PREVALENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN CARNES Y DERIVADOS DE LA INDUSTRIA PORCÍCOLA COLOMBIANA

RESUMEN

Objetivo. Determinar la prevalencia de L. monocytogenes en canales de cerdo, cortes de carne y derivados (chorizo, salchicha y jamón). Materiales y métodos. Se implementó un muestreo estratificado y se tomaron 566 muestras (37%) de canales, 472 muestras (31%) de cortes de carne y 481 muestras (32%) de derivados cárnicos distribuidos de la siguiente manera: 169 (11%) de salchicha, 163 (11%) de jamón y 149 (10%) de chorizo, para un total de 1519 (100%) muestras en un período de 18 meses. Las muestras se procesaron utilizando las normas ISO-17604 e ISO-11290-1 y el método USDA/FSIS (MLG-8.03). Posteriormente se confirmaron los aislamientos por PCR-múltiple para identificar el género y la especie. Resultados. Se obtuvieron 21 (10%) aislamientos de L. monocytogenes en muestras de canales, 160 (76%) en carne de desposte, 10 (5%) en jamón, 6 (3%) en chorizo y 13 (6%) en salchicha. La prevalencia encontrada fue de 3.7% y 33.9% en carne en canal y cortes de carne respectivamente, mientras que la prevalencia en los derivados fue chorizo 4.0%, jamón 6.13% y salchicha 7.69%. La prevalencia general de L. monocytogenes en el estudio fue 13.82%. Conclusiones. Se encontró L. monocytogenes en los diferentes productos analizados, siendo de especial interés el jamón y las salchichas porque ambos son consumidos sin ningún tratamiento térmico.

Palabras clave: L. monocytogenes, porcino, carne de cerdo, prevalencia (Fuente:DeCS y TDC).

INTRODUCCION

L. monocytogenes es un bacilo no formadoras de esporas Gram positivo que se puede encontrar de forma individual, en parejas o en cadenas cortas de 3 a 5 microorganismos con una V o forma de Y. Se carece de una cápsula y moviliza por medio de flagelos peritricos con una temperatura movilización óptimo entre 20 y 25 ° C, con poca o ninguna movilidad a 37 ° C (1). Aunque son bacilos Gram -positivos, las culturas antiguas pueden expresar pleomorfismo. Como un microorganismo zoonótica y emergentes en la industria alimentaria, L. monocytogenes causa listeriosis en los seres humanos y los animales (1,2). Esta bacteria ubicua puede contaminar el agua, los concentrados y especialmente silos agrícolas, lo que resulta en la diseminación de L. monocytogenes durante la crianza animal. Es conocido por cerdos que excretan las bacterias thorugh sus heces, actuando así como reservorios (3).L. monocytogenes ha causado varios brotes alimentarios, especialmente a través de un grupo de productos listos para el consumo de alimentos (RE), donde la carne y los productos lácteos son los más afectados (4,5). En varios informes internacionales Galantine cerdo y jamón, entre otros alimentos contaminados, ha sido declarada como una fuente importante de brotes en Francia y Canadá (1,6-8).Actualmente en Colombia no hay reportes de brotes por el consumo de productos cárnicos. Sin embargo, un estudio reciente realizado por el Instituto Nacional de Vigilancia y Control de las Bebidas, Medicamentos y Alimentos (INVIMA), declaró que los productos cárnicos pueden estar contaminados con este microorganismo y puede constituir un vehículo de listeriosis potencial " (9). Recientemente, el INVIMA en su programa de control y vigilancia informó el retiro de un lote de jamón importado (tipo " Serrano "), debido a la presencia de L. monocytogenes. La legislación colombiana no requiere la búsqueda de L. monocytogenes en los derivados cárnicos. Sin embargo, el Instituto de Normas Técnicas (Icontec), en su norma 1325 (sexta actualización), establece el rechazo de un producto si 25 gramos de la muestra contienen L. monocytogenes.De acuerdo con la política nacional de seguridad y salud en relación con la cadena de carne de cerdo (10), el sector porcino colombiano ha experimentado un importante crecimiento con una

mejora considerable de la productividad. Sin embargo, no hay informes que determinan el mínimo permitido para este patógeno en la cadena de carne de cerdo. Uno de los objetivos de este trabajo fue determinar la prevalencia de L. monocytogenes en los derivados cárnicos, para ayudar a mejorar el estado de salud de la cadena porcina nacional. En Colombia los informes de prevalencia de L. monocytogenes en los derivados cárnicos son escasos. Esto es debido al hecho de que los estudios relacionados con este microorganismo se han centrado en los derivados lácteos más probable. Los pocos informes existentes muestran prevalencia de alrededor del 14,3 % en derivados de carne.El objetivo principal de este trabajo fue determinar la prevalencia de L. monocytogenes en canales de cerdo, la carne de cerdo y productos a base de carne de cerdo de la industria porcina nacional.

