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CINÉTICA ENZIMÁTICA
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
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E + S SE E + P
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• Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.
• Unidades del Metabolismo
• Regulan la vel. de las reac. quím. espontáneas (DG-).
• No promueven reacciones no-espontáneas (DG +).
• Incrementan la Vel. de reacción 103 a 1012 veces sin
afectar el sentido de la reacción.
• No forman parte del producto de la reacción.
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PROPIEDADES GENERALES• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
– De 106 to 1012 veces vs sin enzima.
– Aún más rápido que los catalizadores químicos.
• CONDICIONES DE REACCIÓN– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)
– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5
– Presión atmosférica normal
• CAPACIDAD DE REGULACIÓN– Por concentración de sustrato
– Por concentración de enzima
– Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)
– Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)
– Por regulación alostérica
• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN– Interacción estereoespecífica con el sustrato
– No hay productos colaterales
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ALTA
ESPECIFICIDAD
DE REACCIÓN
INTERACCIÓNESTEREO
ESPECÍFICA CON SU
SUSTRATO
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Los Substratosse acercan a la Enzima
(sitio Activo)
Enzima
Substratos
HO-
H-
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Cambia la configuración de la enzima
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Los reactivos interaccionan
con la enzima (sitio activo)
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La unión del sustrato produce un cambio conformacional
de la enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica.
Substrato
de glucosa
Sitio de enlace
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Se realiza la reacción
catalítica
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Actividad enzimática finales del siglo XIX.
En 1882: complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática.
En 1913: Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una
ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#mm
[ET] = [E] + [ES]
Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
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Leonor Michelis y Maud Menten (1913)
Tiempo
Co
nc
en
t.
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E + S ESK1
K-1
ES E + PK2
K-2
[Et ] = Concentración de E total libre y combinada
[ES]
[Et ] – [ES] = Concentración de E libre
[S] normalmente > a [Et ] de tal forma [ES] es despreciable Vs [S]
1.- Vel. de formación ES = K1 ( [Et ] – [ES] ) [S]
La deducción comienza por considerar
las Velocidades de Formación y de Descomposición de ES
La velocidad de formación de ES a partir de E + P es muy pequeña y puede despreciarse
[ES]
[E] + [S]K1 =
K1 ( [E] + [S] ) = [ES]
2.- Vel. de descomposición de ES = K-1 [ES] + K2 [ES]
3.- Estado estacionario.
Vel. de formación de ES = vel. de descomposición. La [ES] se mantiene constánte
4.- Separación de las constantes de velocidad
K1 ( [Et ] – [ES] ) [S] = K-1 [ES] + K2 [ES]
K1 [Et ] [S] – K1 [ES] [S] = (K-1 + K2) [ES]
K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES]Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
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K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES]
K1 [Et ] [S] = ( K1 [S] + (K-1 + K2) ) [ES] simplificando
K1 [Et ] [S]
K1 [S] + (K-1 + K2) [ES] =
5.- Definición de la velocidad inicial (Vo) en función de [ES]
La Vel. Inicial de acuerdo con la Teo. de M-M, está determinada por la
vel. de descomposición del [ES], K2 ,
ES E + PK2
K-2
Vo
K2
[ES] =
[Et ] [S]
[S] + (K-1 + K2)
K1
[ES] =
Vo = K2 [ES]
[ES]
[ES]
K2 [Et ] [S]
[S] + (K-1 + K2)
K1
Se puede simplicar:
Vo = Definiendo KM
Cte. De Michaelis-Menten como(K-1 + K2)
K1
Vmax como K2 [Et] que es la Vel. Cuando todo el
enzima disponible E, se halla presente en forma de ES.Vmax [S]
[S] + KM
Vo =Ecuación de Michaelis-Menten o Ecuación de Velocidad
para una reacción de un solo S catalizada por un E.
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ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN Vo = Vmax [S]
Km + [S]
1
2 Vo = Vmax
De la ecuación de M-M se deduce una rel. numérica importante
Cuando la Vo es la mitad de la Vmax
Vmax Vmax [S]
2 KM + [S] =
1 [S]
2 KM + [S] =
KM = 2 [S] – [S]
KM = [S]
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Vo =Vmax [S]
KM + [S]
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E E-S E
S P
Velocidad: cantidad de producto formado en una unidad de tiempo
S E P
100 1000 100
1000
1000
1000
1000
1000
1000
250 250
500 500
750 750
1000 1000
2000 1000
3000 1000
Vmax
(mM) mU (mM/ min)
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Cinética enzimática en función de la concentración
de sustrato
KM
1
2 Vo = Vmax
KM = [S]
Vmax
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Catalasa H2O2 25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5
Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
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• La KM es inversamente proporcional con la
actividad de la enzima.
