados.

Figura 3. Estructuracristalina de la arsenito oxidasa de A. faecalis. Dominios I-IV de

lasubunidadmayorsemuestranencolorazuJ,verde.amarilloynaranjarespectivamente

Lasubunidadmenordecolorrojo.Tomadode:Ellisetaf.. 2001.

Pagina12

En cepas de Ochrobactrum tritici al igual que en cepas de Herminiimonas

arsenicoxydans, se report61a presencia de todos los genes anteriores dentro del

oper6n aox(Branco eta/., 2009). Ensayos de mutagenesis con el transpos6n Tn5

endichacepa,revelaronqueexistenotrasprotefnasqueparticipan en el control

de la oxidaci6n del arsenito, como son RpoN y DnaJ. RpoN es un factor 0 54

alternativo de la ARN poJimerasa y DnaJ interacciona con la chaperona DNA-K

(Hsp-70-like) y regulan tanto la transcripci6n como la estabilidad del mRNA de aox

o en la conformaci6n de AoxR respectivamente (Koechler et al., 2010). Por ultimo,

rio abajo detodos losgenesanteriores, seencuentra elgen denominado aoxX,el

cual codifica para una protefnaperiplasmicade union a oxianiones. Su expresi6n

esta determinada por arsenito, regula la expresi6n de los genes aoxAB y, por

consecuencia,laactividad arsenito-oxidante(Cai etal., 2009b; Liuetal.,2012).

Laregulaci6ndelaexpresiondeloper6naoxrespondeaseiialesquorumsensing

cuyas particularidadessedesconocen (Kashyap etal., 2006; Lietal., 2013), pero

podrfanconsistirencambiosconformacionalesinducidosporarsenito,comoenel

casodeAgrobacteriumtumefaciens(Zhangetal., 2002).

Se ha demostrado que los genes de este oper6n selocalizanen una sola copia en

los genomas bacterianos, a menudo como parte de islas geneticas con otros

genes de resistencia a arsenico (ars y ACR3 tipos I y II), transporte de fosfato

(operones Pst1) y transporte de fosfonato (operones phn1). Asi mismo se ha

determinadoquelosgenesseencuentranencontexlosgeneticosvariables

(Figura4),yconfrecuenciaformanpartedeplasmidos(Lietal.,2013).

Pagina14

Las islas de arsenico transferidas por plasmidos son frecuentes en 0­

proteobacterias, a menudo en arreglos geneticos conservados, 10 que habla de

procesos de transferencia genetica horizontal de genes (HGT, por sus siglas en

ingles) (Li eta/" 2013). Dentro de estas islas un elemento genetico que pod ria

desemperiar un papel importante en la distribuci6n de genes de resistencia a

compuestosdearsenicoeselintegr6n.

Los integrones son elementos m6viles de ADN que conlienen un gen de inlegrasa

(una recombinasaespecializada) que les pemniteadquiriro inlercambiargenesde

resistenciaatravesdeeventosderecombinaci6nespecificadesitio(intQyunsitio

deintegraci6ndecaseltes(attl)enelqueseintegranlosgenesderesistencia

(principalmenteaantibi6ticos,aunquela resistenciaa arsenicoesunaposibilidad

fehaciente). Un caselte de genescontiene un gen de resistencia, unelemenlode

59pbyunelementocortoinvertidorepetidoconunsitionucleoderecombinaci6n.

Se han descrilo al menos cinco c1ases de integrones cromos6micos y Iigados a

plasmidosenbacteriasGram-negativas.Los Inlegronesclase1 seconsideranlos

mascomunesenlosaisladosclinicosycontienenlosgenesderesistencia a sales

cuaternarias de amenia qacED1 y resislencia a sulfonamida sul1 en la regi6n

conservada3'(Bassetal., 1999; Lietal., 2006).

De todos los genes que integran al oper6n aox, el gen aoxB ha side el mas

estudiado, dado queen su secuencia selocaliza el sitio catalilicode laenzima.

Este gen consta de alrededor de 2,475 nucle6tidos (Ellis et al., 2001). Varias

invesligacionesconcuerdanenqueselraladeungencuyasecuencianucleolidica

esmuyvariable.Lassecuenciasqueconformanelsitiocataliticode la enzima son

las unicas queguardan relaci6n entre distinlas especies, locual ha side

aprovechadoparalabusquedadelgengraciasalavenlajaquelaconslanciade

Pagina16

estaregi6n otorga (Inskeepatal., 2007; Branco atal., 2009; Escalanteatal.,2009;

Hamamura at a/., 2009; Quemenaur et al., 2006; van Lis at al., 2012). Con base en

los resultados de dichosestudios, se sabe que el gen aoxB: (a) se encuentra en

numerosos microorganismos filogeneticamente dislantes (b) se presenta en

bacterias que provienen de diversos sitios geogn3ficamente aisJados con amplio

rangoen..elniveJdelacontaminaci6nporarsenicoy(c)sepresentayexpresaen

bacteriascon actividadarsenitooxidante (Inskeep atal., 2007).

Eigen aoxBtienelasprincipalescaracteristicasde un marcadormolecular: (i)8e

haencontrado en todas las bacterias aer6bicasarsenito-oxidantesestudiadas

hasta ahora (Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Thiomonas spp.,

Rhizobiumspp., Agrobactarium spp., etc.), (ii) Las regiones conservadas de este

gen,quecorrespondenalsiliocatalfticodelaenzima, hanpermitidoeldiseiiode

cebadores,y(iii) Laregi6n amplificada con dichoscebadoresessuficientemente

grande y cubre las variaciones geneticas dentro del gen, 10 que permite la

discriminaci6nentregruposfilogeneticos.Eslosdatossonalenladoresparaeluso

del gen aoxB como un marcador de resistencia especifico funcional de los

microorganismos arsenito-oxidantes aer6bicos en estudios de diversldad

ambiental (Quemeneuretal., 2006).

Asimismo,se ha demostrado que Josanalisisderelaci6n filogeneticabasadosen

elgen aoxBmuestran de manera generaJ resultados similares a 10soblenidostras

los an<3lisis de secuencias de rADN 168. Esto indica un origen comun de la

enzima arsenito oxidasa presente en microorganismos desde etapas evolutivas

iniciales, aunque es claro tambian que los eventos de HGT han desempeiiado un

papelimportanteenestos procesos(Figura 5) (Quemeneuretal., 2006).

Pagina17

Pagina18

Las regiones conservadas del gen hicieron posible flanquear fragmentos

especlficosydisenaroligonucle6tidosparaelestudiodelaenzima(Quememeuret

a/., 2008).

Los 0ligonucle6tidos utilizados por Quemeneur eta/., 2008 son: aoxBMl-2F: 5'

CCACTICTGCATCGTGGGNTGYGGNTA y aoxBM3-2R:

TGTCGTIGCCCCAGATGAONCCYTTYTC. Estos se disenaron a partir de nueve

secuencias de protefnas AoxB de las bacterias A. faecalis (No. de acceso

AY297781), H. arsenicoxydans (No. de acceso AF509588), Thiomonas

arsenivorans (No. de acceso EU304260), Agrobacterium tumefaciens (No. de

acceso OQ151549), Rhizobium sp. cepa NT26 (No. de acceso AY345225),

Chloroflexus auran/iacus (No. de acceso NZ_AAAH01000321), Thermus

therrnophilus (No. de acceso NC_000854), las Archaea Aeropyrum pemix (No. de

acceso NC_000854) y Sulfolobus /okodaii (No. de acceso NC_0031 06). Oichos

0ligonucle6tidos f1anquean una region de 1,100 pb en la primera mitad de la

secuencia del gen aoxB. Ello corresponde a la secuencia desde la primera parte

(aminoacidos 22 al 32 en AoxB de H. arsenicoxydans) del motivo CX2CX3CX70S

(CHFCIVGCGYH) necesario para unir el grupo [3Fe-4Sj y el motivo consenso

YEKGIIWGN (aminoacidos 383 al 391) (figura 6) (Quemeneur e/ al., 2008)

Pagina19

Pagina20

Inskeepycolaboradoresenel2007,reportaronun pardeoligonucleotidos

(AoxBF: GTSGGBTGYGGMTAYCABGYCTA y aoxBR' 5'

TIGTASGCBGGNCGRTIRTGRAT) (Figura 7) que flanquean un fragmento de

500 pbenelprimercuartodelgen aoxBquecodifica lasubunidad Mo-pterinade

laenzimaarsenitooxidasa. Lassecuencias usadasfueron lascepas: Rhizobium

sp. Cepa NT26 (AAR05656), Thermus thermophiJus cepa HB8 (BAD71923),

ChlorofJexus aurantiacus (ZP_00356732), Herminiimonas arsenicoxydans

(ULPAs1) (AAN05581), Alcalligenes faecalis (AAQ19838), Thiomonas sp. Cepa

VB-2002 (CAD53341) YAgrobacterium tumefaciens cepa 5A (ABB51928).