MATERIALES Y MÉTODOS

Selección de plantas de procesamiento de carne de cerdo. Las plantas fueron seleccionadas de acuerdo a los siguientes criterios: 1) carne de cerdo sólo Abbatoirs 2 ) Plantas que cumplan con las regulaciones con el Decreto 1500, es decir, pagar una cuota para el desarrollo 3 ) plantas ubicadas en zonas determinadas por Fedegan (10). En el momento de este estudio, 42 plantas de procesamiento estaban en todo el país, este estudio incluyó a 23.Tamaño de la muestra. Tamaño de la muestra se calculó utilizando la fórmula de estimación puntual de prevalencia, teniendo en cuenta los siguientes criterios. 1) Tamaño de la población [1.927.273 cerdos sacrificados / año], 2.) Espera que la prevalencia [50 %], 3) Espera máxima diferencia [5 %], 4) Error tipo I [1 %], 5) Tamaño de la muestra [566], 6) Número de plantas para el muestreo [23].Selección de carne de cerdo. Como los criterios de inclusión se consideraron: 1) los mercados que venden carne de cerdo y 2) puntos situados en las áreas de la industria de carne de cerdo. . . El número de muestras para el estudio fue de 472, distribuidos en 58 lotes.Selección de los derivados de la carne. Para la selección de los productos de carne procesados tomamos en cuenta 1) El uso de la carne de cerdo como materia prima y 2) De alto consumo de productos procesados de carne de cerdo. Los productos incluidos son: jamón cocido (tipo sándwich), de bajo costo y salchichas (cocido) y pre -cocinados " chorizo ". El número de muestras incluidas fueron 481, distribuidos de la siguiente forma: 169 (35 %), salchichas, 163 (34 %), jamón, y 149 (31 %) "chorizo”.La toma de muestras. Para canales de cerdo, se recogieron muestras utilizando el método no destructivo se describe en la norma ISO 17604 (12). Cortes de carne fueron tomadas directamente de la venta - puntos de mercado en diferentes zonas del país, con un tamaño de muestra de 500 g. Productos cárnicos procesados fueron tomadas directamente desde el punto en presentaciones comerciales de venta con un tamaño aproximado de 250 a 500 g.Análisis microbiológico. Las muestras fueron trasladadas al Laboratorio de Microbiología de Alimentos de la Pontificia Universidad Javeriana, en condiciones asépticas a procesar inmediatamente. El método utilizado para el procesamiento de las canales de cerdo fue descrito por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA / FSIS) (13). ISO11290 - 1 método fue utilizado para los cortes de carne y productos cárnicos procesados. Brevemente, se tomó 25 g de muestra y se homogeneiza en 225 ml de caldo Fraser semi - y se incubó a 30 ° C durante 48 horas. Un centenar de l suspensión se incubó en 10 ml de caldo Fraser y se incubó durante 40 horas a 35 ° C. L. monocytogenes se aisló en Ottaviani Agosti - agar y Palcam. Colonias presuntivas se purificaron en agar TSAYE. Catalasa prueba, fermentación de azúcares (manitol, xilosa, ramnosa), prueba de hemólisis y la prueba de campo se llevaron a cabo - . Los aislados que bioquímicamente correspondían a L. monocytogenes fueron sometidos a la identificación molecular (género y especie).Maestro de Desarrollo Móvil Bank (MCB). Se inoculó una colonia de cada aislamiento en 20 ml de caldo BHI, y se incubó a 35 ° C durante 24 horas a 120 rpm. El cultivo se mezcló a continuación en una proporción de 1:01 con glicerol al 40 % (v / v) y se mezcló a fondo. Un ml se colocó en un

