Procedimientos de separación basados en diferencias de solubilidad.

Las proteínas en disoluciones muestran cambios profundos en sus diferencias de solubilidad, en función de 1) el pH, 2) la fuerza iónica, 3) las propiedades dieléctricas del disolvente y 4) la temperatura. Estas variables que son reflejo del hecho de que las proteínas son electrolitos de peso molecular muy grande pueden utilizarse para separar mezclas de proteínas, ya que cada proteína posee una composición en aminoácidos característica, la cual determina su comportamiento como electrolito.

 El punto isoeléctrico es el pH para el cual la carga neta de todos los grupos disociables es igual a cero. Normalmente las proteínas poseen una carga eléctrica, la cual depende del pH, de los electrolitos presentes y del solvente. Esta carga hace que las moléculas de proteína se repelen unas a otras, por lo cual no pueden formar agregados y disminuye su tendencia a precipitar. En el punto isoeléctrico al no existir cargas las proteínas pueden formar agregados y es más fácil que precipiten, por lo cual al pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoeléctrico.

Precipitación isoeléctrica.

La precipitación de la mayor parte de las proteínas globulares se halla profundamente influida por el pH del sistema. La figura 7-6 muestra que la solubilidad de la β-lacto globulina, una proteína de la leche, es mínima cuando el pH se encuentra entre 5.2 y 5.3, independientemente de la concentración de cloruro sódico presente. A cada lado de este valor crítico del pH, la solubilidad experimenta un incremento muy agudo. Casi todas las proteínas globulares muestran un mínimo de solubilidad, aunque el pH al que ello ocurre varía de una proteína a otra.

El pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoeléctrico, definido como aquel valor de pH al que la molécula no posee carga eléctrica y es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico. En estas condiciones no existe repulsión electrostática entre moléculas de proteína vecinas y tienden a coalescer y precipitar. Sin embargo cuando los valores de pH están por encima o por debajo del punto isoeléctrico, todas las moléculas de proteína poseen una carga eléctrica

neta del mismo signo. Por dicha razón, se repelen mutuamente, impidiendo su coalescencia de las moléculas sencillas para formar agregados insolubles. Algunas proteínas son virtualmente insolubles en sus pH isoeléctricos.

Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de pH isoeléctrico también diferentes, debido a que difieren en el contenido de aminoácidos con grupo R ionizables, con frecuencia pueden separarse unas de otras, mediante precipitación isoeléctrica. Cuando el pH de una mezcla de proteínas se ajusta al pH isoeléctrico de uno de los componentes, la mayor parte o casi todo el componente precipitará, quedando en la disolución las proteínas cuyos valores de pH isoeléctrico se hallen por encima o por debajo de aquel. La proteína isoeléctrica precipitada permanece en su conformación nativa, y puede re disolverse en un medio de pH apropiado y concentración adecuada.

Para una proteína determinada, el pH isoeléctrico variara algo según la composición iónica del medio, puesto que las proteínas pueden unirse a ciertos aniones o cationes. Cuando una disolución de proteína se dializa a fondo frente a agua destilada para eliminar todos los iones pequeños distintos de los H+ y OH-, el pH de la disolución resultante se conoce como pH isoiónico. El pH isoiónico es constante para cualquier proteína determinada.

Procedimientos de separación basados en la carga eléctrica.

La separación de proteínas sobre la base de su carga eléctrica depende en ultimo termino de sus propiedades acido-básicas, las cuales se hallan determinadas en gran medida por el número y tipos de grupos R ionizables de sus cadenas polipeptídicas. Puesto las proteínas difieren en su composición aminoácido y secuencia, cada proteína posee propiedades acido-básicas características. Algunas proteínas nativas poseen uno o más grupos ionizables que no son accesibles a la valoración, probablemente debido a que se hallan ocultos o a que participan enlaces de hidrogeno.

Por desnaturalización de la proteína nativa estos grupos R ocultos se hacen accesibles. Por ejemplo, en la miglobina de los grupos R de 5, de los 11 restos de histidina son inaccesibles a la valoración hasta que la proteína se desnaturaliza.

