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Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. Blgo.M.Sc., Rafael La Rosa, Blgo.Mag.
Universidad Nacional Mayor de San Marcos(Universidad del Perú, Decana de América)
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASDEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BOTÁNICA
Laboratorio de Fisiología Vegetal
GUÍA DE PRÁCTICAS DELCURSO
FISIOLOGIA VEGETAL
AUTOR:
Mery L. Suni Ninataype, Blga. Mág.
Rafael La Rosa Loli, Blgo. Mág.
SEMESTRE 2013-I
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Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. Blgo.M.Sc., Rafael La Rosa, Blgo.Mag.
CONTENIDO
PRÁCTICA TEMA PÁG.
Práctica 1. Absorción de microelementos
Práctica 2. Potencial hídrico foliar
Práctica 3. Densidad de estomas y estado hídrico foliar
Práctica 4.Medición de la tasa de fotosíntesis (Uso del IRGA)
Evaluación en campo
Práctica 5. Contenido de clorofila en la hoja
Práctica 6.Evaluación de la maduración de los órganos
reproductivos
Práctica 7.Interacción de ABA y AG3 en la germinación de semillas.
Instalación
Práctica 8. Embriogénesis somática en zanahoria. Instalación
Práctica 9. Inducción de raíces
Práctica 10.Calidad de la luz y la regulación de la germinación.
Instalación
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PRÁCTICA 1. ABSORCIÓN DE MICROELEMENTOS
INTRODUCCIÓN.-
El desarrollo y el crecimiento óptimo de la planta dependen de la presencia en
la cantidad necesaria de los elementos minerales esenciales. Por lo tanto el
aporte insuficiente o en exceso de un elemento dará lugar a síntomas muchas
veces apreciable a simple vista. Por otra parte, se conoce que Limnobium
laevigatum, planta acuática perenne con hojas simples, cuando es mantenida
en condiciones adecuadas, posee una rápida multiplicación incrementando su
biomasa en pocos días. Estas características además de su fácil manejo hacen
de Limnobium laevigatum un material ideal para la evaluación de síntomas de
deficiencia y toxicidad. Además dado que es posible encontrar ambientes con
contenido de minerales alto pudiendo las plantas de dichos lugares mostrar
sensibilidad o tolerancia en la presente práctica se desea evaluar la respuesta
de Limnobium laevigatum a condiciones de niveles altos de cobre.
OBJETIVO.-
Evaluar el efecto de niveles altos de cobre en el crecimiento de Limnobium
laevigatum
MATERIAL.-
Soluciones hidropónicas
1 balde de 4L para las soluciones conteniendo 0,1 y 10 ppm de sulfato de Cu
6 recipientes de plástico de 500 mL
Balanza, pHmetro y conductímetro
Pipeta 10 mL
Probeta 1000 mL
Buffer de calibración para pHmetro de 7 y 10
Placas petri
Plantas de Limnobium laevigatum por cada recipiente plástico
Kit para la cuantificación de cobre
4 baterías SP357/1.55 V para pHmetro y conductímetro
Papel toalla
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MÉTODO.-
En el presente experimento se evaluará un factor, la concentración de cobre y
se tendrá 2 tratamientos, uno con nivel alto y otro con nivel óptimo de cobre,
ambos con niveles óptimos de los demás elementos. Tendrán 3 repeticiones
cada tratamiento (Tabla 2.1).
1. Preparación de las Soluciones:
Preparar un volumen suficiente de las soluciones a fin de tener 3
repeticiones de cada tratamiento, diluyendo las soluciones como se le
indique. Se usará el agua de caño como disolvente. Añadir sulfato de cobre
al tratamiento correspondiente en cantidad q brinde los ppm de Cu a evaluar.
2. Instalación del experimento:
Vaciar 0.8 L de solución a cada reciente plástico, según tratamiento de Cu.
