Practica 1
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I. INTRODUCCION
La absorción de radiación ultravioleta o visible proviene de la
excitación de los electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de
onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces
que existen en las especies en estudio. La espectroscopia de absorción molecular
es por tanto valiosa para la identificación de los grupos funcionales de una
molécula. Sin embargo, son más importantes las aplicaciones de la
espectroscopia de absorción ultravioleta y visible para la determinación
cuantitativa de compuestos que contienen grupos absorbentes o también llamados
cromóforos.
La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más
utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su
precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza
(contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas).
Los fundamentos físicoquímicos de la espectrofotometría son relativamente
sencillos.
En esta práctica se determinara la absorbancia del bromocrosol
verde, se realizara distintas medidas con distintos volúmenes; con la ayuda del
instrumento llamado espectrofotómetro.
I.1 Objetivos
- Objetivo general
Determinar la concentración del bromocrosol verde a través del
espectrómetro visible.
- Objetivos específicos
Determinar las concentraciones y absorbancias de cada una de
las muestras realizadas.
Construir la gráfica de la relación absorbancia vs concentración.
Determinar la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia
vs concentración.
II. REVISIÓN DE LITERATURA
II.1 ESPECTROFOTOMETRÍA UV – VISIBLE
La espectrofotometría de absorción fue uno de los primeros métodos
físicos que se aplicó al análisis cuantitativo y la determinación de estructuras, La
espectrofotometría UV-vis supera en costo y sencillez al resto de métodos ópticos
de análisis cuantitativo y es también una técnica auxiliar útil para la elucidación de
estructuras.
La región del ultravioleta se divide en 2 partes: ultravioleta próximo o
cercano (que comprende de 200 a 400 nm del espectro electromagnético) y el
ultravioleta lejano o de vacío (10 a 200 nm). Este último presenta el inconveniente
de que el oxígeno atmosférico absorbe en esa región y por ello no es considerado
en el análisis por espectrofotometría UV - visible. La división entre las regiones
ultravioleta próximo y el visible (400 a 800 nm aproximadamente) se debe a que
el ojo humano sólo puede percibir las radiaciones de onda por encima de 400nm
(OLSEN, 1990).
II.1.1 FUNDAMENTO
Como es sabido, las técnicas espectroscópicas se basan en la
interacción de la radiación electromagnética con la materia. A través de esta
interacción las moléculas pueden pasar de un estado energético (m), a otro
estado energético distinto (l), absorbiendo una cantidad de energía radiante igual a
la diferencia energética existente entre los dos niveles: El - Em. Para conseguir
esto, las moléculas absorben un fotón de una radiación tal que:
Estos tránsitos energéticos son los que dan origen a los espectros
que, en definitiva no son mas que el registro de las distintas u(0k) a las que se
producen estos tránsitos energéticos.
Debido a la existencia de diferentes tipos de energía de los electrones,
de los movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotación de las mismas,
etc; las moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un
rango muy amplio de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de
espectroscopías según las diferentes regiones. Un esquema podría ser el
siguiente:
Figura N°1. Espectro de radiación
La espectroscopía UV-Visible (espectros electrónicos), se debe a la
transición de los electrones mas externos de los átomos de las moléculas, desde
niveles fundamentales a niveles mas altos de energía.
II.2 LEY DE BEERT - LAMBERT
Cuando una onda electromagnética de cierta longitud de onda incide
sobre una sustancia, la fracción de la radiación absorbida es función de la
concentración de la sustancia que atraviesa el rayo de luz y del espesor de la
muestra, que también se llama longitud de paso óptico. La compensación de la
reflexión y la absorción en la ventana puede evitarse definiendo I0 como el poder
de radiación que pasa a través de una muestra testigo (blanco) contenida en la
misma celda de la muestra. La transmitancia T se define como la relación de las
intensidades de la radiación no absorbida I, y de la radiación incidente, de esta
forma:
La absorbancia (A) es el logaritmo del recíproco de la transmitancia
Si el porcentaje de T es 100T; el porcentaje de absorción será 100(1-
T). Las aplicaciones analíticas del comportamiento de absorción de las sustancias
pueden ser cualitativas o cuantitativas, como antes se ha mencionado. Las
primeras dependen del hecho de que una cierta especie molecular sólo absorbe
luz en regiones específicas del espectro y en grado variable característicos de
dicha especie, al resultado se le llama espectro de absorción de esa especie
molecular y es una huella dactilar para propósitos de identificación. Las
aplicaciones cuantitativas dependen de la relación entra la absorbancia y la
concentración de la solución.