• Valor de KM grande, baja actividad
• Valor de KM pequeño, alta actividad
La KM
es un parámetro de
Actividad Enzimática
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Catalasa H2O2 25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5
Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
En ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM
Después de comer …. Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
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H2O
Quimotripsina Ac-Phe-Ala Ac.Phe + Ala 150
H2O
Pepsina Phe-Gly Ac-Phe + Ala 0.3
H2O
Ribonucleasa Citidina 2’,3’ Citidina 3’ 7.9
fosfato cíclico fosfato
Anhidrasa Carbónica
Km de algunas enzimas
ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
Mathews C.K. y Van Holde K.E 1998. .Bioquímica 2ª. Ed. McGraw-Hill Interamericana. España. Pag 418
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Hexosa Cerebral
Azúcar Km
(mol/ L)
Cinasas
D-Glucosa 8 X 10 -6 Glucocinasa
Hexocinasa IV
D-Fructosa 2 X 10 -3 Fructocinasa
D-Manosa 5 X 10 -6 Manocinasa
D-Galactosamina 8 X 10 -5 Galactocinasa
Km
(mmol/ L)
8
2000
5
80
Km
(mmol/ L)
0.008
2.0
0.005
0.08
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ATP + Glucosa ADP + 6-fosfato de glucosa
2 Rutas
Enzimas: pueden catalizar reacciones donde hay 2 S =
Hexocinasa
•Desplazamiento Simple, los 2 S se unen a la E
A + B + E EAB C + D
•Doble desplazamiento o ping-pong
A + B + E AE BE + C
D
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Determinación Cuantitativa de la Cinética Enzimática
1. La reacción global
2. Procedimiento analítico para determinar el S que
desaparece o el P que aparece
3. Sí el E requiere Cofactores (iónes o coenzimas)
4. La dependencia de la actividad enzimática con la
[S] o sea la KM de la Enzima.
5. El pH óptimo
6. Un intervalo de temperatura en la que la E es
estable y muestra actividad elevada.
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Catalasa H2O2 25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5
Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
Glucosa en ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM
Después de comer ….
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Pepsina 1.5
Tripsina 7.7
Catalasa 7.6
Arginasa 9.7
Fumarasa 7.8
Ribonucleasa 7.8
Enzima pH óptimo
Vo
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4 37 85
Temperatura oC)
Vo
10 50 100
Coenzima
Vo
10 30 50 70 100
Tiempo (min)
Vo
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1.0 Unidad de Actividad Enzimática (U):
La cantidad que transforma 1.0 mmol (10-6 M) de S /min,
a 25 0C, en las condiciones de medida óptima.
Actividad específica:
Es el no. de U de una E / mg de proteína.
Es decir: una medida de la pureza de la E.
Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable.
Número de recambio
No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo,
por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico)
Enzima No. de Recambio
Anhidrasa carbónica 36 000 000
B-Amilasa 1 000 000
B-Galactosidasa 12 000
Fosfoglucomutasa 1 240
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[S] (mM) Vo (mM/ min)
1.25 0.86
1.67 1.02
2.5 1.32
5 1.67
10 2.09
¿Vmax?
¿KM?
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y = m x + b
Transformación de la M-M. Representación Doble Recíproco
Vmax [S]
[S] + KM
Vo =
Vmax [S]
KM + [S]Vo =
1 KM + [S]
Vo Vmax [S] =
Sí se toman los recíprocos de ambos
1 KM 1 [S]
Vo Vmax [S] Vmax [S] =
Separando los componentes de numerador
+
1 KM 1 1
Vo Vmax [S] Vmax
=
Simplificando
+Ecuación de
Lineweaver-Burk
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Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.Km= 37.48
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0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
Vo
(mm
ol/
L m
in)
[S] mM
Michaelis Menten
S (mM) Vo (mmol/L min)
0.05 0.71
0.10 1.07
0.20 1.50
0.35 1.80
0.50 1.88
1/S 1/Vo
20.0 1.4
10.0 0.9
5.0 0.7
2.9 0.6
2.0 0.5y = 0.0494x + 0.4257
R² = 0.9991
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
-10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
Linewever-Burk
1/[S]
1/ V
o
1 KM 1 1
Vo Vmax [S] Vmax
= +
y = m x + b
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Gráfica de Eadie-Hofstee
Vmax [S]
KM + [S]Vo =
(KM + [S]) Vo = Vmax [S]
KM Vo [S] Vo Vmax [S]
[S] [S] [S]=
+
Vo = - KM Vo Vmax
[S]
+
y = - m x + bVo
[S]
V max
KM
Vo
Vmax
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KM Vo [S] Vo Vmax [S]=+
KM Vo Vo Vmax
[S] =+
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S (mM) Vo (mmol/L min)
0.05 0.71
0.10 1.07
0.20 1.50
0.35 1.80
0.50 1.88
1/S 1/Vo
20.0 1.4
10.0 0.9
5.0 0.7
2.9 0.6
2.0 0.5
Vo/S Vo
14.200.71
10.701.07
7.501.5
5.141.8
3.761.88
y = -0.1168x + 2.3571R² = 0.9947
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Vo
Vo/S
E-H
7
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Cuando:
Vo= Vmax Todos los sitios activos están ocupados y
no hay moléculas de E libre.
