CENTRO DE CIENCIAS BSICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERA BIOQUMICAINGENIERA BIOQUMICALABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA

PRCTICA No. 1Aislamiento E Identificacin De Un Microorganismo De Uso Industrial

Asesor Acadmico: Dr. Juan Antonio Lozano lvarezAlumnos: Ulises Antonio Alcaraz Nava Vctor Manuel Muoz Silva Aldo Daniel Borjas Esqueda Vicente Lpez Senz Daniel Martn Snchez Tagle Jos Luis Garca Mariscal

Aguascalientes, Ags 5 de Marzo del 2015Prctica 3: Etapas de un proceso biotecnolgicoObjetivo El alumno conocer las etapas de un proceso biotecnolgico. El alumno aplicar las etapas de un proceso biotecnolgico para obtener un metabolito de inters (dextrana)IntroduccinEl dextrano es un complejo, ramificado de glucano ( polisacrido hecho de muchas de glucosa molculas) compuesto de cadenas de diferentes longitudes (3-2000 kilodaltons ). Se utiliza medicinalmente como un antitrombtico (anti plaquetas ), para reducir la sangre viscosidad , y como expansor de volumen en la hipovolemia . La cadena lineal consiste en -1,6 glucosdico vnculos entre las molculas de glucosa, mientras que las ramas comienzan a partir de -1,3 vnculos. El dextrano se sintetiza a partir de sacarosa por ciertas bacterias del cido lctico, el ms conocido es Leuconostoc mesenteroides y Streptococcus mutans . La placa dental es rica en dextranos. (Lewis, 2010)Toda la produccin industrial de este biopolmero se realiza a partir de mtodos biotecnolgicos, mediante dos vas:-Fermentacin, a partir de sacarosa y con la participacin de la bacteriaLeuconostoc mesenteroidesB512, principalmente. Se obtienen as cadenas muy largas (dextranos nativos o crudos), que posteriormente habr que fragmentar hasta conseguir tamaos ms adecuados a su aplicacin final, mediante un proceso de hidrlisis.-Sntesis enzimtica: Se hace crecer un microorganismo que produce la enzima de inters, llamada dextransacarasa. Cuando se tiene la cantidad deseada, se adiciona sacarosa al medio y dicha enzima produce la polimerizacin a dextrano.

En la industria alimentaria se utilizan para preparar dulces que posean una textura interior adecuada, mientras que la industria de la pintura, los teres y steres mixtos de dextranos son usados como agentes lacantes. Adems, determinadas columnas cromatogrficas cuentan con dextranos como su base fja. . Su campo de aplicacin ms importante es, sin duda, la medicina:- Se utilizan disoluciones de dextranos como sustitutos del plasma sanguneo, ya que sus propiedades osmticas y reolgicas son similares. Su aplicacin en este sentido es cada vez menor, y se considera ms conveniente la del dextrano al 3,5 % para hemodiluciones teraputicas reolgicas.- La sal sdica del ster del cido sulfrico y dextrano (complejo dextrano-sulfato) tiene propiedades anticoagulantes similares a la heparina.- Pueden formar complejos con el hierro, con lo que pueden ser usados para el tratamiento de anemias ferropnicas cuando es inviable la administracin oral de sumplementos. La versatilidad del dextrano viene dada por sus propiedades: es neutro y soluble en agua, fcilmente filtrable, biocompatible, biodegradable y estable durante ms de cinco aos Para concluir, como curiosidad, cabe comentar que la placa dental se forma de manera anloga a la sntesis enzimtica explicada con anterioridad: microorganismos de la boca (Streptococcus mutants) poseen la enzima dextransacarasa que forma los dextranos a partir de la sacarosa de los alimentos(Primo,1995).

Materiales y ReactivosMaterialReactivos

1 Matraz Erlenmeyer de 500 ml 1 Probeta de 100 ml y 250 ml1 Mechero Fisher1 Vaso de precipitado de 500 ml1 Agitador1 Asa bacteriolgica1 Embudo1 Bao 1 Matraz kitazatoAlgodnGasaExtracto de levaduraPeptonaSacarosaMetanol o etanol para precipitarAgar-AgarCloruro de sodio

ProcedimientoI. PRODUCCIN DE DEXTRANOS1. Se prepar 100 ml de medio de cultivo que tengan la siguiente composicin.

Sacarosa15 %

Peptona2 %

Extracto de Levadura1 %

NaCl0.1 %

Agua100 ml

pH6.5

2. Se esteriliz a 10 lb/plg2 por 30 minutos.3. Se enfri a temperatura ambiente y se inocul con tres o cuatro asadas del microorganismo (Leuconostoc mesenteroides)4. Se incub en bao con agitacin por 48 hrs. A 25 C.II. SEPARACIN Y PURIFICACIN DEL DEXTRANO1. Una vez terminada la fermentacin al matraz que contiene el dextrano, se le adicion un volumen igual de metanol o etanol para precipitar el dextrano. 2. Al forman cepartculas pequeas se filtr a vaco para poderlas separar.3. Se purific el dextrano obtenido adicionndole 100 ml. De agua y calentado la mezcla a 50 60 C4. Se separ por filtracin y se sec a una temperatura entre 40-50C Se pes el dextrano obtenido y se report.ResultadosDescripcinImagen

Matraz Erlenmeyer con la fermentacin terminada color amarillo oscuro, olor aspero.