Fi9ura7.AlineamlentodesecuenclasnucleotidicasdesletegenesaoxB,quemuelllra las regiones usadas porlnskeepetal., 2007 paraeldiseiiodeoligonucle6tidos

Pagina21

2. ANTECEDENTES

EI rio Mololoa se localiza en la region hidrologica No.12 (Lerma-Santiago), cuenca

F,subcuencaCyeselcuerpodeaguamasimportantequepasaporlaciudadde

Tepic, capital del Estadode Nayarit (Figura 8). Nace en lavertientesuryoestedel

volcan Sanganguey a una altitud aproximada de 2,200 metros sobre el nivel del

mar (msnm) y desemboca en el rio Grande Santiago a una elevacion de 265

msnm. Tiene un desarrollo de 70 km aproximadamente, ubicado entre las

coordenadasgeograficas21°33'y21°44'delatitudnortey104°54'y104°58'de

longitud oeste (SEMARNAT, 2002).

Figura 8. Ublcaclon geogrMica del rio Mololoa. Tornado de: SEMARNAT, 2002

ElaguaenlasubcuencadelrioMololoapresentaundeteriorogeneralproductode

laactividadantropogEmicaenestazona. La Regi6n Centro de Nayarit (7.4% de la

superficie total del estado) concentra eI37.26% del total de la poblaci6n en

Nayarit,locualocasionaunfuerteimpactoenelindicedecalidaddel agua del rio

Pagina22

tras su paso por la ciudad de Tepic. Esto, sumado a la insuficiencia de los

sistemas de tratamiento de aguas residuales, derivan en un marcado deterioro

ecol6gico (Jauregui etal., 2007).

A su paso por la ciudad de Tepic, el rio Mololoa recibe descargas de aguas

residualesprovenientesdelaactividadmunicipal,descargasdetipoindustrial,asi

como provenientesde laactividad pecuaria(Rodriguez etal., 2008). Aunadoa 10

anterior, el rio recibe las aguas de retorno agricola de su cuenca, asi como

lixiviadosdelbasureromunicipal"Ellxtete"(Mondragonetal.,2009),porloquese

considera que potencialmente podria ser afectado en sus aguas y sedimentos

(Rodriguezeta/., 2008).

En la cuenca del rio Mololoa se ha determinado la existencia de arsenico. Esto

puede atribuirse a un aporte natural del entorno, principalmente de origen

volcanico (Gonzalez, 2005; Vivanco eta/., 2010) en concentraciones promediode

10.81 ppm, superioresal contenido promedio de la corteza continental (1.8 ppm)

(Gonzalez, 2005). En consideraci6n a 10 anterior, las aportaciones de arsenico de

origenantropogenicoen lazonadeestudioseriandespreciablesen comparaci6n

a las de origen natural.

Esta problematicageneral hadado lugara que investigacionesefectuadasenel

sitio hayan determinado la presencia de bacterias de importancia medica y

veterinaria como Enterococcus faecalis, E. faecium. E. ga/linarum, E. durans,

Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, Pseudomonas

aeruginosa, P. stutzeri, entre otras especies (Mondragon eta/., 2011). En estos

aislados se ha detectado resistencia a arsenico y MP como mercurio, cromo,

cadmio y a antibioticos como kanamicina, ciprofioxacino, gentamicj[1a y beta­

lactamicos.

La contaminacion ambiental generada por metales pesados (MP), antibi6ticos y

otros contaminantes contribuye a la permanencia y extension de genes de

resistencia (Gorii-Urriza et a/., 2000). Esto ultimo puede ocurrir mediante

Pagina23

transferenciahorizonlal(comoeselintercambiodeplasmidos) entre bacterias no

relacionadas en ambientes naturales (Kruse y Sorum, 1994). Ello da lugar ala

existenciade procesos deco-selecci6n, tales como co-resistencia (un organismo

con resistencia a elementos diferentes) y resistencia cruzada (el mismo

determinantegeneticoesresponsabletantodelaresistenciaaantibi6ticoscomoa

metales). Por 10 anterior, este tipo de contaminaci6n representa un proceso de

presi6n selectiva persistente y generalizado que potencialmente contribuye a

mantener y expandir los factores de resistencia (Baker-Austin et al., 2006;

Mondrag6netal., 2011).

En los microorganismos aislados de la zona contaminada del rio Mololoa se

demostr6 ademas la presencia de los genes arsA, B y C (Mondrag6n et al., 2012),

que cuando se expresan en un microorganismo Ie confieren la capacidad de

sobrevivir y proliferar aun en concentraciones elevadas de arsenico (Cai et al.,

2009a). Algunos de ellos resultaron capaces de transferir la caracteristica de

resistenciaalarsenicoacepassensiblespormediodeconjugaci6n (Mondrag6n el

al., 2010; Mondrag6n elal., 2011; Mondrag6n etal.,2012),locualconcuerdacon

estudios previos en cepas de Corynebacterium flaccumfaciens (Hendrick etal.,

1984). Con el conocimiento de este fen6meno, se explica el hecho de que se

encuentren cepas bacterianas con capacidad de resistencia a metales y

antibi6ticos en ambientes nunca antes expuestos de manera directa a estos

contaminantes(Morozzielal.,1986).lnciusosehademostradoquesu presencia

puedeestarcondicionadaporlosgradientesdeconcentraci6nenlas zonas

contaminadas(Quemeneuretal., 2010).

En este estudio, se trabaj6 con 15 cepas obtenidas en investigaciones previas

realizadasenellaboratoriode ResistenciaBacterianade la UnidadAcademica de

Ciencias Quimico Biol6gicas y Farmaceuticas de la Universidad Aut6noma de

Nayarit (Mondrag6n atal., 2009, Mondrag6n etal., 2010, Mondrag6n etal., 2011,

Mondrag6n at al., 2012). Dichas cepas pertenecen a una colecci6n de 300

aislados que fueronobtenidos de tres puntos distintos en la periferiadelrio

Pagina24

Mololoa. Lasfuentesde colecta fueron las aguas del rfo (R) en las coordenadas

21°32'47.13" latitud norte y 104°53'36.35" longitud oeste, aguas negras (AN)

(21°32'48.23"latitudnortey104°53'43.04"longitudoeste)ylixiviados del basurero

municipal"Ellxtete"de laciudad de Tepic, Nayarit (Lx) (21°33'05.33" latitud norte

Y 104°53'30.65" longitud oeste) (Figura 9).

.P:.A.R...~i.Ei.t.:.. '.~..~.:>....'. ~~. r. 1r /

Rio' .

.\101010' I .1."

