MANUAL DE PRCTICAS13

PRCTICA DE LABORATORIO Nro. 01 NORMAS DE BIOSEGURIDAD. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO.

1. INTRODUCCIN:Todas las personas que trabajamos con materiales de laboratorio que contengan agentes infecciosos debemos estar conscientes de los peligros potenciales asociados a stos. Adems, debemos tener entrenamiento en las prcticas y tcnicas requeridas para manejar los materiales de una manera segura, as como tambin tenemos la obligacin de conocer cules son las normas de seguridad a seguir en el laboratorio de manera tal, que el trabajo se realice con un riesgo mnimo de exposicin, tanto para las personas que lo ejecutan como para el medio ambiente.2. OBJETIVO:Conocer y aplicar los lineamientos bsicos de organizacin, manejo de instrumental y seguridad en el laboratorio de biologa celular y molecular. 3. PARTE TERICA:3.1. BIOSEGURIDADLa seguridad biolgica o bioseguridad, es la aplicacin del conocimiento de lastcnicas y del manejo adecuado de los equipos y materiales de laboratorio para prevenir la exposicin del personal, del rea de laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o biopeligrosos.

3.1.1. Agentes BiopeligrososSon todos aquellos agentes biolgicos y materiales que son potencialmente peligrosos para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellospodemos citar: bacterias, virus, viroides, viriones, hongos, parsitos, productos recombinantes, alrgenos, priones, etc.

3.1.2. Riesgo MicrobiolgicoEn los laboratorios de biologa celular o de microbiologa existen dos fuentes principales de peligros biolgicos, uno de ellos lo representa el procesamiento de muestras provenientes de un paciente o ambiente en concreto y en segundo lugar el manejo de cultivos de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a provocar una infeccin si no son manipulados con precaucin.

3.1.3. Infecciones Adquiridas en el Laboratorio (IAL)Se dice que ocurre una contaminacin en un laboratorio, cuando un microorganismo, capaz de causar enfermedad, entra al cuerpo de un individuo en una concentracin suficiente y a travs de una ruta determinada, siendo capaz de vencer las defensas del individuo generando una infeccin adquirida en el laboratorio.

3.1.4. Vas de InfeccinLos microorganismos pueden ingresar al organismo a travs de: la boca, las vas respiratorias (pulmones), la piel (intacta o lesionada), la conjuntiva, etc. En las IAL, la ruta de entrada no es necesariamente la misma que cuando la enfermedad se adquiere en forma natural.Las vas de contaminacin ms frecuentes en el laboratorio se dan a travs de:La boca; comer, beber y fumar en el laboratorio, realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningn tipo de proteccin; transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o utensilios contaminados (lpices, bolgrafos, etc.); la piel, inoculacin accidental con una aguja hipodrmica u otros instrumentos punzantes o de vidrio; cortaduras o rasguos, los ojos; salpicaduras de materiales infecciosos; transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos contaminados; los pulmones; inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

3.2. LINEAMIENTOS DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO

3.2.1. ORGANIZACIN EN EL LABORATORIO Las prcticas se iniciarn con la presencia del docente. Ingresarn slo l@s estudiantes que porten la indumentaria, los materiales e insumos necesarios para el desarrollo de la prctica en condiciones adecuadas de seguridad. L@s estudiantes deben haber ledo la gua de prctica y portarla en fsico al ingresar al laboratorio, si existen dudas consultar con el docente antes de iniciar la prctica. Mantener el orden y la limpieza al inicio, durante y despus del trabajo dentro de los laboratorios. Al inicio de cada prctica se designar un delegado (a) como responsable de seguridad para verificar que se cumplan las normas de este reglamento. Salir del laboratorio 10 minutos antes de la prxima clase o prctica, previendo el tiempo que utilizarn para recoger, ordenar el material y limpiar su mesa. No se permite el desarrollo de actividades diferentes a la prctica durante la estancia en el laboratorio. El informe de la prctica deber ser entregado en la siguiente semana de su realizacin antes del inicio de la siguiente prctica. El informe de prcticas se considera como un trabajo original redactado ntegramente por el estudiante, cuando se utilicen citas textuales, deber indicarse la fuente. Los informes de prcticas se desarrollarn ntegramente a mano alzada, no se aceptar trabajos digitados en computadora (salvo indicacin del docente). Todos los grficos y dibujos se desarrollarn en el acto y se concluir en la casa. Todo informe de prctica deber contener la siguiente secuencia: Introduccin, Objetivos, Hiptesis, Materiales, Mtodos, Registros, Anlisis de Resultados, Conclusiones y Bibliografa consultada. El informe es personal.

