GUIA DE LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

Programa de Biologia Martha Lily Ocampo

Maryeimy Varon Lopez

PRÁCTICA 3: MEDIOS DE CULTIVO Y TECNICAS DE SIEMBRA

Introducción Se puede decir que el impresionante trabajo de investigación y estudio de las bacterias, realizado principalmente por Pasteur y Koch, dio como resultado el nacimiento de la microbiología. Fue en 1876 cuando Koch fue capaz de propagar una bacteria patógena (Bacillus anthracis) en cultivo puro, en 1881 utilizando medio líquido, lo solidificó con gelatina y desarrolló los métodos de rayado y siembra en placa para aislamiento de bacterias. El siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, al utilizar como agente solidificante un producto denominado agar, extraído de las algas rojas, el cual era muy superior a la gelatina, ya que era resistente a la digestión microbiana y a la licuefacción, posteriormente los medios fueron mejorando, aumentando su enriquecimiento con extractos de carne e infusiones, de tal forma, que la composición de los cultivos fuera similar a la fuente original. Hoy en día el aislamiento en cultivo puro se mantiene, con una mejoría constante en las técnicas de cultivo, aislamiento y crecimiento microbiano. Medios de cultivo El propósito de los medios de cultivo es favorecer el desarrollo de los microorganismos, además de ser la matriz donde se establecen las colonias con características morfológicas y microscópicas típicas de cada especie, las cuales pueden variar de acuerdo a la composición del medio. Igualmente, los medios de cultivo se pueden utilizar para demostrar otras características metabólicas de los microorganismos, por ejemplo: producción de ácidos y gases en medios de fermentación de hidratos de carbono. Clasificación de medios de cultivo: Se podrían hacer varias clasificaciones de los medios de cultivo: 1. Según su estado físico: a. Sólidos b. Semisólidos c. Líquidos.

a. Sólidos: presentan en su composición un agente solidificante, el agar, en una proporción de 12 a 15 gramos por litro. También contener gelatina o albúmina.

b. Semisólidos: presentan agar en su composición, pero en una proporción mucho menor que en los medios de cultivo sólidos. Por ejemplo, el medio de SIM, utilizado para determinar la movilidad de los gérmenes, estudiar la producción de Indol, contiene su composición 2.5 gramos de agar por litro.

c. Líquidos: no contiene ninguna agente solidificante.

2. Según su composición: a. Empíricos o naturales b. Sintéticos c. Semisintéticos

a) Empíricos: en su composición aparecen sustancias orgánicas. b) Sintéticos: en su composición aparecen sustancias químicas definidas. c) Semisintéticos: en su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas 3. Según el uso a que se destinan: a. Medios enriquecidos, b. Medios diferenciales o de aislamiento, c. Medios selectivos e inhibidores, d. Medios de transporte y mantenimiento, e.Medios de uso general y f. Medios para filtración de membrana.

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a) Medios enriquecidos: suele ser medios con nutriente simple que presentan enriquecedores, tales como la sangre de carnero, la sangre de Caballo, etc. son medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes.

b) Medios diferenciales o de aislamiento: contienen colorantes, azúcares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida, generalmente el color.

c) Medios selectivos e inhibidores: además de contar en su composición con los mismos productos que los medios diferenciales, presentan una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a estudiar, y aislar, de ésta forma el microorganismo que se busca.

d) Medios de transporte y mantenimiento: se utilizan en la recogida, transporte y conservación de muestras microbiológicas. Esencialmente, son medios no nutrientes, semisólidos muy reductores, que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las células y evitan los efectos letales de la oxidación. Son medios que no deben potenciar el crecimiento lujurioso.

e) Medios de uso general: son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos, sin exigencias nutritivas especiales.

f) Medios para filtros de membrana: las técnicas de filtración de membrana se han impuesto en microbiología, por las ventajas que presentan. Son técnicas que permiten el examen de grandes volúmenes de líquido con una población muy baja de microorganismos, la separación de los microorganismos del medio de cultivo e incluso su cambio de un medio de cultivo a otro sin interrumpir su ciclo de crecimiento.