Rotularlos indicando tratamiento, repetición y fecha de instalación. Añadir
una cantidad (tres individuos de Limnobium laevigatum) a cada recipiente,
registrar sus pesos
3. Mantenimiento:
Tanto al inicio como al término del experimento retirar un volumen apropiado
de la solución y determinar la cantidad de cobre presente en cada
tratamiento. Igualmente evaluar el pH y conductividad eléctrica (c.e.) al inicio
y término del experimento. Realizar los ajustes de pH en caso necesario.
Mantener el pH en 6,5 o menos y la c.e. en valores menores de 3. Registre
sus datos en una ficha.
4. Evaluación:
Registre los pesos de la muestra de Limnobium laevigatum al inicio y
término del experimento en la Ficha de registro. Evalúe el color, número de
hojas, senescencia de las hojitas y longitud de sus raíces
RESULTADO.-
1. Presente la Ficha de registro de datos y una Tabla con los promedios de
los datos, organizados.
2. Analizar estadísticamente sus resultados y graficar los promedios
mediante barras o líneas donde se pueda observar las diferencias
estadísticas entre los tratamientos.
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TABLA 2.1. Tratamientos a aplicar y valores de concentración de Cu
presentes en las soluciones tratamiento según el kit
FICHA DE REGISTRO DE DATOS. Evalúe al inicio y término de su
experimento las variables abajo indicadas. Registre sus datos.
0,1 ppm Cu 3,5 ppm CuTiempo To
Repetición Long raíz Pf
Nº frondas verdes,
senescentes o cloróticas Long raíz Pf
Nº frondas verdes,
senescentes o cloróticas
1
2
3 Promedio
Tiempo T1
1
2
3 Promedio
Tratamiento Cu (ppm)
Calculado
(ppm)
Concent.
inicial
(kit)
Concent.
final
(kit)
Cobre alto 10,0
Cobre óptimo 0,1
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PRÁCTICA 2. DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL HÍDRICO FOLIAR
INTRODUCCIÓN.-
Las plantas desempeñan un papel importante en el movimiento del agua en la
naturaleza y son el eslabón intermedio en el flujo del agua desde el suelo a la
atmósfera.
El cuerpo de las plantas está constituido, al menos, por un 70% de agua. Para
que un vegetal esté fisiológicamente activo precisa, entre otras condiciones, de
un balance hídrico favorable. La tendencia del agua a ser retenida por un
vegetal es la propiedad más importante para conocer los movimientos del agua
en el sistema suelo-planta/atmósfera.
El agua siempre se moverá, de manera pasiva hacia los lugares del sistema,
en donde el potencial hídrico (Ψ) sea más bajo, y sus unidades son el
megapascal (Mpa), el bar o la atmósfera. Por otro lado, el estado hídrico de la
planta influye fuertemente en su crecimiento y en la producción de biomasa.
Inclusive la tasa de fotosíntesis declinará bajo estrés hídrico debido al cierre de
los estomas.
OBJETIVO.-
Determinar el potencial hídrico foliar en plantas sometidas a condiciones de
déficit hídrico.
MATERIALES.-
Tubos con tapa
Sacabocados
48 Placas petri
10 Frascos Erlenmeyer
Soluciones de sacarosa 0.8m
10 Pipetas 10 mL
Balanza analítica y estufa
Área de cultivo
Por cada grupo de trabajo:
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Ramas de una especie vegetal con diferente condición hídrica
(sometidas a déficit hídrico y otras con riego). Este material será
colectado con el (la) profesor(a)
Pinzas de punta fina
1L agua destilada a entregar un día anterior a la práctica
Papel absorbente (toalla de papel)
Etiquetas pequeñas o marcador de tinta indeleble
MÉTODO.-
Determinación del Potencial Hídrico Foliar por el Método Gravimétrico
El potencial hídrico de un tejido vegetal mediante el método del volumen
constante o método gravimétrico, se fundamenta en la variación del peso de un
tejido vegetal debido al flujo de agua.