A medida de que un haz de fotones pasa por un sistema de una
especie absorbente, el grado de absorción con respecto a la distancia atravesada
es directamente proporcional a la potencia (o a la intensidad) del haz de fotones I.
La reducción de la intensidad en la trayectoria x, -dI, puede escribirse
matemáticamente de la forma siguiente.
Donde k es una contante de proporcionalidad característica de la
naturaleza de la especie absorbente y de la energía de los fotones, e I representa
el poder de la radiación a cualquier distancia x en el medio absorbente.
Reordenando la ecuación anterior.
Este es el enunciado matemático de que la fracción del poder de
radiación absorbido es proporcional al espesor atravesado. Si ahora se estipula
que I0 es el poder de radiación a x=0, y que I representa el poder de la radiación
transmitida que emerge del medio absorbente a x = l. La ecuación puede
integrarse con respecto al total del trayecto de la radiación.
Esta es la ecuación de Lambert la cual indica que para una cierta
concentración de sustancia absorbente, la intensidad de la luz transmitida
disminuye logarítmicamente a medida que la longitud del trayecto aumenta en
forma aritmética. Beer determinó que al aumentar la concentración del absorbente,
se producía el mismo efecto que un aumento proporcional en la longitud del
trayecto de absorción de la radiación. De esta forma, la constante de
proporcionalidad k es, a su vez, proporcional a la concentración de la sustancia
que absorbe.
Por lo tanto la forma combinada de la ley es:
Donde a incorpora el factor de conversión del logaritmo base 10 a
logaritmo natural. Esta expresión es la ley de Lambert-Beer y se puede escribir
como:
Donde ϵ es el coeficiente de absortividad molar en unidades de L cm-1
y mol-1, l es la longitud del paso óptico (longitud de la celda) y C es la
concentración de la sustancia absorbente en unidades de mol L-1.
Figura N°2. Absorción de la radiación
Si se opera a una longitud de onda dada y con una cubeta de un
determinado espesor l, la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a
la concentración molar de la muestra c, lo que constituye el fundamento del
análisis espectrofotométrico cuantitativo.
Existen, sin embargo distintos factores que afectan al cumplimiento de
la ley de Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes
de proceder al análisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente
el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de
calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones.
La ley de Lambert-Beer puede también aplicarse al análisis
cuantitativo de mezclas de dos o más sustancias, siempre que sus respectivos
espectros de absorción sean lo suficientemente distintos. El procedimiento se
basa en que la absorbancia es una propiedad aditiva, de tal forma que la
absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los componentes. Así,
para una mezcla de dos componentes, 1 y 2, que absorben radiación de una
misma longitud de onda, se cumplirá que:
II.3 CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTROFOTÓMETRO UV - VISIBLE
La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un
espectrofotómetro, que en esencia consta de un monocromador (prisma o red de
difracción) que controla la longitud de onda de la radiación que se hace incidir
sobre la muestra. La radiación no absorbida se detecta y mide convenientemente.
La absorbancia de la muestra se compara con la de una “referencia” que consta
estrictamente de disolvente.
II.3.1 INSTRUCCIONES GENERALES DE MANEJO DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
Encendido de lámparas
Lámpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340 nm), encendido
instantáneo.
Lámpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200 nm aprox.), necesita
un calentamiento previo.
Adaptación del espejo a la lámpara adecuada, atendiendo al
rango de longitud de onda de trabajo (sólo en los espectrofotómetros no
automáticos).
Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando
correspondiente.
Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda
del mando “Ajuste del cero”, hasta que aparezca cero en la pantalla.
Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la
referencia, que normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando para ello el
mando “A-T”.
Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra.
Figura N°3. Absorbancia/Transmitancia de la muestra
Las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1.00 cm de espesor)
deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras
esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario
por el carácter abrasivo de éste sino con un papel suave. Una de las aplicaciones
prácticas de mayor interés de la espectrofotometría de absorción UV-Visible es la
del análisis cuantitativo, basada en la aplicación de la ecuación de Lambert-Beer.
II.4 PUNTO ISOSBESTICO
En la mayoría de los casos durante la duración de una reacción
química, una especie absorbente X se transforma en una especie absorbente Y
(en el caso que sólo estén involucradas 2, para los casos en donde hay más
especies se aplica el mismo concepto). Si los espectros de los componentes puros
X e Y se cruzan a una longitud de onda, cualquier espectro registrado durante la
reacción química pasará por ese mismo punto, este punto se conoce como punto
isosbéstico, este es una buena prueba de que existe más de una especie.