3.2.2. MATERIALES E INSTRUMENTAL DE LABORATORIO:3.2.2.1. Materiales de Vidrio Tubo de Ensayo: Se utiliza para mezclar sustancias, calentar, y ejecutar reacciones. Tubos de fermentacin Durham: Son tubos de ensayo pero de menor tamao y dimetro 50 X 6 mm, se usa colocndolo invertido dentro de un tubo de ensayo de tamao mayor, este es til para evidenciar la presencia gas producido por ciertos microorganismos que fermentan carbohidratos. Matraz de Kitasato: Es un matraz de pared gruesa con un una conexin lateral, mediante una manguera que conecta a una trompa de vaco y su funcin es filtrar sustancias pastosas y slidos de tamao pequeo. Matraz de fondo plano: Se utiliza para calentar lquidos. Matraz de fondo redondo: Se utiliza para poner volmenes exactos de solucin. Embudo de decantacin: Se utiliza para la separacin de lquidos miscibles e inmiscibles, para extraer el lquido menos denso separando del ms denso, utilizando generalmente el papel filtro. Vidrio de Reloj: Se utiliza para cubrir recipientes, pesar, transferir slidos, evaporar lquidos a temperatura ambiente. Matraz Aforado: Sirve para preparar volmenes exactos de concentraciones. Bureta: Son tubos de vidrios calibrados que suelen terminar en una llave y sirven para medir volmenes de lquidos con mayor precisin y exactitud. Caja de Petri. En ella se cultivan microorganismos, como hongos o bacterias; tambin puede usarse para seleccionar muestras de animales. Frasco gotero. Estos recipientes de vidrio son de tamaos diversos aunque por lo general tienen tamao de 24 a 50 cc y consistencia gruesa, en su tapa poseen una ranura que permite la salida del lquido contenido en el interior en forma de gotas. Con l se dosifican lquidos, como colorantes. Agitador de vidrio. Estn hechos de varilla de vidrio y se utilizan para agitar o mover sustancias, es decir, facilitan la homogenizacin. Vasos de precipitados o Beakers. Permite obtener precipitados de ellas. Se usan para preparar, disolver o calentar directamente sobre rejillas o planchas de calentamiento. Fiolas o frascos de Erlenmeyer: Este tipo de instrumento posee un cuello ms corto que aumenta de tamao hacia su base, por lo general esta graduado en diferentes volmenes, es til para la mezcla de soluciones en su interior. Placa de Petri :Este instrumento consta de dos disco de vidrio o plstico que encajan uno sobre otro ya que ambos poseen dimetros diferentes, son un instrumentos clsico para contener medios slidos, y semislidos tiles para la siembra de microorganismos. Pipetas: Son cilindros de dimetro pequeo, alargado que permiten tomar soluciones para ser vertidas en otros instrumentos de vidrio, por lo general se encuentran graduadas poseen tamaos variados y son de uso comn en todo tipo de laboratorio. Pipeta Pasteur Esta pipeta puede ser de plstico o vidrio de dimetro corto que permite contener lquidos en su interior tomados de zonas estrechas que no requieren cuantificacin. Varilla de vidrio: Es un cilindro de vidrio con extremos redondeados, con diferentes longitudes y dimetros variados, til para mezclar soluciones y medios de cultivo. Probeta. Estos cilindros poseen una base que le provee estabilidad al cuerpo del cilindro, y en su parte superior posee una depresin que permite el vaciado del contenido colocado en su interior. Este material permite medir volmenes las hay de vidrio y de plstico y de diferentes capacidades. Termmetro: Este un instrumento con una escala graduada para medir la temperatura de los medios o incubadoras de en escalas de grados Celsius o Fahrenheit, ya sea basado en mercurio liquido o electrnico con un electrodo. Campana de vidrio o Desecador: Este instrumento es un recipiente de vidrio que consta de un cuerpo y una tapa de grosor considerado que permite colocar en su interior sales higroscpicas que absorben la humedad de reactivos slidos que accidentalmente han absorbido agua; en los laboratorios de microbiologa, es til para mantener microorganismos que requirieren condiciones de microaerofilia es decir concentraciones altas de CO2 y baja presin de oxgeno. Lminas portaobjeto, Lminas portaobjeto excavada con una o dos cavidades: Son rectangulares tamaos con 75 mm de largo y 25 mm de ancho y 1mm de espesor. Algunas poseen un lugar especfico para su rotulacin. Existen otras lminas como las excavadas y graduadas entre las que destaca la llamada cmara de Neubauer. Lamina cubreobjetos. Existen de diferentes tamaos y formas cuadradas, rectangulares y redondas, las ms utilizadas son las dos primeras ente las que destaca la cuadrada con un tamao de 22 x 22 mm, y la ultima es til para preparaciones permanentes.

