Preparación de métodos de análisis por espectrometría de ... · ¿Como funciona un...
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Preparación de métodos de análisis por
espectrometría de masas: aplicaciones clínicas
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Conflicto de Intereses
Declaro no tener
ningún potencial
conflicto de interés
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
3
SUMARIO
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
4
SUMARIO
Metodología
Aplicación Clínica
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
7
Espectrómetros de masas
ICP-MS
LC-MS/MS
GC-MS/MS
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
8
Espectrómetros de masas
Tecnología Instrumento Analitos
ICP-MS 7700x ICP-MS
(Agilent)
Suero: Al, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Se, Ti, Zn
Sangre: As, Cd, Hg, Pb
Orina: As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, I, Ni, Pb, Zn
GC-MS/MS Scion TQ
(Bruker)
Suero:
AGCML (C22:0, C24:0 y C26:0)
Orina:
Perfíl de ácidos orgánicos (23 analitos)
Confirmación de drogas de abuso
LC-MS/MS QTRAP 5500
(AB Sciex)
Sangre (Cribado Neonatal):
Acilcarnitinas y Aminoácidos
Plasma:
Metanefrinas libres
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SUMARIO
Introducción
Aplicación Clínica
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
10
¿Cuántos tipos de espectrómetros de masas hay?
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11
¿Como funciona un espectrómetro de masas?
Cuadrupolo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
12
¿Como funciona un espectrómetro de masas?
Cuadrupolo
Un cuadrupolo es un filtro de iones
Se aplican voltajes de
radiofrecuencias (RF)
y corriente contínua (DC)
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¿Como funciona un cuadrupolo?
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¿Como funciona un cuadrupolo?
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¿Como funciona un cuadrupolo?
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¿Como funciona un cuadrupolo?
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¿Como funciona un cuadrupolo?
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¿Como funciona un cuadrupolo?
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¿Como funciona un cuadrupolo?
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¿Como funciona un cuadrupolo?
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¿Como funciona un cuadrupolo?
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Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
40
¿Como funciona un espectrometro de masas?
Cuadrupolo
Señal
m/z
+ +
+
+
+
314
Aplicamos unos voltajes que solo permitan pasar la masa: 314 (ión verde)
Modo SIM Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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¿Como funciona un espectrometro de masas?
Cuadrupolo
Señal
m/z
+
+
+
+
+
+
50 - 1000
Modo SCAN
El cuadrupolo también puede hacer un barrido de masas
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Analizador de triple cuadrupolo
+ + +
+
+ +
314 210
Se obtiene una mayor Sensibilidad (Mejor relación S/N)
Se obtiene una mayor Especificidad (MS2 o MS3)
Q1 Q3
q2
Transición
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Analizador de triple cuadrupolo
Diseño en forma de C
Q1
Q3
q2
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N
H
TFA N
H
TFA
PM = 91
PM = 118
PM = 140
a)
b)
ANFETAMINA-N-TFA PM = 231
Fragmentación a
Fragmentación b
+ +
+
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ANFETAMINA-N-TFA
+ + +
+
+ +
231 140, 118, 91
3 transiciones Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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SUMARIO
Introducción
Metodología
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Feocromocitoma/Paraganglioma
47
Los feocromocitomas / paragangliomas son tumores poco frecuentes
(2-8 casos/millón personas/año) que se forman a partir de células
cromafines del sistema nervioso simpático
Los paragangliomas se suelen
formar cerca de la arteria carótida y
a lo largo de las vías nerviosas de la
cabeza, el cuello y la columna
vertebral
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Feocromocitoma/Paraganglioma
48
Los
feocromocitomas
se forman en la
médula
suprarrenal
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
49
Feocromocitoma/Paraganglioma
Un feocromocitoma va a producir cantidades
anormalmente elevadas de catecolaminas
(adrenalina/epinefrina y noradrenalina/norepinefrina)
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Feocromocitoma/Paraganglioma
50
o HTA sostenida
o Cefalea
o Sudoración excesiva
o Palpitaciones
o Debilidad
o Palidez extrema
Síntomas:
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Feocromocitoma/Paraganglioma
51 Genética Molecular Aplicada al Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias (2014-2015). Ed Cont Lab Clin; 21: 34-50
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Feocromocitoma/Paraganglioma
52
Metabolismo: Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
53
Metanefrinas
Eisenhofer G, Peitzsch M. Laboratory evaluation of pheochromocytoma and paraganglioma. Clin Chem. 2014;60(12):1486-99
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Metanefrinas
54
Därr R, Kuhn M, Bode C, Bornstein SR, Pacak K, Lenders JWM, Eisenhofer G.
Accuracy of recommended sampling and assay methods for the determination of plasma-
free and urinary fractionatedmetanephrines in the diagnosis of pheochromocytoma and paraganglioma:
a systematic review. Endocrine. 2017;56(3):495-503.
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Metanefrinas
55
Därr R, Kuhn M, Bode C, Bornstein SR, Pacak K, Lenders JWM, Eisenhofer G.