Matraz Erlenmeyer con etanol, se ve el cambio de color entre dos fases, precipitado blanco y la solucin amarilla clara, olor aspero.

Se muestra el precipitado color blanco separado de la solucin amarilla clara

Imagen muestra el preciptado (metabolito requerido) en papel fitro despues de filtrarlo, color cfe claro

Tabla 1. Muestra cada imagen del procedimiento llevado a cabo con su descripcin

Rendimiento de metabolito producido por la bacteria

%Discusin En la prctica 2 se llev a cabo el primer paso del proceso biotecnlogico, que es la obtencin de una cepa productora de un metabolito de inters industrial. Debido a la alta viscosidad del medio, que aumenta conforme la produccin de la goma, la caja petri donde se inocul, tambin sirvi para la 2 fase del proceso biotecnlogico, el cultivo en masa, porque, de prepararse un medio lquido de tan poco volumen (10ml) este se hubiera vuelto muy viscoso y dficil de verter en el matraz de 100ml.La estructura, el peso molecular, las ramificaciones y, por consiguiente, el aspecto general de la goma obtenida varan con la cepa del microorganismo usada y las condiciones bajo las que fue cultivada (Domb & Kumar, 2011). Por lo que, al obsevarse la goma obtenida una gran cantidad y demasiado gomosa, por lo cual se infirio de la produccion de una goma de alto grado de ramificacion y alto peso molecular, producida por una cepa de una gran capacidad.Como menciona Snchez y Hernndez (2000), el medio de cultivo utilizado reproduca las condiciones en las que la bacteria fue cultivada, con el excepcin del agar, porque era medio lquido y no slido, esto es porque, la modificacion de los efectores externos tiene un efecto notable sobre un proceso, si el valor utilizado no es adecuado puede disminuir o an impedir la formacin de un metabolito determinado. Y los efectores de naturaleza qumica, estn representados por la presencia de los componentes de los medios de fermentacin que deben de cumplir con todos los requerimentos nutrimentales y adems con los requerimientos especficos que son indispensables para la formacin de producto.Con el medio slido ya se haba comprobado que el microorganismo produca la dextrana. Ms especficamente, el medio tena sacarosa como fuente de carbono ya que es el sustrato para que Leuconostoc m. produzca la dextrana. La dextrana es un polisacrido de origen natural biosintetizado por Leuconostoc y Streptococcus a partir de la sacarosa por la enzima dextransucrasa, que utiliza la glucosa de la sacarosa para ensamblar el polmero y liberar fructosa. Reiterando lo mencionado anteriormente por Domb y Kumbar (2011) que el aspecto y las propiedades de la goma presentan una alta variacin, debido a que las cepas productoras son fcilmente influenciadas por las condiciones ambientales.Rodrguez, O. V. et al (2007) establece que la produccin de dextranos se lleva por dos vas, va enzimticas directa y va enzimtica con inoculacin de cepas productoras de dextranas, de la misma manera describe el proceso como un proceso multimetablico, ya que se obtienen diferentes metabolitos, desde cido lctico, etanol, cido actico, fructosa y dextranas. Pero el metabolito de inters, dextranos, se produce con un rendimiento de 20g por litro de medio. Fue fcil de observar que la goma producida tenia demasiadas impurezas debido al proceso, obtenindose una goma no pura que con el calor de la estufa se cristaliz. Esta cristalizacin se atribuye a la sacarosa no fermentada y a la fructosa generada en la fermentacin. Adems un rendimiento bajo del 8 % se atribuye a un mal procedimiento de cosechamiento del metabolito. Como Cuervo et al (2010), su procesamiento de la cosecha es la purificacin a travs de una centrifugacin despus de una sedimentacin de 24 hr y una precipitacin con etanol 1:1 lo que genera que el metabolito de inters sea maximizado. Adems del controlamiento de cantidades de azucares remanentes en forma de sacarosa y la generacin de fructosa como metabolito secundario, ayudan a observar la velocidad de degradacin y por lo tanto el rendimiento ideal.Otro factor clave mencionado por Rodrguez, O. V. et al (2007), es la inoculacin de cierto cantidad de biomasa, que degraden la sacarosa, para obtener una maximizacin. Pues dentro de la industria es necesario cuantificar la biomasa a inocular y realizar mediciones antes, durante y despus, para asegurar la alta produccin del polmero de una manera sencilla y con una rentabilidad alta. ConclusinSe conoci la importancia del proceso bioqumico de la produccin del dextrano en laboratorio, este se realiz por la produccin de la enzima dextransacarasa producida por la bacteria Leuconostoc mesenteroides la cual se obtuvo previamente un pulque. La enzima fue la encargada de juntar los carbohidratos hasta formar el polisacrido.El dextrano tiene muchos usos tanto a nivel industrial como a nivel laboratorio, se utiliza para hacermicroportadorespara el cultivo celular industrial, El dextrano se puede utilizar como un recubrimiento para proteger la estabilizacin de nanopartculas metlicas de la oxidacin y mejorar la biocompatibilidad, Dextrano tambin se ha utilizado en forma de perlas para ayudar en aplicaciones de un biorreactor, entre muchos otros usos.