a) Rotular y preparar en 5 frascos Erlenmeyer, soluciones de sacarosa con
las siguientes concentraciones de 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 y 0.8 molal a partir
de la solución 0.8m. Determinar el volumen a preparar considerando el
número de repeticiones y grupos de trabajo más un pequeño excedente.
b) Con la ayuda de una pipeta retirar 10 ml de sacarosa, de cada
concentración, y verterlo a cada placa petri previamente rotulada.
c) Luego con la ayuda de un sacabocado obtener 25 discos foliares por
cada condición hídrica, y los ponemos en un frasco con tapa, con la
finalidad de evitar la deshidratación de los mismos.
d) Pesar 5 discos de cada condición hídrica para cada concentración de
solución de sacarosa. Estos valores corresponden al peso inicial de
muestra (Po).
e) Introducir los cinco discos, de cada condición hídrica, a cada placa petri
con la concentración de sacarosa correspondiente.
f) Trascurridos 15 minutos, de cada placa petri sacar con una pinza los
discos, secarlos con papel toalla y pesar los discos (P15).
g) En seguida devolver los discos a las placas petri. Repetir este proceso
con cada uno de las placas con las concentraciones restantes, siguiendo
el mismo orden.
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h) A los 45 minutos repetir este proceso, anotando los pesos y estos serán
(P45).
Dado que las soluciones están a presión atmosférica el potencial de presión
(Ψp) =0. Por lo que el potencial hídrico (Ψ) de la solución depende del potencial
osmótico (Ψs).
El potencial osmótico se calcula a partir de la ecuación de Van Hoff.
Ψs=miRT
m= molalidad
i= constante de ionización del soluto (para sacarosa=1)
R= constante de los gases (0.00831 kg Mpa/`oK mol);
T= temperatura absoluta (oK)= oC+ 273
RESULTADO.-
1. Registre sus datos en una tabla y determine en qué concentración de
sacarosa no ocurre cambio de peso del tejido foliar (Ψh).
2. Grafique el porcentaje de cambio de peso inducido por el potencial de
soluto de las soluciones de sacarosa versus su potencial osmótico.
3. Determine el contenido de hídrico de las hojas según la condición de
estrés y explique.
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Ficha de registro de datos. Determinación del potencial hídrico foliar
Sacarosa
(m)
Repeti
ción
Ψs
(Mpa)
P0 (g) P15 (g) P45(g) ∆(P45 - P0) % Cambio
c/Est s/Est c/Est s/Est c/Est s/Est c/Est s/Est c/Est s/Est
0.4
1
2
3
4
5
Prom.
0.5
1
2
3
4
5
Prom.
0.6
1
2
3
4
5
Prom.
0.7
1
2
3
4
5
Prom.
0.8
1
2
3
4
5
Prom.
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PRÁCTICA 3. DENSIDAD DE ESTOMAS Y ESTADO HÍDRICO FOLIAR
INTRODUCCIÓN.-
La epidermis posee estomas usualmente más numerosos en el lado abaxial de
la hoja. La epidermis está usualmente cubierta por una capa denominada
cutícula. Esta previene de una excesiva pérdida de agua por transpiración. En
otras plantas, sin embargo, las hojas pueden estar reducidas o aun estar
ausente, como en las xerofitas. Las plantas en sí regulan el intercambio de
gases a través de sus estomas permitiendo el control de las relaciones hídricas
y la asimilación del carbono. Por lo tanto la apertura del estoma refleja un
compromiso entre el requerimiento fotosintético de CO2 y la disponibilidad de
agua.
La cantidad de agua en el vegetal puede ser expresado de diversas maneras.
Todas consideran la medida del peso fresco al momento del muestreo (Pf), el
peso seco (Ps, usualmente a 80°C) y el peso túrgido (Pt) de la muestra. Esta
última medición se obtiene al flotar hojas o secciones de hojas en agua en
condiciones de punto de compensación de la luz hasta que se alcance el peso
constante.