En la figura se muestra un ejemplo de los espectros de absorción
que corresponde al verde de bromocresol, se puede observar que hay una
longitud de onda en que los tres espectros se cortan, este es el punto isosbéstico
y corresponde a la longitud de onda en que las dos formas tienen la misma
absortividad (HARRIS, 2007).
Figura N°4. Espectros de absorción del bromocrosol verde a diferentes valores
de pH, donde se observa el cambio de una especie a otra dejando evidencia el punto
isosbéstico
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
- Bromocrosol verde 3gr.
- (4) Tubos de Ensayo
- (1) Matraz
- (1) Pipeta
- (1) Vaso precipitado de 250 ml
- (1) Gradilla
- Agua Destilada
- Libreta de apuntes
- Lapicero
3.2 Equipo
- Espectrofotómetro 1200 RS FARLAB
- Laptop
- Cámara digital
3.3 Software
- Microsoft Excel 2013
- Microsoft Word 2013
3.2 MÉTODOLOGÍA
3.2.1 TRABAJO DE LABORATORIO
Se comenzó añadiendo al matraz 250 ml de Agua destilada, y luego
se agregó 3 gramos de Bromocrosol verde y lo mezclamos hasta que se disuelva
completamente.
Luego se usó 4 tubos de ensayo con su respectiva gradilla, y se
agregó las cantidades de 1, 2, 4 y 8 ml de la mezcla y agregamos agua destilada
en cada uno de los 4 tubos de ensayo hasta que en cada uno halla la cantidad de
10 ml (agregamos 9, 8, 6, 2 ml de agua destilada respectivamente).
Posteriormente y previas explicaciones del docente a cargo, se
encendió el espectrofotómetro y se calibró colando agua en la cubeta transparente
del espectofrotómetro.
Finalmente se colocó cada muestra de los 4 tubos de ensayo en la
cubeta transparente del espectofrotómetro para medir la absorbancia.
- Trabajo de Gabinete
Con los datos obtenidos del trabajo de laboratorio de concentración y
absorbancia, construimos una gráfica de absorbancia vs concentración en
Microsoft Excel.
Al construir la gráfica hallamos la línea de tendencia generada por un
ajuste de curva lineal.
Con dicha ecuación podremos determinar la concentración para la
absorbancia requerida.
3.4 Consideraciones
- Si la muestra que analizamos con el espectrofotómetro no nos dio un
dato de absorbancia, no considerar para encontrar el ajuste de curva.
- Debido a que la cubeta transparente del espectofotrómetro solo
utiliza 3.5ml se tuvo que retirar 6.5ml del total del volumen
IV. RESULTADOS
IV.1 Determinación de la concentración inicial
m = 3g (Bromocrosol verde)
v = 250 ml (Agua)
N1= mv
N1= 3 g250ml
= 0.012 g/ml
IV.2 Volumen total
V1 = 1 ml (Mezcla) + 9 ml (Agua) = 10 ml
V2 = 2 ml (Mezcla) + 8 ml (Agua) = 10 ml
V3 = 4 ml (Mezcla) + 6 ml (Agua) = 10 ml
V4 = 8 ml (Mezcla) + 2 ml (Agua) = 10 ml
VT = 10 ml
IV.3 Determinación de las distintas concentraciones
N1 * V1 = N2 * V2
Donde:
N1 = Concentración inicial
V1 = Volumen de cada concentración
N2 = Concentración final
V2 = Volumen total
IV.3.1 Para la concentración 1
N2-1 = 0.012
gmlx1ml
10ml = 0.000012 g/ml
IV.3.2 Para la concentración 2
N2-2 = 0.012
gmlx2ml
10ml = 0.0024 g/ml
IV.3.3 Para la concentración 3
N2-3 = 0.012
gmlx 4ml
10ml = 0.0048 g/ml
IV.3.4 Para la concentración 4
N2-4 = 0.012
gmlx8ml
10ml = 0.0096 g/ml
IV.4 Calculo de la absorbancia
Tabla N°1. Concentración y absorbancia de la muestra en estudio
CONCENTRACIÓN ABSORBANCIAN2-1 = 0.000012 g/ml 1.294N2-2 = 0.0024 g/ml 1.424N2-3 = 0.0048 g/ml 1.938N2-4 = 0.0096 g/ml No se efectuó la lecturaN2-5 = x 1.540
Gráfica N°1. Representación de la absorbancia vs concentración
1 1.2 1.4 1.6 1.8 20
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
f(x) = 0.00709751607677581 x − 0.00877695365961416R² = 0.954936833477586
Absorbancia vs Concentración
AbsorBancia
Concentración
Dada la siguiente ecuación de la gráfica, podemos hallar el valor de la
concentración teniendo como dato la absorbancia.