3.2.2.2. Otros Materiales Mechero de alcohol. Se emplea como fuente de calor cuando se requiere calentamiento lento. Al usarla debe cuidarse de que la mecha est limpia y recortada para que el calor que proporcione sea adecuado. Pisceta o frasco lavador. Es un recipiente que se utiliza para contener agua destilada, este utensilio facilita la limpieza de electrodos. Cpsula de porcelana: Sirve para calentar y evaporar lquidos, fundir cristalizar slidos. Crisol: Sirve para calcinar sustancias, fundir slidos. Mortero: Sirve para triturar, pulverizar y mezclar slidos. Esptula: Sirve para esparcir slidos y tomar nuestras de slidos. Soporte universal: Pieza bsica en el montaje de los sistemas y aparatos como pinzas y anillos de metal. Rejilla de Metal con Centro de Asbesto: Sirve para calentar indirectamente ya que la llama del mechero se concentra en el anillo. Trpode: Es el soporte de vasos de precipitado, matraces, etc. Pinza para tubo de ensayo: Se utiliza para sujetar tubos de ensayos calientes. Gradilla: Se utiliza para colocar los tubos de ensayo. Propipetas: Es un instrumento diseado para succionar lquidos mediante una bomba de vaco posee 3 vlvulas A) Permite la entrada o salida de aire en la pera o bulbo S) para tomar los lquidos y E) Para expulsar los lquidos.