~. )

4~.l"Figura 9, Sitios demuestreo. Se muestra el cauce del rio Mololoa (flecha vertical). Se

seJialan los sitios muestreados de donde seaislaron las bacterias arsenito resistentes:

AN: sitio de colecta de las aguas negras, Lx: zona de escurrimiento de lixiviados

provenientesdelconfinamientodebasuraalrlo,R:puntodecolectadeaguasdelcauce

Pagina25

3. JUSTIFICACI6N

Lapresenciadearslmicoenelambienteafectanegativamentelasaludhumanay

alosorganismosqueallfseencuentren.Laexistenciadebacteriasconresistencia

aarsenitoyarsenatoen'elrioMololoasugierelaocurrenciadeun grave problema

decontaminaci6n. Con base en esta situaci6n, se debe visualizar la zonaentera

como un sistema dinamico con alta movilidad de elementos en el cual todos los

organismos vivos son susceptibles de padecer los efectos adversos de estes

contaminantes, 10 que representa un serio problema de salud pubIicayambiental.

Por ello, resulta pertinente la generaci6n de conocimiento acerca de los

mecanismosbiol6gicos porloscuales lasbacterias han adquiridoydesarrollado

capacidad de resistencia, dado que poseen potencial para ser aplicados como

biorremediadoresentareasqueconsiderenelsaneamientoyrescatedel cauce.

Enestesentido, lapresenteinvestigaci6n buscolaidentificacionyan<\lisisdelgen

aoxB en bacterias aisladas del lugar bajo la premisa de que dicho gen es

responsabledelfenotipoarsenito-resistente.

Pagina26

4. HIPOTESIS

Lasproteobacterias resistentes a arsElnicoaisladas del rio Mololoa poseenelgen

aoxB, hom6logoalasseeueneiasyareportadas.

5. OBJETIVO GENERAL

Identificar y analizar las seeuencias del gen aoxB en una eoleeei6n de

proteobaeteriasresistentesaarsenieo.

5.1 OBJETIVOS ESPECfFICOS

~ Identifiear la presencia del gen aoxBen proteobaeterias arsenito-resistentes

~ Seeueneiar losproduetos amplifieados porlos eebadores para el gen aoxB

~ Analizar las secueneias obtenidas con las reportadas en las bases de datos

paradetermlnarelgradodesimilitud

6. MATERIALES YMETODOS

6.1 MATERIAL BIOL6GICO

En esta investigaci6nseestudiaron 14 eepas de las reportadas con earaeterlstieas

fenotlpieas y genotlpicas de resisteneia tanto a arsenato como -<i arsenito

(Mondrag6netal., 2012). Laidentificaei6nbaeterianadeestosaisladosserealiz6

por el sistema automatizado MieroSeanGll (Cuadro 3) (Mondragon et al., 2009;

Rodriguez, 2010).

P~gina 27

Cuadro 3. IdentlflcacI6n y sltlos de alslamlento de las especles bacterlanasutlllzadasenesteestudio.

Cepa I Especie I ai~~:i:~IO I Cepa

IEspecie I ai~::i:~to

~ Enl&robacI&rclo8c88 R C20 KJebsielfapneumonia AN

C5 Enl&rob8cl&rsp R C2l Actinobacillusurese Lx

C8 Achromobactersp R C23 Escherichia coli AN

Cl0 Ent8rob8cl&rsp R C8l KJebsiellapneumonise AN

C12 Klebsieflapneumonis9 R C95 KJebsiellapneumonlse R

C14 KI8bsi8118oxyloc8 R C97 Klebsiallspneumonise AN

C16 EntsfObacf8rssrogenes R C123 K/ebsiallaoxytoca AN

C19 KJebsiaJlapneUtnonise AN

EI numero de cepa es el aSlgnado en la colecclon de respaldo del Laboralorlo de

Resistencia Bacteriana (AN: Aguas Negras, Lx: Lixiviados del basurero municipal "EI

lx1ete'yR: Agua corrienle del rio).

Para el crecimiento y mantenimiento de las cepas se tomaron muestras a partir del

stockcongeladocon puntilla esteril, secrecieron en 3.0 mL de caldo Luria Bertani

(LB, marca DifcolP) a37'C con agitaci6n constante por18 horasyse inocularon

en agar nutritivo con NaAS02 3 mM para corroborar que se tratara de cultivos

axenicos. Para su conservaci6n se tomaron colonias aisladas, se crecieron y

mantuvieronencaldoLBcon20%glicerola-20·Chastasuuso.

6.3 ESTRATEGIA DE TRABAJO

5e realizaron pruebas fenotipicas consistentes en la evaluaci6n de la

Concentraci6n Minima Inhibitoria (CMI) en placas de agar nutritivo, Y"capacidad

arsenito-oxidante conel metodo de AgN03 (Figura 10) (Brancoetal., 2009).

