introducciónintroducción En 1990 se descubre la primera En 1990 se descubre la primera inteínainteína

Propiedades que las diferencian de otros tiposPropiedades que las diferencian de otros tiposde reordenamientos en proteínas:de reordenamientos en proteínas: Secuencia característica de la Secuencia característica de la inteínainteína.. Reacción Reacción autocatalíticaautocatalítica en ausencia de proteínas en ausencia de proteínas

exógenasexógenas, cofactores o fuentes de energía., cofactores o fuentes de energía. Formación de un enlace peptídico entre las Formación de un enlace peptídico entre las exteínasexteínas..

EstructuraEstructura

Mecanismo estándar delMecanismo estándar delsplicingsplicing de proteínas de proteínas

Inteína libre + exteínas unidas por un enlace peptídico

InteínasInteínas como enzimas. como enzimas.

Aceleran reacciones:Aceleran reacciones: Alineamiento de grupos reactivos.Alineamiento de grupos reactivos. Haciendo más Haciendo más nucleófilosnucleófilos los grupos los grupos

atacantes, y más atacantes, y más electrófíloelectrófílo el carbonilo del el carbonilo delenlace escindible.enlace escindible.

Estabilizando los estados de transiciónEstabilizando los estados de transicióntetraédrica.tetraédrica.

ProtonaciónProtonación y y desprotonacióndesprotonación..

Secuencias de las Secuencias de las exteínasexteínas cercanas a la cercanas a la inteínainteína..

Los precursores han evolucionado paraLos precursores han evolucionado paramaximizar la eficiencia del maximizar la eficiencia del splicingsplicing..

Las Las inteínasinteínas en diferentes lugares de inserción en diferentes lugares de inserciónnormalmente realizan el normalmente realizan el splicingsplicing unas 10 veces unas 10 vecesmás lento y/o dan lugar a un precursor inactivo.más lento y/o dan lugar a un precursor inactivo.

Diferentes Diferentes inteínasinteínas muestran variedad en el muestran variedad en elgrado de especificidad por el sustrato.grado de especificidad por el sustrato.

En general, el En general, el splicingsplicing mejora cuando la mejora cuando lasecuencia nativa de las secuencia nativa de las exteínasexteínas flanquea a la flanquea a lainteínainteína por uno o los dos lados. por uno o los dos lados.

Dos Dos histidinashistidinas conservadas. conservadas.

Mutaciones y datos estructurales indican que laMutaciones y datos estructurales indican que laHisHis en el bloque B ayuda a activar la unión en el en el bloque B ayuda a activar la unión en elsplicingsplicing en el N-terminal. en el N-terminal.

La La HisHis que ocupa el penúltimo residuo de la que ocupa el penúltimo residuo de lainteínainteína activa el ayuste en C-terminal. activa el ayuste en C-terminal.

Parece que esta Parece que esta HisHis debe debe protonarprotonar el nitrógeno el nitrógenode la amida del enlace que se separa al ciclarsede la amida del enlace que se separa al ciclarsela la AsnAsn..

Dos histidinas conservadas.

Diferentes modos de ayuste.Diferentes modos de ayuste.

--InteínasInteínas con Ala1. con Ala1. Estas han perdido la manera de realizar elEstas han perdido la manera de realizar el

ataque ataque nucleófilonucleófilo requerido en el extremo requerido en el extremoamino para poder formar el intermediario (amino para poder formar el intermediario (TioTio))esterester lineal. lineal.

La La CysCys +1 ataca directamente un enlace +1 ataca directamente un enlaceamida en el N terminal formándose elamida en el N terminal formándose elintermediario ramificado.intermediario ramificado.

InteínasInteínas con Ala1. con Ala1.

El mecanismo de estas El mecanismo de estas inteínasinteínas seguiría 3 seguiría 3pasos (se elimina el primer paso delpasos (se elimina el primer paso delproceso estándar).proceso estándar).

En las En las inteínasinteínas estándar si se muta para estándar si se muta paraque el primer residuo sea una Ala, seque el primer residuo sea una Ala, sedetiene el detiene el splicingsplicing..

