162 Control de Calidad en Laboratorio Clínico

Práctica # 5. Verificación de la linealidad fotométrica

Espectrofotómetro utilizado: 1C Coleman Fecha de realización: 27/Mar/ 2012

Objetivo:

Verificar si existe relación lineal entre la respuesta luminosa obtenida en un espectrofotómetro

y la concentración utilizando altas concentraciones de un cromóforo estable. Calcular el

error debido a la falta de linealidad fotométrica.

Fundamento:

La mayoría de las mediciones que se realizan actualmente, en los laboratorios clínicos son fotométricas, de ahí que la calidad analítica dependa entre otras cosas, del tipo y estado en que se encuentre el instrumento utilizado.Si en los laboratorios se utilizan espectrofotómetros con deficiencias en su calibración de lalongitud de onda y/o sensibilidad, entonces esto ocasionará problemas de exactitud. Es por eso que se han desarrollado varios métodos para verificar la linealidad en los fotómetros.

Las determinaciones fotométricas dependen de que la magnitud de la absorbencia (A) sea directamente proporcional a la concentración (C) del compuesto a medir, siendo necesario construir una curva tipo o curva de calibración, que presente gráficamente la relación existente entre ambos parámetros. Las concentraciones de los problemas se obtendrán por procedimientos que dependen del tipo de relación obtenida:

a) Si es lineal y parte de cero, se determinará el factor de calibración química (se le llama así para distinguirlo de la calibración instrumental), que es el inverso de la pendiente de la recta, que a su vez es una constante y se denomina absortividad; al multiplicar el factor por las absorbencias de los problemas se obtienen las concentraciones buscadas.

b) Si es una recta que no parte de cero, entonces las concentraciones buscadas se calcularán por regresión lineal.

c) Si la relación no es lineal, se deberán aplicar otros modelos matemáticos o en su defecto, interpolar en la gráfica correspondiente para obtener los resultados buscados.

La linealidad fotométrica es una propiedad que permite conocer el rango de absorbancias dentro

del cual el espectrofotómetro produce respuestas proporcionales a los cambios de concentración

de una sustancia. Para esta experiencia, se prepararon diluciones seriadas de dicromato de

potasio en agua destilada, la cual es una sustancia que se conoce sigue la ley de Lambert-Beer y

por tanto tiene un comportamiento lineal. Se midieron los valores de absorbancia de dichas

diluciones a 500 nm, para evaluar el comportamiento del instrumento.

CCLC/hlz

Prácticas de laboratorio 163

Procedimiento:

Material necesario para cada equipo: Gradilla con 12 tubos; 2 pipetas de 1 ml, 2 de 5 ml y

2 de 10 ml; Espectrofotómetros y cubetas. Agua destilada 100 ml

Solución madre: Dicromato de potasio 530 mg/dL, preparar 12 diluciones mezclando con

agua hasta un volumen de 5 ml las siguientes cantidades de Dicromato: (30 ml

Dicromato/equipo; 35 ml agua)

Tubo # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Dicromato (ml) 0.1 0.2 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

Agua (ml) 4.9 4.8 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

Factor de dilución 50 25.0 10.0 5.0 3.33 2.5 2.0 1.67 1.43 1.25 1.11 1.0

Abs. obtenida 0.05 0.09 0.21 0.40 0.54 0.71 0.83 0.94 1.03 1.03 1.15 1.26

Abs. calculada 0.03 0.05 0.13 0.25 0.37 0.50 0.63 0.75 0.88 1.00 1.13 1.26

[ ] K2Cr2O7 Teórica 10.6 21.2 53 106 159 212 265 318 371 424 477 530

[ ] K2Cr2O7Obtenida

13.5 23.4 56.2 106 146 192 224 253 277 278 308 339

% Error relativo 27% 10% 6% 0% -8% -9% -15% -20% -25% -34% -35% -36%

Leer a 500 nm ajustando a cero con blanco de agua destilada

CCLC/hlz

[ ] K

2Cr2

O7

Obt

enid

aAb

s. o

bten

ida

164 Control de Calidad en Laboratorio Clínico

1. Construya una gráfica de correlación concentración de Dicromato (teórica) en eje “ x” vs Absorbancia obtenida en eje “y”. Calcule coeficiente de correlación r, pendiente e intersección.

Coeficiente de correlación r Pendiente Intersección0.98 0.62 32.8

400

350

300

250

200

150

100

50

0

Gráfica 1 y = 0.6183x + 32.829R² = 0.9648

0 100 200 300 400 500 600[ ] K2Cr2O7 Teórica

2. Calcule la absorbancia ideal dividiendo la absorbancia de la solución sin diluir (tubo 12) entre el factor de dilución (para cada tubo) y trácela en la gráfica anterior. Compare la diferencia entre la absorbancia experimental y la ideal.

1.6

Gráfica 2 y = 0.9694x + 0.1228R² = 0.9644

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

00 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Abs. Ideal

CCLC/hlz

% E

rror

rela

tivo

Prácticas de laboratorio 165

3. Calcule un factor de calibración dividiendo la concentración del tubo 4 entre su Absorbancia.

4. Calcule la concentración de K2Cr2O7 obtenida multiplicando la lectura de Absorbancia de cada tubo por el factor de calibración.

40%

30%

20%

y = -0.0011x + 0.1448R² = 0.9327

10%

0%

-10%0 100 200 300 400 500 600

-20%

-30%

-40%

-50%[ ] K2Cr2O7 Teórica

5. Compare las concentraciones de K2Cr2O7 reales con las obtenidas y calcule el porcentaje de error relativo. Mediante una gráfica represente el error relativo (% de error + o -, en eje Y) del fotómetro relacionándolo con la concentración teórica (eje X).

6. Comente los resultados de la práctica.Hay que tener en cuenta que la LINEALIDAD es el intervalo de concentraciones del cromógenoentre las cuales existe una relación lineal entre Absorbancia y Concentración. De acuerdo a las graficas anteriores, cuando la concentración del cromógeno sobrepasa los límites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtiéndose la recta en una curva.

La lectura de la Absorbancia fuera de los límites de linealidad se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno, por lo que hay que diluir la muestra para que su concentración entre en los límites de la linealidad. El % de error fue mayor fue grande en el extremo de muy baja concentración y en los últimos 3 de más alta concentración.

Este tipo de análisis nos permitió evaluar el funcionamiento de los espectros habiéndose observado que es necesario realizar el mantenimiento permanente de los mismos para garantizar la confiabilidad de los equipos, pues la falta de linealidad fotométrica es el error más frecuente.

CCLC/hlz

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:

1. Control de calidad de instrumentos y equipamientos de laboratorio: Control de Calidad en losLaboratorios Clínicos, Cap. 11. Murali Dharan.

2. Control de calidad en espectrofotometría UV-Vis: Fernandez Spina, .,Candau García, R.

3. Practical Spectrophotometric Standards: Rand, R.N. Clin. Chem. 1969; 15(9); 839-63.

4. Calibration and Monitoring of Spectrometers and Spectrophotometers: Clin. Chem. 25/6, 1013-1017 (1979)

5. Some Sources of Errors and Artifacts in Spectrophotometric Measurements: Ellis, K., Morrison, J.Clin. Chem. 21/6, 776-777 (1976).