3.2.2.3. Equipos del laboratorio. Bao de Mara: Es un equipo de acero inoxidable, til para calentar soluciones y medios de cultivo contenidos en recipientes, consta de un termostato para regular la temperatura y un control de nivel de agua, til para la preparacin de medios y tcnicas que requieran calor moderado. Incubadora: Es un equipo diseado con material refractario y resistente al calor y que permite mantener un calor constante que favorece el crecimiento de los microorganismos. Contador de colonias: Este equipo est provisto de una cuadricula iluminada y una lupa que facilita el contaje de las placas de Petri Gradilla: Estos andamios estructurales permiten tener y organizar a los tubos de ensayo de forma vertical adems de ser un sistema que permite moverlos, son diversos y variados ya que encontramos gradillas de madera, Metal, plstico etc. Mechero de Bunsen: Este dispositivo se conecta con la manguera de gas en su extremo inferior posee una vlvula para regular el gas. Si se ajusta correctamente la entrada de aire por medio del collar, la llama tendr un cono interior de color azul, no producir holln y tendr el poder calorfico adecuado. Hisopos: Estos aplicadores de madera con un extremo recubierto de algodn son utilizados para la toma de muestra y para la inoculacin en medios de cultivo. Asa y aguja de inoculacin: Las asas son instrumentos de platino o nquel-cromo insertado en una varilla de aluminio en un mango de ebonita o mango de (Konle) posee una rosca en su extremo inferior, si su extremo libre tiene forma de anillo recibe el nombre de asa, til para sembrar inculos en medios de cultivo, si la punta tiene forma recta se usa para sembrar por puncin en medios de cultivo en estado slido. Lupas: Las lupas son un instrumento que permite realizar aumentos de inters para observar caractersticas de ciertas colonias bacterianas o de hongos. El microscopio: Permite la observacin de los microorganismos existen diferentes tipos como el monocular, binocular, invertido, entre otros como: Microscopio ultravioleta, microscopio de fluorescencia, microscopio de campo oscuro, microscopio de contrastes de fases. La centrfuga: Es un equipo que permite la separacin de compuesto de una muestra mediante la fuerza centrfuga, algunas pueden controlar la temperatura al aumentarla o disminuirla a punto de congelacin la medida de las centrifugas se expresa en revoluciones por minuto (r.p.m.) o gravedad expresada en (g). Autoclave de Chamberland: Este instrumento es usado para la esterilizacin por presin y vapor de agua, que se genera para eliminar los microorganismos de medios de cultivo o material de vidrio. Horno: Este equipo sirve para la esterilizacin en seco por medio de temperaturas hasta de 200 C. Nevera o refrigerador: Este equipo permite conservar los medios, reactivos y muestras, mediante bajas temperaturas evitando su deterioro y mayor duracin. Campana de flujo laminar: Este equipo permite la manipulacin de muestras evitando su dispersin mediante un flujo laminar de aire dentro de esta campana ya sea de vidrio o poliestireno, en un mesn que permite la visibilidad mediante lmparas de luz visible o luz ultravioleta, con tomas de gas u elctrica que generen un ambiente para el desarrollo eficaz de trabajo en microbiologa