vial de crioconservación , y se almacenó a -20 ° C. Cada MCB se estudió periódicamente para verificar la pureza microbiana y la viabilidad (14).Extracción de ADN genómico (gDNA). Se inoculó en 5 ml de caldo BHI suplementado con 0,5 % (p / v) de glucosa para la extracción de ADN genómico, un vial congelado de cada aislado. Las células se cultivaron durante 18 horas a 35 ° C y 120 rpm. Un ml de cultivo se centrifugó durante 10 minutos a 5.000 x g. Las células se lavaron con tampón TE 1X (10 mM Tris - HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0 ± 0,2). Se extrajo el ADN utilizando el " kit de purificación de ADN genómico Wizard" (Promega, Madison WI, EE.UU).El ADN genómico ( gDNA ) cuantificación. Se determinó la pureza y la concentración de ADN (NanoDrop 2000c Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) (15).L. monocytogenes identificación molecular de Multiplex -PCR. Los cebadores usados para la reacción de PCR fueron L1 ( CTCCATAAAGGTGACCCT ) / U1 ( CAGCMGCCGCGGTAA TWC ) y LF ( CAAACGTTAACAACGCAGTA ) / LR ( TCCAGAGTGATCGATGTTAA ) ( 16 ) . El volumen final de la reacción fue de 35 ml , que contiene tampón de PCR 1X , 2,5 mM de MgCl2 , 0,2 mM de cada dNTP , 20 pmol de cada cebador y 2U de GoTaqFlexi DNApol ( Promega , Madison WI , EE.UU. ) , y 5 ml de ADNg ( ~ 120 ng ) . Las reacciones se llevaron a cabo en un CyclerTM Gene ( BioRad , Filadelfia, PA , EE.UU. ) programado de la siguiente manera : 1 minuto a 95 º C , seguido por 40 ciclos ( 30 s a 94 º C , 20 s a 51 ° C , 30 s a 72 ° C ) , y un paso de extensión final de 8 minutos a 72 ° C. L. monocytogenes ATCC 19115 se utilizó como control positivo ( 16 ) .La prevalencia de L. monocytogenes. La siguiente fórmula se utilizó para calcular la prevalencia (17).

RESULTADOS

Identificación molecular de L. monocytogenes por Multiplex-PCR. Todos los aislados previamente identificado como L. monocytogenes amplificaron los dos productos esperados de 938 pb y 750 pb, de género y la especie, respectivamente (16). La Figura 1 muestra los resultados de representación.

Canales de cerdo. La figura 2 muestra los resultados de la parte superior de cada una de las plantas de procesamiento analizados. L. monocytogenes se aisló en el (8/23, 34,8%) las plantas. Planta pb18 presentó el mayor número de muestras positivas (7/20, 35%). L. monocytogenes no se aisló en otras plantas (15/23, 65,2%). La prevalencia global de canales de cerdo fue de 3,7% (21/566).

Cortes de carne. Cincuenta y ocho lotes de carne de cerdo fresca se analizaron y L. monocytogenes se aisló en 40 lotes (69%). De los 40 lotes trece muestras estaban contaminadas con L. monocytogenes (22,4%). La bacteria no se aisló en el 31% restante (18/58) de las muestras de carne de cerdo. Hubo una alta prevalencia (33,9%, 160/472), (Figura 2-centro).

Carne de cerdo productos procesados.

Ham. L. monocytogenes se aisló en 10 muestras de jamón, con una prevalencia del 6,13% (Figura 2 abajo).Salchicha. De 169 muestras analizadas, L. monocytogenes se aisló en el trece. La prevalencia fue del 7,69% (Figura 2 abajo)."Chorizo”. Seis cepas de L. monocytogenes fueron obtenidos para una prevalencia de 4.03% (figura 2-inferior).

DISCUSIÓN

L. monocytogenes es un patógeno transmitido por alimentos, con implicaciones en la industria alimentaria debido a su naturaleza ubicua. Esta característica permite que la bacteria se difunde en el medio ambiente, facilitando la adhesión a las plantas de procesamiento de carne, en particular, las plantas de procesamiento de productos de carne de cerdo de carne, lo que favorece la contaminación de alimentos (18-20).En el presente estudio la prevalencia de L. monocytogenes en carcassess carne fue de 3,7 %. Estos valores están dentro del rango de los publicados por otras investigaciones: 2,0 % en Finlandia (21), 4,1 % en Estados Unidos (22). Nuestros resultados son inferiores a los presentados por Gil y Jones, que detectó un 8,3% en una planta canadiense. Sin embargo, el estudio de Gil y Jones sólo tenía 24 muestras, que no es representativo. Los datos de prevalencia de esta investigación son consistentes con varios autores que han señalado que las plantas de procesamiento no son una fuente importante de contaminación con L. monocytogenes. (23-27).La presencia del patógeno en cerdos se asocia al hecho de que estos animales son portadores de L. monocytogenes. Por ejemplo, se ha demostrado que el cerdo albergue esta bacteria en las amígdalas y el intestino (3, 21, 22, 28). Por esta razón, si durante la evisceración no es la ruptura de órganos, la carcasa puede estar contaminada con L. monocytogenes. Aunque es frecuente para L. monocytogenes de contaminar las canales y plantas de procesamiento, los procedimientos de lavado y desinfección posteriores deberían deshacerse de la contaminación. Producto libre de patógenos depende de la eficacia de estos procesos (21).En este estudio los cortes de carne tenían una prevalencia de 33,9 %. Este porcentaje es el más alto entre todas las muestras analizadas. Nuestros resultados coinciden con los reportados por los autores de distintos países. Ochiai et al. reportado una incidencia de 35,7 % en Tokio (20). Por el contrario,