Composición de los medios Los constituyentes más utilizados en la composición de los medios de cultivo son: 1. Agar: comercialmente se presenta en gránulos y en polvo. La concentración en la que aparece en los medios de cultivo depende del propósito para el que esté destinado el medio. 2. Peptona: producto de composición variable, obtenido mediante la hidrólisis ácida o enzimática de proteína animal o vegetal, a partir de materiales como por ejemplo: hígado,músculo, sangre, leche, etc. la composición dependerá del material utilizado y del método de fabricación. 3. Carne: el corazón del buey, el músculo y el hígado son utilizados frecuentemente, pero el cerebro, el vaso y la placenta de ternera pueden ser utilizados también en la preparación de medios de cultivo. 4. Extracto de carne: contiene bases orgánicas solubles, productos de degradación de las proteínas, vitaminas y minerales. 5. Extracto de levadura: se consigue a partir de levadura de pan o de cerveza y es una fuente rica en aminoácidos y vitaminas de complejo B. 6. Sangre: debe ser libre de agentes antimicrobianos, para no inhibir crecimientos. La sangre más utilizada es la de carnero y caballo aunque también se utilizan la sangre de conejo y la sangre humana. La sangre se utiliza para las distintas hemólisis de estreptococos y estafilococos. Debe comprobarse siempre la esterilidad, así como la ausencia de citratos, pues éstos podrían inhibir a los estafilococos. 7. Plasma: se utiliza para demostrar la actividad coagulasa. Normalmente, se utiliza plasma humano y de conejo. 8. Suero: se prepara a partir de la sangre recolectada sin adición de anticoagulante, eliminando el líquido que se separa cuando se contrae el coágulo. 9. Bilis: contiene varios ácidos biliares como compuestos conjugados con aminoácidos. También contiene pigmentos, como bilirrubina y biliverdina. 10. Sales biliares: son extraídas de la bilis, inhiben el crecimiento de organismos gran positivos y bacilos en forma de esporas, sin afectar al desarrollo de los bacilos entéricos Gram negativos. 11. Gelatina: proteína obtenida mediante extracción de material colágeno a partir de tejidos animales. Para los medios de cultivo se utiliza una gelatina de calidad farmacéutica.

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12. Carbohidratos: llamados colectivamente azúcares, se utiliza normalmente para enriquecer medios, para promover el crecimiento o la pigmentación y para determinar si los organismos pueden producir ácido y gas a partir de ellos. 13. Indicadores: se incorpora en algunos medios de cultivo para dar prueba visual del pH y otros cambios producidos durante el crecimiento de la bacteria. Los indicadores para este propósito deben ser no tóxicos a la concentración usada. Los indicadores del potencial REDOX tiene un uso limitado en medios de cultivo, por ejemplo: el azul de metileno o resazurina en medio tioglicolato. Técnicas de siembra

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento del microorganismo objeto de estudio.El éxito en el proceso de siembra depende de los cuidados tenidos durante la actividad, donde se incluyen que todos los materiales estén adecuadamente esterilizados y que toda manipulación sea cuidadosa para evitar la contaminación, e ser posible utilizando un mechero o bien una cámara de Flujo laminar. Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar. Siembra en medio sólido dispuesto en caja de Petri (Ver figura 3) Siembra por Agotamiento: Se toma la caja de Petri en la palma de la mano izquierda ligeramente inclinada; con la mano derecho se maneja el asa previamente esterilizada y con ella se recoge el material de cultivo o en el caso de usar escobillón se inocula en una pequeña área de la caja (cuadrante 1); se quema el asa o el escobillón ; se hace girar la caja en el cuadrante 2 se hacen estrías en la misma forma hasta la mitad de la superficie libre tocando una pequeña parte del cuadrante 1, se quema nuevamente el asa y se hace girar la caja, se continua en los cuadrantes 3 y 4 trazando estrías perpendiculares a las anteriormente practicadas, en el cuadrante 4 tener la precaución NO de tocar las estrías del cuadrante 1. Siembra por película o masiva: En una cepa inoculada en caldo y con buen crecimiento, se introduce un escobillón estéril y se difumina la muestra por toda la superficie del agar. Siembra por difusión: A partir de una muestra en medio liquido se toma una alícuota de 1 ml, la cual se coloca en una caja de Petri estéril y se le adiciona aproximadamente 15-18 ml de un medio liquido estéril el cual debe estar a una temperatura de 50°C (licuado), se realizan movimientos circulares a la caja con el fin de homogenizar la alícuota adicionada. Siembra por difusión en superficie Desde una muestra en medio liquido se toma una alícuota de 0.1 ml, se adicionaen la superficie del medio de cultivo solidificado y usando un asa de jockey la muestra es completamente homogenizada sobre la superficie del agar. Siembra por estría simple y técnica en cuadrantes La muestra es colocada en un extremo de la caja de petri y se realiza el rayado en una sola dirección, también puede haber variación de este procedimiento y usar la técnica de cuadrantes, la cual consiste en dividir la caja de Petri en cuatro cuadrantes, inicialmente se toma el inoculo y se inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa

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posteriormente o tomar nuevamente inóculo). Posteriormente las cajas sembradas, se incuban a temperatura adecuada para la bacteria. Siembra por exposición: Se abre la caja con el agar en el sitio de interés, por un tiempo definido. Se tapa la caja y se lleva a incubación a la temperatura deseada, por 24-48 horas. Siembra por punción Este tipo de siembra es comúnmente utilizado para observar la morfología de los hongos, una porción de la muestra a estudiar es colocada en el centro del medio de cultivo con la caja de Petri invertida usando palillos o asas fúngicas estériles.

