PRACTICA DE LABORATORIO

TECNICA DE TINCION GRAM

I ) INTRODUCCIÓN:

La tinción de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología para la visualización de las bacterias, debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram que desarrolló un método de tinción en 1884.

Por mas de una centuria las bacterias han sido clasificadas a la reacción de Gram, la habilidad de retener un complejo de iodo violeta cuando se trata con con un solvente orgánico tal como el alcohol o la acetona , las bacterias Gram positivas retienen la tintura y aparecen de color violeta, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener y se tiñen de color rojo para ser vistas con el microscopio

En esta práctica de microbiología se va a realizar la técnica de Tinción Gram para poder examinar las células bacterianas que se encuentran en el yogurt determinar al tipo al que pertenecen.

II) OBJETIVO:

1. Emplear técnicas bacteriológicas simples.2. Conocer el fundamento estructural de la Tinción de Gram.3. Utilizar colorantes y comprender su utilización.4. Utilizar el microscopio con el objetivo de inmersión.5. Observar células procariotas

Lograr el óptimo procedimiento para poder aprender la técnica de Tinción Gram de todos los integrantes del grupo y comprender la importancia y la diferencia entra las estructuras de las diferentes bacterias .

IV) MATERIALES Y METODOS

INSTRUMENTOS03 Portaobjetos Goteros,Pipetas,Mechero,Microscopio con lente de inmersión.

REACTIVOSagua destilada.Cristal violeta, Gotas de Yogurt

Solución de LugolAlcohol 95ºSolución Fucsina o Safranina para contrateñir

V) DESARROLLO DE LA PRACTICA

PROCEDIMIENTO:

SIEMBRA: Preparar un porta bien limpio y Coger una porción pequeña de yogur con un palillo o una aguja enmangada y hacer una extensión sobre el porta.

o

FROTIS: Se fijo las células de ida y vuelta – hasta que se desagrego - hasta la mitad del portaobjetos.

FIJACIÓN: con esto evitamos que cualquier sustancia infecte nuestra muestra y luego, que nuestra muestra permanezca en el porta objeto (Se fijo por calor – a mechero

TÉCNICA DE TINCIÓN: Sobre el frotis fijado se vertió la solución de violeta y se deje en reposo 1 minuto siempre que colocamos un colorante o mordiente es recomendable deshacerse de los excesos de líquido ya que pueden interferir cuando apliquemos otra sustancia. Cubrir con lugol durante 3´. El Lugol actúa como "mordiente", vale decir, cristaliza la solucion Violeta de Genciana formando un complejo insoluble en H2O pero soluble en alcohol-acetona.El Lugol forma un complejo cristal violeta-iodo). Si hay excedente se lava. En este caso hubo exceso

DECOLORACIÓN con alcohol al 95 % durante 1 min moviendo el portaobjetos en ambos lados o a cada extremo, hasta que desaparezcan los chorros gris violáceos del colorante. Después lave con agua. . Este paso es fundamental porque en el reside la respuesta diferencial de las Gram + y las Gram –. Sabemos que el alcohol deshidrata y contrae las células por contacto. Sabemos también que los poros de las Gram + son mas pequeños que los de las Gram -Entonces, la solución alcohol, contrae los poros de las bacterias cerrando completamente los de las Gram + y parcialmente los de las Gram -. El resultado es que dicha solución ingresa en estas últimas decolorándolas. Hasta aquí tenemos las Gram + violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas.

CONTRATINCIÓN: Sobre el frotis se echo 2 gotas de Safranina básica es parcialmente soluble en H2O e ingresará sólo en las Gram - ya que las otras continúan cerradas por efecto del alcohol-acetona. La safranina Básicamente interactúa con la membrana celular y forma un complejo insoluble en H2O. para realizar la contra tinción y realizar frotis. Al cabo de 1 ó 2 minutos se vierte el colorante, el preparado se lava con agua si es que hay exceso, y se deja secar.

ELIMINAR EL EXCESO y lavar con H2O para eliminar restos de colorante. Si bien los colorantes ahora son insolubles en agua (recordemos que el Violeta de Genciana fue “fijado” con lugol), el agua actúa lavando el exceso de arriba del portaobjetos por arrastre. La explicación más simple de esto es usando la analogía

de la mancha de aceite en la vereda: si quisiéramos limpiarla usando agua vamos a notar que es imposible disolver el aceite pero si uso una manguera a presión puedo “empujar” la mancha a otro sector. Esto es lo que hacemos en el porta objeto: empujamos el exceso de colorante hacia fuera del portaobjetos, para poder ver lo que hay debajo

Observar en el microscopio

MARCO TEORICO TÉCNICA DE TINCION GRAM

Existen variaciones de esta técnica, pero en términos generales, la tinción Gram involucra estos pasos:

1. Tinción inicial: Las células se tiñen con cristal-violeta. En este paso todas las células se tiñen de morado.

2. Mordente: Se adiciona yoduro lugol que reacciona con el cristal violeta y forma el complejo: cristal violeta-yoduro. Las células continúan moradas.Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, que actúa lavando el complejo cristal violeta-yoduro de las células Gram negativas (estas quedan incoloras). Este es el paso crítico, pues si se exagera, decolora las Gram positivas o de lo contrario, no decolora a las Gram negativas.

3. Contratinción: Se vuelve a teñir con Safranina o fucsina, de manera que las bacterias Gram negativas, que habían quedado incoloras, se tilen de rosado a fucsia, en tanto que las Gram positivas no se afectan con la contratinción.Basándonos en lareacción a esta tinción de las bacterias, éstas se han clasificado,taxonómicamente hablando, en grampositivas y gramnegativas.Las gramnegativas son constantes en su reacción, mientras que lasgrampositivas pueden presentar respuestas variables frente a determinadascondiciones, son gramlábiles. Para explicar el mecanismo de tinción se hanpropuesto varias hipótesis, fundadas en la naturaleza química de la paredVI) RESULTADO DEL EXPERIMENTOOBSERVACIÓNRealizar una tinción de Gram: mediante esta coloración se pueden diferenciar las bacterias típicas del yogur (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus), que son Gram (+), de las bacterias CONCLUSION Hemos podido reconocer a través del método de tinción Gram, en

este caso se identifico bacterias y sus formas y los lactobasilos del yogurt, en nuestro caso se juntaron las bacterias de streptococcus y los lactobasilos estando unidos en el portaobjetos y diferenciándose por los colores rosa y los lactobasilos eran gran positivas y de color rosa y los streptococcus eran vien la observación del microscopio se pudo apreciar su formas bien definidas y diferenciadas. Gram + violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas. VII) GRAFICOS