otros estudios muestran una menor prevalencia e incidencia: 0,15 a 1,2 % en los Estados Unidos (29), 4,0 % en Finlandia (21), 5,0 % en Bulgaria (30), y el 24,0 % en Canadá (8). La baja prevalencia en estos países se puede asociar a la aplicación controlar las medidas durante las etapas de limpieza y desinfección. Se ha determinado durante el deshuesado puede haber contaminación cruzada con los utensilios. En particular, si este proceso se lleva a cabo a temperatura ambiente por debajo de 10 ° C. Esto favorece la presencia de L. monocytogenes debido a su naturaleza psicrotrofos (20, 28). Las condiciones de las superficies y equipos de contacto influyen en la persistencia de L. monocytogenes. Superficies de acero inoxidable se utilizan en la industria de alimentos para evitar la contaminación (26).En el presente estudio la prevalencia de L. monocytogenes en salchicha fue 7,69 %, similar a la encontrada por Vera et al (11) en Bogotá en 2004 (documento publicado en 2006). Vera et al (11) informó de una prevalencia de 8,7 % con 21 muestras positivas de 239 salchichas evaluados. Resultados similares fueron reportados por Karakolev et al (30) en 2009. Se analizaron y determinaron la prevalencia en embutidos secos crudos (11,3 %) y salchicha ahumada cruda (8.6 %), Bulgaria (30). Otras investigaciones han presentado prevalencia de 42,0 % (31), el 28,2 % en los embutidos frescos y fermentados (32), y el 16,9 % en embutidos curados en seco (33). Estos estudios muestran que existe una variabilidad en la prevalencia de L. monocytogenes en salchichas, que puede estar relacionado con el proceso de almacenamiento y preparación (29). Es de destacar que la prevalencia de L. monocytogenes ' depende del país y de la naturaleza de la transformación de los productos. Como ejemplo de ello, los embutidos fermentados crudos o productos sin el embalaje adecuado pueden tener una mayor prevalencia. En contraste, las muestras evaluadas en este estudio fueron embutidos cocidos y envasados al vacío en la planta de producción.Embutidos son productos regionales que varían en función del país en lo que respecta a los ingredientes y procesos de producción. En algunos casos se consideran un tipo de salchicha fermentada, lo que dificulta la comparación de los productos transformados a base de carne de cerdo de diferentes orígenes, en particular en la literatura internacional.La prevalencia de L. monocytogenes en el "chorizo" fue de 4,0 %, menos de lo que se ha dicho por Vera et al (11). Reportaron en Bogotá (2004), una prevalencia de 18,1 % con dos muestras positivas de 11 evaluados. Sus resultados podrían ser debido a un número bajo de muestreo y toma de muestras de salchicha de pre - cocido.En el caso del jamón de la prevalencia en la presente investigación fue 6,13 %. Esta prevalencia fue superior a lo reportado por Martins y Leal (0,8 %) (20), pero inferior a la reportada por Cabedo et al (33) (12,5 %). Vera et al (11) también reportó una mayor prevalencia (16,8 %) con 67 muestras positivas fuera de 398 analizados. Jamón contaminación puede ocurrir durante el corte en lonchas y / o en el envase probablemente debido a la presencia del patógeno en el equipo, cuando las condiciones de higiene no son apropiados (20,26).Chasseignaux et al. punta de salida a la contaminación de los productos cárnicos con L. monocytogenes asociados a la contaminación cruzada con la carne cruda , el equipo, las áreas de procesamiento (34), las zonas de enfriamiento, o incluso el personal del establecimiento. Por lo tanto la incorporación del microorganismo en REF se produce después de haber sometido el producto a los procesos térmicos.Por último, es importante tener en cuenta que la L. monocytogenes se encuentran en diferentes muestras analizadas. Esto demuestra la importancia de los productos de carne de cerdo como un vehículo para la transmisión de esta bacteria.