PRACTICA N° 2. AISLAMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS. TECNICAS DE SEMBRADO

INTRODUCCIÓNCuando intentamos estudiar la flora bacteriana del cuerpo, suelo, agua, alimentos o cualquier otra parte de nuestro entorno, pronto descubrimos que las bacterias existen en poblaciones mixtas. Sólo en muy raras situaciones se presentan como una sola especie. Para poder estudiar las características del cultivo, morfológica y fisiológica de una especie individual, es esencial, en primer lugar, que el organismo deba separarse de la otras especies que normalmente se encuentran en su hábitat; en otras palabras, debemos tener un cultivo puro del microrganismo.Varios métodos diferentes para obtener un cultivo puro de un cultivo mixto están disponibles para nosotros. Los dos los métodos utilizados con más frecuencia implican hacer un estriado en placa o el vertido en placa. Ambas técnicas de placa implican raleamiento de los organismos para que especies individuales puedan seleccionarse de los demás.En esta práctica tendrás la oportunidad de utilizar ambos métodos de aislamiento y las técnicas del sembrado en un intento para separar distintas especies que contiene una mezcla o pull de microrganismos presentes en la degradación o descomposición de alimentos y sustancias orgánicas.

CAPACIDAD: Manipula los instrumentos de laboratorio de manera correcta Conoce la técnicas de aislamiento y siembra de los microrganismos

TECNICA DE TRABAJO

METODO DE PLACA ESTRIADAPara la economía de materiales y tiempo, este método es el ideal. Sin embargo, requiere una cierta habilidad, para la siguiente experiencia. Una apropiada ejecución del estriado en placa dará como resultado un buen aislamiento para la mayoría de los trabajos. 21.1 Figura ilustra cómo las colonias de un cultivo mixto deben ser distribuidas en un correcto estriado en placa. Lo importante es producir buen espaciamiento entre las colonias.Materiales:

Cocina eléctrica Mechero de Bunsen Alambre nicron (resistencia cocina electrica) Termómetro Marcado de vidrio Agar nutritivo vertido en placa Petri Cultivo mixto ( alimentos contaminados a examinar)

1. Prepare su mesa o área de trabajo, desinfección la superficie con el desinfectante disponible del laboratorio. Use una esponja para fregar y limpiar.2. Marque la superficie inferior de una placa de Petri estéril con su nombre y fecha. Utilice un marcador de vidrio.3. Licuar un tubo de agar nutritivo, enfriar a 50 ° C, y Vierta el medio en la parte inferior y central de la placa, siguiendo el procedimiento que se ilustra. Asegure que el cuello del tubo se exponga a la llama antes de verter, para destruir las bacterias de alrededor.Después de verter suavemente el medio en la placa, Gire la placa de manera que se distribuye uniformemente, pero que no salpique sobre los lados.Agar-agar, el agente sólidificante en este medio, se convierte en líquido cuando hierve y resolidifica alrededor de 42 ° C. Verterlo sobre los 50 C° en la placa producirá condensación de humedad en la cubierta. Cualquier humedad en la cubierta es indeseable porque si cae en las colonias, los

organismos de una colonia pueden extenderse a otras colonias, perjudicando toda la técnica de aislamiento.4. realiza estrías en la placa por uno de los métodos mostrados. El instructor indicará que técnica que debe usar.PRECAUCIÓN: Asegúrese de seguir la rutina en la figura 21.3 para obtener el cultivo de organismos.5. Incube la placa en una posición invertida a 25 ° C de 24 a 48 horas. Incubar las placas boca abajo, minimiza el problema de humedad en la cubierta.

ESTRIADO DE CUADRANTES (Método A)

1. Estrié una asada cargada de organismos a través de la zona 1 cerca del borde de la placa. Aplicar el asa ligeramente. No sobrecorte el medio.2. Flamee el asa, enfrié 5 segundos, y realice 5 de 6 estriados desde el Área 1 al Área 2. Momentáneamente coloque el asa en una zona estéril del medio, antes de realizar el estriado, con el fin de asegurar su enfriado.3. Flamee el asa de nuevo, enfriar y hacer 6 o 7 rayas desde el área 2 a través de la zona 3.4. Flamee el asa de nuevo y hacer el numero de estrías posibles de la zona 3 en el área 4, utilizando el resto de la superficie de la placa.5. Flamee el asa antes de poner a un lado.

ESTRIADO DE CUADRANTES (Método B)

1. Estrié una asada llena de organismos y hacia el centro sobre la zona 1, comenzando en el punto designado por "s". Aplique ligeramente el asa. No sobrecorte el medio.2. Flamee el asa, enfrié 5 segundos y toque el medio en área estéril momentáneamente para asegurar el enfriado.3. Gire la placa 90 grados manteniéndola cerrada. Estrié la zona 2 con varios trazos hacia adelante y atrás, tocando la estría original unas cuantas veces.4. Flamee nuevamente el asa. Gire la placa y estrié la zona 3 varias veces, tocando la última área varias veces.5. Flamee el asa, enfríela y gire la placa 90 grados nuevamente. Estrié de zona 4, haciendo contacto con el área 3 varias veces y arrastre el cultivo como se ilustra.6. Flamee el asa antes de ponerlo a un lado.