3.2.3. LINEAMIENTOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO:3.2.3.1. Normas de Seguridad La existencia de contaminacin en un laboratoriode biologa celular o microbiologa obliga a realizar el trabajo bajo las ms estrictas condiciones de asepsia, en completo orden,aunque los microorganismos que se manipulan en el laboratorio son por lo general no patgenos el o la estudiante debe ceirse al cumplimiento de las NORMAS DEL LABORATORIO. En primer lugar evite contacto de las, manos, cabello, ropas, o utensilios de estudio con el material procedente de los cultivos o material contaminado en el laboratorio. L@s estudiantes deben usar bata o guardapolvo BLANCO, LARGO y LIMPIO para entrar al laboratorio, adems debern usar los guantes de isonitrilo o ltex, mascarillas, gafas de seguridad y gorras segn indicaciones del docente. Es necesario una libreta o cuaderno de anotaciones, junto a otros utensilios que permitan la toma de estos datos como: lpiz, sacapuntas, borrador, bolgrafo, marcador, regla o escuadra entre otros. TOMEPRECAUCIONES para este caso y evite el prstamo de los mismos por razones de seguridad dentro del laboratorio. El laboratorio no es un lugar, para correr, jugar o empujar. No debern usar telfonos. El aseo del laboratorio es de primordial importancia, por lo que l@s estudiantes debern cooperar en el mantenimiento de la limpieza de su mesa de trabajo y del material que as lo requiera. Debern limpiar con solucin desinfectante el rea de trabajo ANTES de empezar y al TERMINAR la prctica, por ello cada equipo de trabajo deber portar obligatoriamente la solucin desinfectante antes de cada prctica. La basura debe colocarse en los recipientes correspondientes. No deber ser guardada en cajones y/o vertederos. As como no debern tirarse residuos o desperdicios a los lavabos. Deposite los residuos peligrosos biolgico-infecciosos generados durante la prctica en los recipientes adecuados y en las reas designadas al inicio del curso en cumplimiento con la normatividad vigente. Todo el material no contaminante como algodn, pipetas, envolturas, etc. deber ser depositado en los recipientes destinados para este fin. L@s estudiantes debern abstenerse de colocar sobre las mesas de trabajo cualquier material que no sea el requerido para la realizacin de la prctica (por ejemplo: ropa, bolsas de mano, libros, etc.,) Todos los objetos personales debern ser guardados en las reas designadas. En caso de romper o derramar material contaminado AVISE al personal tcnico o docente. Tome acciones de higiene como: Lavarse las manos con agua y jabn al iniciar y finalizar cada prctica (y/o antes de salir del laboratorio). Los cabellos largos deben estar RECOJIDOS sobre la nuca. No USAR joyas de ninguna especie durante la practica En el laboratorio no se debe comer, beber, masticar chicle, fumar y en general no se lleva objetos a la boca No TOCARSE los ojos, el pelo, las fosas nasales, odos, boca dentro del laboratorio. NUNCA humedezca con saliva alguna etiqueta, use agua. NO use el material de laboratorio para beber. EVITE hablar sobre el material de trabajo. Se recomienda lavar su bata ese mismo da para evitar que esta se convierta en una superficie de crecimiento de microorganismos. EVITE deambular por el laboratorio para evitar accidentes, y provocar corrientes de aire y polvo que promueven contaminaciones. Al calentar materiales, inclinar el tubo de ensayo en direccin fuera de uno y de los dems. Reducir al mnimo la formacin de aerosoles durante la realizacin de cualquier trabajo prctico. No DEVOLVER sustancias a sus envases originales. Emplear la propipeta al medir lquidos biopeligrosos. Realice solamente aquellas actividades indicadas por el docente, no llevar a cabo experimentos no autorizados. DESCARTE los cultivos en los lugares destinados para tal fin. Est terminantemente PROHIBIDO sacar material, reactivo, o equipos del laboratorio. Apagar las salidas de gas, mecheros, hornillas y de cerrar todas las llaves de agua al terminar la clase.

3.2.3.2. Cuidado de los materiales:

Cuidado del material de vidrio: Todo material de vidrio debe estar ubicado en una zona especfica y codificada, completamente limpio, para lo cual debe ser sometido a un riguroso lavado, dependiendo del caso se usar mezcla sulfocrmica o agua regia debiendo ser sometidos posteriormente a numerosos enjuagues con agua corriente y finalmente con agua destilada o bidestilada, y otros podrn ser auto clavados. Sern sometidos a temperaturas de 37- 45 C para el secado respectivo. Debe ser resistente al calor hmedo (autoclave) o al calor seco (horno), resistente a los lavados, resistente a los cidos y las bases, reaccionar como un material inerte al pH (vidrio neutro). Luego se procede a envolver para proceder a la esterilizacin y colocar un papel indicador.

Cuidado de equipos: Todo equipo o instrumental debe estar ubicado en una zona de poco trnsito, alta iluminacin y en una mesa slida. Para el manejo de los mismos se debe tener conocimiento de la manipulacin debindose contar con el manual respectivo. Antes de comenzar a operar un equipo verificar el voltaje, resistencia y amperaje del equipo. Terminado el trabajo el instrumental debe quedar limpio y apagado. Anotar en el cuaderno de control la fecha, hora de inicio y trmino de uso del equipo.