Figura 3. Tipos de siembra en medio solido dispuestas en cajas de Petri Siembra en medio sólido dispuesto en caja Tubo (Ver figura 4) Para la siembra en tubo, este se debe mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir de modo que se pueda introducir el asa con el inoculo (Ver figura 4) Siembra Mixta: Se realiza sobre medios inclinados, haciendo un picadura hasta el fondo del tubo con un asa recta y luego haciendo un siembra en estría sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie inclinada marcando las estrías; de tal manera que, con el asa cargada se realizan dos tipos de siembra y sin retirarla del tubo. Siembra en estría: Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo. Siembra en picadura o punción: Se utiliza un asa recta y en tubos con medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa argollada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo. Siembra en medio Líquido: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con el material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados.

Punción Masiva Agotamiento Estría

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Figura 4.Tipos de siembra en tubos Objetivos:

• Entender y aprender el procedimiento de preparación de los medios de cultivo en el laboratorio de microbiología

• Conocer la clasificación de los diferentes medios de cultivo y los fundamentos de su utilización para el crecimiento de microorganismos.

• Conocer las diferentes técnicas de siembra según el medio y el objetivo propuesto Metodología Preparación de medios de cultivo Después de definir el medio que se desea preparar y realizar los cálculos correspondientes, si este es preparado a partir de sus componentes o de sus medios deshidratados (ver envase del medio e instrucciones) se debe pesar en la balanza la cantidad requerida. Si es a partir de un medio comercial, se debe colocar el polvo deshidratado en el interior de un erlenmeyer y verter allí la cantidad de agua correspondiente. A continuación, debe ser mezclado y calentado hasta homogenizarlo. Si el medio es para servir en placas de petri, se puede dejar en el Erlenmeyer hasta el siguiente paso y si es para colocar en tubos, estos deben ser envasados con 5, 7.5, o 10 ml. Posteriormente si el medio requiere de esterilización, debe ser autoclavado a la temperatura y tiempo que sea indicado por la casa comercial, habitualmente es 121ºC, 15 lb de presión durante 15 minutos, seguido este proceso el medio de cultivo debe ser vertido en las placas de petri (de 15-20ml) teniendo todas las medidas de asepsia correspondientes. En algunos casos los medios de cultivo requieren que sean adicionados otros componentes antes de ser servidos, tal es el caso de los medios, Baird Parker, agar sangre o chocolate, agar OGY, medio actinomicetos, Agar Mossel para Cereus, Agar selectivo para Campylobacter entre otros. Los medios se pueden utilizar inmediatamente o se pueden conservar en refrigeración(Los periodos no deben ser mayores a 1 semana por el peligro de contaminación). Cuando el medio de cultivo no es de casa comercial se puede preparar en el laboratorio, por ejemplo: Agar papa dextrosa agar, (PDA), a partir de un extracto o infusión de papa. Fórmula para 1 litro.

Estría simple

Siembra mixta

picadura y Estría

Picadura agar

Inclinado

Picadura agar

Recto

Con asa Bacteriológica

en medio líquido

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Pelar papas y pesar 200 g. Coloque a hervir por 15 minutos en 1 litro de agua. Cuando éste tibio mida el volumen en el cilindro graduado y adición de agua hasta completar 1 litro.Adicione glucosa al 1% y agar al 1 .5%, luego se debe mezclar bien hasta homogenizar. Hierva el medio. Sirva 8 tubos de ensayo (6 ml cada uno) tápelos y colóquelos en la canastilla o en recipiente plástico (esterilizable). Éstos servirán para preparar los tubos con medio inclinado o en una cuña, coloque el tapón de gasa y algodón al resto del medio del Erlenmeyer y así esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.Una vez esterilizados a los medios saque los recipientes y deje enfriar hasta unos 45-50°C (el calor del recipiente debe ser tolerable al tacto), posteriormente, sirva las cajas de Petri. Se abren estas cerca del mechero a unos 10 cm de distancia y vierta el medio (el que con un espesor menor de 2 mm, aprox. 12-15 ml).