DESNATURALIZACIÓN

Consiste en el des plegamiento de la estructura nativa plegada característica de la cadena poli peptídica de las moléculas globulares, normalmente es irreversible. La mayoría de las proteínas sufren desnaturalización a valores de pH menores de 6 y mayores de 8, debido al cambio de cargas en, los radicales de los residuos aminoácidos, lo que ocasiona la ruptura de puentes de hidrogeno debida a radicales y enlaces   iónicos.Muchas de las moléculas proteicas solo retienen su actividad biológica dentro de una fluctuación muy limitada de temperatura y de pH. La exposición de proteínas solubles o globulares a pH extremos o a temperaturas elevadas, le hace experimentar un cambio conocido como desnaturalización, consiste en un descenso de solubilidad. Puesto que los enlaces químicos covalentes del esqueleto péptico de las proteínas no se rompen durante este tratamiento relativamente suave, se ha llegado a la conclusión que la   estructura primaria permanece intacta. La mayor parte de las proteínas globulares experimenta el proceso de desnaturalización cuando se llega a una temperatura de 60-70℃. La consecuencia más significativa de la desnaturalización es que las proteínas pierden su actividad biológica característica.Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares yFibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales.

Proteínas usadas en el experimento

Caseína

El pH en el que precipitan las proteínas se denomina punto isoeléctrico (pI), ya que se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de 0 y la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada ya que la partículas se agregan. Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos, y así cada proteína tendrá un pI diferente.

La caseína (del latín caseus, "queso") es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos

fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno.

La caseína representa el 80% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida.

Las caseínas es un conjunto heterogéneo de aminoácidos por lo que es difícil fijar una definición. Sin embargo, todas las proteínas englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica común: precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche. Por otra parte, y aunque las proteínas que se denominan caseínas son específicas de cada especie, se clasifican en los siguientes grandes grupos de acuerdo con su movilidad electroforética: αs1-caseína, αs2-caseína, β-caseína y κ-caseína.

Reacción:

Ca-Caseinato+CH3COOH --> caseína + CH3

Gelatina

La gelatina se encuentra como ingrediente en numerosos alimentos. En su fabricación, la colágena, que existe como un material de desperdicio, como piel y

huesos, es convertida en gelatina por ebullición lenta en agua. Se emplean dos procedimientos para fabricarla: extracción con ácido y extracción con cal.      La gelatina tiene la propiedad de presentar una solubilidad completa incluso en su punto isoeléctrico, sin embargo al encontrarse presente un agente deshidratante como el alcohol, puede disminuir su solubilidad notablemente e incluso precipitar.Los aminoácidos que componen a la gelatina son: Acido aspártico, ácido glutámico, alanina, arginina, cistina, fenilalanina, glicina, hidroxiprolina, histidina, isoleucina.Las características de la gelatina se ven modificadas cuando se alcanza un pI de 4.7, presenta mayor turbidez, menor viscosidad y los enlaces son más fuertes. La gelatina está compuesta de la siguiente manera: 84-90% proteína proveniente del colágeno, 1-2% sales minerales, el porcentaje restante es agua. La gelatina es el producto de la hidrolisis parcial del colágeno contenido en las pieles, el tejido conjuntivo y los huesos de animales. La misma se presenta en placas, hojas flexibles, residuos, granos o polvo incoloro o ligeramente marrón amarillento. Ciertas gelatinas son intencionalmente hidrolizadas en forma más profunda que la gelatina alimentaria habitual, para poder ser presentadas, ya sea en soluciones coloidales ya preparadas, o en forma de polvo atomizado soluble en frío. Estos productos no presentan la característica de producir un gel en contacto con el agua.La estructura y el punto isoeléctrico de las proteínas de las gelatinas de pieles de bovinos son diferentes de aquellas provenientes de los huesos y cueros de cerdos.

BIBLIOGRAFÍA:

Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México

Raymond Chang. 2008. Fisicoquímica, 3ª edición, Mc Graw-Hill, México.

Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2005). Lehninger Principios de Bioquímica. 4ª edición. Ed. Omega.

Conclusión:

Fue posible determinar el punto isoeléctrico de estas dos proteínas al conocer la concentración del ácido acético disuelto en los tubos de ensayo que contenían las proteínas. De las cuales se determinó experimentalmente al observar la turbidez e incluso la precipitación de las proteínas al fondo del tubo. Una vez observado esto se pudo deducir si los cálculos prácticos y teóricos coincidían con lo que se observó físicamente. Lo que finalmente concluimos es que las proteínas solo coalecen en el punto isoeléctrico exacto sin sobrepasar o estar por debajo de este, en otras palabras podemos decir que tienden a estar unidas al estar sin una carga neta que las aleje de sí mismas.