InteínasInteínas con Ala1. con Ala1. El análisis de la El análisis de la inteínainteína de de KlbAKlbA de de

MethanococcusMethanococcus jannaschiijannaschii mostró: mostró:

1. Ayuste eficiente en 1. Ayuste eficiente en E.coliE.coli.. 2. Aparecía el intermediario ramificado estándar.2. Aparecía el intermediario ramificado estándar. 3. 3. RequeriaRequeria CysCys +1 en el ayuste, para formar el +1 en el ayuste, para formar el

inermediarioinermediario ramificado. ramificado. 4. La 4. La AsnAsn del C terminal es necesaria para escindir la del C terminal es necesaria para escindir la

exteínaexteína-C.-C. 5. 5. ThrThr e e HisHis activan el ayuste de la parte N terminal. activan el ayuste de la parte N terminal. 6. Se observa el intermediario 6. Se observa el intermediario tioestertioester lineal estándar lineal estándar

cuando se da la reversión de Ala1 a Cys1.cuando se da la reversión de Ala1 a Cys1.

InteínasInteínas que acaban en que acaban en GlnGln o o AspAsp..

Experimentan los mismos reordenamientos queExperimentan los mismos reordenamientos quecon la con la AsnAsn dando también como resultado un dando también como resultado unenlace peptídico.enlace peptídico.

Se ha visto también que la Se ha visto también que la HisHis (penúltimo (penúltimoresiduo de la residuo de la inteínainteína) ayuda al ayuste en el) ayuda al ayuste en elextremo C.extremo C.

InteínasInteínas que acaban en que acaban en GlnGln.. Estudios en las Estudios en las inteínasinteínas RNR del virus RNR del virus ChiloChilo

iridescentiridescent y y PolPol III de III de PyrococcusPyrococcus abyssiabyssi,,mostraron diferentes resultados cuando semostraron diferentes resultados cuando serevertió la revertió la GlnGln por por AsnAsn::

-En la -En la inteínainteína de RNR la tasa de ayuste se vio de RNR la tasa de ayuste se vioreducida 7 veces.reducida 7 veces.

-En la de -En la de PolPol III aumentó 4 veces. III aumentó 4 veces.

InteínasInteínas que acaban en que acaban en AspAsp..

Es el caso de la Es el caso de la inteínainteína de RNR de de RNR deCarboxydothemusCarboxydothemus hydrogenoformanshydrogenoformans..

Se observa que el ayuste se sigue dando alSe observa que el ayuste se sigue dando alcambiar este cambiar este AspAsp por por AsnAsn, , GlnGln y y GluGlu formando formandoun enlace peptídico al ciclarse.un enlace peptídico al ciclarse.

Aplicaciones biotecnológicasAplicaciones biotecnológicasde las de las inteínasinteínas..

Vectores de purificación de proteínas.Vectores de purificación de proteínas.

Reacciones de escisión aisladas y controladas.Reacciones de escisión aisladas y controladas.

Para controlar el corte del N-terminal, se limita laPara controlar el corte del N-terminal, se limita lareacción al primer paso del ayuste.reacción al primer paso del ayuste. Normalmente mutando la Normalmente mutando la AsnAsn C-terminal y el C-terminal y el aaaa +1. +1. El enlace El enlace tioestertioester resultante es generalmente estable resultante es generalmente estable

hasta que se da un ataque hasta que se da un ataque nucleófilonucleófilo..

El enlace El enlace tioestertioester del C-terminal ha sido utilizado del C-terminal ha sido utilizadopara unir diferentes tipos de moléculas apara unir diferentes tipos de moléculas aproteínas diana.proteínas diana.

Vectores de purificación de proteínas.Vectores de purificación de proteínas.

Estrategias para unir polipéptidos.Estrategias para unir polipéptidos.

Se han utilizado dos técnicas basadas enSe han utilizado dos técnicas basadas eninteínasinteínas para unir polipéptidos: para unir polipéptidos: 1. 1. TransTrans--splicingsplicing.. 2. Unión de la proteína expresada mediada2. Unión de la proteína expresada mediada

por por inteínainteína. (EPL o IPL).. (EPL o IPL).

Ambos métodos producen una proteína formadaAmbos métodos producen una proteína formadaa partir de dos o más fragmentos, permitiendoa partir de dos o más fragmentos, permitiendonumerosos tipos de modificaciones denumerosos tipos de modificaciones desegmentos.segmentos.