3.2.3.3. Seales de seguridad

3.2.3.4. Medidas en caso de emergencia: Derrame de material biolgico sobre el cuerpo: Remover la ropa inmediatamente. Lavar vigorosamente el rea expuesta con agua y jabn por un minuto. Reportar el incidente al docente. Buscar atencin mdica si es necesario. La ropa contaminada debe ser colocada en una solucin desinfectante antes de ser lavada. La persona que realice la operacin debe llevar puesto guantes. Para limpiar la porcin del derrame, los trozos de vidrio rotos y/o cultivo deben cubrirse con toallas de papel impregnadas en solucin desinfectante. Al cabo de diez minutos debe limpiarse empleando nuevas toallas de papel y desinfectante. El material contaminado debe ser colocado en un recipiente para material contaminado o bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse junto con los guantes utilizados. Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del prpado con abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar efectivamente el lavado, comenzando por los prpados. Reportar el incidente al docente. Buscar atencin mdica inmediatamente. Cortadas menores y heridas por pinchazo Lavar vigorosamente la herida con agua y jabn por varios minutos. Reportar el incidente al docente. Buscar atencin mdica inmediatamente. En el caso de derrames Reportar el incidente al docente. Limpiar y desinfectar inmediatamente el rea.

El xito de estas normas depende de la sinceridad, la constancia, la participacin activa y cooperativa de cada estudiante, por ello antes de asistir al laboratorio, deben leer el fundamento y las actividades a realizar, para as evitar posibles accidentes, con el conocimiento y las tcnicas de trabajo apropiadas.

4. PARTE PRCTICA

4.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Qu normas de bioseguridad deben tomarse en cuenta para realizar una prctica de reconocimiento de materiales de laboratorio?

4.2. PLANTEAMIENTO DE LA HIPTESIS -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

4.3. PROCEDIMIENTOS DE EXPLORACIN4.3.1. Trabajo en equipos Organizados en 5 grupos de trabajo dispongan en la mesa de trabajo los siguientes materiales:

Tubos de ensayo Placas de Petri Pipetas Baguetas Matraces(Erlenmeyer, Fiolas) Probetas Beaker (vasos de precipitacin) Pipetas (graduadas y volumtricas Mecheros de Bunsen y de alcohol Asas de Kolle Balanza Estufa o incubadora Hornos Autoclave PH metros Microscopio. Cintas masking tape Plumones marcadores

Considerando las normas e indicaciones de la parte terica de la presente gua, dispongan los materiales de la mejor manera para poder disear una prctica simulada utilizando la mayora de los materiales. Desarrollen la prctica diseada respetando las indicaciones de esta gua. Consultar cualquier duda con el docente.

4.3.2. Trabajo individual Realiza las anotaciones necesarias respecto a: Material utilizado con su grfico: Usos del material. Medidas de seguridad para su uso. Medidas de bioseguridad consideradas durante la simulacin de la prctica.

5. REFLEXINEn qu casos se puede ser flexible con el respeto y cumplimiento de las normas de bioseguridad y uso de materiales y equipos de laboratorio? Sustenta tu respuesta.

6. APLICACINAverigua qu medidas de prevencin y qu procedimientos se deben seguir para realizar una prctica de laboratorio donde se observe las clulas del epitelio bucal humano.

7. REFERENCIAS Asociacin Universidad Privada San Juan Bautista Facultad de Ciencias de la Salud Escuela profesional de medicina humana Semestre (2013) Gua de prctica de Biologia Celular y Molecular

Franco Navia, Jos (2010). Gua de Prcticas. Facultad De Ciencias De La Salud Carrera Profesional de Estomatologa Universidad Andina de Cusco. Recuperado el 03 de abril del 2014 desde: www.http://biologiageneralestomatologia

Organizacin Mundial de la Salud (2005) Manual de Bioseguridad en el Laboratorio (3a. Ed.) Recuperado el 03 de abril del 2014, desde: http://www.fcm.uncu.edu.ar/joomla/downloads/OMS.pdf

Lic. Yesenia Zorrilla Gutarra 2014 - I