Cuestionario1.- Describa cada una de las etapas del proceso biotecnolgico desarrollado en esta prcticaa) Eleccin de cultivo: en esta primera etapa lo que se realiz fue el aislamiento a partir de la muestra de pulque enriquecido. De esta manera se fue aislando por resiembra con el fin de tener colonias de L. mesenteroides productoras de dextranob) Cultivo de masa: se inocul la bacteria en un medio de fermentacin, el cual contena principalmente sacarosa, peptona y extracto de levadura.c) Respuestas celulares: para la obtencin del dextrano, que en este caso es el producto de inters, se inocul la bacteria en medio de fermentacin rico de en sacarosa, molcula fundamental para la produccin de dextrano. Cabe mencionar que el medio tambin est diseado para el desarrollo y crecimiento de la bacteria. d) Operacin del proceso: para la reproducibilidad de los microorganismos, se dise un medio especfico en donde se logran desarrollar de la mejor manera, contiene los nutrientes necesarios, y con agitacin orbital a 25C, sta se encuentra en inmejorables condiciones.e) Recuperacin de producto: para la recuperacin del dextrano se precipit aadiendo una parte igual de etanol y con agitacin constante, posteriormente se filtr al vaco para una mejor separacin y posteriormente se dej secando en la estufa a una temperatura entre 40-50C por dos das.2.- Qu son los dextranos y qu aplicacin industrial tienen?Es un polisacrido de alto peso molecular, compuesto de unidades de D-glucosa unidos mediante enlaces glucosdicos a-(1,6); son estructuralmente diversos y se caracterizan de acuerdo con el porcentaje, naturaleza y distribucin de sus enlaces. El dextrano se produce generalmente en cultivos de bacterias lcticas como Streptococcus, Acetobacter o Leuconostoc, en medios que contienen sacarosa, principalmente en la bacteria Leuconostoc mesenteroides. Las clulas en crecimiento secretan una enzima inducible llamada dextransucrasa que convierte el exceso de sacarosa hidrolizndola en dextrano y liberando fructosa al medio. En la industria alimenticia son de amplio uso, se utilizan en panificacin y en confitera principalmente, le confiere texturas adecuadas a determinados dulces. En industria de la pintura, los grupos teres y steres mixtos son usados como agentes lacantes. En la industria farmacutica son muy importantes, ya que disoluciones de dextrano se usan como sustitutos de plasma sanguneo, la sal sdica del ster del cido sulfrico y dextrano se usa por sus propiedades anticoagulantes y complejos con el hierro ayudan en anemias ferropnicas.3.- Por qu el medio de fermentacin se esteriliza a baja presin y 30min en lugar de esterilizar 15lb/pulg2 durante 15 minutos?Debido al contenido del medio de fermentacin, se debe trabajar con una temperatura menor, ya que la sacarosa podra caramelizar o al menos disminuir la disponibilidad en el medio, de esta manera la produccin de dextrano sera menor.4.- A qu se debe el aumento de la viscosidad en el medio de fermentacin a medida que sta avanza?A la produccin progresiva de dextrano por parte de la bacteria, ste como ya se mencion provee viscosidad debido a sus caractersticas reolgicas.Bibliografa: Lewis, Sharon L. (2010).Enfermera Mdico Quirrgica(8 ed.).ISBN978-0323079150. E. Primo. Qumica orgnica bsica y aplicada. Tomo II. Ed. Revert (1995) Cuervo Mulet, R. A., Ledesma, J. A., Duran Vanegas, J. A., & Argote Vega, F. E. (2010). Aislamiento y control microbiolgico de Leuconostoc msenterodes, en un ingenio para optimizar el rendimiento de azcar y etanol. (Spanish).Biotecnologa En El Sector Agropecuario Y Agroindustrial,8(2). Domb, J.A. Kumar, N. (2010). Biodegradable Polymers in Clinical Use and Clinical Development. 1 edicin. John Wiley & Sons. Hoboken, New Jersey. Pp. 217-124 Rodrguez, O. V., & Hanssen, H. (2007). Obtencin de dextrano y fructosa, utilizando residuos agroindustriales con la cepa Leuconostoc mesenteroides NRRL B512-F. (Spanish).Revista EIA, (7). Snchez, G. Hernndez, E. (2000). Environmental Biotechnology and Cleaner Bioprocesses. 1 edicin. Taylor & Francis. New Fetter Lane, London. Pp 250-253