TransTrans--splicingsplicing El El transtrans--splicingsplicing esta limitado por las esta limitado por las

preferencias por el sustrato que tenga la preferencias por el sustrato que tenga la inteínainteína..

En el En el transtrans--splicingsplicing, fragmentos de precursores, fragmentos de precursoresse reorganizan para formar una se reorganizan para formar una inteínainteínafuncional.funcional.

EPL.EPL. Técnica in Técnica in vitrovitro Mediante la Mediante la inteínainteína se forman polipéptidos con se forman polipéptidos con

un un αα--tioestertioester C-terminal que son unidos a C-terminal que son unidos apolipéptidos que empiezan con una polipéptidos que empiezan con una CysCys..

Forma un enlace peptídico.Forma un enlace peptídico.

El El αα--tioestertioester permite la unión de polipéptidos a permite la unión de polipéptidos anumerosos tipos de moléculas. Sin embargo elnumerosos tipos de moléculas. Sin embargo elenlace peptídico solo se forma si la molécula seenlace peptídico solo se forma si la molécula seune a una une a una CysCys con un grupo amino libre. con un grupo amino libre.

EPL.EPL.

Estrategias para unir polipéptidos.Estrategias para unir polipéptidos.

han sido utilizadas para:han sido utilizadas para:

Aumentar el límite de tamaño en análisis NMR.Aumentar el límite de tamaño en análisis NMR. Introducir modificaciones post-Introducir modificaciones post-traduccionalestraduccionales.. Introducir aminoácidos no naturales.Introducir aminoácidos no naturales. Introducir estados de transición análogos yIntroducir estados de transición análogos y

biosensores.biosensores. Limitar la transferencia de Limitar la transferencia de transgenestransgenes no deseados no deseados

en plantas.en plantas. Expresar proteínas citotóxicas.Expresar proteínas citotóxicas.

Unir proteínas a soportes sólidos o a transportadores.Unir proteínas a soportes sólidos o a transportadores.

Las Las inteínasinteínas han sido utilizadas para sintetizar han sido utilizadas para sintetizarmicroarraysmicroarrays de proteínas uniendo las proteínas de proteínas uniendo las proteínasa un dominio de unión a superficies sólidas.a un dominio de unión a superficies sólidas.

Ej.: proteínas diana con Ej.: proteínas diana con αα--tioestertioester fueron fueroninmovilizadas en una superficie de cristal alinmovilizadas en una superficie de cristal alreaccionar con reaccionar con CysCys unida al cristal mediante unida al cristal mediante polietilenpolietilenglicol.glicol.

Ej.: se añadió Ej.: se añadió biotinabiotina a las proteínas utilizando EPL y a las proteínas utilizando EPL yestas se unieron al soporte sólido con estas se unieron al soporte sólido con avidinaavidina..

Unir proteínas a soportes sólidos o a transportadores.Unir proteínas a soportes sólidos o a transportadores.

Ensayos para conocer las uniones específicas aEnsayos para conocer las uniones específicas aun péptido están a veces limitados por laun péptido están a veces limitados por laincapacidad de los incapacidad de los péptidospéptidos para unirse a para unirse asoportes sólidos.soportes sólidos.

Este obstáculo se supera utilizando EPL paraEste obstáculo se supera utilizando EPL paraunir a los unir a los péptidospéptidos a una proteína transportadora a una proteína transportadoraque tenga buenas características de unión yque tenga buenas características de unión ybaja reactividad a anticuerpos.baja reactividad a anticuerpos.

Interruptores Interruptores biomolecularesbiomoleculares in vivo. in vivo.

Manipulando el ayuste en proteínasManipulando el ayuste en proteínasconseguimos que las conseguimos que las inteínasinteínas actúen como actúen comointerruptores moleculares.interruptores moleculares.

Mutantes sensibles a temperatura para elMutantes sensibles a temperatura para elsplicingsplicing insertados en Gal4 y Gal80 han sido insertados en Gal4 y Gal80 han sidoutilizados para controlar espacial yutilizados para controlar espacial ytemporalmente la expresión de genes entemporalmente la expresión de genes enlevaduras y levaduras y DrosophilaDrosophila..

Interruptores Interruptores biomolecularesbiomoleculares in vivo. in vivo.