Pagina28

P",ebasfeno!fpicas

~:iJ

~~~~.~

+

~

Ensayos de blologia molecular

[lapauno Etapados

Figura 10. Esquema de la estrategia experimental utilizadaenesteestudlo.

6.3.1 PRUEBAS FENOTiPICAS Y EXTRACCI6N DE ADN

a) PRUEBAS DE CONCENTRACI6N MiNIMA INHIBlTORIA (CMI)

La concentraci6n minima inhibitoria (CMI) es la concentraci6n mas baja de un

compuestoque inhibeelcrecimientovisiblede un microorganismo despuesde su

incubaci6n (Madigan ef al., 2004). Mediante esta prueba se evalu6 el fenotipo

arsenito-resistentedelas 15 cepas en estudioentenminoscuantitativos.

Cada una de las cepas fue cultivada en caldo Luria Bertani (LB) adicionado con

NaAs023 mM a 37·C por 18 h de incubaci6n con agitaci6n constante a 125 rpm

(Incubator Digital Microprocessor Model 10-140E QuincyLab~. Se prepararon

cajas de agar nutritivo adicionadas con arsenito de sodio (NaAs02) a las

siguientes concentraciones: 0 (control), 2, 6,10,11,12,13,14 Y 15 mM. Cada

cajafue inoculada can 10 ~L del cultivo en caldo previamente descrito-{crecido a

una densidad 6ptica de 0.7) de cada una de las 15cepas (dilucionesprevias1:100

en LB esteril) con la ayuda de plantillas (Figura 11) y se incubaron a 37·C

durante24horas.

PaginaZ9

~:4

5 I; 7

8

Flgura11.PlanllllaempleadaenlalecnicadeCMI.Secolocadebajodelacajadeagar

nutritivocomoreferenciaalinocular, para 10 cual se aprovecha latransparenciadel medio

b) PRUEBA DE CAPACIDADARSENITO-OXIDANTE

Esta prueba se realizo con lafinalidad de evaluar la capacidadde Iascepasde

estudio para oxidar el arsenito a arsenato. Para ello, se empleo el metodo de

AgN03 descrito por Branco et a/., 2009, el cual se detalla a continuacion: se

sembraron las cepas en caldo nutritivo esteril con NaAs02 3 mM y se crecieron

hasta una DOdeO.7a 37·C a 125 rpmyse inocularon 10 ilL de cada cultivoen

piacas de agar nutritivo con NaAs02 3 mM. se incubaron 24 horas a 37 ·C Y se

embebieron de forma homogenea con 1 mL de solucion 0.1 M de AgN03, se

incubaron porotras24 horas a 37 ·Cyse retiraron de la estufa paravisualizarel

resultado. Un colormarron revelo la presencia de arsenato, mientras un colorpaja

indico que el arsenito no se oxido. Como controles se prepararon cajas con

NaAs023 mM y AgN030.1 M sin inoculo bacteriano y cajas con NaAs02 3 mM sin

AgN03coninoculo.

c) ANALISIS DE RESULTADOS

Losresultadosdelaspruebasfenotlpicasfueronanalizadosmediantelaspruebas

de Kruskal-WallisYX2, para locualse utilizoel programastata!>version 8.1 yel

analizador de datos PSPP version 0.7.8 B20110902 de IBM!>, respectivamente. Se

evaluaron las variables: sitiodeaislamientoyactividad arsenito-oxidante, sitiode

Pagina30

aislamientoyCMI, sitio de aislamientoyespecie yactividad arsenito-oxidantey

grade de resistencia, respectivamente. Para las evaluaciones se fij6 un nivel de

significanciaP(a)deO.05.

d) EXTRACCION DE ADN BACTERIANO

Serealiz61aextracci6ndeADNtotaibacterianodetodasiascepasporelmetodo

dechoquetermico, descritoacontinuaci6n. En un tubo eppendorfde 1.5mL,se

colocaron 50 ~L de agua inyectable, se agreg6 una asada de tres colonias

aisladasyse agit6en v6rtex. Lamuestrasemantuvoa96·Cpordiezminutos,

seguido de cinco minutos a -20·C (se repitieron ambos pasos dos veces).

Posteriormente, se centritug6durantetresminutos a 12,000 rpm yserecuper6el

sobrenadante. Se hizo una diluci6n 1:10, y se almacen6 a -20·C hasta su uso.

Para la realizaci6n de las pruebas de PCR se trabaj6 con grupos de ADN de 3

cepasalavez.

6.3.2 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Las cepas que mostraron tenotipo de oxidaci6n del arsenito, se usaron en la

busqueda del gen aoxB como respuesta genotipica del comportamiento. Con base

en 10 anterior,selIevaron a cabo losensayosde biologia molecularconsistentes

especificamenteen pruebasde PCR, con unaestrategia planteadaen dosetapas

(Figura 10). Elcuadro4muestra los oligonucle6tidosempleados para tal efectoy

eltamanodelosfragmentosesperados.

Pagina31

Cuadro4.Caracterlstlcas de los ollgonucle6tldos empleados enestalnvestigacl6n.

Ollgonucle6tldo I

,ADN16SpH'

I

-1.5kpb

I Refe,encl.

Inskeep at

a/., 2007

Comprendi6 las pruebas de PCR enfocadas a la identificaci6n directa del gen

aoxBmedianteelusodedosdistintosparesdeoligonucle6tidos:

a) Empleo de los Oligonucleotidos disenados por Inskeep et al., 2007 "

Se evalu6 la presencia del gen aoxB por PCR, para 10 cual se emplearon los

oligonucleotidos disenados por Inskeep et a/., 2007. Cada reaccion de PCR

conten!a en un volumen final de 25 ).lL: 3).lL de ADN de 3 cepas distintas (1ul

P~gina 32

Icepa), 2.5 J.Ll de buffer 10X (Tris-HCI10 mM pH 8 Y KCI50 mM), 2 III de MgCI2

25 mM, 2 III de dNTP's 2.5 mM, 0.1 III de Taq polimerasa Invitrogen~ (5UI Ill) Y

2.5 fLLde cada iniciadoren unaconcentraci6n de 10pM, ajustadosa25 fLLcon

aguadestiladadesionizadaesteril(H20dde).

Las condiciones en que estas pruebas se realizaron comprendieron a) un cicio

inicial de desnaturalizaci6n de 4 min a 95·C b) 9 ciclos de: 45 segundos de

desnaturalizaci6n a95·C,45segundosdehibridaci6na50·C,y50segundosde

extensi6n a 72 ·C,seguidosde c) 25 cicloscon 45segundos dedesnaturalizaci6n

a95·C,45segundosdehibridaci6n a46·Cy50segundosdeextensi6n a 72·C,

conunpasofinalded)extensi6nde5minutosa72·Cquedisminuy6a4·Chasta

quelostubostueronretiradosdeltermociclador(eppendorfll'AG22331 Hamburg).

b) Empleo de los Oligonucle6tidos disenados par Quemeneur et al., 2008

Se realizaron ensayosde PCR con empleode losoligonucle6tidos disenados por

Quemeneureta/., 2008. Elvolumenfinaldecadareacci6n (preparadasentubos

eppendorfll' de 0.2 ml) tue de 25 fLL: 3 III de ADN de 3 cepas (1 fLUcepa), 2.5 J.1l

de buffer 10X de la Taq polimerasa (Tri~-HCI10 mM pH 8 Y KCI50 mM), 2 III de

MgCI2 25 mM, 2 III de dNTP's (Invitrogen~) 2.5 mM, 0.1 III de Taq polimerasa

Invitrogen~(5 Ullll)y2.5 IlLdecada iniciador10 pM, ajustadosa 25 ilL con agua

destilada desionizadaesteril (H20dde).

las condiciones de temperatura en que se lIevaron a cabo las pruebas de PCR

constaron de4minutosa95 ·C, seguidosde 35ciclos de45segundos a 95 ·C,

45 segundos a 52·C Y 1 minuto y diez segundos a 72 ·C, seguidgl> de una

extensi6n final de 72 ·C por5 minutos, parafinalmente bajara4·C hasta retirar

lostubosdeltermociclador.

Los productos de amplificaci6n se corrie ron en geles de agarosa al1 % en TAE a

100 V durante 90 min en camara de electrotoresis Thermo Scientific 240616~ con

Pagina33

utilizaci6n de TAE 1X como buffer y el marcador de peso molecular de 1 Kb Plus

DNA Ladder (Invitrogen~). Las muestras se corrieron en volumenes de 15 ~L

mezclados can 1.5 ~L de Nucleic Acid Sample Loading Buffer4!l 5X de BioRada!> y

visualizadas en un transiluminador de luz UV BENCHTOP UV 011810-001a!> can

previa tinci6n can bromuro de etidio (0.5 ~g/mL). Tras su visualizaci6n la imagen

delgelfuedigitalizadaparaefectosdearchivoconelequipofotograficopropiodel

transiluminador. Como control de las pruebas de PCR se amplific6 el gen arsC en

el ADN de la cepa E. coli C23, que form6 parte del grupo de prueba de este