OBJETIVO.-
Comparar la densidad, apertura de los estomas (en el haz y envés) y estado
hídrico de las hojas de una especie vegetal, sometida a dos condiciones de
humedad del suelo.
MATERIAL.-
Ramas foliares de especies sometidas a estrés hídrico y otra a riego normal.
Portaobjetos y cubreobjetos
Goteros, pinza, estilete
Hoja de afeitar y papel lente, esmalte de uñas
Tubos con tapa
Sacabocados
18 Placas Petri
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06 Pipetas 10 mL
Balanza analítica
Etiquetas para rotulación
Área de incubación
MÉTODO.-
1. Densidad y apertura de los estomas
Sin mover a la hoja de su posición original, aplicar con la ayuda del pincel,
una o dos capas de esmalte en la superficie superior e inferior de una hoja
madura. Permitir que seque. Luego con la ayuda de una pinza de punta
fina, levantar desde un extremo la película que se ha formado y preparar
una lámina para su observación con el microscopio. Reconozca las células
epidérmicas y las de guardia. A 400X contabilice el número de estomas
que observa y expréselo como densidad de estomas (n°estomas/mm2) o
índice estomático [(n°estomas/n°células epidérmicas + n°estomas) * 100].
Asimismo contabilice el número de estomas abiertos y cerrados presentes
en la muestra observada.
2. Contenido relativo de agua
Obtener 5 discos de las hojas de cada condición hídrica con la ayuda del
sacabocados y colocarlos en los tubos con tapa. Pesarlos inmediatamente
(Pf). Colocar los discos en las placas con agua destilada a 20°C por 3
horas en su punto de compensación de la luz. Cumplido el tiempo secar
cuidadosamente entre hojas de papel absorbente y volver a pesar (Pt).
Secar las muestras en la estufa a 70°C hasta peso constante (Ps).
Determine el contenido de agua, contenido relativo de agua, déficit de
saturación de agua, relación peso túrgido-peso seco para los discos según
el tratamiento, en base a las siguientes fórmulas:
Contenido de agua = ((Pf – Ps)/Ps) *100
Contenido relativo de agua (R*) = ((Pf – Ps)/ (Pt – Ps)) * 100
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Déficit de saturación de agua = 100 – R*
Relación peso túrgido- peso seco = Pt/Ps
RESULTADO.-
Esquematice sus observaciones (o edite sus fotografías) indicando el aumento
de la imagen y las características de las estructuras observadas.
Relacione los resultados obtenidos con la especie y el momento de colecta.
Ficha de registro de datos.- Determinación del estado hídrico foliar (una repetición
por cada subgrupo de trabajo)
Repetición Pf Ps Pt Déf sat Pt/Ps Apert
estoma
c/Est
1
2
3
s/Est
1
2
3
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PRÁCTICA 4. MEDICIÓN DE LA TASA DE FOTOSÍNTESIS
INTRODUCCIÓN.-
El crecimiento de un vegetal es explicado en última instancia por la Tasa
Fotosintética (o Fotosíntesis Neta) que se expresa como la cantidad de CO2
que fija la planta por unidad de área foliar y de tiempo, y se define como la
cantidad neta de carbono (descontando la respiración) que se incorpora al
vegetal en un momento dado, esto es:
Fotosíntesis neta = fotosíntesis - respiración - fotorrespiración
El dióxido de carbono atmosférico difunde a los espacios intercelulares de la
hoja a través de los estomas, mientras estos están abiertos, igualmente el
vapor de agua puede difundir fácilmente de los tejidos vegetales internos que
se encuentran turgentes hacia el exterior (transpiración). El Analizador de
Gases Infrarrojo (IRGA) permite la medición de ambos. Se basa en la
propiedad de ambos gases de absorber luz infrarroja de manera proporcional a
su concentración. Debido a que ambos gases presentan picos de absorción en
el espectro infrarrojo en zonas próximas o solapadas, el equipo incorpora filtros
específicos al evaluar las concentraciones de cada uno. La cuantificación
considera un gas de referencia de concentración conocida.