Figura 5. Proceso de preparación de medios de cultivo, semisólido y líquido.

Técnicas de siembra La transferencia de las bacterias desde los productos patológicos a un medio de cultivo se denomina siembra; la transferencia de un cultivo a otro subcultivo o comúnmente repique.Las siembras se practican por medio de un escobillón, asa bacteriológica recta o redonda, asa de jokey o drigalsky. Los cuidados generales que debe tener para realizar el procedimiento de siembra son: 1. Mantener el mechero entre los medios y usted creando de esta manera una barrera 2. No olvidar esterilizar el asa antes y después de cada siembra. 2. Las siembras practicadas a partir de medios sólidos deben hacerse tomando de una sola

colonia, empezando por los tubos con agar y continuar con el tubo en caldo. 3. La siembra puede ser realizada como fue descrito en la parte inicial del texto (Figura 3 y 4),

acorde con el tipo de medio de cultivo y la necesidad del proceso. 4. Marque por debajo de la caja de Petri (no en la etapa) o alrededor de la misma: Medio. Fecha.

Grupo, número de referencia o muestra. 5. Incube las cajas de Petri en posición invertida por 24-48h 37ºC si son bacterias

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1. Describa la metodología general en un diagrama de flujo teniendo en cuenta las técnicas de siembra en los diferentes medios de cultivo sólido, semisólido y líquido desarrollados en el laboratorio. 2. Complete la tabla abajo, registrando la cantidad que requiere para cada tipo de medio, calculando la cantidad de agar para el volumen que desea preparar y determinando la cantidad de cajas o tubos que pueden ser preparados con el volumen establecido, además en las observaciones debe incluir si este medio requiere alguna característica especial en cuanto a esterilización o aditivo. Medio de cultivo Cantidad

Agar/L Vol. A

preparar (ml)

gr agar.

# Caja vol (15-20ml)

# Tubo/ vol

(5ml)

Observaciones (requiere autoclavar, es

necesario algún aditivo o componente adicional)

Agar nutritivo 180

Agar TSI: 250

* Caldo bilis verde brillante

300

Agar chocolate 500

Agar sangre 600

Agar citrato 300

Caldo triptona 800

3. Completar la siguiente tabla, describiendo el fundamento y la interpretación del medio después de este ser inoculado, puede ampliar la información con dibujos o fotografías.

Medio de cultivo Fundamento Clasificación Interpretación 1 Agar Nutritivo 2 Tripticasa Soya Agar 3 Agar SS 4 Caldo Triptona 5 Agar Baird Parker 6 Agar OGY 7 Caldo BHI 8 Caldo Bilis Verde Brillante

(Brila)

9 Agar EMB 10 Agar SPS 11 Agar Cetrimide 12 Caldo Asparagina 13 Agar sangre 14 Agar Saboraud 15 Agar Mueller Hinton 16 Agar Mac Conckey 17 Agar Chocolate

Ejercicios de metodología relacionados con la práctica

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18 Agar PDA 19 Agar SIM 20 LIA (Lisina-Hierro-Agar) 21 ENDO 22 UREA Resultados En la siguiente tabla encontrara la morfología de las colonias bacterianas obtenidas en medio solido sembradas en tubo y caja, el posible crecimiento en medio semisólido y en medio líquido, información necesaria para completar los resultados referentes a la práctica de medios de cultivo y tipos de siembra. Para mostrar los resultados de esta práctica elabore un cuadro resumen similar al propuesto en la figura 2 (práctica 2), donde incluya: medio de cultivo utilizado, tipo de siembra, morfología de las colonias observadas y tipo de crecimiento según sea el caso, guiándose por la figura 6.

Figura 6: Tipo de crecimiento y morfología de las colonias en medios de cultivo en estado sólido dispuestas en caja de Petri y tubo de ensayo, semisólidas y líquidas en tubos de ensayo.

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Discusión: relacione los medios de cultivo, la composición y tipo de siembra con los microorganismos inoculados. Adicionalmente responda las siguientes preguntas: 1. Consulte la composición de los medios de cultivo empleados y regístrelos en su informe. 2. ¿Encontró Usted alguna relación entre el medio de cultivo y algún tipo de microorganismos predominante? 3. Indique las características y nombres empleados para la descripción macroscópica de colonias según el tipo de microorganismos. 4. Proponga variaciones u otros tratamientos a este tipo de ensayos.