estudioycuya posesi6n de genes arssedetermin6 enestudios previos

(Mondrag6netal.,2012).

Losampliconesgeneradostraslaamplificaci6nfueroncortadosdeIgeldeagarosa

can ayuda de una espatula. EI amplic6n se purific6de acuerdoal procedimiento

del High Pure PCR Product Purification Kita!> de Rochea!> en base a las instrucciones

delfabricante. Laconcentraci6n de los amplicones purificados sedetermin6 en el

analizadorBioteka!>enlamodalidadTake3a!>paraposteriormentesersecuenciados

en la unidad UBIPRO de la Escuela de Estudios Superiores de Iztacala (UNAM)

a) BUSQUEDA DEL GEN aoxB EN INTEGRONES CLASE I

Estaspruebassellevaron a cabo can base en elsiguiente razonamiento:sielgen

aoxBsesitua dentrode una secuencia integr6nica, suamplificaci6nseriaposible

can los 0ligonucle6tidos dirigidos a dicho gen en combinaci6n can los que se

aparean can regiones constantes conservadas del integr6n. La hip6te~~s anterior

se esquematiza en la Figura 12:

Pagina34

Figura 12. Planteamlento de las pruebas de PCR reallzadas con

ollgonucle6tldosdirlgidosalassecuenciasconservadas/nt/1 yqacEDdelintegr6n

Claselencombinacl6nconlosoligonucle6tldosparaelgenaoxB.

Deacuerdoalplanteamiento referidoseutilizaron los 0ligonucle6tidos de Inskeep

et al., 2007 y Quemeneur at al., 2008 en combinaci6n con los dirigidos a la

integrasatipolylaregi6nderesistenciaacompuestoscuaternariosdeamoniode

secuencias integronicas (Liata/., 2006; Bassetal., 1999). Loanteriorserealizo

con el fin de determinar la presencia del gen como parte de la estructura de

Integronesclase1,demanerasimilaraloquesehareportadoconlos genes del

operon mar (Bass at al., 1999), los cuales se pueden encontrar en regiones

geneticasinmediatasalntegronesdentrodeuntransposon,como Tn21 (Liebert at

al., 1999).

Se utilizo el oligonucleotido Intl1 Fw (Li at al., 2006) y el oligonucleotido qacED1 R

descritosporBassatal., 1999 en combinacion con losoligonucleotidosdirigidosal

genaoxB. Esto con elfin de obtenerfragmentosque brindaran infomnacion acerca

de la presencia del gen aoxB, as! como de su contexte genetico dentro del

Integron Clasel.

Seevaluarondistintascondicionesdetemperaturadealineamientoconobjetode

ampliarlasprobabilidadesdeexitoenlaamplificaciondealgunfragmento:a) las

condiciones iniciales constaron de 4 minutos de desnaturalizacion a 94 'C,

seguidos de b) 35 ciclos de 40 segundos de desnaturalizacion a 94 'C, 40

Pagina35

segundos de alineamiento a 57·C Y 3 minutos de extensi6n a 72 ·C, can una

extensi6n final de c) 5 minutos a 72 ·C, hasta descender a 4 'C hasta que los

tubosseretirarondeltermociclador. Otras condiciones constaron de un gradiente

detemperaturadealineamientodesde55a62 ·C, ademasdequese realizaron

pruebas can rampa, las cuales consistieron.en a) una temperatura inicial de

desnaturalizaci6n a 94·C par 4 minutos, seguidos de b) 5 ciclosde 1 minutode

desnaturalizaci6n a 94 ·C, 1 minuto de alineamiento a 56 ·C Y 2 minutos de

extensi6na72·C,quedeahlpas6ac)35ciclosde 1 minutodedesnaturalizaci6n

a 94 ·C, 1 minuta de alineamiento a 58 ·C Y 2 minutos de extensi6n a 72 ·C (a

pesarde desconocerse el tamaiio de fragmento, se fijaron 2 minutos, uno par

cada mil pb), can extensi6n final de d) 4 minutos a 72 ·C que finalmente disminuy6

a4·Chastaretirarlostubosdeltermociclador.

b) SELECCI6N DE CEPAS PARA ANALISIS DE rADN 16S

Seseleccionaroncuatrocepasparadeterminarsuespeciemedianteelanalisisde

sus secuencias de rADN 16S. Las cepas seleccionadas se habian identificado

previamente par MicroScan<'ll como E. cloacae C4, K. pneumoniae C12, E.

aerogenes C16, y K. pneumoniae C81. Estas presentaron actividad arsenito­

oxidante y los valores mas elevados de CMI de AslIl, par 10 cual se aislaron en

media s61ido y se les extrajo ADN total mediante el empleo del kit ZR

FungaI/BacteriaIDNAMiniprep<'ll.

c) ANALISIS DE SECUENCIAS DE ADN RIBOSOMAL 16S

Se utilizaron los 0ligonucle6tidos pAy pH*publicados par Hutson etal., 1993. La

concentraci6n final de cada reactivofue: buffer de laTaq polimerasa (Invitrogen<'ll)

1X, MgC121.5 mM, dNTP's mix 0.2 mM, oligo pA 0.5 mM, oligo pH 0.5 mM, Taq

polimerasa (Invitrogen<'ll) 0.03 U/~L, templado de ADN 1 ng/~L y el resto fue

completadoconaguainyectableparaunvolumenfinalde25~L.

Pagina36

Las condiciones en que se lIevaron a cabo las reacciones constaron de a) 95·C

porcuatrominutosseguidosde b) 35 ciclosde94·C por45 segundos, 56·C por

45 segundos y 72·C por un minuto con una extensi6n final de c) 72·C por5

minutos, para finalmente disminuir a 4 ·C hasta que los tubos fueron retin~dos. EI

fragmentoesperadoeradealrededorde1.6kb,yunavezobtenidoslospraductos

amplificados se enviaron a la empresa Macrogen en Seul, Corea del Sur para su

secuenciaci6n.

Unavezrecibidoslos resultados de lasecuenciaci6n,fueronanalizadosytratados

coneiprogramaChromasversi6n 2.4.1 GI> para ladepuraci6ndeexlremoserr6neos

con base en los ferogramas recibidos. Las secuencias anotadas fueron

comparadas de acuerdo al BlastN de la base de datos del NCBI en los seis

marcosabiertosdelectura(hllp:llblasl.ncbi.nlm.nih.gov/Blasl.cgi).

7. RESULTADOS YDISCUSION

Enesta investigaci6n setrabaj6 un total de 14 proteobacterias confenotipo

resistentea arsenito. Estacaracteristicatambien hasido reportadaen cepasdel

genero Pseudomonas, elcual pertenecea lasproteobacterias, perose ubicaen

una unidad taxon6micamente distinta a las enterobacterias, la familia

Pseudomonadaceae (Quemeneur et al., 2008; Cai et al., 2009b; Heinrich­

Salmeron etal., 2011). Loanteriorsecorrespondeconelhechodequelainmensa

mayoria de las bacterias arsenito oxidantes aisladas de sitios"mes6filos

pertenecen al phylum Proteobacteria (Quemeneuretal., 2008).

7.1 eONCENTRACI6N MfNIMA INillBITORIA (eMI)

Pagina37

Los resultados de esta prueba mostraron que losvalores de CMI de arsenito de

sodio (NaAs02) en las cepas de estudio se encuentran entre 2 y 15 mM (Cuadro

5); las 15 cepas crecieron en As(lIl) 2mM, mientras que de las mismas 15 s610

doce crecieron en As(lIl) 6mM, de las cuales nueve en As(llI) 10mM y seis en

As(llI) 12mM, tres en As(lIl) 14 mM y de estas tres, unicamente dos en As(lIl) 15

mM. Las cepas E. coli C23 y. K. pneumoniae C81 resultaron ser las mas

resistentesaarsenitodesodioentodoelgrupodeprueba(Figura13).

Cuadro6.ResultadosdelaspruebasdeCMldearsenitoyactividadarsenlto-oxidante.

ISlllOdol CMldolalslamlento arsenlto

C4

C5

C8

Cl0

C12

C14

C19 KJebsiellapneumoniae

C20 KJebsieJ/apneumoniae

C21 Lx

C23 AN

C95

C97 KI.bsl.lI.pn.umonl••

C123 KJ.bsl.llaoxytoca AN

arsenlto­

oxidants

(AN. Aguas Negras, Lx. Llxlvlados del basurero mUnicipal "Ellxtete",R: Aguacorrientedel rfo). EI numerodecepaeselasignadoen lacolecci6n.

Pagina38

B cFigura 13. PruebasdeCMI dearsenito realizadas a las 15cepasdeestudio.Circulos

en amarillo senalan los in6culos que dejaronde presentarcrecimientoconformeaument6

la concentraci6n de arsenito. A) 2 mM, B) 6 Mm y C) 10mM. Los ensayos se efecluaron

portriplicado

Las cepas con actividad arsenito-oxidante (Figura 14) fueron: E. cloacae C4,