Los componentes básicos del IRGA son: la cámara foliar y una consola con
teclado, pantalla y memoria (figura 1). Los "sistemas abiertos" modernos de
fotosíntesis también incorporan un cilindro de gas comprimido pequeño y
tuberías de suministro de gas. Esto es porque el aire exterior tiene
fluctuaciones naturales en el contenido de CO2 y vapor de agua, lo que puede
introducir “ruido” de medición. Los modernos "sistemas abiertos" de fotosíntesis
eliminan el CO2 y el vapor de agua por el paso a través de cal sodada (soda
lime) y Silica Gel o Drierite, luego añade CO2 a una velocidad controlada para
obtener una concentración estable de CO2, de tal manera que cuantifica la
diferencia de concentraciones en CO2 y vapor de agua en el aire entre la
entrada y salida de la cámara.
Algunos sistemas cuentan con control de temperatura y una unidad extraíble de
luz, por lo que también se puede medir el efecto de estas variables
ambientales. La consola puede tener una ranura para tarjetas PC. Los datos
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almacenados pueden verse en la pantalla LCD, o enviados a un PC. Algunos
sistemas de fotosíntesis permiten la comunicación por internet usando
protocolos estándar de comunicación de internet.
El IRGA contiene en la cámara foliar (figura 2) una fuente de radiación infrarroja
de bajo voltaje que usualmente es una espiral de aleación níquel-cromo o
tungsteno que se calienta a aproximadamente a 800 ºC; (2) una celda de
análisis de gas con una entrada y una salida de gases a través de la cual pasa
el haz de radiación infrarroja, y (3) un detector de radiación infraroja de estado
sólido hace pasar el flujo que atravesó la cámara con la muestra y el flujo de
referencia alternadamente a través de la celda de análisis por períodos de 2
segundos cada uno. La radiación infrarroja que atraviesa la celda es filtrada
siendo finalmente la señal incrementada y almacenada. Una bomba interna en
el instrumento hace pasar el flujo que atravesó la cámara con la muestra y el
flujo de referencia alternadamente a través de la celda de análisis por períodos
de 2 segundos cada uno. Posteriormente es comparada con la señal recibida
en ciclos posteriores y en función de las diferencias entre muestra y referencias
se calculan las variables de interés.
Modernos sistemas fotosintéticos también pueden ser diseñados para medir la
temperatura de las hojas, temperatura de aire de la cámara, PAR (radiación
fotosintéticamente activa), y presión atmosférica. Estos sistemas pueden
calcular la eficiencia del uso del agua (A/E), la conductancia estomática (gs),
eficiencia de uso de agua intrínseca (A / gs) y concentración de CO2 sub-
estomática (IC). Temperaturas de la Cámara y hoja son medidas con un sensor
termistor. Algunos sistemas también están diseñados para controlar las
condiciones ambientales.
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Figura 1 Sistema Portátil de medición de fotosíntesis. Marca Li-cor, modelo Li-
6400XT-R
Figura 2. Esquema básico mostrando las diferentes partes de la cámara foliar
en un sistema IRGA modelo Li-6400XT-R y la trayectoria del haz de radiación
infrarroja dentro del sistema.
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Consola con pantalla, teclado y memoria
Cámara foliar
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OBJETIVO.-
Determinar la tasa fotosintética foliar de varias especies, herbáceas, arbustivas o
arbóreas en el periodo de máxima radiación.
MATERIAL.-
especies, herbáceas, arbustivas o arbóreas presentes en la C.U.
Analizador de Gases Infrarrojo (IRGA) marca Li-Cor modelo modelo Li-
6400XT-R
PROCEDIMIENTO.-
1. Se transporta el IRGA a campo (con sumo cuidado)
2. Elegir la especie a evaluar
3. Determinar la hoja a ser evaluada. Se recomienda que sea la primera
hoja adulta más próxima al ápice.