Accuracy of recommended sampling and assay methods for the determination of plasma-
free and urinary fractionatedmetanephrines in the diagnosis of pheochromocytoma and paraganglioma:
a systematic review. Endocrine. 2017;56(3):495-503.
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Metanefrinas plasmáticas
56
Eisenhofer G, Peitzsch M. Laboratory evaluation of pheochromocytoma and paraganglioma. Clin Chem. 2014;60(12):1486-99
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
57
Metanefrinas plasmáticas (HUCA)
Las metanefrinas plasmáticas libres
son separadas mediante extracción
sólido-líquido (SPE), usando 500 µL
de muestra (plasma-EDTA) y
cartuchos de extracción de
intercambio catiónico
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Metanefrinas plasmáticas (HUCA)
58
Las muestras son analizadas por
LC-MS/MS, usando un gradiente
de 7 min. (formato de amonio con
un 0.2% de ácido fórmico, pH=3.2
(Buffer A); y metanol con un
0.2% de ácido fórmico (Buffer B))
Pursuit 3 PFP MetaGuard
10 x 2.0 mm
Pursuit 3 PFP 150 x 2.0 mm
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Metanefrinas plasmáticas
59
Tabla. Transiciones y resto de parámetros utilizados en el espectrómetro de masas para la
monitorización de metanefrina y normetanefrina (y sus análogos deuterados)
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Metanefrinas plasmáticas
60
Figura. Cromatograma representativo de normetanefrina, metanefrina y 3-metoxitiramina
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Validación del método
61
Las características analíticas del método
(linealidad, límites de detección (LoD) y
cuantificación (LoQ), precisión, veracidad y
estudio comparativo) fueron evaluadas
siguiendo las guías del CLSI
Documentos:
EP6-A
EP9-A2 IR
EP15-A2
EP17-A
EP21-A
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62
https://clsi.org/standards/products/clinical-chemistry-and-toxicology/documents/c62/
Validación del método Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Comparación de un pool de muestras
con dos niveles de metanefrinas
(267 and 1333 pg/mL) pre- y post-
extracción, analizados durante 5 días
(20 réplicas)
Estudio de Recuperación
63
Metanefrina
70% (56-83%)
Normetanefrina
52% (31-89%)
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La linealidad fue evaluada entre 10 y 2000 pg/mL, obteniéndose
coeficientes de correlación > 0.995
Linealidad
64
Valor Normal
< 100 pg/mL
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Linealidad
65
La linealidad fue evaluada entre 10 y 2000 pg/mL, obteniéndose
coeficientes de correlación > 0.995
Valor Normal
< 165 pg/mL
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66
Calibradores
Los patrones de calibración son preparados en una solución de
fosfato amónico, 10 mmol/L, pH 6.5
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Calibradores
67
Estos patrones muestran un rendimiento similar al obtenido con
patrones preparados en un pool de muestras de plasma previamente
tratadas con carbono activado (para eliminar las metanefrinas
endógenas) y dopadas con metanefrinas exógenas
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La precisión fue calculada mediante un análisis en triplicado (durante
cinco días) de cuatro niveles de metanefrinas en solución de fosfato
amónico (10, 20, 100 y 500 pg/mL) y un control interno de calidad de
Chromsystems (60 y 100 pg/mL de MN y NMN, respectivamente)
Precisión
68
CV (%) - MN CV (%) - NMN
LOQ (10 pg/mL) 11,0 10,9
Otros niveles < 7,5 < 7,8
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El arrastre fue estudiado
analizando dos muestras
con concentraciones
elevadas (2000 pg/mL)
y bajas (50 pg/mL)
de MN y NMN
Efecto Arrastre
69
No se observó un efecto de arrastre para este método,
de acuerdo al test de los rangos con signo de Wilcoxon
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70
Comparación de métodos
El estudio comparativo con un ELISA (n=22) reveló un coeficiente
de correlación de 0.68 para MN y 0.98 para NMN
La diferencia media fue de un -28% para MN (estadísticamente
significativa) y 16% para NMN (no estadísticamente significativa)
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QC Interno Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
72
QC Interno - Clinchek
Metanefrina Normetanefrina
QC Normal Patológico Normal Patológico
Teórico 58.2 238 115 381
Media 52.8 217 105.3 346
CV (%) 8.2 4.8 8.1 6.8
Sesgo (%) -9.2 -8.9 -8.4 -9.3
Resultados 2017 (n=52)
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QC Interno - Clinchek
Metanefrina Normetanefrina
QC Normal Patológico Normal Patológico
Teórico 58.2 238 115 381
Media 52.8 217 105.3 346
CV (%) 8.2 4.8 8.1 6.8
Sesgo (%) -9.2 -8.9 -8.4 -9.3
Resultados 2017 (n=52)
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74
QC Externo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
75
QC Externo
Bajo nº de
participantes
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76
QC Externo
Metanefrina
-8.9%
Normetanefrina
-7.0%
Promedio de 10
muestras sobre 12
(ciclo 2017)
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
77
¿Que pruebas se deben realizar?
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78
Metanefrinas plasmáticas
Nº peticiones
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
79
Metanefrinas fraccionadas urinarias
Nº peticiones
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