KM= [S] Sí... ½ Vmax.
KM representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse
a la mitad de la E disponible y producir la mitad de la Vmax.
KM representa la concentración del sustrato en una célula.
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Gracias
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Inhibidores Enzimáticos
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E E-S E
S
P
Velocidad: cantidad de producto formado en una unidad de tiempo
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
Vo
(mm
ol/
L m
in)
[S] mM
Michaelis MentenS (mM) Vo (mmol/L min)
0.05 0.71
0.10 1.07
0.20 1.50
0.35 1.80
0.50 1.88
1/S 1/Vo
20.0 1.4
10.0 0.9
5.0 0.7
2.9 0.6
2.0 0.5
1 KM 1 1
Vo Vmax [S] Vmax
= +
y = m x + b
Vo = V max [S]
Km + [S]
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Inhibidores
Reactivos químicos específicos que pueden
inhibir a la mayor parte de las enzimas.
INHIBIDORES
Irreversibles
Reversibles
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Inhibidor Irreversible
• Inhibición permanente
• Unión irreversible por medio de enlaces covalentes.
• Modificaciones químicas de los gps. catalíticos.
• Modificada la enzima, está siempre inhibida.
Para distinguirlo de los reversible se someten a
diálisis y si no se separan: enzima e inhibidor, éste es
permanente.
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Diálisis
S + E SE E + P
E + I EI EI
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Inhibidor Irreversible
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Acetilcolinesterasa
Acetilcolina
Acetato + Colina
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
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Inhibidor Irreversible
Acetilcolina
Acetato + Colina
Fluorofosfato de di-isopropilo (DFP)
Enz
Enz
Acetilcolinesterasa
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
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Inhibidor Irreversible Fluorofosfato de di-isopropilo (DFP)
1914- 1918
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Inhibidor Irreversible
Acetilcolinesterasa
Tripsina
Elastasa
Fosfoglucomutasa
Cocoonasa (larvas de gusanos de
seda)
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)
Plaguicidas de tipo organofosforados y carbamatos
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Fluorofosfato de di-isopropilo (DFP) Serina
Cisteína
HistidinaIodoacetamida
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• La unión del inhibidor y la enzima es reversible.
• Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad.
Hay 3 tipos:
Competitiva
No Competitiva
Acompetitiva (Alostérica)
Inhibidor Reversible
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Antibióticos
Insecticidas
Hervicidas
Venenos
Diferentes Medicamentos
Dolor
Inflamación
Infecciones virales
Cáncer
Inhibición
enzimática
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Inhibición Competitiva
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Vmax igual
KM diferente
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Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
![Page 53: Presentación de PowerPointsgpwe.izt.uam.mx/.../3_Cinetica_enzimatica.pdf · 2021. 2. 12. · •Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos. • Unidades del Metabolismo](https://reader036.fdocumento.com/reader036/viewer/2022062609/60fd1ff8e5d2b8107d2dd891/html5/thumbnails/53.jpg)
Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico
Sulfas Infecciones microbianas
Antihipertensores: Captopril y Enalopril
Alopurinol Controla la gota
Fluoruracilo Cáncer
Inhibidores Competitivos
Inhibidor de la Angiotensina. Polipéptido sanguíneo
produce vasoconstricción, aumento de presión arterial
Análogo Inhibe Xantina-oxidasa
Hipoxantina xantina ácido úrico
Inhibe Dihidropteroato sintetasa
precursores de ácido fólico
CK, Cad. Resp.
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El inhibidor NO se une al sitio activo
Inhibición No Competitiva
NO se puede revertir con un exceso de sustrato
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Vmax diferente
KM igual
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Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
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Cinéticas de Inhibición Competitivo
Vmax igual
KM diferente
No competitivo
Vmax diferente
KM igual
No inhibitor
1
V
1/[S]0
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Inhibición acompetitiva
I
El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora
La subunidad catalítica
une al sustrato y
cataliza la reacción
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S (mM) Vo (mmol/L min) Vo (mmol/L min)
0.05 0.71 0.43
0.10 1.07 0.71
0.20 1.50 1.05
0.35 1.80 1.41
0.50 1.88 1.60
1/S 1/Vo 1/Vo
con Inhib.
20.0 1.4 2.3
10.0 0.9 1.4
5.0 0.7 1.0
2.9 0.6 0.7
2.0 0.5 0.6
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Hay enzimas que no obedecen la
ecuación de Michaelis-Menten.
Cinética no es Michaeliana.
Enzimas alostéricos,
pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a
la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de
reacción.
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Gracias
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