y = 0.0071x – 0.0088
Donde:
x = absorbancia
y = concentración (g/ml)
Y = 0.0071 * (1.540) – 0.0088
Y = 0.002134 g/ml
Por lo tanto, la concentración N2-5 es 0.002134 g/ml
V. DISCUSIÓN
Según la Ley de Beer (WALTON, 2005); para la obtención de la curva
de calibración, se representan gráficamente las absorbancias y las
concentraciones de las muestras, cuya relación debe mostrar un comportamiento
lineal; concordando con el autor, obtuvimos una ecuación lineal de las
concentraciones c1= 0.000012g/ml, c2= 0.00024g/ml, c3= 0.0048 g/ml, c5=
0.000012g/ml, con sus respectivas absorbancias a1= 1.294, a2= 1.424, a3= 1.938,
a5=1.540.
Según SIERRA (2010), se debe seleccionar la longitud de onda más
adecuada para realizar las medidas que corresponden a un máximo de
absorbancia, con la finalidad de obtener los resultados dentro de los límites
permitidos. Para la práctica se se escogió una longitud de onda de (240 nm) por lo
tanto el valor de R² = 0.9549 de la ecuación de la gráfica de la relación
absorbancia vs concentración, concordando con el autor, puesto que se trabajó
dentro de la medida adecuada.
VI. CONCLUSIONES
- Se determinó la concentración del bromocrosol verde a través de
espectrofotómetro visible, siendo este 0.000012g/ml para una absorbancia de
1.540.
Se determinaron las concentraciones de cada una de las muestras
realizadas siendo estas c1= 0.000012g/ml, c2= 0.00024g/ml, c3= 0.0048 g/ml, c5=
0.000012g/ml.
Se obtuvieron las absorbancias de cada una de las muestras, siendo
éstas a1= 1.294, a2= 1.424, a3= 1.938, a5=1.540.
Se determinó la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia vs
concentración, siendo esta y=0.0071x - 0.0088, a partir de la cual se calculó la
absorbancia teniendo como dato la concentración.
Se determinó que la relación de la concentración vs absorbancia es
directamente proporcional, es decir, a mayor concentración mayor será la
absorbancia.
No se trabajó con la concentración c4=0.0096 g/ml, debido a que el
espectrofotómetro no efectuó la medición.
VII. RECOMENDACIONES
Diluir completamente la muestra.
Vigilar que al momento del análisis de la muestra en el
espectrómetro, en la habitación no se produzca cambios bruscos en la circulación
de las masas de aire, para que así no haya interferencia en el análisis.
Esperar que el dato proporcionado por el espectrómetro se vuelva
constante para considerarlo valido.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
OLSEN E. 1990. Métodos ópticos de análisis. Madrid, España. Editorial Reverte
S.A. España. 756 p.
HARRIS D. 2007. Análisis químico cuantitativo. 3 ed. Madrid, España, Editorial
Reverte S.A. 418 p.
WILLARD H., et al. 1986. Métodos instrumentales de análisis. México D.F,
México, Editorial Continental S.A. 593 p.
CONNOR, K. 1980. Curso de análisis farmacéutico. 1 ed. Madrid, España,
Editorial Reverté S.A. 228 p.
MIÑONES, J. 1978. Manual de técnicas instrumentales. México D.F, México,
Círculo editor Universo. 146 p.
WALTON H. 2005. Análisis químico e instrumental moderno. 4 ed. Barcelona,
España, Editorial Reverté. 385 p.
UMHE. 2013. Ley de Lambert-Beer [En línea]:
(http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/
Miguel_Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_05.htm, 4 de junio del 2015)
IX. ANEXOS
Figura N°5. Mezcla del bromocrosol verde con agua
Figura N°6. Pruebas para el análisis con volúmenes de 8ml, 4ml, 2ml, 1 ml
respectivamente
Figura N°7. Espectrofotómetro
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS
AMBIENTALES
ANALISIS INSTRUMENTAL
ESPECTROSCOPÍA DE RADIACIÓN UV-VIS
DOCENTE : Ing. DIONISIO MONTALVO, Franklin
ALUMNOS : BARRUETA PAUCAR, Mayori
CRISTANCHO ARIZA, Krystell
FERNÁNDEZ ESCOBAR, Angie
MANRRIQUE GUERRA, Luis
OSORIO PEDRAZA, Erick
POMA CATALÁN, Maribel
CICLO : I - 2015
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA
DE LA SELVA
JUNIO 2015