Enterobacter sp. C5, Enterobacter sp. C10, K. pneumoniae C12, E. aerogenes

C16, K. pneumoniae C20, K. pneumoniae C81 y K. pneumoniae C95 (Cuadra 5).

Se realiz6 un an<llisis de Kruskal-Wallis para establecersi haydiferencia en la

capacidad de resistencia entre las bacterias arsenito-oxidantesylasque no 10 son.

Seencontr6quehaydiferenciaestadisticamentesignificativa (p=O.0177) entre los

grupos.Estosugierequepudierahaberunarelaci6nfenotipicaenlacualla

actividadarsenito-oxidanteestaimplicadaenlacapacidadderesistenciaaIAs(III).

Figura 14. Cultivos con NaAsO, y AgNO, para evaluar actividad arsenito-oxidante.

Lacoloraci6n cafe de los in6culos indica laconversi6ndearsenitoaarsenato

Pagina39

Por otro lado, las cepas que alcanzaron un nivel de resistencia ~ 10 mM (E.

cloacae C4, E. sp. C5, E. sp. C10, K. pneumoniae C12, E. aerogenes C16, K.

pneumoniae C20, E. coli C23, K. pneumoniae C81 y K. pneumoniae C95)

presentarontambilm actividadarsenito-oxidante, conexcepci6ndelacepaE. coli

C23.

La implicaci6n de la actividad arsenito-oxidanteen elfenotipo arsenito-resistente

observado en este estudio concuerda con los resultados descritos en H.

arsenieoxydans cepa ULPAs1 ....80X8, la cual disminuye su capacidad de resistencia

al arsenito de 5 mM a 2.66 mM debido al silenciamiento de aoxB con un

transposonreporterobasadoenlaeZ(Mulieretal.,2003).

Lacapacidaddeoxidarelarsenitoaarsenatonoescondici6nesencialparaque

sepresenteresistenciaaelevadasconcentracionesdearsenico,dadoqueexisten

cepasque no oxidan nireducen alarsenito, ni loconvierten en arsenicales

organicos (PhillipsyTaylor, 1976). Estoscomportamientostienen lugargraciasa

sistemas transmembranales expulsores de arsenito que no involucran cambio

algunodel estado de oxidaci6n, tales como los productosde laexpresi6n de los

genes A y B del oper6n ars (Dey y Rosen, 1995; Saltikov y Olson, 2002; Ord6nez

etal.,2005),aslcomolostransportadoresAcr3ptipo Iyll (Rosen, 1999; Caieta/.,

2009a).

En el caso particular de la cepa E. coli C23, que al igual que la cepa K.

pneumoniae C81 present6 el maximo valor de resistencia al arsenito (15 mM) perc

no mostr6 actividad de arsenito-oxidasa, la resistencia puede atribuirse a la

presencia previamente determinada de los genes arsABC (Mondrag6n et al.,

2012). Sin embargo, estevalormaximoseencuentrapordebajoalreportadopor

Butt y Rehman, 2011, para la cepa K. pneumoniae y K. variieola resistentes a

concentraciones26y24mM de arsenito respectivamentecon resultadopositivoa

lapruebadedeterminaci6ndeactividadarsenitooxidantedeAgN03.

Pagina40

Tras realizar las pruebas de x2, no se encontr6 evidencia estadistica significativa

de que la actividad arsenito oxidante.los valores de CMI 0 la predominancia de

alguna especie en particular tengan alguna variaci6n conforme al sitio de

aislamiento (X2C8IcuI8d8= 3,62 < X2'8b18= 5,99, X2colcul8d8= 12,50 < X2'8b18= 18,31 Y

X2COICUI8d8=21,98<X2'8bI8=23,68.respectivamente),

7.3 IDENTIFICACI6N DEL GEN noxB

7,3,1 BUSQUEDA DEL GEN CON LOS OLIGONUCLE6TIDOSDESCRITOS POR INSKEEP et aI" 2007

Las pruebas de PCR lIevadas a cabo con este par de 0ligonucle6tidos en las

condicionesdescritas por Inskeep etal.. 2007 no resultaron en Iaamplificaci6nde

algunfragmento.PorelioserealizQunaseriedemodificacionesconlafinalidadde

favorecer la amplificaci6n. Dichos cambios consistieron en la realizaci6n de

pruebas con gradiente de MgCI2 y uso de DMSO al 0,5 %. variaci6n de las

temperaturasdealineamiento(48,50. y52'C). ademasde que seIIev6acaboun

gradiente de temperatura de alineamiento desde48 hasta62 °C,

Estas modificaciones dieron lugar a la amplificaci6n de un fragmento de

aproximadamente1.900pbquesegener6contemperaturasdealineamientoque

fueron desde los 52 'c hasta los 65 'c (Figura 15) y que fue persistente aun

cuando se utilizaron templados distintos de ADN, Sin embargo. cuando se someti6

a reamplificaci6nya nose obtuvo, Esta consideraci6n aunada a ladiferenciade

tamano con el fragmento esperado. el resultado se consider6 un art~cio de la

peR,

Pagina41

Figura 16. Electroforesls en gel de agarosa de los productosamplificadosporPCR

con ADN de la cepa 16. Carril 1: marcador de peso molecular (MPM) 1 Kb Plus DNA

Ladder. Carril2: Banda de 1.9 kbgenerada a60"C. Carril3: Banda de 1.9 kb generada a

62"C.Carril4:Bandadel.9kbgeneradaa6S"C

7.3.2 BUSQUEDA DEL GEN CON UTILlZACI6N DE LOSOLIGONUCLE6TIDOS DESCRITOS POR QutMtNEUR et al., 2008.

las condiciones de PCR descritas en la metodologia para este par de

oligonucleotidos nodieron lugara la amplificacion de fragmentoalguno. Porello,

al igual que con el paranteriordeoligonucle6tidos, se realizaron modificaciones

en las pruebas con elfin depropiciarelalineamiento. loscambios consistieronen

la realizacion de curvas de MgCI2 (1, 1.25, 1.5,2 Y2.5 mM), uso de Taq Platinuml!>

y uso del kit Platinuml!> Blue PCR Super Mix, con las temperaturas de

alineamiento:48,52,54,56,58y62 "C.

En las pruebas de PCR donde se empleo el kit Platinuml!> Blue PCR Super Mix no

seobtuvobandeoalguno. En las realizadas de manera convencional a58 "C con

aumento en la cantidad de Taq Platinuml!> de 1 U a 2 U por cada 50 III de

reaccion en el grupo de ADN de las cepas E. cloacae C4, E. sp. C5 Y A. sp. C8

comotemplado, seobtuvieron productos con tamaliosde menosde 100, 470y

670 pb aproximadamente (Figura 16A). Estas bandas fueron eldraidas y

purificadas del gel de agarosa mediante el empleo del kit High Pure PCR Product

Purification Kit~de Roche~(Figura 16B) y posteriormente reamplificadas por PCR

en las mismas condiciones, donde resulto amplificada solo Ja banda de

aproximadamente 670 pb (Figura 16C).

Pagina42

~...•Figura 16: Corrlmlento electroforetlco en geles de agarosa al 1% en TAE. A: Carril 1:marcador de peso molecular (MPM) 1 Kb Plus DNA Ladder. Carril 2: Bandas de 100, 470Y 670 pb aproximadamente amplificadas con los 0ligonucle6tidos de Quememeur et al.,2008; B: Carril 1: marcador de peso molecular (MPM) 1 Kb Plus DNA Ladder. Carril 2Purificaci6n del ADN de la banda de 470 pb. Carril 3: Purificaci6n del ADN de la banda de

670 pb; C: Carril unico: Reamplificaci6n por PCR de la banda de 670 pb.

Como resultado de la secuenciaci6n del producto amplificado por PCR de

aproximadamente670pbse obtuvo una secuenciade 640 pb. Dicha secuenciase

convirti6 a secuencia de aminoacidos con el programa ClustalW y se compar6 con

las reportadas en la base de datos Non-redundant protein sequences del NeSII!>.

EI porcentaje maximo de identidad fue de 80 % con un e-value de 2·1Q-27 y un

coverage de 30 % para un dominic de corte/metHaci6n N-terminal de una proteina

tipo prepilina de Enterobacter cloacae subespecie NCTC 9394 Y en menor grado

conotrassecuenciasafines(Figura17).

Figura 17. Resultado del BLASTpl!> entre la secuencla de amlnoacldos obtenlda de lasecuenclade640 pby las secuenclas reportadasen la base de datos Non·redundant protein sequences del NCBI. Analisis realizado con la secuencia ORF-1. EIanalisisdelasecuenciaORF-2indicarelaci6nconlamismaproteina.

