PRACTICA N 03

NUMERACION DE COLIFORMES, DETERMINACION DEL NMERO MS PROBABLE

I. INTRODUCCION:Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir,homeotermos, pero tambin ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente ensuelos,semillasyvegetales.Loscoliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por lashecesde humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayora de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.

II. OBJETIVOS:

Encontrar la mayor cantidad de numeracin ms probable de coliformes. Determinar la calidad de limpieza de aguas residuales.

III. FUNDAMENTO TEORICO:

La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h.La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de esta frente a una contaminacin reciente.

COLIFORMES:No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminacin. Se distinguen, por lo tanto, loscoliformes totales que comprende la totalidad del grupo y loscoliformes fecales aquellos de origen intestinal.Desde el punto de vista de lasalud pblicaesta diferenciacin es importante puesto que permite asegurar con alto grado de certeza que la contaminacin que presenta el agua es de origen fecal.Las bacterias coliformes fecales forman parte del total del grupo coliforme. Son definidas como bacilos gram-negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a 44.5C +/- 0.2C dentro de las 24 +/- 2 horas. La mayor especie en el grupo de coliforme fecal es el Escherichia coli.La presencia de coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en descomposicin. Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo.

La denominacin genricacoliformesdesigna a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como indicadoresdecontaminacindel agua y los alimentos.

LOS NIVELES RECOMENDADOS DE BACTERIAS COLIFORMES FECALES SON: Agua potable: menos de 0 colonias por 100 ml de la muestra de agua. Natacin: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra de agua.

BACTERIAS COLIFORMESTERMOTOLERANTES:Las bacterias del grupo de los coliformes totales que son capaces de fermentar lactosa a 44-45C se conocen como coliformestermotolerantes. En la mayora de las aguas, el gnero predominante es Escherichia, pero algunos tipos de bacterias de los gneros Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter tambin son termotolerantes. Escherichiacoli se puede distinguir de los dems coliformestermotolerantes por su capacidad para producirindola partir detriptfanoo por la produccin de la enzima -glucuronidasa. E. coli est presente en concentraciones muy grandes en las heces humanas y animales, y raramente se encuentra en ausencia de contaminacin fecal, aunque hay indicios de que puede crecer en suelos tropicales. Entre las especies de coliformes termotolerantes, adems de E. coli, puede haber microorganismos ambientales.

Coliformes e Higiene de alimentos: En la higiene de alimentos los coliformes no se consideran indicadores de contaminacin fecal sino solamente indicadores de calidad. Loscoliformes totalesse usan para evaluar la calidad de la leche pasteurizada, leche en polvo, helados, pastas frescas, frmulas para lactantes, fideos ycereales para el desayuno.Loscoliformes fecalesse usan para evaluar los mariscos frescos. Por ltimo, laE. colise usa como indicador en quesos frescos, quesillos, cereales, masas con relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas.

COLIFORME Y AGUAS SERVIDAS:La prueba de coliformes totales y fecales tambin se utiliza para determinar la calidad bacteriolgica de los efluentes de los sistemas de tratamiento deaguas servidas.Coliformes totales y coliformes fecales:No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminacin. Se distinguen, por lo tanto, loscoliformes totalesque comprende la totalidad del grupo y los coliformes fecales aquellos de origen intestinal.Desde el punto de vista de lasalud pblicaesta diferenciacin es importante puesto que permite asegurar con alto grado de certeza que la contaminacin que presenta el agua es de origen fecal.Coliformes fecales: Las bacterias coliformes fecales forman parte del total del grupo coliforme. Son definidas como bacilos gram-negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a 44.5C +/- 0.2C dentro de las 24 +/- 2 horas. La mayor especie en el grupo de coliforme fecal es el Escherichia coli.E. coli: El aislamiento de esta bacteria en el agua da alto grado de certeza de contaminacin de origen fecal, alrededor del 99%. No es absoluta porque se han aislado cepas deE. colique no tienen origen fecal, pero es un grado de certeza ms que razonable para certificar contaminacin con ese origen. Sin embargo, el aislamiento de estemicroorganismono permite distinguir si la contaminacin proviene de excretas humana o animal, lo cual puede ser importante, puesto que la contaminacin que se desea habitualmente controlar es la de origen humano. Esto no significa menospreciar la de origen animal, especialmente dada la existencia dezoonosis, enfermedades que son comunes al hombre y animales, que tambin se pueden transmitir por el agua.