ESTRIADO RADIANTE

1. Extienda una asada llena de organismos en un área pequeña cerca del borde de la placa en la zona 1. No sobrecorte el medio.2. Flamee el asa y deje que se enfríe durante 5 segundos. Tocar un área estéril del medio asegurando su enfriado.3. Desde el borde del área 1 hacer 7 o 8 estrías rectas para el lado opuesto de la placa.4. Nuevamente flamee el asa, enfríe lo suficiente y cruce estrías sobre las últimas realizadas, comenzando cerca de zona de 1. 5. Flamee el asa de nuevo antes de ponerlo a un lado.

ESTRIADO CONTÍNUO1. Comenzando en el borde de la placa (área A) con una asada llena de organismos propagados en un solo movimiento continuo hacia el centro de la placa. Utilice una ligera presión y evite sobrecortes del medio.2. Gire la placa 180 grados para la porción inoculada de la placa está lejos de usted.3. Sin flamear el asa y utilizando la misma cara de esta, continuar estriando la otra mitad de la placa comenzando por la zona b y ejecutándolo hacia el centro.4. Antes de ponerlo a un lado flamee el asa.

METODO DE PLACA VERTIDA(Dilución de asada)Este método para separar una especie de bacterias de otra consiste en diluir una asada llena de organismos con tres tubos de agar nutritivo licuado de tal manera que una de las placas vertida tendrá un número óptimo de organismos para proporcionar buen aislamiento. Se ilustra el procedimiento general.Una ventaja de este método es que se requiere un poco de menos habilidad del utilizado en el estriado en placa; una desventaja, sin embargo, es que requiere más medios, tubos y planchas o cocinas eléctricas. Procede de realizar tres dilución en placas vertidas, utilizando el mismo cultivo mixto que utilizó para el estriado en placa.Materiales:

cultivo mixto de bacterias 3 tubos de agar nutritivo 3 placas de Petri estériles Plancha o cocina eléctrica vaso de agua termómetro asa de inoculación marcador de vidrio

1. Etiquetar los tres tubos con agar nutritivo, roturarlos y colocarlos en un vaso de precipitación con agua sobre una plancha o cocina eléctrica para ser licuado. Para ahorrar tiempo, empezar con agua caliente si está disponible.2. Mientras se están calentando los tubos de medios de comunicación, etiqueta los fondos de las tres placas de Petri I, II, y III. 3. Para enfriar los tubos con medio agar nutritivo a 50 ° C, utilice el mismo método que se utilizó para la placa estriada.

4. Después de seguir la fig, inocular 1er tubo con una asada llena de organismos del cultivo mixto. Tenga en cuenta la secuencia y la manera de manejo de los tubos según la fig.5. Inocular el 2do tubo con una asada llena deI 1er tubo, después mezclar bien los organismos en tubo agitándolos de lado a lado o haciéndolos rodar vigorosamente entre las palmas de ambas manos.No salpicar el medio hacia arriba sobre las tapas . Regresar los tubos a baño.6. Agite el 2do tubo para dispersar completamente a los organismos e inocular 3er tubo con una asada del 2do tubo. Retornar el 2do tubo en el baño de agua.7. Agite el 3er tubo, flamear y verter su contenido en la placa 3.8. Flamear los cuellos de los tubos 2 y 3, y vierta su contenido en sus respectivas placas.9. Después de que el medio se ha solidificado completamente, incubar las placas de forma invertida a 25 ° C durante 24 a 48 horas.

VALORACION DE LOS DOS METODOSDespués de 24 a 48 horas de incubación examine las placas Petri. Buscar colonias que están bien aisladas de los demás. Observe cómo se aglomeran las colonias que aparecen en las placa 1 realice la comparación con placas 2 y 3. Las placas 2 o 3 tendrán el aislamiento más favorable de las colonias. Dibujar la aparición de las placas estriadas y reporte los resultados sobre el informe de laboratorio.

TECNICAS DE SUBCULTIVOEl siguiente paso en el desarrollo de un cultivo puro es para transferir a los organismos de la placa de Petri a un tubo de caldo nutritivo o de agar nutritivo inclinado. Después de esto y que el subcultivo ha sido incubado por 24 horas, una tinción del subcultivo puede hacerse para determinar si un cultivo puro se ha logrado. Al transferir los organismos de la placa a tubos, una aguja de inoculación (alambre recto) se utiliza en lugar del asa de alambre. Se inserta la aguja en el centro de la colonia donde existe una mayor probabilidad de contraer sólo uno especie de organismo. Utilice la siguiente rutina para subcultivos de los organismos diferentes.

Materiales: tubos de agar nutritivo inclinado aguja de inoculación Quemador de Bunsen

1. Identifique los tubos de cultivo puro utilizando pruebas bioquímicas 2. Incubar durante 24 a 48 horas a 25 ° C.3. Utilice tablas de comparación bioquímica4. Utilice coloraciones especificas y observe al microscopio5. Dibujar los organismos para el informe de laboratorio.Completar el informe de laboratorio para este ejercicio.