Pagina43

Estasecuencia(640pb)sealine6medianteelusodelprogramaClustalW2conia

secuencia reportadaporCaietal.• 2009b para elgen aoxB(subunidadMo-pterina,

827 aa) de 2484 nucle6tidos en Achromobacter sp. Cepa SY8 (Numero de acceso

NCBI: ABP63660.1. GI: 145321)85) y mostr6 escasas regiones cortas con un

minimogrado de conseIVaci6n a 10 largo de los 2484 nucle6tidosde lasecuencia

con lacualsecompar6. Lasecuenciaempleadacomo referenciafueelegidapor

suhomologiaconlamayorladesecuenciasreportadasparaaoxB.

Dada la escasa identidad entre fa secuencia obtenida y la secuencia aoxB usada

comoreferenciaparaelalineamiento, la fa Ita de relaci6n estructuralymetab6lica

de la proteina tipo prepilina con la enzima arsenito oxidasa y fa diferencia de

tamano entre el fragmento obtenido (640 pb) Y el esperado al emplear los

0ligonucle6tidos descritos por Quememeur etal., 2008 (1,100 Pb),sepudoafirmar

queelbandeoobtenidoen la PCRcareciaderelaci6n consecuenciastipo aoxBo

relacionadas.

Aun cuando las evidencias fenotipicas de resistencia a arsenito, arsenato y

actividad arsenito-oxidante en las cepas de estudio sugieren Iaexistenciadela

enzima arsenito oxidasa, no se identific6 el gen aoxB con los 0ligonucle6tidos

reportados para tal prop6sito. Sin embargo, existen reportes de cepas arsenito­

oxidantes en cuyo genoma no se encontraron los genes aoxB, como las cepas

arsenito oxidantes Alkalilimnico/a ehrlichii-MLHE-1 y Azoarcus sp. DA01 (Rhine et

aI., 2007). En base a ello, se sugiri6 que la capacidad arsenito oxidante de A.

ehrlichiise debra probablemente a la presencia de una proteina semejante a la

arsenato reductasa respiratoria (ArrA) (Hoeft et aI., 2007). Se propon:. que ArrA

presentacapacidadoxidadoraatravesdeunflujodeelectronesreverso,cualidad

opuestaa la forma conocida. Posteriormenle, Kulpetal., 2008 report6 unaislado

con capacidad arsenito-oxidante en ausencia del gen aoxB y atribuye la funci6n

oxidadora a ArrA, ya que obtuvo un amplic6n con un -68 % de identidad a fa

secuenciadesugencorrespondientedescritoenA.ehrlichii.

Pagina44

Otraevidenciade mecanismosdeoxidaci6n ajenosa la presencia del gen aoxB

esla reportadaenA. ehrlichiicepa MLHE·1 porZargaretal., 2010, quien identific6

un"nuevo"tipodearsenitooxidasaconmayorrelaci6nfilogeneticaalasenzimas

arsenato reductasas respiratorias ArrAB que a las arsenito oxidasas AoxAB, cuyos

genes inicialmente denomin6 mlg_0216 y posleriormente JJf)cA. La identificaci6n

deestosgenescomounaarsenitooxidasaalternalivaabri6nuevasposibilidades

para reexaminarporqueciertascepasarsenilooxidanles han eludidoladetecci6n

porPCRdearsenitooxidasastipoaoxB(Zargaretal.,2010).

Los analisisfilogenelicos de lassecuencias nucleotidicasdedichooper6n

confirman que pertenecen a un grupo de arsenito oxidasas dislinto de AoxAB y

ArrAB dentro de la misma familia de enzimas DMSO reductasas, y se cree que

podrianhaberestadosujetasaprocesosdetransferenciagenelicahorizontal

(Zargaretal., 2012).

Parala oxidaci6n del arsenito en condicionesan6xicas las bacleriashanacoplado

tanto la reducci6n como oxidaci6n de compuestos de arsenico para su

supervivenciayla conservaci6n de energiaycrecimiento'(Zargar etal., 2010). No

obstante, el desarrollo de tales mecanismos podria estar Iimitado a condiciones

especificas como una medida adaptaliva en ese grupo de microorganismos en

particular.

Resulta improbable que la falta de amplificaci6n en las pruebas de PCR sea

consecuencia de variaciones en lasecuenciagenelicadel gen aoxB. Aun cuando

lassecuencias codificantes han estado sujetas a variacionescomounarespuesla

a las condiciones del entorno,existeun gradovariablede conservaci6nentre

diferentesespecies(38.4a96.8%deidentidadsegunresulladosdeQoemEmeur

at al., 2008; resultados de: Santini y Vanden Hoven, 2004, Inskeep el al., 2007,

Branco elal., 2009, Cai elal., 2009b, Clingenpeel etal., 2009y Osborne elal.,

2013manejanporcentajesdeidentidaddenlrodeesterango).

Polgina45

La aseveraci6n de que la falla de amplificaci6n no obedece avariaciones en la

secuencia de aoxB se robuslece si ademas del grade de conservaci6n se

considera queel primerselde oligonucleotidos empleadoen esta investigaci6n

(publicadoporlnskeepatal.,2007)fuediseiiadodadalaconservaci6nde

secuenciasespeclficasde aoxBcon diferenciaci6n de losdemas miembrosde la

familia DMSO reduclasas, y que el segundo sel utilizado (publicados por

Quemeneur at al., 2008) fue probado en el mismo esludio en ensayos de PCR con

ADN de 10 cepas no arsenilo-oxidantes, de las cuales 6 poseian una

molibdoenzima de la familia DMSO.

7.4 BUSQUEDA DEL GEN aoxB INMERSO EN INTEGRONES CLASE I

Los pruebas de identificaci6n del gen aoxB dentro del contexte genetico de un

Integr6n Clase I cuando se utilizaron los 0ligonucle6tidos Intl1 Fw + AoxBRv no

dieron lugar a la amplificaci6n de algun fragmento de ADN relacionado a aoxB.

Las pruebas realizadas con el 0ligonucle6tido qacEDRv (Bass et al., 1999) en

combinaci6n con aoxBFwnoamplificaronfragmentoalguno,porlo cualserealiz6

ungradientedelemperaluradealineamienlode55,58,60y62'Casicomouna

rampa de temperatura con los mismos reaclivos y templados de ADN y no se tuvo

exito en la amplificaci6n de algun fragmento de ADN en las cepas de estudio.

Enestesentido,elunicoestudioenelcualsehadeterminadounmarcoabiertode

leclura parcial para inlegrasa en el mismocontexto genetico que el gen aoxB 10

comprende los lrabajosde Osborne etal., 2013,quienesencontraronsecuencias

que comparten homologla con inlegrasas de fago putalivas -de varias

betaproteobacterias, aunque es poco probable que fueran funcionales (Osborne et

al., 2013).

Pagina46

Los resultados obtenidos en esta investigaci6n sugieren que en el ADN de las

cepasenestudioelgenaoxBnoseencuentra inmersoen un integr6n, 10 cual no

implicaqueelgennoestepresenteensugenoma.

La ausencia de amplificaci6n podria deberse a que estos microorganismos

empleen un mecanisme enzimatico distinto del sistema aox para la oxidaci6n de

arsenito. Estudios recientes de expresi6n de genes en concentraciones elevadas

de arsenico demuestran la posibilidad de que se lIeven a cabo procesos

exaptativos que involucren diferentes mecanismos con proteinas propias para

lograr la resistencia bacteriana a arsenico. Ejemplos de estos procesos son:

transporte (miembros de la familia de transportadores MFS), biogenesis de

membrana (diacyl-gligerol-kinasa (DAGK) y fosfolipido fosfatasa (PAP)),

maduraci6n post-transcripcional de tRNAs (Queuosina), respuesta al estres

(chaperona ClpB) y reparaci6n de ADN (ADN glucosilasa) (Morgante y Gonzalez,

2013).

7.5 ANALI515 DE 5ECUENCIA5 DE rADN 165

Como ya se mencion6, de las 15 cepas utilizadas en este estudio (las cuales

presentan grados variables de resistencia a Aslil yAsV), 8 mostraron capacidad

arsenitooxidante.Apesardeesto, en las pruebasde PCR nose identific6elgen

soxB como responsable de dicha actividad. Es preciso conocer el sistema

biol6gico porel cual se observa este comportamiento. Una opci6n metodol6gica

