PRACTICA NO. 1DETERMINCIÒN DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MÈTODO DE SANGER.

INTRODUCCION.La determinación de la estructura primaria de una proteína suele denominarse secuenciación Existen varias maneras de determinar la secuencia de aminoácidos, el primero en lograr esto fue Frederick Sanger, quien diseño un método capaz de determinar la secuencia de los aminoácidos en una proteína, el cual consiste en el marcaje del amino terminal a través del uso del 1-Fluoro-2,4-Dinitrobenceno (DNFB). Este compuesto químico color amarillo reacciona con los grupos amino libres en condiciones ligeramente básicas, formando los dinitrofenil derivados (DNP-aa), también reaccionara con los grupos imidazol, fenólicos y epsilon   amino; por lo que se dará una dinitrofenilacion en la cadena lateral de la Tirosina, Histidina y Lisina.Al hidrolizar el péptido o la proteína ya dinitrofenilada, se da una ruptura total de los enlaces peptídicos, lo que nos da como resultado un hidrolizado que contendrá aminoácidos libres y DNP derivados que se conservan intactos, ya que su enlace es más difícil de romper.Los DNP de aminoácidos terminales, a diferencia de los demás DNP y de los aminoácidos libres, son no polares por lo que se pueden extraer muy fácilmente con un disolvente no polar.Estos DNP de aminos terminales son sometidos a una cromatografía en capa fina o en papel Whatman; por lo que se determina por comparación con otros DNP derivados de aminoácidos, al amino terminal de la proteína.

OBJETIVOS.

El alumno utilizara el método de Sanger para identificar los aminoácidos que contienen el grupo alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina.

INTERPRETACION DE CADA PASO EFECTUADO EN LA PREPARACION DEL DERIVADO DINITROFENILADO.

Se disolvió la proteína (hemoglobina) en 2.4mL de bicarbonato de sodio al 4.2% con el fin de preparar un medio de reacción alcalino, para desprotonar al grupo alfa-amino libre y así facilitar la reacción con el DNFB.

Después de haber adicionado el DNFB se agito vigorosamente durante 1 hora, y de este modo se llevara a cabo la dinitrofenilacion, manteniendo un PH entre 8 y 9 y con ellos formar un derivado amarillo 2, 4- dinitrofenil aminoácido (DNP-aa).

Posteriormente se ajusto el PH debajo de 3 con 12 gotas de HCL 3 N y de esta manera protonar nuevamente el nitrógeno del amino terminal y proteger al enlace C-N, para que al hidrolizar a la proteína no romper a este enlace.

Se realizó 3 extracciones de la suspensión amarilla obtenida, a través de una solución de éter saturado con sulfato ferroso (FeSO4) para eliminar la fracción de DNFB que no había reaccionado ni con el aminoácido mencionado ni con el resto de grupos imidazol susceptibles a dicho reactivo, que pudiesen estar presentes en la cadena polipeptídica de la hemoglobina. En la fase acuosa estaban contenidos el DNP-aa de interés y demás derivados dinitrofenilados a causa de su alta polaridad en tanto que en la fase orgánica, color café, se colectó el DNFB sobrante y se extrajo.

Se coloco el tubo que contenía a la proteína en baño maría y se agito para evaporar los residuos de éter que pudiesen haber quedado.

Se añadieron 5 mL de HCl 6N al tubo que contenía la proteína dinitrofenilada y se le sometió a una presión en autoclave durante 3 horas con la finalidad de realizar una hidrólisis acida y fraccionar, mediante la ruptura del enlace peptidico a cada uno de los aminoácidos constituyentes de la proteína pero manteniendo estable la interacción entre el dinitrofenilo y el grupo amino.

Se repitió otra serie de extracciones con éter y FeSO4 pero esta vez, la fase extraída y desechada fue la acuosa, pues contenía derivados dinitrofenilados polares con carga y en este punto del procedimiento el aminoácido marcado ya era no polar y se encontraba en la fase etérea, la cual se recogió y colectó en un vaso de precipitados y posteriormente evaporar el éter.

Finalmente se preparo un cromatograma y se adiciono un poco de etanol a nuestro vaso de precipitados, para hidratar el DNP-aa

RESULTADOS.

Imágenes del cromatograma obtenido durante la práctica.

Los resultados de los Rfs de la cromatografía obtenidos a partir de la relación que existe entre el frente del soluto y el frente del disolvente fueron los siguientes.

MUESTRA RFsDNP- Glu ( 24.5) / ( 32.3) = O.75DNP-Val ( 23.7) / ( 32.7) = O.72DNP-Asp ( 25.2) / ( 33.1) = 0.76DNP-Ala ( 21.5) / ( 33.3) = 0.64DNP-Phe ( 20.5) / ( 33.0) = 0.62DNFB ( 17.3) / ( 33.0) = 0.52PROBLEMA 1ra Mancha ( 19.1) / ( 32.6) = 0.58PROBLEMA 2da Mancha ( 23.9) / ( 32.4) = 0.73

Tabla 1. Relación de frentes obtenidos a partir del Cromatograma.

DISCUCIONES.

La molécula de hemoglobina está formada por cuatropolipeptidicos o cadenas polipetidicas, dos cadenas alfa y dos cadenas beta. Cada cadena alfa está constituida por 141 aminoácidos y la VALINA es el aminoácido con Grupo alfa amino terminal.

Analizando los resultados de los Rfs y comparando loslos valores de los 5 DNPs con el valor del Rf del problema,podimos darnos cuenta que el valor de Rf de la VALINA esel que más se acerca al del problema, con esto podemos decir entonces que la VALINA es el aminoácido con grupo alfa amino terminal de la proteína de Hemoglobina, ratificando así lo citado en la literatura.

CONCLUSIONES.

La VALINA es el aminoácido con grupo alfa amino terminalde la Hemoglobina.

BIBLIOGRAFIA.

Conn, Eric E. (2007). Bioquímica Fundamental. Limusa Wiley. México. Págs. Consultadas: 69, 89, 90.

Peña Antonio (1988). Bioquímica. Limusa. Segunda edición. Pág. consultada: 427.