4. Colocar la cámara foliar cuidadosamente de tal manera que encierre la
hoja a ser medida manteniendo su posición original. Registrar el valor
de la tasa de fotosíntesis.
5. En caso de haber estado en otra posición, colocarlo en posición
perpendicular a la incidencia de la radiación solar y registrar el valor de
la tasa. Registre los datos que muestra la Pantalla de cristal líquido en la
consola.
6. En el laboratorio, en caso de haber almacenado la información en la
memoria del equipo, descargar la información y se procede a analizarla
RESULTADOS.-
Llene la ficha que se adjunta. Realice un gráfico que compare la tasa de
fotosíntesis y otras variables evaluadas para las especies estudiadas.
CONCLUSIONES
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Considerando los resultados obtenidos y la bibliografía existente, justifique los
resultados obtenidos.
Referencias.-
María Elena Fernández, Javier E. Gyenge. 2010.Técnicas en medición en
ecofisiología vegetal: conceptos y procedimientos / editores – Buenos Aires :
Ediciones INTA, 2010.140 p.
Ficha de evaluación
Especies
Fotosíntesis
neta (μmol m-2 s-1)
Concentració
n de H2O
(mmol mol-1)
Conductanci
a estomática
PAR
Especie 1
Especie 2
Especie 3
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PRÁCTICA 6. MADURACIÓN DE LOS ÓRGANOS REPRODUCTIVOS
INTRODUCCIÓN.-
El éxito del mejoramiento genético y de los trabajos de polinización está
relacionado con el momento y la duración de la receptividad del estigma y la
viabilidad de los granos de polen. Además estos estudios pueden permitir
conocer si una especie presenta esterilidad, homogamia o dicogamia (si es
protandra o proterogina). De modo que en la presente práctica se desea
evaluar la receptividad del estigma y relacionarlo con el momento de la
apertura natural de la antera en diferentes etapas del desarrollo floral.
OBJETIVO.-
Evaluar la variación de la maduración de los órganos reproductivos
(receptividad de estigma y liberación de polen) desde la antesis hasta el inicio
de senescencia floral
MATERIAL.-
Material biológico: flores en diferentes etapas de desarrollo de Aloe sp, u otra
especie vegetal
Equipos de laboratorio:
Microscopio estereoscópico
Materiales:
H2O2
Debe traer el estudiante: Regla (flexible de preferencia), ficha de registro de
datos, lápiz, papel toalla.
Portaobjeto, cubreobjetos, pinzas, estiletes, gotero,
METODO.-
Evaluación de la dehiscencia de la antera y receptividad del estigma:
a. Colectar flores en cada etapa básica de desarrollo: yema, flor y
flor senescente, de 3 a 5 de cada etapa.
b. Obtener los datos de las columnas 2 y 3 de la Ficha de Registro
de Datos. Realizar las mediciones bajo el microscopio estereoscópico si
fuera necesario.
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c. Identificar en qué etapa ocurre el inicio y término de la apertura
natural de las anteras y registrar sus datos en la Ficha (columna 4)
d. Determinar la receptividad del estigma aplicando sobre su
superficie H2O2. Asociar la intensidad del burbujeo con el grado de
receptividad del estigma. Realizar la prueba a los pistilos de las diferentes
etapas encontradas a fin de caracterizar cada etapa.
RESULTADO.-
Registre sus datos en la ficha que se adjunta. Prepare una tabla con el
promedio obtenido para las variables evaluadas en cada etapa de desarrollo.
Grafique “dispersando” todos sus datos de cada variable e identificando con un
color diferente cada etapa de desarrollo en función del tiempo
Ficha de Registro de Datos
Estadío y repetición (ej Y1, F1 y S1)
long de filamento / long de antera
long de pistilo / long de ovario
Dehiscencia de la antera b
Receptividad del estigma a
a = registrar si el burbujeo es leve, moderado o abundanteb = indicar si la dehiscencia es inicial, parcial o total
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