poria cualse podrfaabordaresta cuesti6n seria la secuenciaci6n de genomay

posteriorcomparaci6nconlasbasesdedatosdegenomascompletosreportados.

Para ello, es necesario la determinaci6n especifica de la especie cuyo genoma

sera secuenciado, para, de esta forma, asegurar que el genoma anotado

corresponda a especiesreportadaspreviamente. Loanteriorparatenerun punto

decomparaci6n yencontrarla 0 las secuenciasque pudieran serresponsablesde

laoxidaci6ndearsenito.

Pagina47

Poresta raz6n, se seleccionaron las cepas C4, C12, C16y C81, por ser las que

presentaron actividad arsenito-oxidante y los valores mas altos de CMI de

arsenito. Se analizaron sus secuencias de rADN 16S con la finalidad de lIevar a

cabo en investigacionesposteriores lasecuenciaci6ndelgenomacompletodeuna

de elias y buscarsecuencias relacionadasalgen aoxBoa proteinas conocidas 0

nuevas con facultad de lIevara cabo laoxidaci6n delarsenito.

El corrimiento electroforetico de los productos de las pruebas de PCR con los

0ligonucle6tidos dirigidos a secuencias de ADN ribosomal 16S se muestran en la

figura18.Lassecuenciasresultadasdelasecuenciaci6nde738y693pb

correspondientes a las cepas C4 y C16 respectivamente presentaron un

porcentajede identidad del 99 % con EnterobactercioacaecepaZ9 No. deacceso

KF429496.1 y 97 % con Enterobacter hormaechei cepa PS53C No. de acceso

JX294308.1. Esto es, ambas cepas corresponden al genero Enterobacter (cuadro

6).

Los analisisde lassecuencias para C12 yC81, mostraron una identidad del99y

92% respectivamente con K. pneumoniae (Cepas SW, No. de acceso

AB641122.1) y NW115, (No. de acceso JF915362.1) (cuadro 6). Esto se logr6

mediante comparaci6n con las secuencias reportadas en las bases de datos:

Nucleotide collection, NCBI Genomes (Chromosome), Reference genomic

sequences (refse<Lgenomic), 16S Ribosomal RNA sequences (Bacteria and

Archea) y Reference RNA sequences (refseq_rna) del National Center for

Biotechnology Information (NCBIQIl).

Pagina48

1 2 3 4 5 6 7

t.JMlOo.- c::;> cx,) QIC) ••

t'l

."',.~

Flgura1B.Electroforeslsen gel deagarosaal1 %delosproductosdePCR.CarriI1·marcador de peso molecular (MPM) 100 pb. Carril 2: ADN cepa 4. Carril 3: ADN cepa 12.Carril4: ADN cepa 16. Carril 5: ADN cepa 61. Carril 6: control negativo (-ADN). Carril 7:ccntrolpositivo.

Cuadro 6. Tamaflo y porcentaje de los fragmentos rADN 165 secuenclados. 5emuestran los porcentajes de los fragmentos anotados, respectoa la longltud delampllc6n(1,500pb).

Cepa ITama~o resultado de la I% respeetc al tama~o1

secuenclacI6n esperado

Poreentajede

identidad

EcfoacaeC4

K.pnaumonfaeC12

EaerogenesC16

K.pneumoniaeC81

738

976

693

1015

49.2

65.0

46.2

67.6

99

99

97

92

Laconfirmaci6n de especie de las cuatro cepas seleccionadasresultademucha

utilidad para decidir el genoma a secuenciar en investigaciones posteriores. Sin

embargo, el hecho de que los porcentajes de recuperaci6n con respecto al

amplic6n hayan sido tan bajoses un inconveniente. Estoporquesiseconsidera

quelaestrategiadeamplificaci6nprodujofragmentosde1,500pb(querepresenta

un 97 % aproximadamente del total de la secuencia primaria de rARN 16S (Hutson

elal., 1993)) yde los mismos se recuperaron porcentajes de entre 4ll y67 %,

pudieron haberse perdido fragmentos determinantes en la diferenciaci6n de

especies.

Loanteriorpodria representarun importante sesgo de los resultados, por10 cual

sera necesario efectuar otras pruebas de amplificaci6n de rADN 16S para tener

Pagina49

porcentajes de recuperaci6n mas elevados. Otra posibilidad serla utilizar los

0ligonucle6tidos complementarios descritos por el mismo Hutson et al., 1993, los

cuales flanquean dos regiones traslapadas de aproximadamente 1,000 pb cada

una,loquedisminuirialaposibilidadderesultadoserroneos.

8. CONCLUSIONES

EI60 % de las 15 cepas de estudio mostraron valores de CMI entre 10 y 15

mM de arsenito de sodio.

Hay diferencia en cuanto a la resistencia a arsenito entre las bacterias

arsenito-oxidantesylasquenoloson.eIBB.B%delascepascuyosvalores

de CMI fueron ~ 10 Mm mostraron actividad arsenito-oxidante en las

pruebasdenitratodeplataO.1 M.

Probablemente las cepas en estudio presentan un mecanisme de

resistencia a arsenito alterno al sistema ars.

EnlascepasutilizadasenesteestudionoseidentificoelgenaoxB,por!o

queelfenotipoobservadopuedeserresultadodeunmecanismodistintoa

aoxB.

No se identifico el gen aoxB como parte de Integrones Clas!!' J con la .

metodoJogiautilizadaparaestefin.

Se confirm6 la especie de las cuatro cepas evaluadas por analisis de

secuenciaderADN 16S

Pagina50

9. PRODUCTOS DE LA INVESTIGACI6N

- Capitulo titulado "Microbial arsenite biotransformation and its potential

applications in bioremediation" en: Velazquez-FernandezJBycols., 2013.

"Bioremediation: Processes, Challenges and Future Prospects". ISBN: 978­

1-62948-513-3.

- Presentaci6n de resultados del proyecto en el Tercer Congreso

Internacional de la Rama de Bioqufmica y Biologfa Molecular de Bacterias

del3al7deoctubredel2013en CuatroCiemegas, Coahuila.

10. PROSPECTIVAS

• Cuantificaci6n de la conversi6n de arsenito Para tener informaci6n de la

medida en la que las cepas objetode estudio realizan la conversi6n de

arsenitoaarsenato,resultarfaconvenientedeterminardelavelocidaddel

proceso, en un mediocontrolado, dado que el objetivo a largo plazo serfa

aprovechar estas caracterlsticas en un dispositivo que asegure la mayor

eficienciayeficaciaposibles.

• Purificaci6n de la enzima. Otra acci6n importante a considerar seria la

purificaci6ndelaenzimaarsenitooxidasaapartirdecultivospurosconel

fin de evaluarsu usoen la descontaminaci6n de aguasen lugardeemplear

microorganismos completos. Ademas, esta purificaci6n permitiria su

cristalizaci6nycaracterizaci6n.

Pagina51

• Caracterizar moleculannente la enzima. Ir de proteina al DNA para obtener

lasecuenciadelgendelaarsenitooxidasa.

11. BIBLIOGRAFiA

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ANEXO 1 SOLUCIONES Y REACTIVOS EMPLEADOS

- Agarosa al1 % en TAEfTBE

Pesarlacantidad necesaria de agarosa en una proporci6n p/vdel 1% respectoal

volumen final deseado. Disolver en el buffer TAE 0 TBE (uno u otro, depende del

tamalio del fragmento), calentar hasta su completa disoluci6n. Vaciar en el molde,

previa colocaci6n del peine para pocillos yesperarhasta la polimerizaci6n para

montarelcorrimientoelectrofonilico.

- Arsenito de sodio (NaAs02) 0.1 M

Pesar1.2991grsdeNaAs02yaforaren100mLdeaguadestiiadaesteril.

- Nitrato de plata (AgN03) 1M

PesarO.849grsyaforaren5mLdeaguadestiladaesterii.

- TAE 1X

Realizar la diluci6n de 20 mL de TAE (Tris + Acido Acetico + EDTA) 50X de BIO­

RAD® en 980 mL de agua destilada esteril y homogenizar.

- TBE1X

_ Disolver 108 grs de Tris Base, 55 grs de Acido Borico y 40 mL de EDTA

disodico (pH 8.0) en 800mLdeaguadestiiadaesterilyaforara un Iitropara

obtener el buffer TBE 10X. De este, tomar 100 mL y diluir a un Iitro con

aguadestiladaesterilparaliegarasialbufferTBE 1X.

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