COLIFORMES E HIGIENE DE ALIMENTOS:En la higiene de alimentos los coliformes no se consideran indicadores de contaminacin fecal sino solamente indicadores de calidad. Loscoliformes totalesse usan para evaluar la calidad de la leche pasteurizada, leche en polvo, helados, pastas frescas, frmulas para lactantes, fideos ycereales para el desayuno. Loscoliformes fecalesse usan para evaluar los mariscos frescos.Por ltimo, laE. colise usa como indicador en quesos frescos, quesillos, cereales, masas con relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas.

1. CALDO BRILA VERDE: Es de color verde brillante COMPOSICION: Peptona.... 10 g. Lactosa.10 g. Bilis de buey....20 g. Verde brillante.....0,0133 g. Agua destilada.. 1.000 ml. pH a 7,4

2. AGAR BILIADO-ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA (VIOLET RED BILE AGAR: VRBA). Extracto de levadura ..3g. Peptona.7g. Cloruro sdico..5g. Sales biliares..10g. Lactosa..5g. Rojo neutro..0.03g. Cristal violeta...0.02g. Agar..15g. Agua destilada ...1000g. pH a 7,4

IV. MATERIALES Y EQUIPOS:

Matraz, cocina, tubos de ensayo, pipetas, caldo brila (verde), incubadora.

Incubadora a 37C, pipetas bactereologicas de 1ml, aguja de inoculacin con alambre de nicron,

V. PROCEDIMIENTO:

Se prepara la muestra y se base a los tubos de 10-2 a 10-8.luego se baja 1ml por cada tubo para realizar el proceso.

Moler la muestra(carne),+ agua peptonadabasear en el matraz.

Filtrar trabajar con la muestra.

NMERO MS PROBABLE (NMP) DE BACTERIAS: TRES TUBOS DE CADA DILUCIN NMERO DE TUBOS POSITIVOS EN CADA NIVEL DE DILUCIN LMITE DE CONFIANZA

a) Calculado a partir de los datos de Man (1975)b) En cada nivel de dilucin, inocular i ml en cada uno de tres tubos de medio.Para calcular el NMP de las diluciones mayores que las que sealan, multiplicar el NMP por el factor de dilucin apropiado de 10, 100, 1000, etc. Por ejemplo, si se han seleccionado tubos provenientes de las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, multiplicar por 10, si las diluciones 10-3, 10-4, 10-5 multiplicar por 100.

VI. RESULTADOS:

NEGATIVO:Color verde botella , translucido, no hay gas en la campana

POSITIVO:Color verde olivo, opaco o turbio, si hay presencia de gas en la campana.

Los tres tubos de 10-1 muestran produccin de gas, ningn tubo de 10-2 muestra algn gas y un tubo de la 10-3, donde se observa que la campana de Durganesta flotando por el gas (CO2). Segn el nmero ms probable el resultado es: 301 multiplicando por 10 (ya que son de las diluciones 10-1,10-2 y 10-3) lo que significa que hay ms de 301 de coliformes por gramo de lechuga. El cual nos indica que hay muy poca contaminacin por microorganismos en el producto analizado (carne de supermercado).

VII. RECOMENDACIONES:

Tener buena limpieza en los baos especialmente ya que estos se dispersen rpidamente, produciendo diarrea, es la bacteria con la que constantemente estamos tratando en todo sentido. Esterilizar el ambiente. Es recomendable trabajar con 3 muestras consecutivas y con esos valores se encuentra el resultado. Se necesario trabajar con MERCK es mas HOMOGENEA en caldo caldobrila.

VIII. CONCLUCIONES:

Cuando hablamos de coliformes totales nos referimos a casi todas su familia como lactosa positivo se le denomina con el nombre de coliforme, Estas bacterias se elimina con tratamiento trmico a 60 65C aunque es miy bajo y se puede aumentar la temperatura. Cuando hablamos coliformes totales estamos respondiendo si hubo tratamiento trmico, buena limpieza, si alcanzaron la T adecuada o esterilizacin del ambiente. Coliforme lactosa positiva ocurre fermentacin y se obtiene CO2 es decir el medio de cultivo esta dentro va a salir en forma de gases quiere decir que la reaccin es positiva y si no ocurre nada la reaccin es negativa. Para trabajar con el echeria coli en un producto terminado o INDUSTRIAL solo tendramos que trabajar con los positivos y el que tenga mayor presencia de gas.

IX. BIBLIOGRAFIA:

P. Anderson / V. Caldern - Microbiologa alimentara - Metodologa analtica para alimentos y bebidas - Editorial Daz santos S.A. (Espaa) 1999 Manual de medios de cultivo Merck http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/GUIA.htm